KR101723007B1 - 고순도 d-사이코스를 제조하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 과당을 D-사이코스 에피머화 반응시켜 D-사이코스 함유 용액을 생성하고,
상기 D-사이코스 함유 용액을 제1 냉각 및 이온 정제하고,
상기 정제된 D-사이코스 함유 용액을 제1 농축 및 제2 냉각하고,
상기 제1 농축 및 제2 냉각된 D-사이코스 함유 용액을 크로마토그래피하여 과당 함유 모액과 D-사이코스 함유 분리액을 수득하고,
상기 D-사이코스 함유 분리액을 제2 농축 및 제3 냉각하여 D-사이코스 결정을 수득하는 것을 포함하며,
상기 크로마토그래피에서 생성된 과당 함유 모액을 상기 D-사이코스 에피머화 반응에 재사용하는 것을 포함하는, D-사이코스 제조 방법에 관한 것이다.
상기 D-사이코스 함유 용액을 제1 냉각 및 이온 정제하고,
상기 정제된 D-사이코스 함유 용액을 제1 농축 및 제2 냉각하고,
상기 제1 농축 및 제2 냉각된 D-사이코스 함유 용액을 크로마토그래피하여 과당 함유 모액과 D-사이코스 함유 분리액을 수득하고,
상기 D-사이코스 함유 분리액을 제2 농축 및 제3 냉각하여 D-사이코스 결정을 수득하는 것을 포함하며,
상기 크로마토그래피에서 생성된 과당 함유 모액을 상기 D-사이코스 에피머화 반응에 재사용하는 것을 포함하는, D-사이코스 제조 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 D-사이코스의 제조 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 제조공정 중 열 변성 없이 높은 수율로 고순도의 D-사이코스를 제조하는 방법에 관한 것이다.
D-사이코스는 과당이나 설탕과는 달리 인체 내에서 대사되지 않아 칼로리가 거의 없으며, 체지방 형성 억제 작용으로 체중 증가에 영향이 적은 감미료로 보고 되고 있다(Matuo, T. et. Al.. Asia Pac . J. Clin . Untr ., 10, 233-237, 2001; Matsuo, T. and K. Izumori, Asia Pac . J. Clin . Nutr ., 13, S127, 2004).
최근에 본 발명자들은 포도당을 과당으로 이성화한 후, 이를 D-사이코스 에피머화 효소를 생산하는 고정화 균체와 반응시켜 D-사이코스를 경제적으로 생산하는 방법을 보고하였다(대한민국 특허출원 제10-2009-0118465호).
효소 반응에 의해 생산된 D-사이코스를 포함하는 반응액은 약 20 내지 30 %(w/w)의 D-사이코스 고형분을 포함하는 저순도 제품이기 때문에, 98 %(w/w) 이상의 고순도 D-사이코스를 제조하기 위해서는 연속식 크로마토그래피를 사용하여 고순도 분리를 통해 결정화 제조하는 것이 요구된다.
상기 방법에서 과당으로부터 생산되는 D-사이코스의 효소반응 전환율이 20 내지 30 %(w/w)이므로 D-사이코스의 생산물량에 비하여 발생되는 모액, 즉 연속식 크로마토그래피에서 분리된 과당 모액과 결정화 분리모액의 양이 많은 공정 흐름을 나타낸다. 결과적으로, D-사이코스 생산량 저하로 인한 원단위 증가로 제조원가가 상승되어 산업적 생산에 있어서 비경제적인 문제를 나타낸다.
따라서, 저수율로 인한 원단위 상승을 낮추기 위해 높은 수율로 고순도의 D-사이코스를 제조할 수 있는 방법의 제공이 요구되고 있다.
없음
이에 본 발명은, 일 양태에서, 높은 수율로 고순도 D-사이코스를 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 예에서,
과당을 D-사이코스 에피머화 반응시켜 D-사이코스 함유 용액을 생성하고,
상기 D-사이코스 함유 용액을 제1 냉각 및 이온 정제하고,
상기 정제된 D-사이코스 함유 용액을 제1 농축 및 제2 냉각하고,
상기 제1 농축 및 제2 냉각된 D-사이코스 함유 용액을 크로마토그래피하여 과당 함유 모액과 D-사이코스 함유 분리액을 수득하고,
상기 D-사이코스 함유 분리액을 제2 농축 및 제3 냉각하여 D-사이코스 결정을 수득하는 것을 포함하며,
상기 크로마토그래피에서 생성된 과당 함유 모액을 상기 D-사이코스 에피머화 반응에 재사용하는 것을 포함하는, D-사이코스 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 예에서,
과당을 D-사이코스 에피머화 반응시켜 D-사이코스 함유 용액을 생성하고,
상기 D-사이코스 함유 용액을 제1 냉각 및 이온 정제하고,
상기 정제된 D-사이코스 함유 용액을 제1 농축 및 제2 냉각하고,
상기 제1 농축 및 제2 냉각된 D-사이코스 함유 용액을 크로마토그래피하여 과당 함유 모액과 D-사이코스 함유 분리액을 수득하고,
상기 D-사이코스 함유 분리액을 제2 농축 및 제3 냉각하여 D-사이코스 결정을 수득하는 것을 포함하며,
상기 크로마토그래피에서 생성된 과당 함유 모액을 D-사이코스 에피머화 반응에 재사용하고,
상기 D-사이코스 결정화시 생성된 모액을, 제1 냉각 및 이온 정제, 제1 농축 및 제2 냉각, 및 크로마토그래피 중 어느 하나 이상에 재사용하는 것을 포함하는, D-사이코스 제조 방법이 제공된다.
상기 일 예 혹은 다른 예에서, 크로마토그래피에서 생성된 과당 함유 모액 또는 D-사이코스 결정화시 생성된 모액을 재사용 전 25℃ 내지 45℃의 범위, 구체적으로 30℃ 내지 40℃의 범위로 냉각하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 상기 크로마토그래피는 예를 들어, 연속식 크로마토그래피일 수 있다.
상기 일 예 혹은 다른 예에서, 제1 냉각 및 제3 냉각은 용액 또는 주위 온도를 25℃ 내지 45℃의 범위, 구체적으로는 30℃ 내지 40℃의 범위로 냉각하는 것이고, 제2 냉각은 용액 또는 주위 온도를 45℃ 내지 65℃의 범위, 구체적으로는 50℃ 내지 60℃의 범위로 냉각하는 것일 수 있다.
상기 일 예 혹은 다른 예에서, 상기 제1 농축은 상기 정제된 D-사이코스 함유 용액을 D-사이코스 농도가 50 brix 내지 70 brix의 범위가 되도록 하는 것이며, 상기 제2 농축은, 분리액 중 D-사이코스의 농도가 75 brix 이상, 예를 들어, 80 brix 이상이 되도록 하는 것일 수 있다.
상기 일 예 혹은 다른 예에서, 상기 크로마토그래피에서 생성된 과당 함유 모액으로, 순도 70 %(w/w) 이상의 과당 함유 분획물을 사용하고, 상기 D-사이코스 결정화시 생성된 모액으로, 순도 90% (w/w) 이상의 D-사이코스 함유 분획물을 사용할 수 있다.
상기 일 예 혹은 다른 예에서, 상기 D-사이코스 에피머화 반응은, D-사이코스 에피머화 효소, 이의 변이체, 상기 효소를 생성하는 균주 또는 이의 배양물의 존재 하에서 40℃ 내지 70℃의 온도, 구체적으로는, 40℃ 내지 60℃의 온도, 보다 구체적으로는 40℃ 내지 50℃의 온도에서 에피머화 반응시키는 것을 포함할 수 있다.
상기 일 예 혹은 다른 예에서, 상기 이온 정제는 강산성 양이온교환수지 및/또는 약염기성 음이온교환수지를 이용할 수 있다.
상기 일 예 혹은 다른 예에서, D-사이코스 함유 분리액은 D-사이코스를 93% (w/w) 이상, 구체적으로는 95% (w/w) 이상 포함할 수 있다.
상기 일 예 혹은 다른 예에서, 상기 제1 내지 제3 냉각은 각각 열교환 냉각일 수 있다. 열교환 냉각은 전열면적이 넓고 유체의 난류발생으로 열교환 속도가 빠르며, 스케일 형성이 방지되므로 성능저하가 매우 적어 경제성이 높은 이점이 있다.
상기 일 예 혹은 다른 예에서, 상기 수득된 D-사이코스 결정의 순도가 95% (w/w) 이상, 보다 구체적으로는 99% (w/w) 이상일 수 있다.
상기 일 예 혹은 다른 예에서, 상기 제조 방법에 따라 제조된 D-사이코스 결정의 수율은 75% 이상, 구체적으로 85% 이상일 수 있다.
본 발명의 또 다른 예에서, 본원에 기재된 D-사이코스를 제조하는 방법에 따라 제조된, 순도 99% (w/w) 이상의 D-사이코스가 제공된다.
본 발명의 일 예에 따른 D-사이코스의 제조 방법은 D-사이코스의 열변성을 방지하여 안정화된 공법으로 높은 수율로 D-사이코스 제조가 가능하다.
또한, 본 발명의 일 예에 따른 D-사이코스의 제조 방법은 크로마토그래피에서 생성된 과당 함유 모액 및/또는 D-사이코스 결정화시 생성된 모액을 회수하여 사이코스 에피머화 반응이나 제1 냉각 및 이온 정제, 제1 농축 및 제2 냉각, 또는 크로마토그래피 등에 재사용함으로써 장기간 재순환하여도 크로마토그래피를 통한 D-사이코스의 안정적인 분리가 가능하여 D-사이코스의 높은 수율을 구현할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 예에 따른 D-사이코스 제조 방법의 공정을 간략히 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 다른 예에 따른 D-사이코스 제조 방법의 공정을 간략히 나타낸 모식도이다.
도 3은 비교예 2에서의 D-사이코스 제조 방법의 공정을 간략히 나타낸 모식도이다.
도 4 내지 8은 온도와 D-사이코스의 농도에 따른 D-사이코스의 순도%(w/w) 변화를 보여주는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 다른 예에 따른 D-사이코스 제조 방법의 공정을 간략히 나타낸 모식도이다.
도 3은 비교예 2에서의 D-사이코스 제조 방법의 공정을 간략히 나타낸 모식도이다.
도 4 내지 8은 온도와 D-사이코스의 농도에 따른 D-사이코스의 순도%(w/w) 변화를 보여주는 그래프이다.
이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다. 본 명세서에 기재되지 않은 내용은 본 발명의 기술 분야 또는 유사 분야에서 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.
본 발명의 일 예에서,
과당을 D-사이코스 에피머화 반응시켜 D-사이코스 함유 용액을 생성하고,
상기 D-사이코스 함유 용액을 제1 냉각 및 이온 정제하고,
상기 정제된 D-사이코스 함유 용액을 제1 농축 및 제2 냉각하고,
상기 제1 농축 및 제2 냉각된 D-사이코스 함유 용액을 크로마토그래피하여 과당 함유 모액과 D-사이코스 함유 분리액을 수득하고,
상기 D-사이코스 함유 분리액을 제2 농축 및 제3 냉각하여 D-사이코스 결정을 수득하는 것을 포함하며,
상기 크로마토그래피에서 생성된 과당 함유 모액을 상기 D-사이코스 에피머화 반응에 재사용하는 것을 포함하는, D-사이코스 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 예에서,
과당을 D-사이코스 에피머화 반응시켜 D-사이코스 함유 용액을 생성하고,
상기 D-사이코스 함유 용액을 제1 냉각 및 이온 정제하고,
상기 정제된 D-사이코스 함유 용액을 제1 농축 및 제2 냉각하고,
제1 농축 및 제2 냉각된 D-사이코스 함유 용액을 크로마토그래피하여 과당 함유 모액과 D-사이코스 함유 분리액을 수득하고,
상기 D-사이코스 함유 분리액을 제2 농축 및 제3 냉각하여 D-사이코스 결정을 수득하는 것을 포함하며,
상기 크로마토그래피에서 생성된 과당 함유 모액을 상기 D-사이코스 에피머화 반응에 재사용하고, 상기 D-사이코스 결정화시 생성된 모액을, 상기 제1 냉각 및 이온 정제, 상기 제1 농축 및 제2 냉각, 또는 크로마토그래피에 재사용하는 것을 포함하는, D-사이코스 제조 방법이 제공된다. 크로마토그래피에서 생성된 과당 함유 모액 및/또는 D-사이코스 결정화시 생성된 모액을 D-사이코스 에피머화 반응이나 제1 냉각 및 이온 정제, 제1 농축 및 제2 냉각, 또는 크로마토그래피 등에 재사용함으로써, 높은 수율의 D-사이코스 생산이 가능하며, 이로 인해 생산효율이 증대되고 제조 원가를 낮출 수 있는 이점이 있다.
우선, 에피머화 반응에 기질로서 사용되는 과당은 30 내지 50 brix(%)의 농도로, 30℃ 내지 40 ℃ 의 온도에서 용수에 용해시켜 이용할 수 있다. 또는, 과당을 크로마토그래피에서 생성된 과당 함유 모액과 혼합하여 30℃ 내지 40 ℃ 의 온도에서 30 내지 50 brix(%)의 농도로 사용할 수 있다. 여기서, 상기 크로마토그래피에서 생성된 과당 함유 모액은, 순도 70 %(w/w) 이상, 구체적으로 75% (w/w) 이상의 과당 함유 분획물을 사용할 수 있다.
상기 D-사이코스 에피머화 반응은, 사이코스 에피머화 효소, 이의 변이체, 상기 효소를 생성하는 균주 또는 이의 배양물의 존재 하에서 과당을 에피머화하여 D-사이코스를 생성하는 것이다. 본 발명에 사용될 수 있는 D-사이코스 에피머화 효소는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 플라보니프랙터 플라우티(Flavonifractor plauti), 클로스트리디움 힐레모네(Clostridium hylemonae) 등 다양한 공여미생물 유래 효소 또는 변이체 일수 있다. 상기 형질전환용 균주로는 대장균(Escherichia coli)이나 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 바실러스(Bacillus) 속, 아스퍼질러스 (Aspergillus) 속으로 이 균주만으로 국한되는 것은 아니다. 상기 대장균에 형질 전환된 균주로는 예를 들어, BL21(DE3)/pET24-ATPE[대한민국 공개특허 제10-211-0035805호], BL21(DE3)/pET24-ATPE-2 [대한민국 등록특허 제10-1203856호] 등이 있으며, 상기 코리네박테리움 속 균주는 Corynebacterium glutamicum ATCC13032/pCJ-1-ATPE [대한민국공개특허 제10-2011-0035805호의 기탁번호 KCCM11046], Corynebacterium glutamicum ATCC13032/pFIS-1-ATPE-2 [대한민국등록특허 제10-1203856호의 기탁번호 KCCM11204P], Corynebacterium glutamicum CJ KY [대한민국등록특허 제10-1455759호의 기탁번호 KCCM11403P], Corynebacterium glutamicum ATCC13032/pFIS-2-ATPE-2 [대한민국출원특허 제10-2015-0047111호의 기탁번호 KCCM11678P] 등이 있다.
일 예에서, 상기 에피머화 반응은, 사이코스 에피머화 효소, 이의 변이체, 상기 효소를 생성하는 균주 또는 이의 배양물을, 담체, 예를 들어 알긴산 나트륨에 고정시키고, 상기 고정화된 효소를, 이성화 반응 설비, 예컨대 컬럼에 충진한 후, 상기 충진된 컬럼에 과당을 포함하는 용액을 공급하는 것일 수 있다. 상기 설비 내 온도는 에피머화 반응을 위해 40℃ 내지 70℃의 온도, 예컨대, 40℃ 내지 55℃의 온도를 유지시킬 수 있다. 이 때, 공급되는 과당을 포함하는 용액의 온도는, 예를 들어, 시간당 5 ℃ 내지 20℃ 씩 40℃ 내지 60℃의 온도로, 예컨대 50 ℃ 온도로 열교환기를 통해 승온시켜 SV [Space Velocity: 유량(L)/시간(Hr)/수지량(L)] 0.5 내지 3으로 통과하게 한다. 에피머화 반응에 의해 생성된 D-사이코스의 순도는 약 15 % 내지 약 35 (w/w)%, 예를 들어, 약 20% 내지 약 30 (w/w)%일 수 있다.
위와 같이 제조된 D-사이코스 함유 용액을 제1 냉각 및 이온 정제할 수 있다. 상기 제1 냉각은 상기 용액의 온도 또는 주위 온도를 25℃ 내지 45℃의 범위, 구체적으로 30℃ 내지 40℃의 범위로 냉각하는 것이다. 일 예에서, D-사이코스 결정화시 생성된 모액을 제1 냉각 및 이온 정제 단계에서 재사용할 수 있다. 구체적으로는 시간 당 1℃ 내지 10℃씩 서서히 냉각시킬 수 있으며, 상기 냉각에는 열 교환기를 사용할 수 있다. D-사이코스는 일정 온도에 지속 노출이 될 경우, 열변성에 의해 D-사이코스가 파괴되어 제조공정 흐름에서 D-사이코스 순도가 저하되고, 따라서 높은 수율의 D-사이코스 생산이 어려운 단점이 있다(도 4 내지 8 참조). 이에 본 발명에서는 제조 공정의 각 단계에서 온도를 제어함으로써 D-사이코스의 열변성이 없도록 하였다.
이후, 이온 정제하는 것은, 상기 냉각된 용액을 강산성 양이온교환수지 및/또는 약염기성 음이온교환수지가 충진된 컬럼을 통해 정제하는 것일 수 있다. 강염기성 음이온수지를 사용할 경우에는 25℃ 내지 45℃의 저온에서도 D-사이코스를 변성시켜 순도저하가 발생할 수 있으므로, 높은 수율의 D-사이코스 제조를 위해서 강산성 양이온교환수지 또는 약염기성 음이온교환수지를 이용할 수 있으며, 보다 구체적으로는 100 % 약염기성 음이온교환수지를 사용하는 것이 좋다. 이온 성분의 효과적 제거를 위해 양이온교환수지와 음이온 교환수지를 동시에 사용할 수 있다. 이 경우 양이온교환수지와 음이온 교환수지의 비율은 1:0.5 내지 1:3일 수 있다. 상기 이온 정제 동안, 25℃ 내지 45℃의 온도, 구체적으로 30℃ 내지 40℃의 온도가 유지되어 D-사이코스의 변성을 방지할 수 있다. 이로써, D-사이코스 함유 용액 내 불순물로 포함된 이온 성분을 제거할 수 있다. 상기 이온 정제 후 이온성 성분의 함량은 전기 전도계로 측정시 단위 cm 당 20 마이크로 지맨스 이하, 구체적으로는 10 마이크로 지맨스 이하일 수 있다. 이온 정제된 용액 중 D-사이코스의 순도는 약 10 %(w/w) 내지 약 35 %(w/w)이다.
상기 이온 정제된 D-사이코스 함유 용액을 제1 농축 및 제2 냉각한다.
상기 제1 농축은 상기 이온 정제된 D-사이코스 함유 용액을 D-사이코스 농도가 50 brix 내지 70 brix의 범위, 예를 들어, 55 brix 내지 65 brix의 범위가 되도록 농축시키는 공정이다. 구체적으로는 60℃ 내지 80℃의 온도 하에서, 예를 들어, 65℃ 내지 75℃의 온도 하에서 1분 내지 1시간 동안, 구체적으로는 1분 내지 30분 동안 농축시킬 수 있다. 이 때 농축에는 D-사이코스 변성 방지를 위해 저온 농축기를 사용할 수 있다. 본원에서 brix는 전체 용액의 중량을 기준으로 D-사이코스, 또는 과당의 중량의 백분율을 의미한다. 상기 제1 농축 후 제2 냉각을 실시할 수 있다. 제2 냉각을 실시하는 경우, 용액 또는 주위 온도는, 상기 제1 농축시 온도보다 적어도 10℃ 정도 저온이 되도록 냉각시킬 수 있다. 구체예에서 제2 냉각 온도는 50℃ 내지 60℃의 범위일 수 있다. 구체적으로는 시간 당 5℃ 내지 25℃씩 서서히 냉각시킬 수 있으며, 상기 냉각에는 열 교환기를 사용할 수 있다. 일 예에서, D-사이코스 결정화시 생성된 모액을 제1 농축 및/또는 제2 냉각 단계에서 재사용할 수 있다.
이후, 상기 농축 및 냉각된 D-사이코스 함유 용액을 크로마토그래피하여 모액과 D-사이코스 함유 분리액을 수득할 수 있다.
크로마토그래피는 D-사이코스와 이온 수지에 부착된 금속 이온 사이의 약한 결합력의 차이를 이용하여 D-사이코스를 분리하는 것이며, 예를 들어 연속식 크로마토그래피를 사용할 수 있다. 크로마토그래피에 사용되는 이온 수지는 K, Na, Ca, Ma 잔기가 부착된 강산성 양이온 교환수지일 수 있다. D-사이코스와 과당을 분리한다는 측면에서는 K, Ca, 또는 Na가 특히 좋다. 상기 크로마토그래피로 과당 함유 용액과 D-사이코스 함유 분리액을 얻을 수 있다. 상기 D-사이코스 함유 분리액은 순도 90% (w/w) 이상, 예를 들어, 순도 95% (w/w) 이상의 D-사이코스 함유 분획물일 수 있다. 구체적으로, D-사이코스 순도가 90 내지 99 %(w/w) 이상일 수 있다.
과당 함유 용액은 순도 70 %(w/w) 이상의 과당 함유 분획물일 수 있다. 여기서, 과당 함유 용액은 D-사이코스 에피머화 반응에 재사용할 수 있다. 재사용 전, 25℃ 내지 45℃의 범위, 30℃ 내지 40℃의 범위로 냉각하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
이후, 상기 D-사이코스 함유 분리액을 제2 농축 및 제3 냉각하여 D-사이코스 결정을 수득할 수 있다. 크로마토그래피에 의해 분리된 순도 90% (w/w) 이상, 예를 들어, 순도 95% (w/w) 이상의 D-사이코스 용액을 제2 농축하여 분리액 중 D-사이코스의 농도가 75 brix 이상, 예를 들어, 80 brix 이상이 되도록 할 수 있다. 상기 농축은 구체적으로는 60℃ 내지 80℃의 온도 하에서, 예를 들어, 65℃ 내지 75℃의 온도 하에서 1분 내지 1시간 동안, 구체적으로는 1분 내지 30분 동안 농축시킬 수 있다. 이 때 농축에는 D-사이코스 변성 방지를 위해 저온 농축기를 사용할 수 있다. 상기 제2 농축 후 제3 냉각을 실시할 수 있다. 제3 냉각은 D-사이코스를 결정화하기 위한 것으로, 용액 또는 주위 온도를 30℃ 내지 40℃의 범위로 냉각하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로는, 시간 당 5℃ 내지 20℃씩 서서히 냉각시켜 25℃ 내지 45℃, 예를 들어, 30℃ 내지 40℃ 범위 내가 되도록 하고, 상기한 온도 범위 내에서 승온과 냉각이 5 회 내지 10회 반복적으로 이루어지게 하여 40시간 내지 120시간 동안 결정화를 진행할 수 있다. 수득된 D-사이코스 결정은 추가로 탈수 및 건조될 수 있다. 수득된 D-사이코스 결정의 순도는 95% 이상, 구체적으로 99% 이상이고, 또한, D-사이코스 결정의 하기 식 1에 따른 수율은 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상일 수 있다.
[식 1]
수율(%) = (탈수 및 건조된 D-사이코스 결정의 중량 / 결정화 원액의 D-사이코스 중량)× 100
상기 수율 계산시, 결정화전 원액 중 D-사이코스 중량 측정은 HPLC 분석을 통하여 원액 중의 D-사이코스 g/L를 측정 한 뒤, 기 측정된 결정화 원액량(L)에 따라 상기 측정되어진 D-사이코스 g/L를 대입하여 특정 원액량(L)에 포함된 D-사이코스의 중량(g)을 계산할 수 있다.
상기 D-사이코스 결정화시 생성된, D-사이코스 결정을 제외한 모액은 상기 각 단계에 재사용될 수 있으며, 일 예에서는, 제1 냉각 및 이온 정제, 제1 농축 및 제2 냉각, 및 크로마토그래피 공정 중 어느 하나 이상에 재사용할 수 있다. D-사이코스 결정화시 생성된 모액을 재사용 전 25℃ 내지 45℃의 범위로 냉각되어 재사용될 수 있다. D-사이코스 결정화시 생성된 모액은 순도 90% (w/w) 이상, 순도 92% (w/w) 이상, 순도 95% (w/w) 이상의 D-사이코스 함유 분획물일 수 있다.
이하, 본 발명의 구체적인 실시예를 통해 본 발명의 구성 및 작용을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 다만, 이는 본 발명의 구체적 예시로 제시된 것이며 어떠한 의미로도 이에 의해 본 발명이 제한되는 것으로 해석될 수는 없다.
여기에 기재되지 않은 내용은 이 기술 분야에서 숙련된 자이면 충분히 기술적으로 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략하기로 한다.
실시예
1
순도 99 %(w/w) 이상의 결정과당과 회수된 약 30 ℃의 연속식 크로마토그래피 모액과 회수된 약 30 ℃의 결정화 모액과 약 30 ℃의 용수를 사용하여 용해조 내에서 교반 혼합하여 50 brix(%) 로 용해하여 효소반응 기질 용액을 준비하였다.
효소 반응은 대한민국 특허출원 제10-2009-0118465호에 개시된 바와 같은, 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM 11046의 균주로부터 분리된 D-사이코스 에피머화 효소를 소디움 알기네이트 담체에 고정화시키고 이성화반응 설비(이성화탑, 한주기계공업)에 충진한 뒤, 상기 준비된 효소반응 기질 용액을 열 교환기를 통하여 시간당 5 내지 20 ℃ 씩 50 ℃ 온도로 승온시켜 SV [Space Velocity: 유량(L)/시간(Hr)/수지량(L)] 0.5 로 반응시켰고 이때의 D-사이코스의 순도는 약 24 %(w/w) 였다.
상기 순도 24 %(w/w)의 D-사이코스 용액을 열 교환기를 통하여 시간당 5 내지 10℃ 씩 30 내지 40℃ 온도로 제1 냉각시킨 후, 수소기로 치환된 강산성 양이온 교환 수지(Lewatit S 1668) 및 수산화기로 치환된 약염기성 음이온 교환 수지(Lewatit S 4528)가 충진된 컬럼에 SV [Space Velocity: 유량(L)/시간(Hr)/수지량(L)] 3 으로 통액하여 효소반응 용액 중의 이온 성분을 제거하였고, 이온 성분 제거의 확인은 전기 전도계 측정을 통해 단위 cm 당 10 마이크로 지맨스 이하가 되도록 조절하였으며 정제된 효소 반응액의 D-사이코스의 순도는 24 %(w/w)로 유지되었다.
상기 이온 정제된 D-사이코스 함유 용액을 저온 농축기(강제박막형농축기(Forced Thin Film Evaporator, 웰크론한텍) 내에 투입하여 65 내지 75℃ 의 온도 하에서 10 내지 15분 동안 단시간에 농축하여 농도를 60 brix(%)(D-사이코스 용액×100/전체 용액)로 조절하였고, 열 교환기를 통하여 시간당 5 내지 25℃ 씩 제2 냉각시켜 50℃ 내지 60℃ 에서 칼슘 활성기가 부착된 강산성 양이온교환수지가 충진된 컬럼에서의 연속식 크로마토그래피에 의해 D-사이코스의 순도가 95 %(w/w) 이상인 분획과 과당의 순도가 75 %(w/w) 이상인 분획으로 분리하였다.
상기 연속식 크로마토그래피에서 분리된 모액 즉, 순도 75 %(w/w) 이상의 과당 분획은 회수하여 시간당 20 내지 30℃ 씩 냉각시켜 30℃ 에서 효소반응 공정으로 재순환시켰다.
상기 연속식 크로마토그래피에서 분리되어진 순도 95 %(w/w) 이상의 D-사이코스 용액을 65 내지 75 ℃ 의 온도 하에서 10 내지 15 분 동안 단시간에 농축하여 농도를 80 brix(%) 로 조절하였고, 농축된 순도 95 %(w/w) 이상의 D-사이코스 용액을 열 교환기를 통하여 시간당 5 내지 20℃씩 40 ℃의 온도로 급속히 냉각시킨 후 30 내지 40℃ 범위 내에서 승온과 냉각이 5 내지 10 회 반복적으로 이루어지게 하여 80 내지 120 시간 동안 결정화하여 D-사이코스를 제조 하였다(도 1 참조). 또한, 추가적으로, 상기 결정화에서 분리된 모액 즉, 순도 90% 이상의 D-사이코스 분획을 회수하여 30℃로 냉각시키고, 상기 수소기로 치환된 강산성 양이온 교환 수지 및 수산화기로 치환된 약염기성 음이온 교환 수지가 충진된 컬럼에 재순환시켰다.
상기와 같은 과정을 통해, 저온 농축기에서 단시간에 농축함과 동시에 열교환기를 이용하여 공정 내 온도를 저온으로 조절함으로써 생산 수율이 75 % 이상으로 월등한 순도 99% 이상의 고순도 D-사이코스를 얻을 수 있었다.
비교예
1
실시예 1에서 연속식 크로마토그래피에서 생성된 과당 함유 모액을 사이코스 에피머화 반응에 재사용하는 것과, 사이코스 결정화시 생성된 모액을 재사용하는 하는 것은 실시하되, 제1 냉각, 제2 냉각 등의 냉각 과정 없이 실시하는 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하여 순도 99% 이상의 고순도 D-사이코스를 생산하였고, 이때의 생산 수율은 60 %이었다.
이는, D-사이코스가 일정 농도와 일정 시간이 경과됨에 따라 순도가 줄어드는 특징을 가졌기 때문에(도 4 내지 8 참조) 공정 내 냉각 단계 없이 연속식 크로마토그래피 분리 과당모액과 결정화 분리모액의 재순환 반복횟수가 지속적으로 누적될 경우, 연속식 크로마토그래피에 투입되는 D-사이코스 순도가 최초 24 %(w/w) 에서 반복횟수와 비례하여 그 순도가 낮아지고 결정화를 위한 95 %(w/w) 이상의 고순도 D-사이코스 분획 분리 수율이 낮아지는 결과를 나타내며, 이러한 95 %(w/w) 이상의 고순도 D-사이코스의 낮은 회수율은 순도 99% 이상의 고순도 D-사이코스 생산 수율 감소의 원인으로 작용하기 때문으로 보인다. 또한, D-사이코스 유래의 변성된 불순물이 연속식 크로마토그래피 분리단계에서 과당 분획으로 분리되므로, 공정 내 재순환 반복횟수가 누적됨에 따라 연속식 크로마토그래피 분리에 문제를 일으켜 누적되는 불순물의 제어를 위하여 분리된 과당 분획의 약 5 ~ 10 %(v/v) 용액을 폐기하게 되고, 이는 결과적으로 순도 99% 이상의 고순도 D-사이코스 생산 수율 감소의 원인으로 작용한다.
연속식 크로마토그래피 분리 과당 모액 약 5 ~ 10 %(v/v)을 폐기하지 않을 경우, 누적되는 불순물에 의하여 연속식 크로마토그래피 투입원액의 D-사이코스 순도가 지속적으로 감소되므로, 95 %(w/w) 이상의 고순도 D-사이코스 분리를 위한 연속식 크로마토그래피의 분리 프로그램 조건을 지속적으로 변경해야 하는데 이것은 산업적 생산 효율화를 떨어뜨리는 요인이며, 연속식 크로마토그래피에서 95 %(w/w) 이상의 고순도 D-사이코스 분리를 위한 탈이온수 사용량 또한 증가되므로 농축공정의 부하를 초래하여 공정흐름의 병목현상을 일으켜 생산량 저하와 제조원가 상승의 결과를 일으킨다.
비교예
2
실시예 1에서 연속식 크로마토그래피에서 생성된 과당 함유 모액을 사이코스 에피머화 반응에 재사용하는 것과, 사이코스 결정화시 생성된 모액을 재사용하는 하는 것을 생략한 것을 제외하고는, 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하여 순도 99% 이상의 고순도 D-사이코스를 생산하였고, 이때의 생산 수율은 20 % 이었다(도 3 참조).
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할것이다.
Claims (18)
- 과당을 D-사이코스 에피머화 반응시켜 D-사이코스 함유 용액을 생성하고,
상기 D-사이코스 함유 용액을 제1 냉각 및 이온 정제하고,
상기 정제된 D-사이코스 함유 용액을 제1 농축 및 제2 냉각하고,
제1 농축 및 제2 냉각된 D-사이코스 함유 용액을 크로마토그래피하여 과당 함유 모액과 D-사이코스 함유 분리액을 수득하고,
상기 D-사이코스 함유 분리액을 제2 농축 및 제3 냉각하여 D-사이코스 결정을 수득하는 것을 포함하며,
상기 크로마토그래피에서 생성된 과당 함유 모액을 상기 D-사이코스 에피머화 반응에 재사용하는 것을 포함하고,
상기 D-사이코스 결정화시 생성된 모액을, 제1 냉각 및 이온 정제, 상기 제1 농축 및 제2 냉각, 또는 크로마토그래피에 재사용하는 것을 포함하며,
상기 제1 냉각 및 제3 냉각은 용액 또는 주위 온도를 25℃ 내지 45℃의 범위로 냉각하는 것이고, 상기 제2 냉각은 용액 또는 주위 온도를 45℃ 내지 65℃의 범위로 냉각하는 것인 D-사이코스 제조 방법. - 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 D-사이코스 결정화시 생성된 모액을 상기 제1 냉각 및 이온 정제에 재사용하는 것을 추가로 포함하는, D-사이코스 제조 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 크로마토그래피가 연속식 크로마토그래피인, D-사이코스 제조 방법.
- 제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 크로마토그래피에서 생성된 과당 함유 모액 또는 상기 D-사이코스 결정화시 생성된 모액을 재사용 전 25℃ 내지 45℃의 범위로 냉각하는 것을 추가로 포함하는, D-사이코스 제조 방법.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 제1 냉각 및 제3 냉각은 용액 또는 주위 온도를 30℃ 내지 40℃의 범위로 냉각하는 것이고, 제2 냉각은 용액 또는 주위 온도를 50℃ 내지 60℃의 범위로 냉각하는 것인, D-사이코스 제조 방법.
- 제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 제1 농축은 상기 정제된 D-사이코스 함유 용액을 D-사이코스 농도가 50 brix 내지 70 brix의 범위가 되도록 하는 것이며, 상기 제2 농축은, 분리액 중 D-사이코스의 농도가 75 brix 이상이 되도록 하는 것인, D-사이코스 제조 방법.
- 제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 크로마토그래피에서 생성된 과당 함유 모액으로, 순도 70 %(w/w) 이상의 과당 함유 분획물을 사용하는, D-사이코스 제조 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 D-사이코스 결정화시 생성된 모액으로, 순도 90% (w/w) 이상의 D-사이코스 함유 분획물을 사용하는, D-사이코스 제조 방법.
- 제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 D-사이코스 에피머화 반응은, D-사이코스 에피머화 효소, 이의 변이체, 상기 효소를 생성하는 균주 또는 이의 배양물의 존재 하에서 40℃ 내지 70℃의 온도에서 반응시키는 것을 포함하는, D-사이코스 제조 방법.
- 제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 이온 정제가 강산성 양이온교환수지 또는 약염기성 음이온교환수지를 이용하는, D-사이코스 제조 방법.
- 제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 D-사이코스 함유 분리액은 D-사이코스를 93% (w/w) 이상 포함하는, D-사이코스 제조 방법.
- 제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 제1 내지 제3 냉각은 각각 열교환 냉각인, D-사이코스 제조 방법.
- 제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 수득된 D-사이코스 결정의 순도가 95% 이상인, D-사이코스 제조 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 수득된 D-사이코스 결정의 순도가 99% 이상인, D-사이코스 제조 방법.
- 제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 D-사이코스 결정의 수율이 75% 이상인, D-사이코스 제조 방법.
- 삭제
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