KR20110108185A - Ｄ-사이코스 결정을 제조하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 D-사이코스 용액으로부터 과포화를 이용하여 D-사이코스 결정을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

Ｄ-사이코스 결정을 제조하는 방법{Method of producing D-psicose crystals}

본 발명은 D-사이코스 용액으로부터 과포화를 이용하여 D-사이코스 결정을 제조하는 방법에 관한 것이다.

D-사이코스는 당밀이나 포도당의 이성화 반응과정 중에 극소량 존재하는 천연당으로 설탕 대비 70%의 감미도를 가진 단당류이다. D-사이코스는 과당이나 설탕과는 달리 인체 내에서 대사되지 않아 칼로리가 거의 없으며, 체지방 형성 억제 작용으로 체중 증가에 영향이 적은 감미료로 보고되고 있다(Matuo, T. et. al., Asia Pac . J. Clin . Nutr., 10, 233-237, 2001 ; Matsuo, T. and K. Izumori, Asia Pac . J. Clin . Nutr., 13, S127, 2004) .

최근에는 D-사이코스의 비우식 기능 및 항우식 기능에 대한 효과가 발표되어, 혈당에 영향이 없고, 비만을 유발시키지 않는다는 기존에 알려진 기능과 함께, 치아건강에 도움을 주는 소재로써, 설탕을 대체할 수 있는 감미료로의 개발이 활발하게 이루어지고 있다.

D-사이코스의 특성과 기능성으로 체중증가 방지용 감미료로서 식품산업 분야로부터 각광받고 있으나, 고온에서 과당으로부터 극소량 전환되기 때문에 화학적인 합성이 쉽지 않은 물질이다. 이에 과당과 D-타가토스 에피머화 효소를 반응시키거나, 과당과 D-사이코스 에피머화 효소를 반응시켜 대량 생산하는 방법이 보고되었으나, D-사이코스 수율이 저조하여 제조원가가 상승하는 문제점이 있다.

최근에 본 발명자들은 포도당을 과당으로 이성화한 후, 이를 D-사이코스 에피머화 효소를 생산하는 고정화 균체와 반응시켜 D-사이코스를 경제적으로 생산하는 방법을 보고하였다 (대한민국 특허출원 제10-2009-0118465호).

효소 반응에 의해 생산된 D-사이코스를 포함하는 반응액은 약 20 내지 30%의 D-사이코스 고형분을 포함하는 저순도 제품이기 때문에 고순도로 D-사이코스를 분리하는 것이 요구된다. 실제로 산업적으로 생산되는 소재들은 고순도로 분리하기 위해 다양한 방법들이 적용되고 있으며, 당의 경우 주로 크로마토그래피를 사용하여 고순도액을 만든 후, 결정화하여 제품을 생산하고 있다. D-사이코스의 경우, 아직 산업화된 사례가 없다.

D-사이코스를 분말 제형으로 제조하기 위해 D-사이코스의 반응액 중 미반응 과당을 효모로 발효시켜 제거한 후, 대량의 에탄올을 사용하는 방법이 보고되었다(Kei T. et . al., J. Biosci . Bioeng., 90(4), 453-455, 2000). 그러나, 대량의 에탄올 사용은 방폭 및 회수를 위한 고가의 설비를 필요로 하고 유기용매의 사용에 따른 교반기 고장 및 회수된 제품 중 이물질 유발 등과 같은 문제점을 수반한다. 또한 최종 제품이 미분 형태이기 때문에 탈수, 세척, 건조 중에 유실이 많고, 분말화 중 서로 흡착되면서 분말 사이에 불순물이 함유되어 최종 제품의 순도가 낮아진다. 생산된 미분형태의 제품은 무게에 비해 부피가 커져, 과대 포장으로 제조원가 상승 및 유통상의 추가 비용 발생으로 환경 문제를 가중시키며, 식품제조 공정에서는 소재의 흐름성이 낮아 식품 제조에 불리하다.

따라서, 에탄올 등 유기용매를 사용하지 않고, 경제적으로 D-사이코스를 제조하며, 제조 공정 중의 흐름성 및 제품으로서의 상품성을 개선하기 위해 미분 상태가 아닌 결정 상태의 순수한 D-사이코스를 제조하는 방법이 여전히 요구된다.

이에, 본 발명자들은 생물학적 전환이나 효소 반응에 의해 수득된 D-사이코스 용액으로부터 유기 용매를 사용하지 않고, 준안정 영역(metastable zone)의 과포화 상태를 유지하는 것에 의해 적절한 크기의 D-사이코스 결정을 제조하는 방법에 대한 연구를 수행하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 D-사이코스 용액의 포화 곡선과 과포화 곡선 사이의 범위에 존재하는 준안정 영역의 과포화 상태를 유지하는 것에 의해 의해 D-사이코스 결정을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은

D-사이코스 용액으로부터 불순물을 제거하여 정제된 D-사이코스 용액를 수득하는 단계;

상기 정제된 D-사이코스 용액를 농축시키는 단계;

상기에서 농축된 D-사이코스 용액을 준안정 영역(metastable zone)의 과포화 상태에서 결정화시키는 단계를 포함하는, 정제된 D-사이코스 결정을 제조하는 방법을 제공한다.

본 명세서에서 사용된 "과포화 상태"는 용질이 용매의 용해능력 이상으로 용해되어 있는 불안정한 상태로서, 용질이 고체로 석출될 수 있는 상태를 의미한다. 따라서, 결정화에 의해 용액 중의 용질을 분리하기 위해서는 과포화 상태가 반드시 필요하다. 일반적으로 용액의 과포화 상태는 외부조건, 불순물, 온도, 농도, pH 등에 의해 영향을 받을 수 있다.

본 명세서에서 사용된 "준안정 영역(metastable zone)"의 과포화 상태는 용액의 농도가 평형 농도, 즉, 포화 농도로부터 자발적으로 결정을 석출하는 최저 과포화까지의 범위를 의미한다. 이 영역의 농도에서 결정핵 형성(crystal nucleation)과 같은 결정화 현상은 일어나지 않으나, 과포화 농도이므로, 외부로부터 결정을 넣어주면 자발적으로 결정 성장(crystal growth)이 일어나서 결정 크기가 증가된다. 즉, 결정을 생성하기 위해 포화 농도 이상인 용액에 종정(seed)이 투입되면, 준안정 영역에서 종정이 성장하여 큰 결정을 형성한다. 결정화용 용액이 과도하게 농축되거나 급격하게 냉각되면 준안정 영역을 초과하는 과포화 상태가 되어, 결정의 성장이 아닌, 결정핵 형성이 일어나서 다수의 미세 결정이 형성된다. 따라서, 적절한 크기의 결정을 수득하기 위해서 결정화용 용액을 준안정 영역의 과포화 상태에서 유지시키면서 적절한 속도로 결정화를 진행시켜야 한다.

본 발명의 일 구체예에서, 출발물질인 D-사이코스 용액은 과당 또는 포도당으로부터 D-사이코스 에피머화 효소를 발현하는 코리네박테리움 속 균주 또는 그로부터 분리된 D-사이코스 에피머화 효소에 의해 제조된 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, D-사이코스 용액은 대한민국 특허출원 제2009-0118465호에 기재된 바와 같이, D-사이코스 에피머화 효소를 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰 KCTC 13032를 배양하여 수득된 균체 또는 균체로부터 분리된 효소를 소디움 알기네이트와 같은 고정화 담체에 고정화시킨 후, 과당을 기질로 공급하여 수득될 수 있다.

D-사이코스 용액으로부터 D-사이코스 결정을 수득하기 위해서 D-사이코스의 정제 및 결정화에 영향을 미칠 수 있는 다른 물질들을 제거하여 효율적인 결정화를 위해 필요한 상태를 형성해야 한다.

따라서, 본 발명에 따른 D-사이코스 결정을 제조하는 방법은 D-사이코스 용액으로부터 불순물을 제거하여 정제된 D-사이코스 용액를 수득하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 정제된 D-사이코스 용액을 수득하는 단계는 상기 D-사이코스 용액을 탈색제가 충진된 컬럼을 통과시켜 탈색시키는 단계; 상기에서 탈색된 D-사이코스 용액을 이온교환수지 크로마토그래피에 의해 탈염시키는 단계; 및 상기에서 탈염된 D-사이코스 용액을 칼슘 활성기가 부착된 이온교환수지가 충진된 컬럼을 통해 통과시켜 정제된 D-사이코스 용액을 수득하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 D-사이코스 용액을 탈염시키는 단계는 양이온 교환 수지가 충진된 컬럼, 음이온 교환 수지가 충진된 컬럼, 및 양이온 교환수지와 음이온 교환수지의 혼합물이 충진된 컬럼을 통과시키는 크로마토그래피에 의해 수행될 수 있다.

고순도의 D-사이코스를 정제하기 위해서 일반적으로 크로마토그래피에 의한 분리가 이용된다. D-사이코스 결정을 수득하기 위한 D-사이코스 용액 중 D-사이코스의 함량은 70 내지 85% 이상이어야 한다. 따라서, 결정화 단계 전에 D-사이코스를 정제하고 원하는 수준까지 농축해야 한다. D-사이코스 에피머화 효소에 의해 제조된 D-사이코스 용액 중 D-사이코스의 순도는 22% 정도로 낮기 때문에 직접 결정화를 수행할 수 없다. 고순도의 D-사이코스 결정을 수득하기 위해서 결정화 단계 전에 탈색 및 탈염에 의해 불순물을 제거하고 크로마토그래피, 예를 들면, 칼슘 활성기가 부착된 이온교환수지가 충진된 컬럼에서의 크로마토그래피에 의해 D-사이코스를 정제할 수 있다.

본 발명에 따른 D-사이코스 결정을 제조하는 방법은 정제된 D-사이코스 용액를 농축시키는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 정제된 D-사이코스 용액을 농축시키는 단계는 60 내지 70℃에서 수행될 수 있다. 농축액의 온도가 70℃보다 높아지면 D-사이코스의 열변성이 일어날 수 있으며, 60℃보다 낮아지면 원하는 수준의 농축을 달성하기 어렵다. 농축이 진행되면서 증발열에 의해 반응물의 온도가 급격히 증가되므로, 농축액의 온도를 70℃ 이하로 유지하면서 신속하게 농축해야 한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 D-사이코스를 농축시키는 단계는 65℃ 이하에서 수행될 수 있다.

본 발명에 따른 D-사이코스 결정을 제조하는 방법은 상기 농축된 D-사이코스 용액을 온도 및 농도를 조절하여 준안정 영역의 과포화 상태에서 결정화시키는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 결정화 단계에서 사용되는 농축된 D-사이코스 용액은 70 내지 85%(g/g) 이상의 D-사이코스 용액일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 결정화 단계에서 상기 농축된 D-사이코스 용액에 D-사이코스 종정(seed)이 상기 D-사이코스 용액 중의 D-사이코스 총량의 0.01 내지 1%(g/g)으로 첨가될 수 있다.

본 발명에서 D-사이코스 결정의 제조는 D-사이코스가 용액 중에서 용매와 평형 상태를 이루는 평형 농도 이상으로 존재하고 자발적으로 결정 성장이 일어나는 구간인 준안정 영역의 과포화 상태를 유지하는 것에 의해 수행된다. 본 발명에서 결정화를 위해 요구되는 과포화 상태는 D-사이코스 용액의 온도를 낮추거나 또는 D-사이코스 용액 중 D-사이코스의 농도를 변화시키는 것에 의해 유지될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 결정화 단계에서 일정 간격으로 시료를 채취하여 육안이나 현미경으로 관찰하거나 또는 시료의 원심분리로부터 수득된 상층액 중 당 농도를 분석하는 것에 의해 결정화의 경과를 모니터링하고, 그 결과에 따라 온도 또는 D-사이코스의 농도를 조절할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 결정화 단계는 D-사이코스 종정을 첨가한 후, 용액 중에서 D-사이코스 결정의 성장이 중지되거나 또는 D-사이코스 용액의 농도가 변화하지 않는 시점에 온도를 낮추는 것에 의해 준안정 영역의 과포화 상태를 유지하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 결정화 단계는 D-사이코스 종정을 첨가한 후, 약한 교반, 예를 들면, 10 rpm으로 교반하면서 결정을 성장시키며, 상기 용액 중의 D-사이코스의 농도를 조절하여 D-사이코스가 준안정 영역의 과포화도 이상으로 농축되면 상기 용액보다 낮은 농도의 D-사이코스 용액을 첨가하여 준안정 영역의 과포화 상태를 유지하는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 결정화 단계에서 D-사이코스 용액의 준안정 영역의 과포화 상태를 유지하기 위해 첨가되는 D-사이코스 용액은 과포화도 이상으로 농축된 D-사이코스 용액보다 낮은 농도의 D-사이코스를 포함하며, 예를 들면, 60 내지 70%의 D-사이코스 용액일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 결정화 단계에서 과포화 상태는 포화 농도와 포화 농도보다 6%(g/g 용액) 더 높은 농도 범위에 존재할 수 있다.

과포화 농도는 물질의 고유한 특성으로 포화 농도를 냉각하거나 농축하여 얻어질 수 있다. 고농도로 농축한 용액을 포화 농도를 유지하는 온도로 조절한 후, 서서히 냉각하다가 일정 온도 또는 상태에 도달하면 미세결정이 생성되는 불안정한 상태에 도달하는데 이때의 농도 및 온도를 각각 과포화 농도 및 과포화 온도로 정의할 수 있다. 과포화 농도에 도달한 용액에 탈이온수를 첨가하고, 재가열하여 미결정을 빠르게 용해시킨 후, 희석된 농도에서의 포화 온도로 조절하며, 이를 재차 냉각하여 미결정이 생성되는 과포화농도를 규명할 수 있다. 다양한 포화 농도에서 희석과 가열, 및 재냉각을 반복하여 물질의 준안정 영역(metastable zone)을 규명할 수 있다. D-사이코스도 고유한 준안정 영역의 농도 범위를 가지며, 포화 농도 이상 내지 포화 농도보다 약 6% 높은 구간인 것으로 확인되었다. D-사이코스의 준안정 영역을 유지하면서 결정화를 수행하여 모양이 안정적이고 크기가 큰 결정을 획득할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 본 발명에 따른 D-사이코스 결정을 제조하는 방법은 상기 결정화 단계에서 수득된 D-사이코스 결정을 원심분리에 의해 회수하고, 탈이온수로 세척한 후, 건조시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 결정의 건조는 유동층 건조기 또는 진공 건조기에서 수행될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 정제된 D-사이코스 결정은 0.1 mm 내지 0.2 mm의 크기를 가질 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 정제된 D-사이코스 결정은

효소 반응 등에 의해 생산된 D-사이코스 용액을 40% (g/g 용액) 농도로 농축하여 60℃에서 GAC (Granulated active carbon) 탈색제가 충진된 컬럼을 2시간당 8m의 선속도로 통과시켜 탈색하는 단계;

탈색된 D-사이코스 용액을 각각 양이온 교환수지, 음이온 교환수지, 및 양이온과 음이온교환수지가 혼합된 수지가 충진된 40℃의 컬럼을 시간당 이온 교환수지 부피의 2배 속도로 주입하여 탈염시키는 단계;

탈색 및 탈염으로 정제된 D-사이코스 용액을 60% (g/g 용액)로 농축시킨 후, 칼슘 활성기가 부착된 이온교환수지로 충진된 분리 컬럼을 통과시켜 과당과 사이코스를 분리하는 단계;

분리된 D-사이코스 용액을 70℃ 이하인 조건에서, 농축기를 이용하여, 85% (g/g 용액) 이상까지 농축하는 단계;

농축된 D-사이코스 용액에 D-사이코스 종정을 용해된 총 D-사이코스 양의 0.01 내지 1% (g/g)로 주입한 후, 온도와 농도를 조절하여 준안정 영역의 과포화 상태에서 결정화하는 단계; 및

생성된 D-사이코스 결정을 원심 분리에 의해 결정 모액으로부터 분리하고, 결정 모액 및 D-사이코스 결정을 세척하며, 유동층 건조기 또는 진공건조기를 이용하여 건조하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다.

이하 본 발명을 구체적인 실시예에 의해 보다 상세히 설명하고자 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 제조방법을 이용하여, D-사이코스 용액으로부터 유기 용매를 사용하지 않는 경제적인 결정화 공정을 통해 순수하고 산업적 적용에 적합한 형태의 D-사이코스 결정을 제조할 수 있다.

도 1은 온도에 따른 순수한 D-사이코스의 포화 곡선과 과포화 곡선을 보여준다.
도 2는 80% (g/g 용액) 농도에서 온도에 따른 D-사이코스의 잔존량을 보여준다.
도 3은 생산된 D-사이코스의 종정을 현미경으로 관찰한 결과를 보여준다.
도 4는 본 발명의 일 구체예에 따라, 온도 조절에 의해 생산된 D-사이코스 결정을 현미경으로 관찰한 결과를 보여준다.
도 5는 본 발명의 일 구체예에 따라, 진공 농축에 의해 생산된 D-사이코스 결정을 현미경으로 관찰한 결과를 보여준다.

실시예 1: 코리네박테리움 속 미생물을 이용한 저순도 D- 사이코스 용액 생산

대한민국 특허출원 제10-2009-0118465호에 개시된 바와 같이, 코리네박테리움 글루타미쿰 KCTC 13032의 발효 배양 및 상기 미생물 또는 그로부터 분리된 D-사이코스 에피머화 효소가 고정화된 담체에 의한 과당의 D-사이코스로의 전환을 포함하는, D-사이코스를 연속 생산하는 방법에 의해 D-사이코스를 제조하였다. 상기 방법에 의해 제조된 D-사이코스 용액 중 D-사이코스의 양은 약 22%로 직접 결정화하기에는 낮은 농도였다.

실시예 2: 저순도 D- 사이코스 용액 정제

실시예 1에서 생산된 D-사이코스 용액을 40% (g/g 용액)로 농축한 후, 입자상 활성탄소(granulated active carbon)가 충진된 탈색 컬럼을 통과시켜 농축액 내의 유색물질을 제거하였다.

실시예 1에서 생산된 D-사이코스 용액의 D-사이코스 순도는 고형분비 22%로 매우 낮아 결정화하기에는 적합하지 않았다. 결정화를 위해서는 결정화 대상 물질의 순도를 70 내지 90% 이상으로 높여야 한다. 크로마토그래피에 의한 D-사이코스의 효율적인 분리를 위해서는 D-사이코스 용액 중의 이온이 제거되어야 한다. 분리 대상 용액 내에 이온 성분이 존재하면 이온 성분과 분리 수지의 활성기가 치환되어, 분리능이 저하되므로, 분리 수지를 이용한 반복적인 분리가 불가능하다. 따라서, 상기에서 준비된 탈색된 D-사이코스 용액을 수소기로 치환된 양이온교환수지와 수산화기로 치환된 음이온교환수지가 충진된 컬럼을 통과시킨 후, 최종 단계에서 양이온 교환수지 및 음이온 교환수지가 혼합 충진된 이온교환 컬럼을 통과시켜, 상기 용액 중의 이온성분을 제거하였다. 이온성분 제거의 확인은 전기전도계로 측정하였으며, 단위 cm 당 10 마이크로 지맨스 이하가 되도록 조절하였다.

실시예 3: 크로마토그래피를 이용한 고순도 D- 사이코스 용액 제조

상기 실시예 2에서 탈색 및 탈염으로 유색 물질 및 이온 성분 등의 불순물을 제거한 저순도 D-사이코스 용액을 60% (g/g 용액)까지 농축하여 칼슘기로 치환시킨 이온교환수지 (Purolite PCR 642 K)에 통과시켜 정제된 D-사이코스 용액을 수득하였다.

상기 이온교환수지 컬럼 내에 충진된 이온교환 수지의 양은 200L였고, 통과시킨 시료, 즉, 실시예 2에서 제조된 정제된 D-사이코스 용액의 양은 회당 20L였으며, 운전 온도는 60℃였다. 시료를 주입하고 시간당 260L의 탈이온수로 용출시킨 후, 수득된 각 분획에서 HPLC 시스템(HP, Agilent 1200series)으로 과당과 D-사이코스의 당 농도를 측정하였다. 순수한 D-사이코스 분획을 취하였으며, 과당이 섞인 분획은 농축하여 다시 분리대상 시료로 사용하였다. HPLC 분석 컬럼은 칼슘기로 치환된 컬럼 (Bio Rad사)을 이용하였고, 탈이온수를 분당 0.5mL로 흘려주었다.

실시예 4: D- 사이코스 용액의 농축

결정화를 위해 필요한 D-사이코스 농축액을 얻기 위해, 상기 실시예 3에서 순수분리된 D-사이코스 용액을 진공농축기(EYELA사, N-11)에 넣고 80%(g/g 용액) 까지 농축하였다. 농축된 액을 각각 분주하여 70℃, 65℃, 및 60℃의 항온수조에 방치한 후, 시간에 따라 시료를 채취하여, 농축액 내 D-사이코스의 잔존량을 측정하였다. 그 결과가 도 2에 도시된다. 농축액의 온도가 70℃ 이상이 되면 3시간 이후 D-사이코스의 열 변성이 일어났으며, 22시간 후에는 초기양 대비 78%만이 잔존하는 것으로 확인되었다. 농축과정 중 증발열에 의해 내부의 온도는 40℃ 이하를 유지하나, 농축에 의해 D-사이코스의 양이 80% (g/g 용액) 이상이 되면 온도가 급격히 증가한다. 이와 같은 결과로부터, D-사이코스를 80% (g/g 용액) 이상으로 농축하는 경우, 내부 농축액의 온도를 70℃ 이하로 신속히 낮추거나, 바람직하게는 65℃ 이하에서 농축 단계를 수행하는 것이 필요하다는 것을 확인하였다.

실시예 5: D- 사이코스 종정의 제조

상기 실시예 3에 의해 정제 분리된 D-사이코스 용액(D-사이코스 1000g 함유)을 수득한 후, 이를 실시예 4의 방법에 의해 85% (g/g 용액)로 농축하였다. 순도 95% 시약 제품 (Sigma사) 1g를 구입한 후, 막자 사발에 넣고 분쇄한 후, 이를 에탄올 용액과 혼합하였다. 2중 자켓이 장착된 2L 반응조가 달린 반응기 시스템 (IKA사, LR-2. ST)을 결정기(crystallizer)로 이용하고, 결정기 내 농축액의 초기 온도를 50℃로 조절하였으며, 제조한 95% 순도의 D-사이코스 에탄올 용액을 종정으로 첨가한 후 100rpm의 속도로 교반시켰다. 결정 모액과 종정의 혼합된 상태를 확인한 후, 교반 속도를 10rpm으로 재조절하고, 시간당 1℃씩 냉각시켰다. 현미경을 사용하여 D-사이코스의 결정의 갯수가 급격히 증가하는 농도를 구하였다. 이 상태를 과포화도로 예측하였고, 이후 온도를 유지하여 결정을 성장시키면서, 현미경 관찰 및 당 농도계를 사용하여 분석하여 결정이 성장하지 않거나, 상등액의 당 농도가 변화하지 않으면 1℃씩 냉각시켰다. 33℃까지 냉각시킨 후, 수득된 최종 결정 상태가 도 3에 도시된다. 33℃에서 냉각을 중지하고, 원심분리에 의한 탈수 및 세척, 건조를 통해 D-사이코스 종정을 획득하였다. 획득한 최종 종정은 직경 0.04 mm 내지 0.10 mm의 범위에 분포하였고, 건조 무게는 초기 수용액 중에 존재한 D-사이코스 무게 대비 40%였다.

실시예 6: D- 사이코스 포화 농도와 과포화 농도 측정

상기 실시예 3 내지 실시예 5를 반복하여 순수한 D-사이코스를 획득하였다. 제조된 D-사이코스를 용해시켜 온도에 따른 포화 곡선을 측정하였다. 30℃에서 시작하여, D-사이코스를 소량씩 첨가하여 더 이상 녹지 않는 농도를 해당 온도에서의 포화농도로 규정하였으며, 최종 80℃까지 작업을 수행하여 도 1에 도시된 D-사이코스 포화곡선을 작성하였다.

또한, D-사이코스를 용해시켜 85%(g/g 용액) 까지 농축시킨 후, 결정기에 넣고 서서히 냉각을 진행하여 미세결정이 급격히 생성되는 온도를 구하였다. 탈이온수를 첨가하여 포화 농도를 변화시킨 후, 반복 냉각 실험으로 각각의 포화 온도에 따른 과포화 농도를 측정하여 도 1에 도시된 D-사이코스 과포화 곡선을 작성하였다.

실시예 7: 온도 변화를 이용한 D- 사이코스 결정화

상기 실시예 3에 의해 순수 분리된 D-사이코스 용액(D-사이코스 2,780g 함유)을 수득한 후, 이를 85% (g/g 용액)까지 농축하고, 결정기에 넣고 50℃로 유지되도록 조절하였다. 실시예 5에서 수득한 종정을 막자사발에 넣고 분쇄하였으며, 이를 에탄올과 혼합하였다. 상기 결정화를 위해 농축된 D-사이코스 용액 중의 D-사이코스 대비 0.3% (w/w)되도록 D-사이코스 에탄올 용액을 종정으로 투입한 후, 교반기를 100rpm으로 교반시켜 종정이 농축액에 전체적으로 고르게 분포되게 하였다. 이후 교반기 속도를 10rpm으로 낮추고, 시간에 따라 시료를 추출하여 결정 갯수의 증가 및 결정의 크기 변화를 현미경으로 관찰하고, 1.5 mL 마이크로튜브를 이용하여 원심분리한 후, 상등액의 농도는 당농도계로 측정하고, 상등액의 순도는 HPLC 로 측정하였다.

결정 크기의 변화 또는 상등액의 농도 변화가 없는 온도 (포화농도)에 도달하면, 결정기의 온도를 1℃씩 냉각하여 D-사이코스 용액이 포화 농도와 과포화 농도 사이의 영역에 존재하도록, 즉 준안정 영역의 과포화 상태를 유지하게 하였다.

급격한 냉각에 의해 D-사이코스 결정화 용액이 과포화 영역으로 이동하면 미세결정이 생성되기 시작하고 이는 종정의 양이 많아지는 결과로 나타나며, 결국은 결정의 크기가 작아지는 결과를 유발한다. 결정의 크기가 작으면 원심분리에 의한 탈수가 용이하지 않기 때문에 실제 공정에 적용할 수 없다.

최종 상등액의 농도가 74% (g/g 용액)가 될 때까지 냉각하였으며, 이때의 결정 상태가 도 4에 도시된다. 결정화가 완료된 용액을 고속원심 탈수기에 넣고 4,000rpm에서 10분간 회전시켜, 상등액은 유출시키고, 결정만 회수한 후, 탈수 중 탈이온수를 분무형태로 가하여 결정 외부의 상등액을 세척하였다. 탈수 후 회수된 D-사이코스를 유동층 건조기나 진공 건조기로 이동시켜 결정을 건조시켰다. 건조 후 D-사이코스 결정의 양은 1,408g으로 초기 용해된 D-사이코스 2,780g 대비 약 50% 회수된 것으로 확인되었다. 결정크기는 0.1 mm 내지 0.2 mm로 확인되었고, 시판되는 과당이나 설탕에 비해 약 1/2정도의 크기에 해당했다.

실시예 8: 농도 변화를 이용한 D- 사이코스 결정화

상기 실시예 3에 의해 순수 분리된 D-사이코스 용액으로부터 고형분 5,000g을 수득한 후, 이 중 2/3는 60% (g/g 용액)로 농축하고, 1/3은 80% (g/g 용액)로 농축하였다. 농도 80% (g/g 용액) 농축액을 10L 부피의 플라스크를 장착한 농축기(EYELA사, N-11)에 넣고 10rpm으로 교반하면서 농축시켰다. 진공을 이용하여 플라스크 내부로 실시예 5에서 제조된 종정인 D-사이코스 에탄올 용액을 0.3%(g/g) 첨가하고, 내부에는 온도계를 장착하여 내부 온도의 변화를 측정하였다. 농축이 진행됨에 따라, 결정이 성장하였으며, 시간에 따라 시료를 추출하여 결정 갯수의 증가, 결정의 크기 변화를 현미경으로 관찰하고, 1.5mL 마이크로튜브를 이용하여 원심분리한 후, 상등액의 농도는 당농도계로 측정하고, 상등액의 순도는 HPLC 로 측정하였다. 때때로 과포화도 이상으로 농축되어, 미세결정이 생성되어 결정 크기가 작아지는 현상이 발생하였다. 이와 같은 경우에는 미리 제조한 60% (g/g 용액)의 저농도 D-사이코스 용액을 주입하여 생성된 미세결정을 용해시키고, 결정의 성장으로 낮아진 결정 모액의 순도를 높이는 효과를 동시에 얻을 수 있었다.

시료를 추출하여 원심분리한 후, 더 이상 결정 크기에 변화가 없다면 진공을 제거하고 40℃에서 12시간 방치하였으며, 이때의 결정 상태가 도 4에 도시된다. 결정화가 완료된 용액을 고속원심 탈수기에 넣고 4,000rpm에서 10분간 회전시켜, 상등액은 유출시키고, 결정만 회수하였으며, 탈수 중 탈이온수를 분무형태로 가하여 결정 외부의 상등액을 세척하였다. 탈수 후 회수된 D-사이코스 결정을 유동층 건조기나 진공 건조기로 이동시켜 건조시켰다. 건조 후 결정의 양은 2,650g였으며, 용해된 D-사이코스 5,000g 대비 약 53% 회수된 것으로 나타났다. 결정크기는 0.1 mm 내지 0.2 mm로 나타났으며, 온도변화를 이용한 결정과 비교할 때, 길이가 약간 길어진 모양으로 차이가 있었다.

이상을 통해 본 발명의 바람직한 실시예에 대해 기술하였으나, 모든 면에서 예시적인 것이며, 이에 한정하는 것이 아닌 것으로 이해해야 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형 가능한 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (8)

1. D-사이코스 용액으로부터 불순물을 제거하여 정제된 D-사이코스 용액를 수득하는 단계;
   상기 정제된 D-사이코스 용액를 농축시키는 단계;
   상기에서 농축된 D-사이코스 용액을 준안정 영역(metastable zone)의 과포화 상태에서 결정화시키는 단계를 포함하는, 정제된 D-사이코스 결정을 제조하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 정제된 D-사이코스 용액을 수득하는 단계는
   상기 D-사이코스 용액을 탈색제가 충진된 컬럼을 통과시켜 탈색시키는 단계;
   상기에서 탈색된 D-사이코스 용액을 이온교환수지 크로마토그래피에 의해 탈염시키는 단계; 및
   상기에서 탈염된 D-사이코스 용액을 칼슘 활성기가 부착된 이온교환수지가 충진된 컬럼을 통해 통과시켜 정제된 D-사이코스 용액을 수득하는 단계를 포함하는 것인 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 정제된 D-사이코스 용액을 농축시키는 단계는 60 내지 70℃에서 수행되는 것인 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 결정화 단계에서 상기 농축된 D-사이코스 용액에 D-사이코스 종정(seed)이 상기 농축된 D-사이코스 용액 중의 D-사이코스 총량의 0.01 내지 1%(g/g)으로 첨가되는 것인 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 결정화 단계에서 사용되는 농축된 D-사이코스 용액은 70%(g/g) 이상의 D-사이코스 용액인 것인 방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 결정화 단계에서 결정화의 진행을 모니터링하여 D-사이코스 결정의 성장이 중지되거나 또는 D-사이코스 용액의 농도가 변화하지 않는 시점에 온도를 낮추는 것에 의해 준안정 영역의 과포화 상태를 유지하는 것인 방법.
7. 제1항에 있어서, 상기 결정화 단계에서 결정화의 진행을 모니터링하여 상기 용액 중의 D-사이코스가 과포화도 이상으로 농축되면 상기 용액보다 낮은 농도의 D-사이코스 용액을 첨가하여 준안정 영역의 과포화 상태를 유지하는 것인 방법.
8. 제1항에 있어서, 상기 결정화 단계에서 준안정 영역의 과포화 상태는 포화 농도와 포화 농도보다 6%(g/g 용액) 더 높은 농도 범위에 존재하는 것인 방법.

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