JP2876416B2

JP2876416B2 - Ｄ―プシコースの製造方法

Info

Publication number: JP2876416B2
Application number: JP2021396A
Authority: JP
Inventors: 健何森; 桂二津▲崎▼
Original assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Current assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Priority date: 1990-01-31
Filing date: 1990-01-31
Publication date: 1999-03-31
Anticipated expiration: 2014-03-31
Also published as: JPH03228687A

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、Ｄ−プシコースを製造方法に関するもので
あり、更に詳細には、アルカリゲネス属に属し、Ｄ−ガ
ラクチトール、Ｄ−タガトースおよびＤ−タリトールか
ら選ばれる一種以上の糖質からＤ−プシコース産生能を
有する細菌を用いて、Ｄ−ガラクチトール、Ｄ−タガト
ースおよびＤ−タリトールから選ばれる一種以上の糖質
からＤ−プシコースを製造する方法に関するものであ
る。

［従来の方法］Ｄ−プシコースは、ケトヘキソースに分類される単糖
類である。その製造方法としては、有機化学的手法によ
って、常法通り、Ｄ−アルトロースまたはＤ−アロース
をカセイソーダ、ピリジンなどのアルカリ性薬剤の共存
下で異性化させ、Ｄ−プシコースを製造することは原理
的には可能である。しかし、実際には、原料となるＤ−
アルトロースまたはＤ−アロースを得ることが困難であ
るため、充分量のＤ−プシコースを合成する適当な方法
は現在までに報告されていない。

Ｄ−プシコースの自然界における存在はアジサイ科ズ
イナ（Itea japonica Oliver）中に、また抗生物質プシ
コフラニン（psicofuranine）の成分として知られてい
る。しかし、一般的には殆ど存在しない希少糖質であ
る。

［発明が解決しようとする課題］近年、生化学工業が急速に発達し、糖質化学の分野に
おいても、新たな糖質の開発が望まれている。Ｄ−プシ
コースは、試薬として少量市販されているものの、その
大量製造方法が確立されておらず、未だ、食品工業、医
薬品工業、化学工業などの工業原料として使用されるに
至っていない。

［課題を解決するための手段］本発明者は、Ｄ−プシコースを生化学的手段により大
量、安価に製造することを目的に鋭意研究した。

その結果、アルカリゲネス属に属し、Ｄ−ガラクチト
ール、Ｄ−タガトースおよびＤ−タリトールから選ばれ
る一種以上の糖質からＤ−プシコース産生能を有する細
菌を、Ｄ−ガラクチトール、Ｄ−タガトースおよびＤ−
タリトールから選ばれる一種以上の糖質を含有する水溶
液に接触させて、Ｄ−プシコースを生成せしめ、これを
採取することにより、容易に、高収率でＤ−プシコース
を製造し得ることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明において、Ｄ−ガラクチトール、Ｄ
−タガトースおよびＤ−タリトールから選ばれる一種以
上の糖質からＤ−プシコースを製造するのに使用される
細菌は、アルカリゲネス属に属し、Ｄ−ガラクチトー
ル、Ｄ−タガトースおよびＤ−タリトールから選ばれる
一種または二種以上の糖質からＤ−プシコース産生能を
有する細菌である。その一例としては、後に説明するア
ルカリゲネス・デニトリフィカンス・サブスピーシーズ
・キシロソキシダンス（Alcaligenes denitrificans su
bsp.xylosoxydans）701Aまたは、これの変異株などが有
利に利用できる。

アルカリゲネス・デニトリフィカンス・サブスピーシ
ーズ・キシロソキシダンス 701Aは、平成２年１月19日
付で、工業技術院微生物工業技術研究所に、微生物受託
番号FERM BP−2735として寄託されている。

このアルカリゲネス・デニトリフィカンス・サブスピ
ーシーズ・キシロソキシダンス 701A（FERM BP−2735）
の菌学的性質を以下に記載する。

A.採集地及び分離源採集地香川県木田郡三木町分離源土壌 B.細胞の形態（１）細胞の形及び大きさ短桿菌 0.8乃至0.9×1.2乃至1.3μｍ（２）細胞の多形性の有無無（３）運動性の有無有（４）鞭毛の有無有（５）胞子の有無無（６）グラム染色性陰性（７）坑酸性無 C.各培地における生育状況（１）肉汁寒天平板培養（28℃、２日）コロニーは、不透明な湿光を帯びた黄白色の円形で、
表面は平滑であり、半レンズ状の隆起をしている。周縁
は全縁で内容は均質である。色素は形成しない。

（２）肉汁ゼラチン穿刺培養（20℃および28℃、５
日）培養表面に穿刺部を中心にコロニーが形成され、液化
しない。

D.生理学的性質（１）硝酸塩の還元陽性（２）脱窒反応陽性（３）MRテスト陽性（４）VPテスト陰性（５）インドールの生成陰性（６）硫化水素の生成陽性（７）デンプンの加水分解陰性（８）クエン酸の利用陽性（９）色素の生成生成せず（10）ウレアーゼ陽性（11）オキシダーゼ陽性（12）カタラーゼ陽性（13）生育の範囲生育pH ５乃至９生育温度 20乃至37℃ （14）酸素に対する態度好気性（15）Ｏ−Ｆテスト糖（グルコース）を好気低条件下でのみ酸化する。

（16）糖類から酸の生成Ｌ−アラビノース＋Ｄ−キシロース＋Ｄ−グルコース＋Ｄ−マンノース＋Ｄ−フラクトース＋Ｄ−ガラクトース＋マルトース − ショ糖 − 乳糖 − トレハロース − Ｄ−ソルビトール − Ｄ−マンニトール − Ｄ−ガラクチトール − イノシトール＋グリセロール＋（17）炭素源の資化性Ｄ−グルコース＋Ｄ−キシロース＋Ｄ−ソルビトール＋Ｄ−フラクトース＋酢酸＋本菌株は、上述の菌学的性質から、ウイリアムズ・ア
ンド・ウィルキンズ（Williams ＆ Wilkins）社、「バ
ージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バク
テリオロジー（Bergey′s Manual of Systematic Bacte
riology）」、第１巻（1984年）に準じて分類すれば、
グラム陰性、好気性の短桿菌であり、胞子を形成せず、
運動性あり、色素を生成せず、また、カタラーゼおよび
オキシダーゼが陽性であることからクロモバクテリウム
・リビダム（Chromobacterium lividum）あるいはアル
カリゲネス（Alcaligenes）の可能性が考えられる。本
菌は嫌気的条件下で硝酸塩に生育できることから、アル
カリゲネス・デニトリフィカンス（Alcaligenes denitr
ificans）に属すると考えられる。Ｄ−グルコース、Ｄ
−キシロース、酢酸塩に生育すること、Ｄ−グルコー
ス、Ｄ−キシロースなどの糖から酸を生成することか
ら、アルカリゲネス・デニトリフィカンス・サブスピー
シーズ・キシロソキシダンス（Alcaligenes denitrific
ans subsp.xylosoxydans）と同定され、アルカリゲネス
・デニトリフィカンス・サブスピーシーズ・キシロソキ
シダンス701Aと命名された。

本発明でいう、アルカリゲネス属に属し、Ｄ−ガラク
チトール、Ｄ−タガトースおよびＤ−タリトールから選
ばれる一種以上の糖質からＤ−プシコース産生能を有す
る細菌を、Ｄ−ガラクチトール、Ｄ−タガトースおよび
Ｄ−タリトールから選ばれる一種以上の糖質を含有する
水溶液に接触させてＤ−プシコースを生成せしめ、これ
を採取するとは、Ｄ−ガラクチトール、Ｄ−タガトース
およびＤ−タリトールから選ばれる一種以上の糖質から
Ｄ−プシコース産生能を有する、例えば、アルカリゲネ
ス・デニトリフィカンス・サブスピーシーズ・キシロソ
キシダンス 701A（FERM BP−2735）、または、この変異
株などの細菌をＤ−ガラクチトール、Ｄ−タガトースお
よびＤ−タリトールから選ばれる一種以上の糖質を含有
する栄養培地で培養し、望ましくは、振盪、通気撹拌な
どの好気的条件下で培養し、培養液中にＤ−プシコース
を生成せしめ、これを採取するか、または、このように
して培養した後、得られる細菌（生菌体）を用いて水溶
液中のＤ−ガラクチトール、Ｄ−タガトースおよびＤ−
タリトールから選ばれる一種以上の糖質をＤ−プシコー
スに変換する。望ましくは、振盪、通気撹拌、酸素の圧
入などの好気的条件下で変換させ、生成するＤ−プシコ
ースを採取すればよい。

培養方法としては、アルガリゲネス属に属する細菌が
必要とする栄養源、例えば、炭素源、窒素源、無機塩な
どを含有する培地、望ましくは、微酸性乃至微アルカリ
性の液体培地に、Ｄ−ガラクチトール、Ｄ−タガトース
およびＤ−タリトールから選ばれる一種以上の糖質から
Ｄ−プシコース産生能を有する細菌を植菌し、温度約20
乃至35℃で、１乃至15日間好気的条件下で培養すればよ
い。とりわけ、Ｌ−ソルボース、Ｄ−ガラクチトール、
Ｄ−タガトースおよびＤ−タリトールなどの糖質ととも
に各種栄養源を含有する液体培地で好気的に培養するの
が望ましい。

前述のような培養方法によって得られた細菌（生菌
体）を、Ｄ−ガラクチトール,D−タガトースおよびＤ−
タリトールから選ばれる一種以上の糖質を含有する水溶
液と接触、望ましくは、好気的条件下で接触させ、Ｄ−
プシコースに変換させることができる。また、この際、
比較的安価なＤ−ガラクチトールを原料としてもＤ−ダ
カトース、Ｄ−タリトールを経てＤ−プシコースに変換
されるので好都合である。

この変換に用いられる細菌は、培養液から分離された
生菌体そのままの状態に限る必要はなく、例えば、生菌
体を半透膜製のホローファイバーに封入した細菌、寒
天、ゼラチン、アルギン酸塩などで包括し、ビーズ状、
シート状などの各種形状に固定化した細菌などとして、
Ｄ−ガラクチトール、Ｄ−タガトースおよびＤ−タリト
ールから選ばれる一種以上の糖質からＤ−プシコースへ
の変換に、繰り返し利用することも好都合である。

以上述べた各種の方法により生成、蓄積したＤ−プシ
コースを含有する水溶液は、適当な分離方法、例えば、
遠心分離、濾過などの方法によって細菌と分離され、採
取される。

得られたＤ−プシコース液は、必要により、例えば、
硫安塩析、水酸化亜鉛吸着などによる除蛋白、活性炭吸
着による脱色、Ｈ型、OH型イオン交換樹脂による脱塩な
どの方法で精製し、濃縮してシラップ状のＤ−プシコー
ス製品を採取することができる。また、更に、イオン交
換樹脂を用いるカラムクロマトグラフィー、例えばダウ
ケミカル社製造の商品名ダウエックス50W−X4、ダウエ
ックスWGR、東京有機化学工業株式会社製造の商品名ア
ンバーライトXT−1008、アンバーライトIRA47、三菱化
成工業株式会社製造の商品名ダイヤイオンSK106、ダイ
ヤイオンWA11などを用いるカラムクロマトグラフィーで
分画、精製することにより99％以上の高純度の標品も容
易に得ることができる。

このようにして製造されるＤ−プシコースは、通常、
Ｄ−ガラクチトール、Ｄ−タガトースおよびＤ−タリト
ールから選ばれる一種以上の原料糖質に対し約50W/W％
以上の高収率で得られ、大量、安価に供給する工業的製
造方法として好適である。

従って、Ｄ−プシコースの用途も、従来のように試薬
用途に限定されることなく、食品工業、医薬品工業、化
学工業などの原料、中間体などとして自由に利用でき
る。

以下、実施例について述べる。

実施例１硫酸アンモニウム0.2W/V％、リン酸一カリウム0.24W/
V％、リン酸二カリウム0.56W/V％、硫酸マグネシウム・
７水塩0.01W/V％、酵母エキス0.5W/V％、Ｌ−ソルボー
ス2W/V％及び脱イオン水からなる培養液100mLずつを500
mL容振盪フラスコ20本にとり、120℃で20分間オートク
レーブした後、アルカリゲネス・デニトリフィカンス・
サブスピーシーズ・キシロソキシダンス 701A（FERM BP
−2735）を１白金耳ずつ植菌し、30℃で７日間振盪培養
した。

培養後、遠心分離により集菌し、得られた生菌体約20
gをＤ−ガラクチトール2W/V％を含有する0.05Mリン酸塩
緩衝液（pH7.0）1Lに加え混合し、この混合液約100mLず
つを500mL容振盪フラスコに分注し、30℃２日間振盪
し、Ｄ−ガラクチトールをＤ−プシコースに変換させ
た。次いで遠心分離して細菌を除去した。

得られた上清に25W/V％硫酸亜鉛を1/10容加えpH7.6に
調整し、遠心分離して上清を採取したこの上清を、常法
に従って、活性炭を用いて脱色し、次いで、ダイヤイオ
ンSK1B（Ｈ型、三菱化成工業株式会社製造の商品名）お
よびダイヤイオンWA30（OH型、三菱化成工業株式会社製
造の商品名）を用いて脱塩し、減圧濃縮して濃度約60％
の透明なシラップを得た。

これをダウエックス50W−X4（カルシウム型のカチオ
ン交換樹脂、ダウケミカル社製造の商品名）を用いるカ
ラムクロマトグラフィーにより精製、濃縮して高純度に
精製されたＤ−プシコースシラップを採取した。

Ｄ−プシコースのＤ−ガラクチトールに対する収率
は、固形物当り約70％であった。

このようにして得られた製品を同定するため、Sigma
社が市販している試薬Ｄ−プシコースと、その理化学的
性質を比較実験した。この実験においては、Sigma社の
試薬Ｄ−プシコースを標準Ｄ−プシコースと呼び、本発
明の方法で得られたＤ−プシコースを本製品と呼ぶ。

（１）高速液体クロマトグラフィーによる分析本製品を高速液体クロマトグラフィー（日本分光工業
社製880−PU;カラム、日立製作所GL−C611;溶離液、10
^-4M水酸化ナトリウム、60℃；流速、1mL/min;検出、島
津製作所RID−6A）で分析したところ、その溶出位置
は、標準のＬ−ソルボース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−タ
ガトースなどのケトヘキソースとは異り、標準Ｄ−プシ
コースと同一の28.7分であった。

（２）¹³C−NMRによる測定本製品の¹³C−NMRによる測定を、バイオケミストリー
（Biochemistry）、第13巻、第146乃至153頁（1974年）
に記載している方法に準じて行ったところ、そのケミカ
ルシフトは、全てのシグナルについて、標準Ｄ−プシコ
ースのそれとよく一致した。また、そのケミカルシフト
は、下記の表に示すごとく、前記文献の値ともよい一致
を見た。

（３）比旋光度の測定本製品値 ▲［α］²⁰ _D▼＝＋2.9（Ｃ＝10％、inH
₂O）文献値 ▲［α］²⁰ _D▼＝＋3.1（Ｃ＝10％、inH
₂O）以上の結果から明らかなように、本発明の方法で得ら
れた製品は、Ｄ−プシコースであると判断される。

本製品は、希少糖質としての試薬のみならず、食品工
業、医薬品工業、化学工業などの原料、中間体などとし
ても有利に利用できる。

実施例２実施例１の培養液のうち、Ｌ−ソルボースをＤ−ガラ
クチトールに置き換えた以外は、実施例１と同組成の培
養液15Lを30L容ジャーファーメンター２基にとり、120
℃で20分間滅菌した後、30℃に冷却し、これに、同組成
の培養液に30℃で１日間振盪培養したアルカリゲネス・
デニトリフィカンス・サブスピーシーズ・キシロソキシ
ダンス 701A（FERM BP−2735）の種培養液を1W/V％植菌
し、30℃で２日間通気撹拌培養して、Ｄ−ガラクチトー
ルをＤ−プシコースに変換させ、次いで遠心分離して菌
体と上清とに分離し、得られた上清を実施例１の方法に
準じて、活性炭、イオン交換樹脂を用いて脱塩し、濃縮
した後、カラムクロマトグラフィーによって精製、濃縮
してＤ−プシコースシラップを採取した。Ｄ−プシコー
スのＤ−ガラクチトールに対する収率は、固形物当り約
55％であった。

本製品の理化学的性質も、実施例１の場合と同様に、
Sigma社の試薬Ｄ−プシコースとよく一致した。

実施例３実施例１の方法で得た生菌体約20gを、Ｄ−タリトー
ル2W/V％を含有する0.05Mリン酸塩緩衝液（pH7.0）1Lに
加えて混合し、以後、実施例１と同様に、Ｄ−プシコー
スに変換せしめ、精製、濃縮して、Ｄ−プシコースシラ
ップをＤ−タリトールに対して、固形物当り約85％の収
率で得た。

本製品は、食品工業、医薬品工業、化学工業などの原
料、中間体などとして有利に利用できる。

実施例４実施例２の方法で得た生菌体約100gを、Ｄ−ガラクチ
トールおよびＤ−タガトースを各1.5W/V％ずつ含有する
0.02Mリン酸塩緩衝液（pH6.8）5Lに加えて混合し、以
後、実施例２と同様に、Ｄ−プシコースに変換せしめ、
精製、濃縮して、Ｄ−プシコースシラップを原料糖質に
対して、固形物当り約75％の収率で得た。

［発明の効果］上記したことから明らかなように、本発明は、従来得
ることの極めて困難であったＤ−プシコースを、生化学
的方法により容易に製造する方法を確立するものであ
る。特に、アルカリゲネス属に属する微生物を用いて、
Ｄ−ガラクチトールという安価な糖アルコールを原料と
してもＤ−タガトース、Ｄ−タリトールを経てＤ−プシ
コースを生産できることを見出したことは、Ｄ−プシコ
ースの製造方法にとって、極めて有利である。

従って、本発明の方法は、Ｄ−プシコースの工業的製
造方法として好適であり、大量、安価な供給を可能に
し、希少糖質としての試薬用途のみならず、従来予想す
らできなかった食品工業、医薬品工業、化学工業などの
原料、中間体などへの用途を可能にするものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:05）

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】アルカリゲネス属に属し、Ｄ−ガラクチト
ール、Ｄ−タガトースおよびＤ−タリトールから選ばれ
る一種以上の糖質からＤ−プシコース産生能を有する細
菌を、Ｄ−ガラクチトール、Ｄ−タガトースおよびＤ−
タリトールから選ばれる一種以上の糖質を含有する水溶
液に接触させてＤ−プシコースを生成せしめ、これを採
取することを特徴とするＤ−プシコースの製造方法。
【請求項２】アルカリゲネス属に属する細菌が、アルカ
リゲネス・デニトリフィカンス・サブスピーシーズ・キ
シロソキシダンス 701A EFRM BP−2735であることを
特徴とする特許請求の範囲第（１）項記載のＤ−プシコ
ースの製造方法。
【請求項３】アルカリゲネス・デニトリフィカンス・サ
ブスピーシーズ・キシロソキシダンス 701A （FERM
BP−2735）。