JP3020266B2

JP3020266B2 - ホスホマイシンの製造方法

Info

Publication number: JP3020266B2
Application number: JP27138390A
Authority: JP
Inventors: 伸哉伊藤
Original assignee: 有限会社ビセイケン
Priority date: 1990-10-09
Filing date: 1990-10-09
Publication date: 2000-03-15
Anticipated expiration: 2015-03-15
Also published as: JPH04148692A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、cis−プロペニルホスホン酸を微生物反応
によりホスホマイシンに変換することを特徴とする抗生
物質ホスホマイシンの製造方法に関するものである。ホ
スホマイシンは、放線菌の二次代謝産物であり、化学構
造は、以下の式１に示す、（−）−（1R,2R）−1,2−エ
ポキシプロピルホスホン酸である。グラム陽性菌、陰性
菌に広い抗菌スペクトルを示し、緑濃菌、変形菌、セラ
チア及び多剤耐性ブドウ球菌及び大腸菌による感染症に
内服或いは注射薬として使用されている。

〔従来の技術〕ホスホマイシンの製造技術としては、生産菌であるス
トレプトマイセス・フラジエ（Streptomyces fradi
e）、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Strep
tomyces viridochromogenes）又はストレプトマイセス
・エドモレンシス（Streptomyces wedmorensis）の培養
液よりホスホマイシンを分離、精製する方法（特公昭45
−9828号公報）、又はストレプトマイセス・オーダイネ
ンシス（Streptomyces odainensis）の培養液よりホス
ホマイシンを分離、精製する方法（特開昭51−54989号
公報）、cis−プロペニルホスホン酸を化学的にエポキ
シ化する方法（特公昭46−43206号公報）、tert−ブタ
ノールを原料として化学的に合成する方法〔ジャーナル
・オブ・オーガニック・ケミストリー（Journal of Org
anic Chemistry）35,3510（1970）］、ペニシリウム
属、オリデュウム属及びファシロマイセス属に属するカ
ビを用いてcis−プロペニルホスホン酸をエポキシ化す
る方法［アプライド・マイクロバイオロジー〔Applied
Microbiology〕22,55（1971）］、セルビブリオ属及び
ブレビバクテリウム属に属する細菌を用いてcis−プロ
ペニルホスホン酸をエポキシ化する方法（特開昭64−37
296号公報）が知られている。

〔発明が解決しようとする課題〕

前記従来のホスホマイシンの製造方法において、放線
菌の培養液から分離、精製する方法はその生産量が低い
という欠点があった。また、化学的に合成する方法で
は、抗生物質として不活性な（＋）−体が副生するこ
と、また煩雑な光学分割を行う必要があった。また、カ
ビを用いる方法では、基質であるcis−プロペニルホス
ホン酸の濃度が高くなると変換率が低下する現象が認め
られること、細菌を用いる方法では、生成物であるホス
ホマイシンに対する耐性が低いことという欠点があっ
た。

そこで、高濃度のcis−プロペニルホスホン酸及びホ
スホマイシンに対する耐性を有し、且つcis−プロペニ
ルホスホン酸をホスホマイシンに変換する能力を有する
微生物の開発が望まれてきた。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者はこうした背景において、cis−プロペニル
ホスホン酸を基質としホスホマイシンを製造するに適し
た方法を鋭意検討し、シュウドモナス属、アルカリゲネ
ス属、コリネバクテリウム属、フラボバクテリウム属、
アエロモナス属、ノカルディア属又はストレプトマイセ
ス属に属する微生物が、cis−プロペニルホスホン酸を
光学活性的にホスホマイシンに変換し、なおかつ、高濃
度のcis−プロペニルホスホン酸及びホスホマイシン存
在下でもエポキシ化の能力が高いことを発見し、本発明
を完成したのである。

本発明において利用される微生物は、シュウドモナス
属、アルカリゲネス属、コリネバクテリウム属、フラボ
バクテリウム属、アエロモナス属、ノカルディア属又は
ストレプトマイセス属に属し、cis−プロペニルホスホ
ン酸を光学活性的に変換する能力を有するものであれ
ば、いずれのものでも用いられる。

このうち、特に好ましくは、シュウドモナス・プチダ
（Pseudomonas putida）IK−８株、アルカリゲネス・フ
ェーカリス（Alcaligenes faecalis）IFO13111株、コリ
ネバクテリウム・フラビゲナム（Corynebacterium flav
igenum）AHU1345株、フラボバクテリウム・エステルア
ロマチカム（Flavobacterium esteraromaticum）IFO375
1株、アエロモナス・ハイドロフィラ（Aeromonas hydro
phila）IAM1018株、ノカルディア・コーラリア（Nocard
ia corallina）IFO3338、ストレプトマイセス・グリセ
ウス（Streptomyces griseus）IAM0123株及びストペル
トマイセス（Streptomyces sp.）IK−17株である。

また、これらの微生物に紫外線を照射したり、NTG
（Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジ
ン）やEMS（エタンメタンスルホン酸）等の変異誘起剤
で処理することにより、ホスホマイシンの生産能を高め
た変異株を使用することもできる。

上記の菌株において、シュウドモナス・プチダIK−８
とストレプトマイセスIK−17は、本発明者が土壌中より
新たに分離したものである。これらの菌株の菌学的性質
及び微生物工業技術研究所への寄託番号は下記の通りで
ある。

〔菌株IK−８〕 I.細胞形態:2〜４の極鞭毛を有する直桿菌 0.7〜1.0×1.5〜2.0μｍ運動性：有りグラム染色：陰性胞子形成：無し II.各培地における生育状態（１）標準寒天板培地コロニーは円形、表面は平滑、全縁状で蛍光有り。

（２）標準寒天斜面培地直線状で表面は平滑、バター質、玉虫色、生育良好。

（３）標準液体培地かすかに粉状沈澱を有する。皮膜形成はなし。

III.生理的性質カタラーゼ：陽性チトクロームオキシダーゼ：陽性色素生成：黄色（トリプトソイ寒天培地、水溶性）Ｏ−Ｆ試験：酸化型酸産生：ブドウ糖＋キシロース＋マルトース − ラクトース − マニトール − シュクロース− 澱粉 − 発育 : 5℃ ＋ 41℃ − マッコンキー寒天培地＋ SS寒天培地＋硝酸塩還元 − 硝酸塩からガス − アルギニンジヒドラーゼ＋ゼラチン分解 − Tween80 分解 − 尿素分解＋クエン酸の利用＋ TSI −／− リトマスミルクアルカリ化酸素要求偏性好気以上の菌学的性質よりバージ・マニュアル（Bergey's
Manual of Determinative Bacteriology）第８版によ
り検索したところ、本菌はシュウドモナス・プチダと認
められたので、本菌をシュウドモナス・プチダIK−８と
した。そして、本菌を平成２年10月６日付で微生物工業
技術研究所に寄託し、該寄託番号はFERM Ｐ−11751で
ある。

〔菌株IK−17〕 I.コロニーの性状第１表に各培地におけるコロニーの性状を示した。

II.菌の形態イースト・麦芽培地を用いて、スライド培養により菌
の形態を観察したところ、以下のようであった。

基生菌糸：放射状であり、断裂しない。

気菌糸：単純分岐している。

胞子：胞子は気菌糸より出て、直線状に10個以上連鎖
している。胞子は白色でその大きさは、0.5〜1.0×1.0
〜2.0μｍ、円筒型をなし、表面は平滑である。胞子の
う、菌核はない。

III.膜の組成 LL−ジアミノピメリン酸＋ meso−ジアミノピメリン酸 − グリシン＋アラニン＋ IV.生理学的性質アミラーゼ＋カタラーゼ＋色素産生 − ゼラチン液化＋ミルクのペプトン化＋糖の資化性Ｌ−アラビノース＋Ｄ−キシロース＋Ｄ−グルコース＋Ｄ−フラクトース＋シュクロース − Ｌ−ラムノース＋ラフィノース − イノシトール ± Ｄ−マニトール − 澱粉＋デキストリン＋マルトース＋ラクトース＋イヌリン − Ｄ−ガラクトース＋Ｄ−マンノース＋ソルビトール − グリセロール＋以上の菌学的性質より、バーシ・マニュアル第８版に
より検索した所、本菌株はストレプトマイセス属細菌と
同定された。その種については、ストレプトマイセス・
アルボビナセウス（Streptomyces albovinaceus）に近
いもののＤ−マニトールを資化しないことから、明確な
確定には至らなかった。そこで、本菌株をストレプトマ
イセス・エスピー（Streptomyces sp.）IK−17株とし
た。そして、本菌を平成２年10月６日付けで微生物工業
技術研究所に寄託し、該委託番号はFERM Ｐ−11750で
ある。

ホスホマイシンは、上記菌株の一種をcis−プロペニ
ルホスホン酸を含有した培地で培養することによって得
られる。cis−プロペニルホスホン酸の添加方法等とし
ては、例えば、培地中に予め添加しておく方法、ま
ず通常の微生物培養の培地で前記微生物を培養し、適当
な時期に添加する方法、又は培養した菌体を集め菌体
処理物とし、これを適当な水系溶媒でcis−プロペニル
ホスホン酸と接触せしめる方法のいずれを取ることもで
きる。

この菌体処理物としては、生菌体以外にも乾燥菌体、
アセトン処理菌体、固定化菌体等の処理物が使用でき
る。

培地の炭素源としては、グルコール、シュクロース等
の糖類をはじめ、グリセロール等のアルコール類、クエ
ン酸等の誘起酸類、又は廃糖蜜、コーンスティプリカー
等の天然物由来のもののうちから、使用菌種の資化しう
るものを選択して用いることができる。

窒素源としては、硫安、塩化アンモニウム等のアンモ
ニウム塩、尿素等のアミド類、アミノ酸類、又は肉エキ
ス、ペプトン等の蛋白質やその加水分解等が使用でき
る。また、通常の微生物培養に用いられる栄養塩類、即
ち、リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、鉄、
亜鉛、コバルト、マンガン等の金属塩、更に酵母エキ
ス、ビタミン、ヌクレオチド等の生育因子が必要に応じ
て添加される。

培養は、一般の通気攪拌培養を行う。培養温度は、菌
が生育する温度であればいずれでもよいが、25〜30℃が
好ましい。また、培地のpHは、６〜８の間が望ましい。
添加するcis−プロペニルホスホン酸の濃度は、菌が育
成する範囲内であればいずれの濃度でも使用できるが、
通常は0.3〜2.0％である。

反応液からのホスホマイシンの採取には、公知の遠心
分離法、抽出法、濃縮法、クロマトグラフィー法等が使
用できる。

ホスホマイシンの定量方法は、特に限定されないが、
通常、プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）I
FO13300及びセラチア・マルセセンス（Serratia marces
cens）IAM1065を用いるバイオアッセイ法に従って行わ
れる。

〔実施例〕

以下実施例により本発明を具体的に説明する。

実施例１本実施例は、第２表に示す各菌株におけるホスホマイ
シンの生産量を検討したものである。

０、３％のcis−プロペニルホスホン酸、５％のグリ
セロール、0.5％の肉エキス、１％のペプトン、２％の
トリプトン、0.15％のNaCl、0.05％のCoCl₂・7H₂O及び
0.02％のNaVO₃を含む培地（pH7.5）10mを入れた大型
試験管に、本発明で使用する菌株を接取し、30℃、７日
間、振蘯培養した。培養液中に蓄積したホスホマイシン
の量は、バイオアッセイで測定した。

具体的にいえば、プロテウス・シラビリヌIFO13300菌
又はセラチア・マルセセンスIAM1065菌をスラントよ
り、酵母エキス−ペプトン培地（各0.5％を含む）に接
種し、30℃で一夜培養する。得られた培養液1mを、滅
菌した後50〜55℃に保温した0.3％肉エキス、0.5％ペプ
トン及び0.2％酵母エキスを含む寒天培地100mに加
え、滅菌したシャーレに分注し固化させる。ペーパーデ
ィスク（直径8mm）に被検液50μをしみこませ、寒天
上に置き30℃で16時間培養する。得られた阻止円の大き
さを測定し、前もって作成した標準ホスホマイシン（シ
グマ社製）による検量線より定量する。

各菌株のホスホマイシン生産量を第２表に示す。この
結果によれば、ホスホマイシンは0.05〜0.55mg/m培地
も生産され、特に、シュードモナス・プチダIK−８、ア
ルカリゲネス・フェーカリスIFO13111、ストレプトマイ
セス・グリセウスIAM0123、ストレプトマイセス・エプ
ピーIK−17は、0.40〜0.55mg/m培地と多くのホスホマ
イシンが生産された。

実施例２本実施例は、第３表に示す３種菌株の生育状況とcis
−プロペニルホスホン酸及びホスホマイシンの濃度との
関係を検討したものである。

0.5％の酵母エキスと0.5％のペプトンを含む培地にci
s−プロペニルホスホン酸又はホスホマイシンを添加し
た寒天培地に本発明で使用する各菌株を接種し、30℃で
７日間培養し、その生育を測定する。

その結果を第３表に示す。この結果によれば、これら
の菌株は、高濃度のcis−プロペニルホスホン酸（２％
濃度）又はホスホマイシン（1.5％濃度）存在下でも、
十分に良好な生育を示し、そのため十分な耐性を有する
ことが判明した。

実施例３本実施例は、本実施例において生産された化合物が光
学純度に優れたホスホマイシンであることを確認したも
のである。

0.3％のcis−プロペニルホスホン酸、５％のグリセロ
ール、１％のクエン酸ナトリウム、0.5％の肉エキス、
１％のペプトン、２％のトリプトン、0.15％のNaCl、0.
05％のCoCl₂・7H₂O及び0.02％のNaVO₃の組成の滅菌培地
100m（pH7.5）を含む500mの容振蘯フラスコにシュ
ウドモナス・プチダIK−８株を接種し、30℃で７日間振
蘯培養した。培養液1000mより、遠心分離（10,000rp
m、15分）にて、菌体を除去した。

得られた上澄に20gの顆粒状活性炭を加え、濾過する
ことにより着色物質を取り除いた。濾液を陰イオン交換
樹脂アンバーライトCG50（ローム・アンド・ハース社
製）を充填したカラム（６×50cm）に通し、ホスホマイ
シンを吸着させ、このカラムを水洗後、１％の塩化ナト
リウム溶液1,000mを用いてホスホマイシンを溶出させ
た。活性画分を集め減圧濃縮後メタノールを加え、25％
のメタノール溶液とした。

次に、25％のメタノール溶液を用いて充填した活性ア
ルミナ（ICNアルミナＡ、スーパーＩ、ICNバイオメディ
カル社製）カラム（３×30cm）に上記溶液を通し、ホス
ホマイシンを吸着させ、水及び0.5Mのアンモニア水にて
ホスホマイシンを溶出した。活性画分を集め減圧濃縮
後、20％のメタノールに溶解し、20％のメタノールを用
いて充填したセファデックスLH20（ファルマシア社製）
カラム（３×30cm）に吸着し、20％のメタノール溶液20
0mにて溶出した。活性画分を減圧濃縮・乾燥しホスホ
マイシンナトリウム塩150mgが得られた。

本化合物のＨ−NMR（D₂O）は、δ1.47（3H,d,J＝5.
9）、2.85（1H,J＝19.3,5.2Hz）、3.2〜3.4（1H,m）と
標準化合物と完全に一致した。また、旋光度〔α〕
_435nm ^20゜c＝−9.0となり、標準化合物の−8.4（ｃ＝1,
水）と同等若しくはそれ以上の値を示し、同化合物は10
0％に近い光学純度を有するホスホマイシンと同定され
た。

実施例４本実施例も実施例３と同様な確認をしたものである。

使用菌株をストレプトマイセス・エスピーIK−17株に
代えて、実施例３と同様に行い、ホスホマイシンナトリ
ウム塩を110mg得た。この化合物も、実施例３の化合物
と同様に優れた光学純度をもつホスホマイシンであっ
た。

実施例５本実施例は、フラボバクテリウム・エステルアロマチ
カムを用いて実施例３と同様な確認をしたものである。

0.3％のcis−プロペニルホスホン酸、２％のグリセロ
ール、0.5％の酵母エキス、１％のペプトン、２％のト
リプトン、0.15％のNaCl、0.05％のCoCl₂・7H₂O、0.02
％のNaVO₃、0.02％の消泡剤（アンチホームＡエマルジ
ョン、シグマ社製）の組成の滅菌培地にフラボバクテリ
ウム・エステルアロマチカムIFO3751を接種し、実施例
３と同様に培養した。培養液1000mより、遠心分離（1
0,000rpm、15分）にて、菌体を除去した。濾液を陰イオ
ン交換樹脂アンバーライトCG50を充填したカラム（７×
50cm）に通し、ホスホマイシンを吸着させ、このカラム
を水洗後、１％の塩化ナトリウム溶液1000mを用いて
ホスホマイシンを溶出させた。以後、実施例３と同様に
行い、ホスホマイシンナトリウム塩を500mg得た。この
化合物も、実施例３と同様に優れた光学純度をもつホス
ホマイシンであった。

〔発明の効果〕

本製造方法によれば、前記に示すように、cis−プロ
ペニルホスホン酸を光学活性的に効率よくホスホマイシ
ンに変換し製造でき、更にcis−プロペニルホスホン酸
及びホスホマイシンの高濃度存在下であっても、効率よ
くホスホマイシンを製造できる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 17/02 Ｃ１２Ｒ 1:05） (Ｃ１２Ｐ 17/02 Ｃ１２Ｒ 1:15） (Ｃ１２Ｐ 17/02 Ｃ１２Ｒ 1:20） (Ｃ１２Ｐ 17/02 Ｃ１２Ｒ 1:365） (Ｃ１２Ｐ 17/02 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｐ 17/02 Ｃ１２Ｒ 1:545） (Ｃ１２Ｐ 17/02 Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】シュウドモナス属、アルカリゲネス属、コ
リネバクテリウム属、フラボバクテリウム属、アエロモ
ナス属、ノカルディア属又はストレプトマイセス属に属
し、cis−プロペニルホスホン酸を不斉エポキシ化する
能力を有する微生物の培養液、菌体及びその処理物のう
ちの少なくとも１つとcis−プロペニルリン酸とを適当
な媒体中で接触、反応せしめることにより、該媒体中に
ホスホマイシンを蓄積し、該ホスホマイシンを採取する
ことを特徴とするホスホマイシンの製造方法。