JPH09173057A - ε−ポリ−Ｌ−リジンを著量に生産する菌株及びそれを用いたε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】従来のε−ポリ−Ｌ−リジン生産株またはその
改良株に比べて、さらにε−ポリ−Ｌ−リジン生産能が
高く、ε−ポリ−Ｌ−リジンの生産性を向上させること
のできる菌株の提供と該菌株を用いてε−ポリ−Ｌ−リ
ジンを著量に製造する方法を提供する。 【解決手段】ε−ポリ−Ｌ−リジンの生産能を有するス
トレプトマイセス・アルブラス種の微生物を変異処理し
て得られ、10mg/ml以上の高濃度のＳ−（２−アミノエ
チル）−Ｌ−システインに対する耐性を有するε−ポリ
−Ｌ−リジンを著量に生産する菌株を得、該菌株を好気
的に培地に培養して、培養液中のε−ポリ−Ｌ−リジン
を採取するε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ε−ポリ−Ｌ−リ
ジン（以下、εＰＬという）を著量に生産する菌株と該
菌株を用いて発酵法によりεＰＬを製造する方法に関す
る。εＰＬは、必須アミノ酸であるＬ−リジンのポリマ
−であるため安全性が高く、また、カチオン含量が高い
ので、特異な物性を有する。したがってトイレタリ−用
品、化粧品、飼料添加物、医薬、農薬、食品添加物、電
子材料等の用途が期待できる。特に食品添加物の分野で
は、天然物系の添加物として注目されている。

【０００２】

【従来の技術】従来、発酵法によるεＰＬの製造法とし
ては、自然界から分離されたストレプトマイセス属に属
するεＰＬ生産株であるストレプトマイセス・アルブラ
ス・サブスピ−シズ・リジノポリメラス（Streptomyces
albulus subsp.lysinopolymerus) No.346-D株（微工研
菌寄第3834号）を培地に培養し、得られる培養物からε
ＰＬを分離、精製して得る方法が知られている（特公昭
59-20359号公報）。また、該ストレプトマイセス・アル
ブラス・サブスピ−シズ・リジノポリメラスNo.346-D株
を、Ｌ−リジンのアナログ物質であるＳ−（２−アミノ
エチル）−Ｌ−システインに耐性を有する変異株に変異
処理して、得られた変異株であるストレプトマイセス・
アルブラス・リジノポリメラス11011A-1株（微工研条寄
第1109号）を培地に培養して、得られる培養物から、分
離、精製して該εＰＬを得る方法も知られている（特公
平3-42070号公報、特公平3-78998号公報）。しかしなが
ら、種々の用途に対応しうる安価なεＰＬを製造するに
は、該11011A-1株を用いても、εＰＬの生産量及び対糖
収率は未だ充分ではないとう点もあり、さらにεＰＬ生
産能を高めた改良株及び該改良株を用いて工業的に安価
で効率的なεＰＬの製造法の開発が望まれていた。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、従来の
εＰＬ生産株またはその変異株にくらべて、εＰＬ生産
能をさらに高めたεＰＬ生産株を得るべく鋭意研究を重
ねた。その結果、10mg/ml以上の高濃度のＳ−（２−ア
ミノエチル）−Ｌ−システイン（以下、ＡＥＣという）
に対して耐性を有する変異株がεＰＬを著量に生産する
ことのできる菌株になることを見いだすとともに、該菌
株を好気的に培地に培養することにより、εＰＬを著量
に生産することができることを見い出し、これらの知見
に基づき、本研究を完成した。以上の記述から明らかな
ように、本発明の目的は、従来のεＰＬ生産株またはそ
の改良株に比べてさらにεＰＬの生産能が高く、εＰＬ
の生産性を向上させることのできる菌株を提供するとと
もに、該菌株を用いてεＰＬを安価で、著量に製造する
方法を提供することである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明は以下の技術的手
段で構成される。 （１）ε−ポリ−Ｌ−リジンの生産能を有するストレプ
トマイセス・アルブラス( Streptomyces albulus）種の
微生物を変異処理して得られ、10mg/ml以上の高濃度の
Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システインに対して耐
性を有するε−ポリ−Ｌ−リジンを著量に生産する菌
株。 （２）ストレプトマイセス・アルブラス・サブスピ−シ
ズ・リジノポリメラス(Streptomyces albulus subsp. l
ysinopolymerus)11011A-1株（微工研条寄第1109号）を
変異処理して得られ、10mg/ml以上の高濃度のＳ−（２
−アミノエチル）−Ｌ−システインに対して耐性を有す
るε−ポリ−Ｌ−リジンを著量に生産するB21021 株
（寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５１９３号）。 （３）10mg/ml以上の高濃度のＳ−（２−アミノエチ
ル）−Ｌ−システインに対して耐性を有し、かつε−ポ
リ−Ｌ−リジン生産能を有するストレプトマイセス属に
属する微生物を、好気的に培地に培養し、培養液中に生
成蓄積したε−ポリ−Ｌ−リジンを採取することを特徴
とするε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法。 （４）前記第２項記載のB21021株を好気的に培地に培養
し、培養液中に生成蓄積したε−ポリ−Ｌ−リジンを採
取することを特徴とするε−ポリ−Ｌ−リジンの製造
法。

【０００５】本発明で用いるＡＥＣは、Ｌ−リジンの構
造類似物質（アナログ物質）であり、Ｌ−リジンとは、
４位の炭素原子が硫黄原子と交換されていることのみが
異なった構造の化合物である。該ＡＥＣを培地中に添加
すると菌の生育阻害を引き起こすが、さらにＬ−スレオ
ニンを組み合わせることにより、生育阻害が明らかによ
り強く示される。

【０００６】特公平3-42070 号公報に開示の11011A-1株
は、Ｌ−リジンのアナログ物質であるＡＥＣに対する耐
性を有するεＰＬ生産株ではあるが、2mg/mlの濃度のＡ
ＥＣ存在下でスクリ−ニングしたものであり、その生育
範囲はＡＥＣ濃度がせいぜい5 mg/ml以下の場合だけ
で、ＡＥＣ濃度が10mg/ml 以上では全く生育を示さな
い。

【０００７】本発明の改良株は、10mg/ml以上の濃度の
ＡＥＣ存在下でスクリ−ニングしたもので、ＡＥＣ濃度
が40mg/mlでも生育可能な耐性度を有するストレプトマ
イセス属に属する微生物であり、さらに菌学的性質も親
株である11011A-1株とは一部で違いが認められる。

【０００８】かかる改良株を得る際に使用される親株と
しては、εＰＬを生産するストレプトマイセス属の微生
物であれば使用できるが、ストレプトマイセス・アルブ
ラス・リジノポリメラス 11011A-1 株（微工研条寄第11
09号）が好ましい。

【０００９】本発明で変異処理とは、εＰＬを生産する
ストレプトマイセス属の微生物（菌株）を、10mg/ml以
上の高濃度のＡＥＣに対して耐性を有する改良株に変異
させる処理のことをいい、かかる変異処理の方法として
は、Ｎ−メチル−Ｎ' −ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジ
ン（以下ＮＴＧという）を、緩衝液1ml当たり0.1mg〜3m
gの濃度になるように添加して、１０分間〜２時間該菌
株と該ＮＴＧを接触させる方法や、紫外線を照射線量10
0〜1000J/cm2で該菌株に照射する方法、５−ブロモウラ
シル等の薬剤で処理する方法、その他慣用の化学的もし
くは物理的変異処理方法を挙げることができる。

【００１０】変異処理した菌株をスクリーニングする方
法としては、培地1ml当たりＡＥＣを10mg以上になるよ
うに、さらにＬ−スレオニンを培地1ml当たり1mgになる
ように添加した最少寒天培地上に接種し、該培地上に生
育してくる菌株を採取する方法を挙げることができる。

【００１１】以下に本発明を詳細に説明する。ＡＥＣ高
濃度耐性株である本発明の改良株の具体的な取得方法の
１つは、εＰＬ生産株であるストレプトマイセス・アル
ブラス・サブスピ−シズ・リジノポリメラス 11011A-1
株の胞子をトリス−マレイン酸緩衝液(pH 6.0)に懸濁
し、ＮＴＧを該緩衝液1mL当たり1.5 mgとなるように該
緩衝液に添加して、３７℃で６０分間接触させる。その
後、遠心分離により胞子を集め、リン酸緩衝液（0.05M,
pH 7.0)で洗浄したあと、液体栄養培地（グルコ−ス５
％、硫酸アンモニウム１％、酵母エキス 0.5％、K₂HPO₄
0.08 ％、 KH₂PO₄ 0.136％、 MgSO₄・7H₂O 0.05 ％、 ZnSO
₄・7H₂O 0.004％、 FeSO₄・7H₂O O.003％ pH6.8、ただし、
％とはg/dl％をいう）中で一夜培養する。培養後、遠心
分離で菌体を集め、リン酸緩衝液(0.05M,pH 7.0)で洗浄
したのち、培地1ml当たりＡＥＣを20mg及び培地1ml当た
りＬ−スレオニンを1mg含む最少寒天培地（グルコ−ス
５％、硫酸アンモニウム１％、K₂HPO₄ 0.08％、 KH₂PO₄
0.136％、 MgSO₄・7H₂O 0.05 ％、 ZnSO₄・7H₂O 0.004％、
FeSO₄・7H₂O O.003％ pH6.8、 寒天1.5 ％、ただし、％は
g/dl％をいう）上に塗布し、３０℃で３〜４日間培養
し、生育したコロニ−を採取する。 こうして得られた
ＡＥＣ高濃度耐性株についてεＰＬの生産性の評価を行
い、最も生産性の高い菌株がストレプトマイセス・アル
ブラス・サブスピ−シズ・リジノポリメラス B21021株
（寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５１９３号）であり、これ
に続くのがB22107株、B22201株である。

【００１２】得られた改良株であるＡＥＣ高濃度耐性株
のＡＥＣに対する耐性度は、次のようにして測定する。
すなわち、後述の表−１に記載した各濃度のＡＥＣとＬ
−スレオニンを培地1mg当たり１ml添加した最少寒天培
地（前記）のそれぞれに該耐性株を塗布して、３０℃で
２日〜７日間培養し、生育を肉眼で観察することによ
り、耐性度を比較する。その結果を表１に示した。親株
である11011A-1株は、ＡＥＣ濃度が 5mg/ml では生育が
認められるが、10mg/mlの濃度では全く生育を示さない
のに対して、高濃度耐性株であるB21021株は、ＡＥＣ濃
度が40mg/ml でも生育が認められる。この様に、本発明
の改良株は、高濃度のＡＥＣに対するの耐性を有すると
いう点で、親株と明確に区別することができる。

【００１３】

【表１】

【００１４】次に、B21021株の菌学的性質を示すと次の
通りである。 （１）形態学的性質 胞子形成菌糸の分枝法及び形態 単純分枝、閉鎖らせん状（closed spiral) 胞子の数：数10個 胞子の表面構造及び大きさ 胞子は円ないし楕円形で大きさは約1.2 〜1.5μであ
り、その表面構造はスパ イニ−(Spiny) である。 鞭毛、菌核、胞子のうの有無：認められない。 胞子柄の着生位置：気菌糸上 （２）各種培地上における培養性状 表２の各種培地上における性状はそれぞれ３０℃で10〜
14日間培養後の観察結果である。

【００１５】

【表２】

【００１６】（３）生理的性質 生育温度範囲 約１５〜４０℃。生育最適温度：３０℃付近。 ゼラチンの液化、でんぷんの加水分解及び脱脂牛乳の
ペプトン化すべて陽性 脱脂牛乳の凝固：陰性 メラニン様色素の生成 チロシン寒天培地上では褐色の色素を生成する。 細胞壁組成 細胞壁組成成分中のジアミノピメリン酸の型についてベ
ッカ−（Becker)らの方法［アプライド・マイクロバイ
オロジ−（Applied Microbiology）第１３巻、ｐ２３６
(1965年）］により分析した結果、Ｌ，Ｌ型であった。 （４）炭素源の利用性（プリドハム・ゴットリ−ブ寒天
培地） Ｌ−アラビノ−ス − Ｄ−キシロ−ス − Ｄ−グルコ−ス ＋ Ｄ−フラクト−ス ＋ Ｌ−ラムノ−ス − Ｄ−ガラクト−ス ＋ シュ−クロ−ス − ラフィノ−ス − Ｄ−マンニト−ル ＋ イノシト−ル ＋ サリシン ＋ ＋：利用する、−：利用しない

【００１７】以上記述したように、本発明の改良株の１
つであるB21021株の菌学的性質は、親株である11011A-1
株の菌学的性質といくつかの点において違いが認められ
る。例えば、炭素源の利用性において、11011A-1株はサ
リシンを利用できないが、B21021株は利用できる。ま
た、培養性状においても、シュ−クロ−ス・硝酸塩寒天
培地上で、11011A-1株は灰褐色の気菌糸が生育するが、
B21021株は生育しない。栄養寒天培地上では、11011A-1
株は白色の気菌糸が豊富に生育するが、B21021株では気
菌糸の生育がわずかである。さらに溶解性色素が、1101
1A-1株ではグルコ−ス・アスパラギン寒天培地及びグリ
セロ−ル・アスパラギン寒天培地でも認められるのに対
して、B21021株では両方の培地ともに認められない。こ
の様に、菌学的性質においてもB21021株は親株である11
011A-1株と明確に区別ができる。

【００１８】得られた改良株を用いてεＰＬを生産する
には、該改良株を培地に接種して培養し、培養液から生
成蓄積したεＰＬを分離、精製する。培地としては、炭
素源、窒素源、無機物及びその他栄養物を適当に含有す
る培地ならばいずれも使用できる。炭素源としては、グ
ルコ−ス、フラクト−ス、グリセリン、スタ−チ等の該
改良株が資化可能なものなら制限されず、その含有量は
１〜５％（％はg/dl％）が好ましい。窒素源としては、
ペプトン、カゼイン加水分解物、アミノ酸、無機アンモ
ニウム塩等いずれでもかまわないが、好ましくは硫酸ア
ンモニウムである。窒素源の含有量は、0.2 〜2％(％は
g/dl％)が好ましい。培養途中で、炭素源及び窒素源を
逐次添加しても良い。無機物としてはリン酸イオン、カ
リウムイオン、ナトリウムイオン、マグネシウムイオ
ン、亜鉛イオン、鉄イオン、マンガンイオン、ニッケル
イオン、硫酸イオン等が挙げられる。また酵母エキスを
0.1〜0.5 ％（％はg/dl％）含有させると、菌の生育を
良好にし、εＰＬの生産においても好ましい結果を与え
る。

【００１９】培養は、好気的条件下で振とう培養、撹拌
培養等で行う。培養温度は２５〜３５℃が好ましい。培
地のｐＨは中性付近（ｐＨ６〜８）が好ましいが、培養
開始後、菌の生育とともにｐＨは低下する。ｐＨが４ま
で低下した時点で、アルカリを添加してｐＨを４に維持
させる。添加するアルカリはアンモニア水が好ましい
が、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等でも差し支え
ない。通常１〜７日間でεＰＬは培養液中に蓄積され
る。

【００２０】上記培養液から遠心分離もしくはフィルタ
−で菌体を除いたのち、菌体除去液を精製、脱色し、こ
れを濃縮する。濃縮液からアセトン、エタノ−ル等の有
機溶媒で晶析することにより、εＰＬが得られる。

【００２１】

【実施例】本発明を実施例により更に詳細に説明する。
培養液中のεＰＬ生産量の測定は、イツアキ(Itzhaki)
らのアナリテイカルバイオケミストリ(Analytical Bioc
hemistry),50,569、(1972)に記載の方法により測定し
た。すなわち、培養液を遠心分離して菌体を除いたの
ち、上澄液（εＰＬ:0 〜200μg ）２mlと１ｍＭメチル
オレンジ水溶液２mlとを混合し、室温で３０分放置後、
生じたεＰＬ−メチルオレンジコンプレックスを遠心分
離で除き、その上澄水の４６５ｎｍにおける吸光度を測
定し、培養液中のεＰＬ量を求める。また、実施例、比
較例中の％は特に断らない限り重量(g)/容量(dl)％であ
る。

【００２２】実施例１ グルコ−ス５％、酵母エキス 0.5％、硫酸アンモニウム
１％、K₂HPO₄ 0.08％、KH₂PO₄ 0.136％、MgSO₄・7H₂O 0.
05 ％、 ZnSO₄・7H₂O 0.004％、 FeSO₄・7H₂O 0.003％、 pH
6.8 の培地２リットルを調製し、３リットル容ジャ−
に入れ、これに取得した改良株であるストレプトマイセ
ス・アルブラス・サブスピ−シズ・リジノポリメラスB2
1021株の前培養液 100mlを接種し、３０℃、７００rpm
、通気量３リットル／分で７２時間、好気培養を行っ
た。ただし、ｐＨの調整は、10％アンモニア水を用いて
ｐＨ４に維持した。また、グルコ−ス及び硫酸アンモニ
ウムについては、残存濃度が低下した時点で逐次添加を
行った。７２時間培養後のεＰＬ生産量及び対糖収率を
表３に示した。ここで対糖収率（％）とは（εＰＬ生産
量／グルコ−ス消費量）×１００で表される値のことで
ある。

【００２３】実施例２ ストレプトマイセス・アルブラス・サブスピ−シズ・リ
ジノポリメラスB21021株の代わりに、ストレプトマイセ
ス・アルブラス・サブスピ−シズ・リジノポリメラスB2
2107株を用いる以外は実施例１に準拠して培養し、培養
液中のεＰＬ量を測定した。７２時間培養後のεＰＬ生
産量及び対糖収率を表３に示した。

【００２４】実施例３ ストレプトマイセス・アルブラス・サブスピ−シズ・リ
ジノポリメラスB21021株の代わりに、ストレプトマイセ
ス・アルブラス・サブスピ−シズ・リジノポリメラスB2
2201株を用いる以外は実施例１に準拠して培養し、培養
液中のεＰＬ量を測定した。７２時間培養後のεＰＬ生
産量及び対糖収率を表３に示した。

【００２５】比較例１ ストレプトマイセス・アルブラス・サブスピ−シズ・リ
ジノポリメラスB21021株の代わりに、親株であるストレ
プトマイセス・アルブラス・サブスピ−シズ・リジノポ
リメラス11011A-1株を用いる以外は実施例１に準拠して
行った。７２時間培養後のεＰＬ生産量及び対糖収率を
表３に示した。

【００２６】実施例４ グルコ−ス５％、酵母エキス 0.5％、硫酸アンモニウム
１％、K₂HPO₄ 0.08％、KH₂PO₄ 0.136％、MgSO₄・7H₂O 0.
05 ％、 ZnSO₄・7H₂O 0.004％、 FeSO₄・7H₂O 0.003％、 pH
6.8 の培地２リットルを調製し、３リットル容ジャ−
に入れ、これに取得した改良株であるストレプトマイセ
ス・アルブラス・サブスピ−シズ・リジノポリメラスB2
1021株の前培養液 100mlを接種し、３０℃、７００rpm
、通気量３リットル／分で１６８時間、好気培養を行
った。ただし、ｐＨの調整は、10％アンモニア水を用い
てｐＨ４に維持した。また、グルコ−ス及び硫酸アンモ
ニウムについては、残存濃度が低下した時点で逐次添加
を行った。１６８時間培養後のεＰＬ生産量及び対糖収
率を表４に示した。

【００２７】実施例５ ストレプトマイセス・アルブラス・サブスピ−シズ・リ
ジノポリメラスB21021株の代わりに、ストレプトマイセ
ス・アルブラス・サブスピ−シズ・リジノポリメラスB2
2107株を用いる以外は実施例４に準拠して培養し、培養
液中のεＰＬ量を測定した。１６８時間培養後のεＰＬ
生産量及び対糖収率を表４に示した。

【００２８】実施例６ ストレプトマイセス・アルブラス・サブスピ−シズ・リ
ジノポリメラスB21021株の代わりに、ストレプトマイセ
ス・アルブラス・サブスピ−シズ・リジノポリメラスB2
2201株を用いる以外は実施例４に準拠して培養し、培養
液中のεＰＬ量を測定した。１６８時間培養後のεＰＬ
生産量及び対糖収率を表４に示した。

【００２９】比較例２ ストレプトマイセス・アルブラス・サブスピ−シズ・リ
ジノポリメラスB21021株の代わりに、親株であるストレ
プトマイセス・アルブラス・サブスピ−シズ・リジノポ
リメラス11011A-1株を用いる以外は実施例４に準拠して
行った。１６８時間培養後のεＰＬ生産量及び対糖収率
を表４に示した。

【００３０】実施例７ 実施例４で１６８時間培養した培養液について、この培
養液を遠心分離して菌体を除き、ｐＨ7.5に調整してか
ら、ＩＲＣ−５０（カチオン交換樹脂）、ＩＲＡ−４０
２（アニオン交換樹脂）、ＸＴ−１００６（カチオン交
換樹脂）の各イオン交換樹脂で分離、精製し、逆浸透膜
（ＲＯ）で濃縮してεＰＬを得た。その収量を表５に示
した。

【００３１】比較例３ 比較例２で１６８時間培養した培養液について、実施例
７と同様に培養液を遠心分離して菌体を除き、ｐＨ7.5
に調整してから、ＩＲＣ−５０（カチオン交換樹脂）、
ＩＲＡ−４０２（アニオン交換樹脂）、ＸＴ−１００６
（カチオン交換樹脂）の各イオン交換樹脂で分離、精製
し、逆浸透膜で濃縮して、εＰＬを得た。その収量を表
５に示した。

【００３２】表３、表４及び表５の結果から明かなよう
に、B21021株のεＰＬ生産量及び対糖収率はともに、11
011A-1株のそれに比べて顕著に増大していることが分か
る。

【００３３】

【発明の効果】本発明のＡＥＣ高濃度耐性を有する改良
株は、高生産かつ高収率でεＰＬを生産する能力を有
し、該生産株を用いることにより、高い生産性と高収率
でεＰＬを製造することが可能である。

【００３４】

【表１】

【００３５】

【表２】

【００３６】

【表３】

【００３７】

【表４】

【００３８】

【表５】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:465）

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ε−ポリ−Ｌ−リジンの生産能を有するス
   トレプトマイセス・アルブラス( Streptomyces albulu
   s）種の微生物を変異処理して得られ、10mg/ml以上の高
   濃度のＳ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システインに対
   して耐性を有するε−ポリ−Ｌ−リジンを著量に生産す
   る菌株。
2. 【請求項２】ストレプトマイセス・アルブラス・サブス
   ピ−シズ・リジノポリメラス(Streptomyces albulus su
   bsp. lysinopolymerus)11011A-1株（微工研条寄第1109
   号）を変異処理して得られ、10mg/ml以上の高濃度のＳ
   −（２−アミノエチル）−Ｌ−システインに対して耐性
   を有するε−ポリ−Ｌ−リジンを著量に生産するB21021
   株（寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５１９３号）。
3. 【請求項３】10mg/ml以上の高濃度のＳ−（２−アミノ
   エチル）−Ｌ−システインに対して耐性を有し、かつε
   −ポリ−Ｌ−リジン生産能を有するストレプトマイセス
   属に属する微生物を、好気的に培地に培養し、培養液中
   に生成蓄積したε−ポリ−Ｌ−リジンを採取することを
   特徴とするε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法。
4. 【請求項４】請求項２記載のB21021株を好気的に培地に
   培養し、培養液中に生成蓄積したε−ポリ−Ｌ−リジン
   を採取することを特徴とするε−Ｌ−リジンの製造法。