JP2692457B2 - 発酵法によるピルビン酸の製造法 - Google Patents
発酵法によるピルビン酸の製造法Info
- Publication number
- JP2692457B2 JP2692457B2 JP30196591A JP30196591A JP2692457B2 JP 2692457 B2 JP2692457 B2 JP 2692457B2 JP 30196591 A JP30196591 A JP 30196591A JP 30196591 A JP30196591 A JP 30196591A JP 2692457 B2 JP2692457 B2 JP 2692457B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- strain
- acid
- atpase
- glucose
- pyruvic acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ピルビン酸生産菌及
び、これを用いてピルビン酸を発酵法により生産する方
法に関する。
び、これを用いてピルビン酸を発酵法により生産する方
法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、ピルビン酸を発酵生産する微生物
は、細菌、かび、酵母に広く認められており、特に収量
の高いものとしては、コリネバクテリウム・エスピー
（嶋村睦夫，吉武寿一：農化誌 ,44 ,195-201 ,(197
0)）、アシネトバクター・エスピー（Y. Izumi, Y. Mat
umura, Y. Tani and H. Yamada: Agric.Biol. Chem.,4
6,2673-2679 ,(1982)）、カンディダ・リポリティカ
（内尾良輔，菊地健二，前尾敷勇，江井 仁，広瀬義
夫：日本農芸化学会大会講演要旨集，129 ,(1975)）、
トルロプシス・グラブラータ（米原 徹，宮田令子：日
本発酵工学会大会講演要旨集）等が知られている。
は、細菌、かび、酵母に広く認められており、特に収量
の高いものとしては、コリネバクテリウム・エスピー
（嶋村睦夫，吉武寿一：農化誌 ,44 ,195-201 ,(197
0)）、アシネトバクター・エスピー（Y. Izumi, Y. Mat
umura, Y. Tani and H. Yamada: Agric.Biol. Chem.,4
6,2673-2679 ,(1982)）、カンディダ・リポリティカ
（内尾良輔，菊地健二，前尾敷勇，江井 仁，広瀬義
夫：日本農芸化学会大会講演要旨集，129 ,(1975)）、
トルロプシス・グラブラータ（米原 徹，宮田令子：日
本発酵工学会大会講演要旨集）等が知られている。
【０００３】これらの微生物はピルビン酸脱水素酵素複
合体の補酵素の一つであるチアミンの要求性を付与する
ことによりピルビン酸を生成蓄積せしめるようにされた
ものである。これに対して本発明者らは、エンテロバク
ター属に属し、この酵素のもう一つの補酵素であるリポ
酸を要求する変異株によってもピルビン酸生産が可能で
あることを初めて見いだし、既に報告した（A. Yokotaa
nd S. Takao:Agric.Biol. Chem., 53, 705-711 ,(198
9)）。
合体の補酵素の一つであるチアミンの要求性を付与する
ことによりピルビン酸を生成蓄積せしめるようにされた
ものである。これに対して本発明者らは、エンテロバク
ター属に属し、この酵素のもう一つの補酵素であるリポ
酸を要求する変異株によってもピルビン酸生産が可能で
あることを初めて見いだし、既に報告した（A. Yokotaa
nd S. Takao:Agric.Biol. Chem., 53, 705-711 ,(198
9)）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、ピル
ビン酸を短時間の培養において高収率、高蓄積量で生成
する新規ピルビン酸生産菌を取得し、安価かつ効率的な
発酵法によるピルビン酸の製造法を提供することであ
る。
ビン酸を短時間の培養において高収率、高蓄積量で生成
する新規ピルビン酸生産菌を取得し、安価かつ効率的な
発酵法によるピルビン酸の製造法を提供することであ
る。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究を行なった結果、発酵法によるピ
ルビン酸生産においてリポ酸要求かつH+-ATPaseの欠失
変異株が糖消費速度、ピルビン酸生産速度、及び蓄積
量、収率を著しく高めることを見いだし、本発明を完成
するに至った。即ち本発明は、エシェリヒア属に属し、
生育のためにリポ酸を要求し、かつH+-ATPaseを欠失
し、更にピルビン酸生産能を有する変異株、並びに当該
変異株を液体培地に培養し、培養液中にピルビン酸を生
成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする発酵法
によるピルビン酸の製造法を提供するものである。
を解決すべく鋭意研究を行なった結果、発酵法によるピ
ルビン酸生産においてリポ酸要求かつH+-ATPaseの欠失
変異株が糖消費速度、ピルビン酸生産速度、及び蓄積
量、収率を著しく高めることを見いだし、本発明を完成
するに至った。即ち本発明は、エシェリヒア属に属し、
生育のためにリポ酸を要求し、かつH+-ATPaseを欠失
し、更にピルビン酸生産能を有する変異株、並びに当該
変異株を液体培地に培養し、培養液中にピルビン酸を生
成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする発酵法
によるピルビン酸の製造法を提供するものである。
【０００６】本発明において使用される変異株は、リポ
酸要求かつH+-ATPaseの欠失を有する変異株である。具
体的に例示すると、エシェリヒア・コリ AJ12631 (FER
M P-12381)等が挙げられる。このような本発明で使用す
る変異株は、例えばエシェリヒア・コリのリポ酸要求株
を親株として、通常の変異操作、形質導入、形質転換等
によってH+-ATPaseの欠失を導入することによって得る
ことができる。
酸要求かつH+-ATPaseの欠失を有する変異株である。具
体的に例示すると、エシェリヒア・コリ AJ12631 (FER
M P-12381)等が挙げられる。このような本発明で使用す
る変異株は、例えばエシェリヒア・コリのリポ酸要求株
を親株として、通常の変異操作、形質導入、形質転換等
によってH+-ATPaseの欠失を導入することによって得る
ことができる。
【０００７】リポ酸要求性の親株として具体的には、エ
シェリヒア・コリW1485 lip2 (ATCC25645)等が挙げられ
る。リポ酸要求性変異株の取得方法としては、通常の変
異誘導操作、例えば紫外線、Ｘ線照射あるいはN-メチル
-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン、亜硝酸などの化学
薬剤処理を施し、変異処理した菌体を寒天平板培地で培
養し、リポ酸要求性となったコロニーを分離することに
よって得られる（A. A. Herbert and J. R. Guest: J.
Gen. Microbiol.,53 ,363-381 ,(1968)） 。
シェリヒア・コリW1485 lip2 (ATCC25645)等が挙げられ
る。リポ酸要求性変異株の取得方法としては、通常の変
異誘導操作、例えば紫外線、Ｘ線照射あるいはN-メチル
-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン、亜硝酸などの化学
薬剤処理を施し、変異処理した菌体を寒天平板培地で培
養し、リポ酸要求性となったコロニーを分離することに
よって得られる（A. A. Herbert and J. R. Guest: J.
Gen. Microbiol.,53 ,363-381 ,(1968)） 。
【０００８】このようなリポ酸要求性変異株に、例えば
形質導入により H+-ATPase の欠失を導入することによ
って本発明の変異株が得られるが、H+-ATPase欠失変異
を供与する株としてはエシェリヒア・コリ AN718（E. c
oli Genetic Stock Center Department of Biology ,Ne
w Havenより入手）等が挙げられる。H+-ATPase欠失変異
株は、例えば上記の通常の変異誘導操作を行い変異処理
した菌株のうち、コハク酸を唯一の炭素源とする寒天平
板培地で生育できず、グルコースを唯一の炭素源とする
平板培地で生育できる変異株を取得し、さらにこの中よ
りH+-ATPase活性を欠失している株を取得することによ
って得られる。
形質導入により H+-ATPase の欠失を導入することによ
って本発明の変異株が得られるが、H+-ATPase欠失変異
を供与する株としてはエシェリヒア・コリ AN718（E. c
oli Genetic Stock Center Department of Biology ,Ne
w Havenより入手）等が挙げられる。H+-ATPase欠失変異
株は、例えば上記の通常の変異誘導操作を行い変異処理
した菌株のうち、コハク酸を唯一の炭素源とする寒天平
板培地で生育できず、グルコースを唯一の炭素源とする
平板培地で生育できる変異株を取得し、さらにこの中よ
りH+-ATPase活性を欠失している株を取得することによ
って得られる。
【０００９】また、H+-ATPaseは８種類のサブユニット
が複雑に集合した分子量約50万の膜結合性酵素であり、
ATPを加水分解して生じる自由エネルギー変化によってH
+を膜外に排出するポンプ機能と、細胞内呼吸により生
じた膜内外のH+の濃度勾配を利用してATPを合成する機
能とがある。またこの酵素は、膜内在性でH+輸送活性を
持つＦ0画分と、膜表在性でATPの分解及び合成を触媒す
るＦ1画分に分けられ、Ｆ0はa、b、cの３種、Ｆ1はα、
β、γ、δ、εの５種のサブユニットから構成されてい
る。形質導入するべき変異遺伝子はこれらのどのサブユ
ニットの物でもよい。
が複雑に集合した分子量約50万の膜結合性酵素であり、
ATPを加水分解して生じる自由エネルギー変化によってH
+を膜外に排出するポンプ機能と、細胞内呼吸により生
じた膜内外のH+の濃度勾配を利用してATPを合成する機
能とがある。またこの酵素は、膜内在性でH+輸送活性を
持つＦ0画分と、膜表在性でATPの分解及び合成を触媒す
るＦ1画分に分けられ、Ｆ0はa、b、cの３種、Ｆ1はα、
β、γ、δ、εの５種のサブユニットから構成されてい
る。形質導入するべき変異遺伝子はこれらのどのサブユ
ニットの物でもよい。
【００１０】本発明でピルビン酸を生産するために使用
する培地は炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応
じてアミノ酸、ビタミン、核酸などの有機微量栄養素を
含有する通常の栄養培地が使用される。炭素源としては
使用する変異株の利用可能なものであればよく、例えば
グルコース、フラクトース、澱粉分解物糖蜜などの糖類
が使用され、その他菌株によっては、シュークロース、
マルトースや、エタノール、プロパノール等のアルコー
ル類、酢酸、クエン酸等の有機酸類、ノルマルパラフィ
ン等も単独あるいは他の炭素源と併用して使用される。
する培地は炭素源、窒素源、無機塩類、その他必要に応
じてアミノ酸、ビタミン、核酸などの有機微量栄養素を
含有する通常の栄養培地が使用される。炭素源としては
使用する変異株の利用可能なものであればよく、例えば
グルコース、フラクトース、澱粉分解物糖蜜などの糖類
が使用され、その他菌株によっては、シュークロース、
マルトースや、エタノール、プロパノール等のアルコー
ル類、酢酸、クエン酸等の有機酸類、ノルマルパラフィ
ン等も単独あるいは他の炭素源と併用して使用される。
【００１１】窒素源としては硫酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、
硝酸塩、尿素、アンモニア、肉エキス等無機あるいは有
機の窒素源が使用される。有機微量栄養素としてはアミ
ノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含
有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、蛋白分解物
等が使用され、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求
性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添す
ることが必要である。
ンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、
硝酸塩、尿素、アンモニア、肉エキス等無機あるいは有
機の窒素源が使用される。有機微量栄養素としてはアミ
ノ酸、ビタミン、脂肪酸、核酸、更にこれらのものを含
有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、蛋白分解物
等が使用され、生育にアミノ酸などを要求する栄養要求
性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添す
ることが必要である。
【００１２】培養は好気的条件で行うことが望ましく、
培養期間中培地のpHを５乃至９、温度を20℃乃至40℃に
制御しつつ１日乃至４日間振とう培養または通気撹拌培
養することによりピルビン酸が蓄量培養液中に蓄積され
る。
培養期間中培地のpHを５乃至９、温度を20℃乃至40℃に
制御しつつ１日乃至４日間振とう培養または通気撹拌培
養することによりピルビン酸が蓄量培養液中に蓄積され
る。
【００１３】培養液からピルビン酸を採取する方法は公
知の方法に従って行えばよく、培養液から菌体を分離除
去した後、ピルビン酸塩として濃縮晶析する方法あるい
はイオン交換樹脂を用いる方法などにより採取される。
知の方法に従って行えばよく、培養液から菌体を分離除
去した後、ピルビン酸塩として濃縮晶析する方法あるい
はイオン交換樹脂を用いる方法などにより採取される。
【００１４】
【実施例】以下、実施例をもとに更に具体的に説明す
る。
る。
【００１５】（実施例１ ピルビン酸生成菌の取得）リ
ポ酸要求性ピルビン酸生産菌としてエシェリヒア・コリ
W1485 lip2(ATCC25645)(lip-)を選択し、H+-ATPaseの
Ｆ1のαサブユニットに変異を持つエシェリヒア・コリ
AN718 (CGSC6308) (F-, entA403, pyrE41, atpA401, ar
gH1,rspL109,λ-, supE44)の変異遺伝子であるatpA401
を供与遺伝子としてP1kcファージによって形質導入する
ことにより、リポ酸要求性かつ H+-ATPase が欠失した
変異株エシェリヒア・コリAJ12631(FERM P-12381)を取
得した。
ポ酸要求性ピルビン酸生産菌としてエシェリヒア・コリ
W1485 lip2(ATCC25645)(lip-)を選択し、H+-ATPaseの
Ｆ1のαサブユニットに変異を持つエシェリヒア・コリ
AN718 (CGSC6308) (F-, entA403, pyrE41, atpA401, ar
gH1,rspL109,λ-, supE44)の変異遺伝子であるatpA401
を供与遺伝子としてP1kcファージによって形質導入する
ことにより、リポ酸要求性かつ H+-ATPase が欠失した
変異株エシェリヒア・コリAJ12631(FERM P-12381)を取
得した。
【００１６】まず、エシェリヒア・コリ AN718株由来の
H+-ATPase欠失変異を、リポ酸要求性ピルビン酸生産菌
であるエシェリヒア・コリ W1485 lip2(ATCC25645)(lip
-)に形質導入し目的株を選択する際、コロニー１個づつ
について、直接H+-ATPase欠失の有無を調べるには多大
の労力を必要とする。そこで効率よく目的株を得るため
に、atpA401遺伝子（83分）の近傍に位置するbgl遺伝子
（82-83分）をマーカーとして利用することにした。bgl
遺伝子はホスホ−β−グルコシダーゼをコードしてお
り、この遺伝子上に変異を持つエシェリヒア・コリは、
通常資化することのできないサリシンを唯一の炭素源と
して生育できるようになり、平板培地にBromothymol bl
ue(BTB)を添加しておくとサリシン資化性株のコロニー
は自ら生産した有機酸によって黄色に着色する。このこ
とを利用して、変異bgl遺伝子(bgl+)とatpA401遺伝子を
P1kc（IFO20008）によって連鎖形質導入すれば、サリ
シンを唯一の炭素源とする培地で生育できることを示標
として、ポジティブ・セレクションにより効率よくH+-A
TPase欠失変異株を選択することができる。
H+-ATPase欠失変異を、リポ酸要求性ピルビン酸生産菌
であるエシェリヒア・コリ W1485 lip2(ATCC25645)(lip
-)に形質導入し目的株を選択する際、コロニー１個づつ
について、直接H+-ATPase欠失の有無を調べるには多大
の労力を必要とする。そこで効率よく目的株を得るため
に、atpA401遺伝子（83分）の近傍に位置するbgl遺伝子
（82-83分）をマーカーとして利用することにした。bgl
遺伝子はホスホ−β−グルコシダーゼをコードしてお
り、この遺伝子上に変異を持つエシェリヒア・コリは、
通常資化することのできないサリシンを唯一の炭素源と
して生育できるようになり、平板培地にBromothymol bl
ue(BTB)を添加しておくとサリシン資化性株のコロニー
は自ら生産した有機酸によって黄色に着色する。このこ
とを利用して、変異bgl遺伝子(bgl+)とatpA401遺伝子を
P1kc（IFO20008）によって連鎖形質導入すれば、サリ
シンを唯一の炭素源とする培地で生育できることを示標
として、ポジティブ・セレクションにより効率よくH+-A
TPase欠失変異株を選択することができる。
【００１７】そこでまず、AN718株からのサリシン資化
性(bgl+)株の分離を行った。分離は次のように行なっ
た。まず、L-brothで37℃一夜培養したAN718株を、炭素
源をサリシン5 g/lとし、BTBを0.2 g/l添加した表１に
示したAN718培地に107-108cells/ plateの菌体を塗抹
接種して、37℃で２日間培養後に出現した黄色のコロニ
ーを釣り上げた。このようにして取得した株をAN718(bg
l+)とした。
性(bgl+)株の分離を行った。分離は次のように行なっ
た。まず、L-brothで37℃一夜培養したAN718株を、炭素
源をサリシン5 g/lとし、BTBを0.2 g/l添加した表１に
示したAN718培地に107-108cells/ plateの菌体を塗抹
接種して、37℃で２日間培養後に出現した黄色のコロニ
ーを釣り上げた。このようにして取得した株をAN718(bg
l+)とした。
【００１８】
【表１】
【００１９】上記のようにして取得したAN718(bgl+)
が、Ｆ1-ATPase活性を欠失していることの確認をおこな
った。確認の方法は、AN718(bgl+)株のコハク酸非資化
性を確認し、さらにＦ1-ATPase活性を測定することによ
って行った。
が、Ｆ1-ATPase活性を欠失していることの確認をおこな
った。確認の方法は、AN718(bgl+)株のコハク酸非資化
性を確認し、さらにＦ1-ATPase活性を測定することによ
って行った。
【００２０】コハク酸非資化性については、H+-ATPase
欠失変異株が基質レベルのリン酸化によってATPを獲得
できるグルコースのような炭素源には生育できるが、コ
ハク酸のような炭素源ではそれができないため生育でき
ないことを利用してＦ1-ATPase活性の欠失を確認してい
る。実際、炭素源をグルコースあるいはコハク酸とした
AN718培地にエシェリヒア・コリAN718(bgl+)を塗抹接種
した結果、グルコース資化性は有するが、コハク酸資化
性の無いことを確認した。
欠失変異株が基質レベルのリン酸化によってATPを獲得
できるグルコースのような炭素源には生育できるが、コ
ハク酸のような炭素源ではそれができないため生育でき
ないことを利用してＦ1-ATPase活性の欠失を確認してい
る。実際、炭素源をグルコースあるいはコハク酸とした
AN718培地にエシェリヒア・コリAN718(bgl+)を塗抹接種
した結果、グルコース資化性は有するが、コハク酸資化
性の無いことを確認した。
【００２１】またこの株のＦ1-ATPase活性を小林の方法
で測定した。本法はATPから遊離するリン酸を硫酸酸性
下でモリブデンと反応呈色させ、そのＯＤ660を測定す
ることを原理とするが、膜からＦ1成分を遊離させて活
性測定することから、Ｆ0成分の変化は確認されず、Ｆ1
-ATPase活性のみを測定することができる。H+-ATPaseＦ
1標品の調製法を以下に示した。なお操作はすべて４℃
または氷冷下で行った。
で測定した。本法はATPから遊離するリン酸を硫酸酸性
下でモリブデンと反応呈色させ、そのＯＤ660を測定す
ることを原理とするが、膜からＦ1成分を遊離させて活
性測定することから、Ｆ0成分の変化は確認されず、Ｆ1
-ATPase活性のみを測定することができる。H+-ATPaseＦ
1標品の調製法を以下に示した。なお操作はすべて４℃
または氷冷下で行った。
【００２２】まずL-brothで対数増殖後期まで培養した
菌体を9000rpm、４℃、５分間の遠心分離で集め、30mM
NaClを含む10mMトリス塩酸緩衝液(pH7.20)で３回洗浄
後、湿菌体１gに対して５mlの２mMのトリス塩酸緩衝液
(pH7.20)に懸濁した。この４mlを20W、５分間超音波処
理し、10000g、10分間の遠心で未破壊細胞を取り除いた
後、上澄みを更に30000g、40分間遠心して膜画分を得
た。これを１g当り30mlの2mMトリス塩酸緩衝液(pH7.20)
に再懸濁し、再び30000g、40分間遠心してその上澄みに
メタノールを20%となるように添加したものをATPase Ｆ
1標品とした。反応は2.5mM ATP、1mM塩化マグネシウ
ム、10μg/lアルブミンを含む20mMトリス塩酸緩衝液(pH
8.40)550μlにＦ1標品50μlを添加し、37℃で開始し
た。反応10分後、0.1N塩酸溶液の添加と同時に氷冷して
反応を停止させ、リン酸発色液2.1mlを加え、室温で10
分間放置し、直ちにＯＤ660を測定した。リン酸発色液
は5N硫酸、25g/lモリブデン酸アンモニウム塩、10g/l
p-メチルアミノフェノールスルフェート＋30g/l硫酸水
素ナトリウム、脱塩水を1:1:1:4(V/V)の割合で使用前に
混合した。活性は１分間に１μmoleのATPを分解する酵
素量を１ユニットとし、比活性はタンパク質１mg当りの
ユニット数として表示した。タンパク質の定量はバイオ
ラッドプロテインアッセイキットによって行った。測定
結果は表２に示した通りで AN718 (bgl+)株は親株AN71
8と同様Ｆ1-ATPase活性が欠失していることが確認され
たのでH+-ATPase欠失変異の供与株として用いることに
した。
菌体を9000rpm、４℃、５分間の遠心分離で集め、30mM
NaClを含む10mMトリス塩酸緩衝液(pH7.20)で３回洗浄
後、湿菌体１gに対して５mlの２mMのトリス塩酸緩衝液
(pH7.20)に懸濁した。この４mlを20W、５分間超音波処
理し、10000g、10分間の遠心で未破壊細胞を取り除いた
後、上澄みを更に30000g、40分間遠心して膜画分を得
た。これを１g当り30mlの2mMトリス塩酸緩衝液(pH7.20)
に再懸濁し、再び30000g、40分間遠心してその上澄みに
メタノールを20%となるように添加したものをATPase Ｆ
1標品とした。反応は2.5mM ATP、1mM塩化マグネシウ
ム、10μg/lアルブミンを含む20mMトリス塩酸緩衝液(pH
8.40)550μlにＦ1標品50μlを添加し、37℃で開始し
た。反応10分後、0.1N塩酸溶液の添加と同時に氷冷して
反応を停止させ、リン酸発色液2.1mlを加え、室温で10
分間放置し、直ちにＯＤ660を測定した。リン酸発色液
は5N硫酸、25g/lモリブデン酸アンモニウム塩、10g/l
p-メチルアミノフェノールスルフェート＋30g/l硫酸水
素ナトリウム、脱塩水を1:1:1:4(V/V)の割合で使用前に
混合した。活性は１分間に１μmoleのATPを分解する酵
素量を１ユニットとし、比活性はタンパク質１mg当りの
ユニット数として表示した。タンパク質の定量はバイオ
ラッドプロテインアッセイキットによって行った。測定
結果は表２に示した通りで AN718 (bgl+)株は親株AN71
8と同様Ｆ1-ATPase活性が欠失していることが確認され
たのでH+-ATPase欠失変異の供与株として用いることに
した。
【００２３】
【表２】
【００２４】次に W1485lip2 株へのH+-ATPase欠失変異
の導入を行った。AN718 (bgl+)株にP1kcを常法通り感染
させ、5.3×109PFU/mlの溶菌液を得た。このlysateを用
いてW1485lip2株に形質導入を行った。すなわちW1485li
p2のL-broth一夜培養液に塩化カルシウムを10mMになる
ように添加し、ファージ液をmoi(multiplicity of infe
ction)が0.2-0.02になるようにL-brothで希釈したもの
と0.5mlづつ混合して、37℃で15ー20分ファージを吸着さ
せた。これにクエン酸ナトリウムを10mMになるように添
加して遠心集菌後、10mMクエン酸ナトリウムを含む生理
食塩水で３回洗浄し、この0.1mlづつを、炭酸源をサリ
シン5g/lに置き換え、BTB 0.2g/l、DL-リポ酸20μg/l
を含むM9平板培地に塗抹し、37℃で２日培養した。その
結果、W1485lip2のサリシン資化性株の自然突然変異株
出現率が1×10-7であるのに対し形質導入を行った場合
にはmoi0.2で、3×10-5、moi0.02で1.25×10-6と10-100
倍高い頻度であった。これらのサリシン資化性コロニー
を同じ培地でコロニー分離し、分離株を塗抹試験によっ
てコハク酸の非資化性及び親株の性質であるリポ酸要求
性の確認を行った。コハク酸の非資化性については、炭
素源をグルコースあるいはコハク酸とし、DL-リポ酸20
μg/l、カザミノ酸1g/lを添加したM9平板培地での生
育、リポ酸要求性はM9平板培地にDL-リポ酸20μg/l添
加、無添加での生育を調べることで判定した。その結
果、コハク酸非資化性かつリポ酸要求性を示す菌株とし
てエシェリヒア・コリAJ12631が得られ、この株のＦ1-A
TPase活性を上記方法で測定したところ、表２に示した
ように活性が検出されなかった。
の導入を行った。AN718 (bgl+)株にP1kcを常法通り感染
させ、5.3×109PFU/mlの溶菌液を得た。このlysateを用
いてW1485lip2株に形質導入を行った。すなわちW1485li
p2のL-broth一夜培養液に塩化カルシウムを10mMになる
ように添加し、ファージ液をmoi(multiplicity of infe
ction)が0.2-0.02になるようにL-brothで希釈したもの
と0.5mlづつ混合して、37℃で15ー20分ファージを吸着さ
せた。これにクエン酸ナトリウムを10mMになるように添
加して遠心集菌後、10mMクエン酸ナトリウムを含む生理
食塩水で３回洗浄し、この0.1mlづつを、炭酸源をサリ
シン5g/lに置き換え、BTB 0.2g/l、DL-リポ酸20μg/l
を含むM9平板培地に塗抹し、37℃で２日培養した。その
結果、W1485lip2のサリシン資化性株の自然突然変異株
出現率が1×10-7であるのに対し形質導入を行った場合
にはmoi0.2で、3×10-5、moi0.02で1.25×10-6と10-100
倍高い頻度であった。これらのサリシン資化性コロニー
を同じ培地でコロニー分離し、分離株を塗抹試験によっ
てコハク酸の非資化性及び親株の性質であるリポ酸要求
性の確認を行った。コハク酸の非資化性については、炭
素源をグルコースあるいはコハク酸とし、DL-リポ酸20
μg/l、カザミノ酸1g/lを添加したM9平板培地での生
育、リポ酸要求性はM9平板培地にDL-リポ酸20μg/l添
加、無添加での生育を調べることで判定した。その結
果、コハク酸非資化性かつリポ酸要求性を示す菌株とし
てエシェリヒア・コリAJ12631が得られ、この株のＦ1-A
TPase活性を上記方法で測定したところ、表２に示した
ように活性が検出されなかった。
【００２５】（実施例２ 発酵法によるピルビン酸の生
産）エシェリヒア・コリAJ12631株のピルビン酸生産能
をジャーファーメンターを用いて培養評価し、親株W148
5lip2と比較した。培養方法は次の通りである。培養温
度はすべて37℃である。W1485lip2株は、LA培地（表
３）にDL-リポ酸を20μg/l添加した寒天平板培地で一夜
培養した菌体１白金耳分を、DL-リポ酸を２μg/l含むLB
培地（表４）120mlに接種し18時間振とう培養して前培
養菌液を得た。またAJ12631株はLuria broth培地にDL-
リポ酸20μg/lと寒天20 g/lを含む寒天平板培地で一夜
培養後、菌体１白金耳分を、グルコース2g/lおよびDL-
リポ酸2μg/lを添加した120mlのLB培地に接種し、18時
間振とう培養し前培養菌液を得た。また比較のため親株
もAJ12631と同じグルコース添加培地で培養して前培養
菌液を調製した。ジャー培養用のピルビン酸生産培地の
組成は表５に示した。この培地３lを５l容のミニジャー
ファーメンターに分注し、120℃、10分間滅菌した。前
培養菌液120ml全量を接種し、通気３l/min、撹拌600rp
m、３N NaOHでpH6.0にコントロールしつつ、培養した。
培養中発泡が激しいときには消泡剤(LG109,旭電化製)を
一滴添加した。培養液中のピルビン酸はHPLC、グルコー
スはグルコースオキシダーゼによる酵素法、生育はＯＤ
590によって測定した。その結果、表６に示したよう
に、AJ12631では親株に比べて著しいピルビン酸生産性
の向上が認められた。すなわち、ピルビン酸生産量は親
株W1485lip2が前培養にグルコース無添加で48時間後に1
4.3g/l、前培養にグルコースを添加した場合が40時間で
12.7g/lであったのに対し、AJ12631株では40時間でグル
コースを消費し、最大生産量が29.2g/lと、糖消費促
進、ピルビン酸生産量および速度の著しい向上が認めら
れた。
産）エシェリヒア・コリAJ12631株のピルビン酸生産能
をジャーファーメンターを用いて培養評価し、親株W148
5lip2と比較した。培養方法は次の通りである。培養温
度はすべて37℃である。W1485lip2株は、LA培地（表
３）にDL-リポ酸を20μg/l添加した寒天平板培地で一夜
培養した菌体１白金耳分を、DL-リポ酸を２μg/l含むLB
培地（表４）120mlに接種し18時間振とう培養して前培
養菌液を得た。またAJ12631株はLuria broth培地にDL-
リポ酸20μg/lと寒天20 g/lを含む寒天平板培地で一夜
培養後、菌体１白金耳分を、グルコース2g/lおよびDL-
リポ酸2μg/lを添加した120mlのLB培地に接種し、18時
間振とう培養し前培養菌液を得た。また比較のため親株
もAJ12631と同じグルコース添加培地で培養して前培養
菌液を調製した。ジャー培養用のピルビン酸生産培地の
組成は表５に示した。この培地３lを５l容のミニジャー
ファーメンターに分注し、120℃、10分間滅菌した。前
培養菌液120ml全量を接種し、通気３l/min、撹拌600rp
m、３N NaOHでpH6.0にコントロールしつつ、培養した。
培養中発泡が激しいときには消泡剤(LG109,旭電化製)を
一滴添加した。培養液中のピルビン酸はHPLC、グルコー
スはグルコースオキシダーゼによる酵素法、生育はＯＤ
590によって測定した。その結果、表６に示したよう
に、AJ12631では親株に比べて著しいピルビン酸生産性
の向上が認められた。すなわち、ピルビン酸生産量は親
株W1485lip2が前培養にグルコース無添加で48時間後に1
4.3g/l、前培養にグルコースを添加した場合が40時間で
12.7g/lであったのに対し、AJ12631株では40時間でグル
コースを消費し、最大生産量が29.2g/lと、糖消費促
進、ピルビン酸生産量および速度の著しい向上が認めら
れた。
【００２６】
【表３】
【００２７】
【表４】
【００２８】
【表５】
【００２９】
【表６】
【００３０】さらにこの表６の結果から、残糖を10g/l
以上残しピルビン酸蓄積量の上昇する時点でのグルコー
ス消費量当りの菌体形成量(生育／ク゛ルコース)と、ピルビ
ン酸生成量(ヒ゜ルヒ゛ン酸／ク゛ルコース)をそれぞれ算出し、
その比を求めて菌体当りのピルビン酸生成量(ヒ゜ルヒ゛ン
酸／生育)を表７に示した。
以上残しピルビン酸蓄積量の上昇する時点でのグルコー
ス消費量当りの菌体形成量(生育／ク゛ルコース)と、ピルビ
ン酸生成量(ヒ゜ルヒ゛ン酸／ク゛ルコース)をそれぞれ算出し、
その比を求めて菌体当りのピルビン酸生成量(ヒ゜ルヒ゛ン
酸／生育)を表７に示した。
【００３１】
【表７】
【００３２】消費糖（グルコース）当りの生育及びピル
ビン酸収率とその比を見てみると、グルコース1g当りの
生育量は、親株W1485lip2（グルコース無添加前培養）
の方がAJ12631よりも1.4倍高いのに対し、ピルビン酸蓄
積量はAJ12631の方が2.0倍も親株より高く、菌体当りの
ピルビン酸生産量ではAJ12631の方が2.8倍も高かった。
さらに、理論的にはグルコース１モルから２モルのピル
ビン酸が生成するが、菌体形成にグルコースが使われた
ことを無視してピルビン酸のモル収率を求めると、W148
5lip2、AJ12631はそれぞれ33%,65%となり、H+-ATPase欠
失変異を付与することによって、グルコースからピルビ
ン酸への転換効率が高められることが分かった。
ビン酸収率とその比を見てみると、グルコース1g当りの
生育量は、親株W1485lip2（グルコース無添加前培養）
の方がAJ12631よりも1.4倍高いのに対し、ピルビン酸蓄
積量はAJ12631の方が2.0倍も親株より高く、菌体当りの
ピルビン酸生産量ではAJ12631の方が2.8倍も高かった。
さらに、理論的にはグルコース１モルから２モルのピル
ビン酸が生成するが、菌体形成にグルコースが使われた
ことを無視してピルビン酸のモル収率を求めると、W148
5lip2、AJ12631はそれぞれ33%,65%となり、H+-ATPase欠
失変異を付与することによって、グルコースからピルビ
ン酸への転換効率が高められることが分かった。
【００３３】このように、AJ12631に代表されるリポ酸
要求性かつH+-ATPase欠失変異株でピルビン酸が蓄積す
るのには、エネルギー獲得が効率の悪い基質レベルのリ
ン酸化のみとなるため、菌体内のATPレベルが低下し、
結果として解糖系が活性化されるためであると推定され
る。
要求性かつH+-ATPase欠失変異株でピルビン酸が蓄積す
るのには、エネルギー獲得が効率の悪い基質レベルのリ
ン酸化のみとなるため、菌体内のATPレベルが低下し、
結果として解糖系が活性化されるためであると推定され
る。
【００３４】
【発明の効果】本発明において使用される変異株は親株
に比べて著しいピルビン酸生産性の向上が認められた。
すなわち、ピルビン酸蓄積量増大、糖消費促進、ピルビ
ン酸生産速度の著しい向上が認められた。また、グルコ
ースからピルビン酸への転換効率も高められた。
に比べて著しいピルビン酸生産性の向上が認められた。
すなわち、ピルビン酸蓄積量増大、糖消費促進、ピルビ
ン酸生産速度の著しい向上が認められた。また、グルコ
ースからピルビン酸への転換効率も高められた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 7/50 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (1)
- 【請求項１】エシェリヒア・コリ種に属し、生育のため
にリポ酸を要求し、かつH+-ATPaseを欠失し、更にピル
ビン酸生産能を有する変異株
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30196591A JP2692457B2 (ja) | 1991-11-18 | 1991-11-18 | 発酵法によるピルビン酸の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30196591A JP2692457B2 (ja) | 1991-11-18 | 1991-11-18 | 発酵法によるピルビン酸の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05137568A JPH05137568A (ja) | 1993-06-01 |
| JP2692457B2 true JP2692457B2 (ja) | 1997-12-17 |
Family
ID=17903262
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP30196591A Expired - Fee Related JP2692457B2 (ja) | 1991-11-18 | 1991-11-18 | 発酵法によるピルビン酸の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2692457B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5888783A (en) * | 1994-08-30 | 1999-03-30 | Ajinomoto Co., Inc. | Methods for producing L-valine and L-leucine |
| EP2611764A4 (en) * | 2010-08-30 | 2016-12-14 | Arzeda Corp | FERMENTATION ROUTE FOR THE PRODUCTION OF LÉVULINIC ACID, LEVULINATE ESTERS, VALÉROLACTONE, AND CERTAIN OF THEIR DERIVATIVES |
| JP6583759B1 (ja) * | 2018-11-22 | 2019-10-02 | 勝 枦 | Ｄｎａを改変したり、新たに核酸を導入した細胞を抗生物質を利用せずに確認、選抜する方法 |
-
1991
- 1991-11-18 JP JP30196591A patent/JP2692457B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH05137568A (ja) | 1993-06-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3966583B2 (ja) | 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法 | |
| JP3698742B2 (ja) | 光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸の製造法 | |
| US5166061A (en) | Process for the production of 4-halo-3-hydroxybutyronitrile with Corynebacterium or Microbacterium | |
| US5238827A (en) | Process for preparing glycine from glycinonitrile | |
| JP2692457B2 (ja) | 発酵法によるピルビン酸の製造法 | |
| Tani et al. | Production of L-Serine by a methanol-utilizing bacterium, Arthrobacter globiformis SK-200 | |
| IE69844B1 (en) | Microbiological process for the preparation of 6-hydroxypicolinic acid | |
| US4492757A (en) | Process for preparing L-threonine | |
| EP0389620B1 (en) | Process for preparing pyruvic acid by fermentation | |
| JPH09173057A (ja) | ε−ポリ−Ｌ−リジンを著量に生産する菌株及びそれを用いたε−ポリ−Ｌ−リジンの製造法 | |
| CA1302931C (en) | Preparation of pyruvic acid | |
| JPH0740945B2 (ja) | 発酵法によるピルビン酸の製造法 | |
| US5496715A (en) | Process for preparing indigo | |
| JPS6262156B2 (ja) | ||
| EP0567644B1 (en) | Process for producing l-alanine by fermentation | |
| JP3006907B2 (ja) | 発酵法によるｌ−アラニンの製造法 | |
| JP3413294B2 (ja) | ２，５−ジヒドロキシピリジンの製造法および２，５−ジヒドロキシピリジン生産菌 | |
| WO1992018637A1 (en) | Method for the production of d-gluconic acid | |
| US4430429A (en) | Production of vitamin B12 -activity substances | |
| EP0295622B1 (en) | Process for producing l-tryptophan | |
| JP3173176B2 (ja) | Ｓ（＋）−シトラマル酸の製造方法 | |
| JPH0591895A (ja) | Ｄ−セリンの製造法 | |
| JPS6228678B2 (ja) | ||
| WO1991003546A1 (fr) | Levure riche en arginine | |
| JPS58158190A (ja) | Ｄ（−）−β−ヒドロキシ酪酸の製造法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090905 Year of fee payment: 12 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090905 Year of fee payment: 12 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100905 Year of fee payment: 13 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Year of fee payment: 13 Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100905 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Year of fee payment: 13 Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100905 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Year of fee payment: 13 Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100905 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |