JP6583759B1 - Dnaを改変したり、新たに核酸を導入した細胞を抗生物質を利用せずに確認、選抜する方法 - Google Patents
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Abstract
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大腸菌Escherichia coli JM109株(供給源:国立遺伝学研究所)を塗抹したLB培地を37℃で一晩増殖させた。その大腸菌を0.05Mの塩化カルシウム溶液に入れ、氷冷した。そこにプラスミドpUC19を入れ、氷冷後、ヒートショックを行って、氷冷した。その後、LB液体培地(LB Broth,Miller(Luria−Bertani)、Difco Laboratoriesより作製)を加えて、大腸菌を回復させた。プラスミドを加えていないものも同様に行い、対照実験とした。
NH4Cl、KH2PO4、Na2HPO4、NaCl、MgSO4、CaCl2を含み、グルコースを除いた一般的なM9培地を作製し、BTB溶液を培養するときの終濃度が20%になるように、ラクトースを培養するときの終濃度が終濃度0.5%になるようにを加えて、改良M9液体培地を作製した。
実施例1で形質転換の操作後、回復させた大腸菌が懸濁されているLB液体培地の一部を実施例2で作製した改良M9培地に加えて、混合した。37℃で培養した。その結果、プラスミドを加えて形質転換した大腸菌が含まれているものは、改良M9培地が青色から緑、そして黄色に変化していった。なお、色は、時間がたつごとに変化していく様子がよくわかり、形質転換した細胞が増えていくことを視覚的にとられることができた。対照実験で行ったプラスミドを加えていないものは、青色のままだった。
ジメチルホルムアミドに溶かしたX−galが終濃度0.004%なるように加えたLB寒天培地(X−gal)、X−galが終濃度0.004%、IPTGが終濃度0.1mMになるように加えたLB寒天培地(X−gal/IPTG)を作製した。LB寒天培地(X−gal)とLB寒天培地(X−gal/IPTG)に実施例3で得た改良M9培地中の大腸菌を塗抹し、37℃培養した。その結果、どちらの寒天培地でも、白色のコロニー(形質転換していない大腸菌)と青色のコロニー(形質転換している大腸菌のコロニー)が出現し、容易に形質転換している大腸菌を選抜できることが確認された。また、液体培地で色の変化がないものは青色のコロニーが出現せず、液体培地で少ししか色が変化していないものを塗布した寒天培地では青色のコロニーの割合が少なく、液体培地で色がかなり変化しているものを塗布した寒天培地では青色のコロニーが多かった。
Claims (10)
- 微生物の細胞を形質転換の操作後、形質転換体がつくる物質によって色が変わる試薬または指示薬を含んだ形質転換体のみが増殖する液体の培地に加えることで、色が変化するかどうかで形質転換した細胞の有無を確認する方法。
- 微生物の細胞を形質転換の操作後、形質転換体がつくる物質によって色が変わる試薬または指示薬を含んだ形質転換体のみが増殖する液体の培地に加えることで、時間がたつごとに形質転換した細胞が増殖していく様子を色の変化を通して確認する方法。
- 微生物の細胞を形質転換の操作後、形質転換体がつくる物質によって色が変わる試薬または指示薬を含んだ形質転換体のみが増殖する液体の培地で培養した液体を形質転換体を選抜する固体培地に塗抹することで、固体培地上に現れるコロニーを観察することにより、形質転換した細胞のコロニーの有無を確認する方法。
- 微生物の細胞を形質転換の操作後、形質転換体がつくる物質によって色が変わる試薬または指示薬を含んだ形質転換体のみが増殖する液体の培地で培養した液体を形質転換体を選抜する固体培地に塗抹することで、固体培地上に現れるコロニーのうち、形質転換した細胞のコロニーの割合を測定することで、形質転換体のみが増殖する液体培地での培養時間の違いによって、形質転換した細胞のコロニーの割合が変化してくることを確認する方法。
- DNAを改変するか、または、新たな核酸を導入する操作をし、DNAが改変された細胞または新たな核酸が導入された細胞と、DNAが改変されなかった細胞または新たな核酸が導入されなかった細胞がどの程度ずつ混ざっているかわからない状態の細胞の集まりを、DNAが改変された細胞または新たな核酸が導入された細胞がつくる物質によって色が変わる試薬または指示薬を含み、かつDNAが改変された細胞または新たな核酸が導入された細胞のみが増殖する液体の培地に加えることで、色が変化するかどうかでDNAが改変された細胞または新たな核酸が導入された細胞の有無を確認する方法。
- DNAを改変するか、または、新たな核酸を導入する操作をし、DNAが改変された細胞または新たな核酸が導入された細胞と、DNAが改変されなかった細胞または新たな核酸が導入されなかった細胞がどの程度ずつ混ざっているかわからない状態の細胞の集まりを、DNAが改変された細胞または新たな核酸が導入された細胞がつくる物質によって色が変わる試薬または指示薬を含み、かつDNAが改変された細胞または新たな核酸が導入された細胞のみが増殖する液体の培地に加えることで、時間がたつごとにDNAが改変された細胞または新たな核酸が導入された細胞が増殖していく様子を色の変化を通して確認する方法。
- DNAを改変するか、または、新たな核酸を導入する操作をし、DNAが改変された細胞または新たな核酸が導入された細胞と、DNAが改変されなかった細胞または新たな核酸が導入されなかった細胞がどの程度ずつ混ざっているかわからない状態の細胞の集まりを、DNAが改変された細胞または新たな核酸が導入された細胞がつくる物質によって色が変わる試薬または指示薬を含み、かつDNAが改変された細胞または新たな核酸が導入された細胞のみが増殖する液体の培地で培養した液体を形質転換体を選抜する固体培地に塗抹することで、固体培地上に現れるコロニーを観察することにより、DNAが改変された細胞または新たな核酸が導入された細胞のコロニーの有無を確認する方法。
- DNAを改変するか、または、新たな核酸を導入する操作をし、DNAが改変された細胞または新たな核酸が導入された細胞と、DNAが改変されなかった細胞または新たな核酸が導入されなかった細胞がどの程度ずつ混ざっているかわからない状態の細胞の集まりを、DNAが改変された細胞または新たな核酸が導入された細胞がつくる物質によって色が変わる試薬または指示薬を含み、かつDNAが改変された細胞または新たな核酸が導入された細胞のみが増殖する液体の培地で培養した液体を形質転換体を選抜する固体培地に塗抹することで、固体培地上に現れるコロニーのうち、DNAが改変された細胞または新たな核酸が導入された細胞のコロニーの割合を測定することで、DNAが改変された細胞または新たな核酸が導入された細胞のみが増殖する液体培地での培養時間の違いによって、DNAが改変された細胞または新たな核酸が導入された細胞のコロニーの割合が変化してくることを確認する方法。
- 請求項1、2、3、4、5、6、7、8のいずれかを、抗生物質を用いずに行う方法。
- β−ガラクトシダーゼをコードする1acZ遺伝子を含むベクターを、β−ガラクトシダーゼの活性がない大腸菌に導入し、その形質転換体がβ−ガラクトシダーゼ活性を有するようになることを利用することで、抗生物質を用いることなく、請求項1、2、3、4、5、6、7、8のいずれかを行う方法。
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