WO2024005122A1 - 微生物の分析の準備方法、および、微生物の分析方法 - Google Patents

微生物の分析の準備方法、および、微生物の分析方法 Download PDF

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WO2024005122A1
WO2024005122A1 PCT/JP2023/024121 JP2023024121W WO2024005122A1 WO 2024005122 A1 WO2024005122 A1 WO 2024005122A1 JP 2023024121 W JP2023024121 W JP 2023024121W WO 2024005122 A1 WO2024005122 A1 WO 2024005122A1
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WO
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medium
microorganisms
microorganism
analysis
asr
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PCT/JP2023/024121
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English (en)
French (fr)
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浩一 児嶋
友騎 若林
駿弥 西嶋
淳子 坂田
Original Assignee
株式会社島津製作所
地方独立行政法人大阪健康安全基盤研究所
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/24—Methods of sampling, or inoculating or spreading a sample; Methods of physically isolating an intact microorganisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/62—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating the ionisation of gases, e.g. aerosols; by investigating electric discharges, e.g. emission of cathode
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material

Definitions

  • the present invention relates to a preparation method for microorganism analysis and a microorganism analysis method.
  • the order Enteobacteriales is known to include pathogenic bacteria such as enterohemorrhagic Escherichia coli, Salmonella, Shigella, and Yersinia pestis.
  • the order Enterobacteriaceae also includes bacteria that are the subject of epidemiological investigations into food poisoning. Classifying and analyzing microorganisms of the order Enterobacteriaceae, including these important bacterial groups, is important in microbial research and medical practice.
  • Patent Document 1 As one of the classification and analysis of microorganisms belonging to the order Enterobacteriaceae, International Publication No. 2020/202861 (Patent Document 1) states that when some strains belonging to the order Enterobacteriaceae are cultured under appropriate conditions, It has been shown to produce acid shock proteins. It is also disclosed that different acid shock protein peaks were found in the mass spectra of different strains.
  • the present disclosure has been made to solve such problems, and its purpose is to easily detect when microorganisms produce acid shock proteins and recover them.
  • a method for preparing for analysis of microorganisms is a method for preparing for analysis of microorganisms using acid shock protein, comprising the steps of preparing one or more media containing a pH indicator; a step of culturing the microorganism in a medium under specific conditions; a step of identifying the color of the medium and detecting when the microorganism produces acid shock protein based on the identification result; and collecting the microorganism for analysis at the time of producing the microorganism.
  • FIG. 5 is a flowchart illustrating preparation for analysis and processing for analysis according to the first embodiment.
  • 3 is a flowchart showing preparation for microbial analysis and processing for analysis according to Embodiment 2.
  • FIG. It is a figure showing the change in color over time in each of the first medium and the second medium.
  • FIG. 3 is a diagram showing mass spectra of microorganisms recovered from each of the first medium and the second medium.
  • FIG. 3 is a diagram showing mass spectra of microorganisms recovered from each of the first medium and the second medium. It is a figure showing the change in the color of the medium during overculture.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the configuration of an analyzer 1.
  • the analyzer 1 is a mass spectrometer for performing mass spectrometry of a substance contained in a sample, and is, for example, a MALDI-TOF MS (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry).
  • the analyzer 1 corresponds to an example of a "mass spectrometer" in this specification.
  • the sample is a sample derived from a microorganism belonging to the order Enterobacteriales.
  • the sample contains a target substance, which is a molecule to be analyzed.
  • the sample may include a standard substance (calibrant), which is a molecule used to calibrate the mass spectrum.
  • the analysis in the analyzer 1 includes detecting a peak in a mass spectrum and measuring the mass-to-charge ratio (m/z) of a specific or non-specific substance contained in the sample.
  • the substance is a protein and the substance of interest is an acid shock protein.
  • the analysis in the analyzer 1 is to determine whether a specific substance is contained in the sample based on the m/z (hereinafter also referred to as "actual m/z") indicated by the peak on the mass spectrum. , calculating the concentration of a particular substance in the sample, and classifying microorganisms contained in the sample.
  • Classifying microorganisms includes determining the classification of the microorganism. In this specification, unless otherwise specified, the classification of microorganisms refers to classification at at least one level such as family, genus, species, strain, etc.
  • classifying microorganisms includes determining whether the microorganisms are included in a predetermined classification. Furthermore, classifying microorganisms includes identifying whether a certain microorganism is included in a different classification from other microorganisms.
  • analysis device 1 includes a control section 10 and a measurement section 20.
  • the measurement unit 20 ionizes a substance (for example, protein) in the sample using a high voltage, separates the ions S according to the flight time correlated to m/z, and then detects the ions.
  • the measurement section 20 includes an ionization section 21, an ion acceleration section 22, a mass separation section 23, and a detection section 24.
  • the movement of ions S in the measuring section 20 is schematically shown by arrow A1.
  • the ionization unit 21 ionizes the substance in the sample by matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI).
  • MALDI matrix-assisted laser desorption ionization
  • any soft ionization method such as the electrospray ionization (ESI) method can be used.
  • ESI electrospray ionization
  • the ionization unit 21 includes a sample plate holder (not shown) that supports the sample plate, and an ion source that includes a laser device (not shown) that irradiates the sample plate with laser light. After the sample is placed in the sample plate, a matrix is added to the sample and the sample is allowed to dry. Thereafter, the sample plate is placed in a sample plate holder within the vacuum container of the ionization section 21.
  • the type of matrix is not particularly limited, it is preferable to use sinapinic acid or ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) from the viewpoint of efficiently ionizing the protein sample.
  • CHCA sinapinic acid or ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid
  • the ionization unit 21 reduces the pressure of the vacuum container in which the sample plate is installed, and then irradiates each sample on the sample plate with laser light to sequentially ionize the sample.
  • the type of laser device that irradiates laser light is not particularly limited as long as it can emit light that is absorbed by the selected matrix.
  • the matrix contains sinapinic acid or CHCA, N2 laser (wavelength 337 nm), etc. can be suitably used.
  • the ions S ionized in the ionization section 21 are extracted by an electric field by an extraction electrode (not shown) and introduced into the ion acceleration section 22 .
  • the ion acceleration unit 22 includes an acceleration electrode 221 and accelerates the introduced ions S.
  • the flow of accelerated ions S is appropriately focused by an ion lens (not shown) and introduced into the mass separation unit 23.
  • the mass separation unit 23 includes a flight tube 231, and separates the ions S based on the difference in flight time when each ion S flies inside the flight tube 231.
  • a linear type flight tube 231 is shown, but a reflectron type, multiturn type, etc. may also be used.
  • the mass spectrometry method is not particularly limited as long as the ions S contained in the sample can be separated and detected.
  • the detection unit 24 includes an ion detector such as a multi-channel plate, detects the ions S separated by the mass separation unit 23, and outputs a detection signal with an intensity corresponding to the number of ions incident on the detection unit 24.
  • the detection signal output from the detection section 24 is input to the processing section 11 of the control section 10.
  • FIG. 1 the flow of a detection signal of ions S from the detection section 24 of the measurement section 20 is schematically shown by an arrow A2.
  • the control unit 10 includes a processing unit 11, a storage unit 12, and an input/output unit 13.
  • the processing unit 11 is configured to include a processor such as a CPU, and functions as a main body for controlling the analysis device 1 .
  • the processing unit 11 performs various processes by executing programs stored in the storage unit 12 and the like.
  • the processing unit 11 corresponds to an example of a "processor" in the present disclosure.
  • the processing unit 11 includes an apparatus control unit 111, a mass spectrum creation unit 112, a mass spectrum analysis unit 113, and a calibration unit 114.
  • the device control unit 111 controls the operation of the measurement unit 20 based on data related to analysis conditions input from the input unit 131, which will be described later.
  • control of the measurement unit 20 by the device control unit 111 is schematically shown by arrow A3.
  • the mass spectrum creation unit 112 converts the flight time into m/z from the measurement data including the detected amount of the ion detected by the detection unit 24 and the flight time of the ion, and calculates the detected amount corresponding to each m/z. Create a mass spectrum showing .
  • the mass spectrum analysis unit 113 detects a mass spectrum peak in the mass spectrum. Calculate m/z corresponding to the detected peak.
  • the mass spectrum analysis unit 113 may determine the substance to which the measured m/z indicated by the peak on the mass spectrum corresponds based on a protein database or the like. In other words, the mass spectrum analysis unit 113 can calculate the actually measured m/z of a specific or non-specific substance contained in the sample.
  • the mass spectrum analysis unit 113 further determines whether or not a specific substance is contained in the sample based on the actually measured m/z (component identification in the sample), and calculates the concentration of the specific substance in the sample. It is also possible to classify the organisms contained in the sample. More generally, the mass spectrum analysis unit 113 may perform structural analysis of a substance contained in a sample.
  • the calibration unit 114 calibrates the mass spectrum based on the actually measured m/z and theoretical m/z of the standard material.
  • Theoretical m/z is a value generally referred to as a theoretical value or theoretical m/z, and is a theoretical mass-to-charge ratio calculated in consideration of the molecular weight, added ions, and the number of charges.
  • Calibration in mass spectrometry refers to correcting the actually measured m/z of a standard material so that it approaches the theoretical m/z, and applying that correction to the entire spectrum.
  • the storage unit 12 includes a nonvolatile storage medium.
  • the storage unit 12 stores a theoretical m/z, a mass spectrum created by the mass spectrum creation unit 112, measurement data output from the measurement unit 20, a program for the processing unit 11 to execute processing, and the like.
  • the storage unit 12 corresponds to an example of "memory" in the present disclosure.
  • the input/output unit 13 is an interface through which the analyzer 1 inputs and outputs information to and from the outside.
  • the input/output section 13 includes an input section 131, an output section 132, and a communication section 133.
  • the input unit 131 includes input devices such as a mouse, a keyboard, various buttons, and/or a touch panel.
  • the input unit 131 receives information necessary for controlling the operation of the measuring unit 20, information necessary for processing performed by the processing unit 11, etc. from the user.
  • the output unit 132 includes a display device such as a liquid crystal monitor, a printer, and the like.
  • the output unit 132 displays information related to measurement by the measurement unit 20, results of processing by the processing unit 11, etc. on a display device or prints it on a paper medium.
  • the communication unit 133 is configured to include a communication device that can communicate via wireless or wired connection such as the Internet.
  • the communication unit 133 receives data necessary for processing by the processing unit 11, transmits data processed by the processing unit 11 such as determination results, and transmits and receives necessary data as appropriate.
  • control unit 10 may be placed in a computer, server, etc. that is physically separate from the measurement unit 20.
  • Microorganisms belonging to the order Enterobacteriaceae include pathogenic bacteria such as enterohemorrhagic Escherichia coli, Salmonella spp., Shigella spp., and Yersinia pestis, and may be targets to be considered in the prevention and/or treatment of infectious diseases. be. Furthermore, microorganisms belonging to the order Enterobacteriaceae are known to include important bacterial groups, such as being the subject of epidemiological surveys for food poisoning.
  • a bacterium is suspected of causing an infectious disease and/or food poisoning, it may be necessary to identify it more specifically at the genus and species level and/or at the strain level within the order Enterobacteriales. This is because the treatment policy is determined according to the identified genus and species (bacteria name), and the route of infection is identified by differentiation at the strain level. Therefore, high accuracy is required for these identifications and strain identifications.
  • Patent Document 1 As one of the analyzes of microorganisms belonging to the order Enterobacteriaceae using this MALDI, the inventors have appropriately analyzed some strains belonging to the order Enterobacteriales in International Publication No. 2020/202861 (Patent Document 1). It was shown that Asr was produced when cultured under the following conditions. Specifically, when some strains belonging to the order Enterobacteriaceae were cultured in a medium with added sugar, a peak was detected that was not detected when cultured in a medium without added sugar. Further, the peak was considered to correspond to Asr based on its molecular weight. Similarly, when some strains were cultured at low oxygen concentrations (for example, 5% or less), peaks thought to correspond to Asr were detected.
  • Patent Document 1 also discloses that different Asr patterns were found in the mass spectra of different strains.
  • the time when a microorganism produces Asr literally means “a period when Asr (acid shock protein) is physically produced through transcription, translation, and post-translational modification from a gene.” including the period in which it exists.
  • the ⁇ period of Asr production'' is defined as ⁇ Asr (acid shock protein) is already present in the microorganism (i.e., has accumulated in the cell), but transcription, translation, and/or post-translational modification has not taken place.
  • microorganisms expressing Asr can be recovered.
  • the inventors found that there are differences in the culture conditions and timing for producing Asr depending on the microorganism. For example, the inventors have discovered that different microorganisms may require different types of sugars to produce Asr. Furthermore, it has been found that even in microorganisms that produce Asr from the same type of sugar, the culture time required to produce Asr may differ.
  • the culture conditions for producing Asr may vary depending on the microorganism, so in order to confirm whether the microorganism to be analyzed is actually producing Asr, it is necessary to measure the mass spectrum of the microorganism and It was necessary to check whether the corresponding peaks were detected. In other words, in order to analyze microorganisms using Asr, it is necessary to repeat mass spectrometry many times until the microorganisms in the stage of producing Asr can be recovered, which requires time and money for the analyst. . Therefore, there has been a need for a means for easily detecting and recovering microorganisms that are in the stage of producing Asr.
  • a medium containing a pH (hydrogen ion index) indicator is prepared, and microorganisms are cultured in the medium under conditions that produce Asr. Then, based on a change in the color of the medium, it is detected that Asr is being produced. That is, the time when microorganisms produce Asr is detected. Then, at that time, the microorganisms are collected for analysis. Thereby, the time when microorganisms produce Asr can be easily detected and recovered.
  • a method for detecting the timing of producing Asr and recovering it will be explained in more detail.
  • FIG. 2 is a flowchart showing preparation for analysis of microorganisms using Asr and processing for analysis according to Embodiment 1. The steps shown in FIG. 2 are performed manually by an analyst using, for example, laboratory instruments and equipment commonly used in microbial culture and mass spectrometry. In addition, in the figure, “S” is used as an abbreviation of "STEP".
  • the analyst prepares one or more media containing a pH indicator.
  • a pH indicator For example, an analyst creates a liquid medium mixed with a pH indicator.
  • it may also include microorganisms cultured in the medium.
  • the analyst inoculates the above-mentioned medium with microorganisms.
  • an analyst mixes a suspension of microorganisms to be analyzed into the medium.
  • the analyst cultures the microorganisms in a medium under specific conditions. More specifically, the analyst cultivates the microorganism in the medium under first conditions for producing Asr. For example, the analyst places the medium in an incubator that is maintained at a temperature suitable for culturing microorganisms. Suitable temperatures for culturing microorganisms are, for example, temperatures between about 25°C and about 40°C, preferably about 37°C.
  • the analyst identifies the color of the medium and detects the time when the microorganism produces Asr based on the identification result (change in color). For example, an analyst can identify colors with the naked eye and, based on the identification results, determine when microorganisms are producing acid shock proteins.
  • the analyst collects the microorganisms for analysis at the time when they produce Asr.
  • the analyst performs analysis using Asr using the collected microorganisms. For example, an analyst places the collected microorganisms in the analyzer 1 and performs mass spectrometry.
  • S4 may be performed by a device (for example, a camera) that acquires color information of the culture medium and a device (for example, a computer) that detects when microorganisms produce acid shock proteins based on the acquired color information. good.
  • a device for example, a camera
  • a device for example, a computer
  • the pH indicator is a dye whose color changes depending on the pH.
  • the pH indicator includes, for example, at least one of bromocresol green, methyl red, litmus, bromocresol purple, bromothymol blue (BTB), phenol red, neutral red, and naphtholphthalein.
  • a single pH indicator may be used, or a plurality of pH indicators having different color change ranges may be used in combination.
  • the pH indicator is BTB. In this case, by changing the color of the medium from green to yellow, it can be detected that the neutral medium has changed to acidic.
  • the culture medium is a liquid culture medium contained in a container such as a Petri dish or a tube.
  • a container such as a Petri dish or a tube.
  • the microorganisms and the acid produced by the microorganisms spread throughout the medium, so the color change of the entire medium has the advantage of making it easier to identify changes in color in the medium.
  • color identification using a device such as a camera, it is considered convenient because there is no need to take color unevenness of the culture medium into consideration.
  • in order to create a medium unlike solid media, it is not necessary to add agar and cool and solidify it, making it easier to create a medium.
  • the pH indicator is mixed during the preparation of the medium, but it may be added after the preparation of the medium as long as it is before the microorganisms are planted.
  • the medium may be a solid medium stored in a container such as a Petri dish.
  • the fluidity since the fluidity is lower than in the case of a liquid medium, the acid produced by the microorganisms is localized only in the vicinity of the bacteria. Therefore, only the area near the bacteria changes color, not the entire medium.
  • the low fluidity has the advantage that it is easier to handle when moving the culture medium.
  • the pH indicator is mixed during the preparation of the medium, but it may be added dropwise to the surface of the medium after the medium has been cooled and solidified, as long as it is before the microorganisms are inoculated.
  • the first condition for producing Asr is, for example, at least one of the conditions that sugar is added to the first medium, the condition that it is overcultured, and the condition that it is cultured in an anaerobic state. include.
  • These conditions for producing Asr are culture conditions that the inventors have confirmed through many years of research.
  • the condition that the medium is a sugar-added medium is satisfied, for example, by adding sugar when preparing the medium in S1.
  • the sugar added to the medium is not particularly limited, but monosaccharides, disaccharides, trisaccharides, and tetrasaccharides are preferred. However, it may also be a sugar obtained by bonding five or more monosaccharides.
  • Monosaccharides added to the medium include, for example, allose, altrose, glucose, mannose, gulose, idose, galactose, talose, fucose, fuculose, rhamnose, psicose (also called allulose), fructose, sorbose, tagatose, ribose, arabinose, At least one of xylose, lyxose, ribulose, xylulose, deoxyribose, sedoheptulose, ketotetrose, erythrulose, aldotetrose, erythrose, threose, ketotriose (dihydroxyacetone), and aldotriose (glyceraldehyde).
  • ketotetrose erythrulose is preferred.
  • aldotetrose erythrose or threose is preferred.
  • One of these monosaccharides may be added, or a combination of multiple types of sugars may be used.
  • the sugar is more preferably glucose.
  • the disaccharide added to the medium is, for example, at least one of sucrose, lactose, maltose, trehalose, turanose and cellobiose, preferably lactose.
  • the trisaccharide added to the medium is, for example, at least one of raffinose, melezitose and maltotriose.
  • the tetrasaccharide added to the medium is, for example, at least one of acarbose and stachyose. Further, the range of the concentration of sugar added to the medium is preferably 0.1 wt% or more, more preferably 0.5 wt% or more.
  • overculturing refers to culturing for a first period or longer, which is longer than the period for culturing microorganisms normally used in experiments. However, the normal culture period and the first period of overculture may differ depending on the microorganism. Therefore, the condition of being overcultured may vary depending on the microorganism, but is usually satisfied by culturing a microorganism overnight and then culturing it for two nights.
  • the condition of being in an anaerobic state is usually satisfied by culturing at an oxygen concentration of 5% or less (preferably 1% or less), for example.
  • the medium cultured under the first conditions is hereinafter also referred to as the "first medium.”
  • the microorganism to be analyzed does not produce Asr, at least under the culture conditions at that time. It can be determined that More specifically, if a specific type of sugar is added to the first medium, and the first medium does not exhibit the color exhibited by the pH indicator in acidic conditions for a specific period of time, the microorganism to be analyzed will contain the specific type of sugar. It can be assumed that acid shock proteins are not produced through the metabolism of In this case, other culture conditions can be tried, such as changing the type of sugar added to produce Asr. This makes it possible to examine the conditions for microorganisms to produce Asr.
  • the bacteria can be collected after confirming that they are producing Asr based on a change in the color of the culture medium. Thereby, it is possible to cope with the case where the Asr production timing is shifted due to some factor.
  • the certain factor is, for example, that the first medium has become anaerobic without the analyst being aware of it, and Asr is being produced faster than expected.
  • the nutrients in the culture medium are insufficient and the microorganisms are not being cultured to begin with.
  • an analyst collects a portion of the liquid medium containing microorganisms for mass spectrometry.
  • a portion of the microbial colony grown on the solid medium is collected for mass spectrometry.
  • the amount of cultured microorganisms reaches the amount required for analysis during the Asr producing period.
  • the amount of collected microorganisms can be ensured.
  • the amount of bacteria can be determined by the degree of suspension of the medium.
  • determination can be made by the size or number of colonies on the medium. The analyst collects microorganisms when, for example, the amount of microorganisms is determined visually or by measurement to be sufficient for analysis.
  • the collected microorganisms or the culture medium containing microorganisms may be adjusted as appropriate before being analyzed in the analyzer 1.
  • analysis of microorganisms using other Asr may be performed, and this case is also included in S6.
  • the analysis system 100 can easily detect the time when microorganisms produce Asr in the first medium and recover the microorganisms. That is, it is possible to simplify the judgment of the timing of collecting microorganisms in the preparation stage of an experiment using Asr.
  • FIG. 3 is a flowchart showing the process for analyzing microorganisms according to the second embodiment.
  • S3 in the flowchart of FIG. 2 is changed to S3A.
  • the analyst cultivates the microorganism to be analyzed in the first medium under the first conditions, and in parallel, in a medium different from the first medium, in order to not produce Asr.
  • the microorganism to be analyzed is cultured under second conditions.
  • the second condition is that all of the following conditions are satisfied: no sugar is added to the second medium, no overculture, and no anaerobic conditions.
  • the condition that the medium is not sugar-added is satisfied, for example, by not adding sugar when preparing the medium in S1.
  • “Not overculture” refers to culture for the second period or below, which cannot be said to be overculture.
  • the second period is shorter than the first period resulting in overculture.
  • the second period may vary depending on the microorganism. Therefore, the condition that there is no overculture may vary depending on the microorganism, but for example, the condition is that the culture period is one night or less, and more specifically, the condition is that the culture period is about 18 hours or less.
  • the condition of not being in an anaerobic state is satisfied, for example, by a condition where the oxygen concentration is 10% to 15% higher than that of the first medium.
  • the medium used for culturing under the second conditions is hereinafter also referred to as "second medium.” As explained below, the second medium is a so-called control medium for the first medium.
  • microorganisms may produce Asr even in the case of overculture or culture under anaerobic conditions as described above.
  • the inventors have found that microorganisms may produce Asr even in the case of overculture or culture under anaerobic conditions as described above.
  • the culture is unintentionally overcultured or becomes anaerobic, resulting in the production of Asr.
  • the mass spectrum of such a medium is compared with the mass spectrum obtained from the first medium, Asr peaks are detected in both media, making it difficult to identify the Asr peak.
  • the analyst misunderstands that the Asr peak is not detected in the first medium either. There is a possibility. In this case, it may be incorrectly determined that the microorganism to be analyzed does not produce Asr, at least under the culture conditions (more specifically, the type of sugar added). That is, a situation may arise in which preparations for microbial analysis using Asr are delayed.
  • the preparation method for microbial analysis according to the present embodiment is superior to the comparative example in that the pH of the culture medium can be confirmed using a simpler method.
  • the first experimental example shows the case where Asr of Hafnia alvei, a member of the family Hafinidae of the order Enterobacteriaceae, was analyzed.
  • a sugar-free IFO802 medium (1 wt% high polypeptone, 0.2 wt% yeast extract, 0.1 wt% magnesium sulfate) was prepared and used.
  • a medium was prepared and used in which glucose was added to IFO802 medium at a concentration of 0.5 wt%.
  • BTB was added to each at a concentration of 0.013 wt%.
  • a small amount of a suspension of Hafnia alvei strain NBRC105685 was added to these liquid media and cultured at 37°C, and the state of coloration was observed at regular intervals.
  • FIG. 4 is a diagram showing changes in color over time in each of the first medium and the second medium.
  • FIG. 4 is a diagram schematically showing photographs taken with a camera of a culture medium housed in a Petri dish at regular intervals.
  • dense hatching for example, 61
  • coarse hatching for example, 63
  • medium hatching for example, 62
  • both the sugar-containing first medium and the sugar-free second medium were green, indicating neutrality.
  • the first medium became yellow, indicating acidity
  • the second medium became blue, indicating basicity. That is, it was considered that Asr was produced in the first medium and not in the second medium.
  • the pH indicated by the colors of the first and second media was suitable for analysis using Asr, but the amount of bacteria was too small to perform mass spectrometry, so sampling was not performed.
  • the culture was continued, and 9 hours after the start of the culture, the amount of bacteria had increased sufficiently, and the coloration remained suitable for Asr analysis, so sampling was performed.
  • Asr was prepared from the sampled bacteria, and a mass spectrum was obtained using a MALDI device (MALDI-8020, manufactured by Shimadzu Corporation).
  • FIGS. 5 and 6 are diagrams showing mass spectra of microorganisms recovered from each of the first medium and the second medium.
  • the upper rows of FIGS. 5 and 6 show mass spectra of the first medium.
  • the lower rows of FIGS. 5 and 6 show mass spectra of the second medium.
  • the horizontal axis in FIGS. 5 and 6 indicates m/z.
  • the vertical axis shows % strength.
  • FIG. 5 shows a mass spectrum ranging from about m/z 1900 to about m/z 8300.
  • FIG. 6 is a mass spectrum showing an enlarged range of about m/z 1830 to about m/z 2600, which is a part of FIG. 5.
  • Asr is produced when the target microorganism grows to an amount that allows analysis using Asr. After confirming the condition, the sample can be prepared.
  • the preparation method for microorganism analysis according to the embodiment when the preparation method for microorganism analysis according to the embodiment is not used, that is, when a pH indicator is not mixed into the medium, it may also be noticed when sugars that cannot be metabolized by the microorganism to be analyzed are added to the first medium. I can't. In such a case, even if the analyst determines that the microorganisms have grown to an amount suitable for analysis and attempts to perform an analysis using Asr, it is impossible. On the other hand, if the preparation method for microorganism analysis according to the embodiment is used, the analyst can notice that the color of the pH indicator does not change, and therefore can avoid the waste of attempting impossible analysis. .
  • the second experimental example is an experiment showing changes in the pH of the medium due to overculture.
  • FIG. 7 is a diagram showing the change in color of the medium during overculture.
  • Experimental conditions such as the composition of the first medium and second medium were the same as in the first experimental example.
  • the colors indicated by hatching are also the same as in the first experimental example.
  • the time required for overculture varies depending on the type of microorganism, but for example, the case where a microorganism that is normally cultured for one night and used in an experiment is cultured for two nights is shown. In one example, one night is 15 hours and two nights are 39 hours.
  • the second experimental example corresponds to the case where the first medium and the second medium used in the first experimental example were continued to be cultured as they were.
  • the first medium was yellow, indicating acidity.
  • the second medium showed a green to blue color indicating neutrality to basicity.
  • the second medium does not contain sugar
  • Asr may be produced if overculture is performed.
  • the mass spectrum of microorganisms in the first medium is A method of estimating Asr based on peaks detected only in the spectrum cannot be used. Therefore, the microorganisms in the over-cultured second medium are considered to be in a state inappropriate for the identification of Asr by comparing the first medium and the second medium.
  • the preparation method for microbial analysis according to the embodiment is not used, that is, if a pH indicator is not mixed in the medium, it will not be possible to notice that the second medium was overcultured.
  • the analyst determines that the microorganisms in the first and second media have grown to an amount that allows analysis using Asr, and determines the Asr peak by comparing the first and second media. Even if you try to identify it, you are likely to fail.
  • the preparation method for microorganism analysis according to the embodiment is used, the analyst can notice overculture based on the color of the pH indicator, so there is a high possibility of failure. It is possible to eliminate the waste of trial analysis.
  • a method for preparing for analysis of microorganisms is a method for preparing for analysis of microorganisms using acid shock protein, which includes the steps of preparing one or more media containing a pH indicator; a step of culturing the microorganism in a medium under specific conditions; a step of identifying the color of the medium and detecting when the microorganism produces acid shock protein based on the identification result; and collecting the microorganism for analysis at the time of producing the microorganism.
  • the one or more medium includes a first medium.
  • the specific conditions include a first condition for causing a microorganism to produce acid shock protein.
  • the step of culturing includes culturing the microorganism in a first medium under first conditions.
  • the first condition includes at least one of the following conditions: sugar is added to the first medium, overculture, and culture under anaerobic conditions.
  • Acid shock proteins can be produced and recovered by microorganisms according to the conditions described in the preparation method for microorganism analysis described in Section 2. Therefore, a sample necessary for microbial analysis using acid shock protein can be obtained.
  • the one or more medium includes a second medium.
  • the specific conditions include a second condition for preventing microorganisms from producing acid shock proteins.
  • the step of culturing further includes culturing the microorganism in a second medium under second conditions.
  • the second condition is that the second medium has no added sugar, is not overcultured, and is not in an anaerobic state.
  • the step of detecting the time is based on the change in color of the medium over time, when the microorganism has absorbed acid shock proteins.
  • the step includes detecting when the production occurs.
  • the time of Asr production can be identified and the microorganisms can be recovered. That is, the timing at which the microorganisms should be collected can be specified.
  • the step of detecting the time may include The method includes the step of estimating that the microorganism does not produce acid shock proteins by metabolizing sugars when the culture medium does not exhibit the color exhibited by the pH indicator for a specified period of time.
  • the step of collecting is performed at a time when the amount of microorganisms necessary for analysis is at a time when microorganisms produce acid shock proteins. collecting the microorganisms when the amount has been reached.
  • the pH indicator may include bromocresol green, methyl red, litmus, bromocresol purple, bromothymol blue, phenol red, neutral Contains at least one of red and naphtholphthalein.
  • the medium is a liquid medium.
  • the microorganisms and the acid produced by the microorganisms spread throughout the medium, so the color of the entire medium changes, making it easy to identify changes in color in the medium.
  • preparation for analysis using Asr becomes easier, such as by eliminating the work of cooling and solidifying the culture medium with agar.
  • the medium is a solid medium.
  • the medium is easier to handle when moving due to its low fluidity.
  • the microorganism analysis is microorganism mass spectrometry using a mass spectrometer.
  • 1 analysis device 10 control unit, 11 processing unit, 12 storage unit, 13 input/output unit, 20 measurement unit, 21 ionization unit, 22 ion acceleration unit, 23 mass separation unit, 24 detection unit, 100 analysis system, 111 device control section, 112 mass spectrum creation section, 113 mass spectrum analysis section, 114 calibration section, 131 input section, 132 output section, 133 communication section, 221 acceleration electrode, 231 flight tube, S ion.

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Abstract

アシッドショックプロテインを用いた微生物の分析の準備方法であって、ｐＨ指示薬を含む１以上の培地を準備するステップ（Ｓ１）と、微生物を培地に植え付けるステップ（Ｓ２）と、培地において特定条件下で微生物の培養を行なうステップ（Ｓ３）と、培地の色を識別し、識別結果に基づいて、微生物がアシッドショックプロテインを産生する時期を検出するステップ（Ｓ４）と、アシッドショックプロテインを産生する時期に、微生物を分析のために回収するステップ（Ｓ５）とを備える。

Description

微生物の分析の準備方法、および、微生物の分析方法
　本発明は、微生物の分析の準備方法、および、微生物の分析方法に関する。
　微生物の分類の中でも、腸内細菌目（Ｅｎｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ）は、腸管出血性大腸菌、サルモネラ属菌、赤痢菌、ペスト菌等の病原性の菌を含むことが知られている。また、腸内細菌目は、食中毒での疫学調査の対象となる菌も含まれる。これらの重要な菌群を含む腸内細菌目の微生物を分類、分析することは、微生物に関する研究の場および医療現場において重要である。
国際公開第２０２０／２０２８６１号
　腸内細菌目に属する微生物の分類、分析の一つとして、国際公開第２０２０／２０２８６１号（特許文献１）には、腸内細菌目に属する一部の株を適切な条件下で培養すると、アシッドショックプロテインを産生することが示されている。また、異なる株のマススペクトルにおいて、異なるアシッドショックプロテインのピークが見いだされたことも開示されている。
　このようなアシッドショックプロテインを用いた微生物の分析のためには、微生物を適切な条件下で培養し、当該微生物がアシッドショックプロテインを産生する時期に回収して、分析を行なうことが必要である。しかし、微生物がアシッドショックプロテインを産生する時期か否か、すなわち微生物がアシッドショックプロテインを含んでいるか否かは、質量分析を行なってマススペクトルのピークを確認するまでは分からないという問題があった。そのため、アシッドショックプロテインを用いた微生物の分析を行ないたい分析者は、アシッドショックプロテインを産生する時期において微生物を回収するまでに、何度も質量分析を行なう必要があった。すなわち、アシッドショックプロテインを産生する時期の微生物の回収のために、時間と費用とがかかっていた。よって、アシッドショックプロテインを産生する時期の微生物を簡便に回収する手法が期待されていた。
　本開示は、かかる課題を解決するためになされたものであり、その目的は、微生物について、アシッドショックプロテインを産生する時期を簡便に検出し、回収することである。
　本開示の第１の局面に係る微生物の分析の準備方法は、アシッドショックプロテインを用いた微生物の分析の準備方法であって、ｐＨ指示薬を含む１以上の培地を準備するステップと、微生物を培地に植え付けるステップと、培地において特定条件下で微生物の培養を行なうステップと、培地の色を識別し、識別結果に基づいて、微生物がアシッドショックプロテインを産生する時期を検出するステップと、アシッドショックプロテインを産生する時期に、微生物を分析のために回収するステップとを備える。
　本開示による微生物の分析の準備方法によれば、微生物について、アシッドショックプロテインを産生する時期を簡便に検出し、回収できる。
分析装置の構成を示す概略図である。 実施形態１に係る分析の準備および分析のための処理を示すフローチャートである。 実施形態２に係る微生物の分析の準備および分析のための処理を示すフローチャートである。 第１培地、第２培地の各々における色の経時変化を示す図である。 第１培地、第２培地の各々から回収された微生物のマススペクトルを示す図である。 第１培地、第２培地の各々から回収された微生物のマススペクトルを示す図である。 過培養時の培地の色の変化を示す図である。
　以下に、本発明の実施形態について図面を参照して詳細に説明する。なお、以下では図中の同一または相当部分には同一の符号を付して、その説明は原則的に繰返さないものとする。
　［１．分析装置の構成］
　まず、アシッドショックプロテイン（Ａｃｉｄ　ｓｈｏｃｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ、以下「Ａｓｒ」とも称する）を用いた微生物の分析を行なう分析装置１の一例を示す。図１は、分析装置１の構成を示す概略図である。分析装置１は、試料に含まれる物質の質量分析を行なうための質量分析装置であり、たとえば、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ（Matrix-Assisted　Laser　Desorption/Ionization　Time-of-Flight　Mass　Spectrometry）である。分析装置１は、本明細書における「質量分析装置」の一実施例に対応する。
　本実施形態において、試料は腸内細菌目に属する微生物由来の試料である。試料には、分析対象の分子である対象物質が含まれる。試料には、マススペクトルの較正に用いられる分子である標準物質（キャリブラント）が含まれてもよい。また、本実施形態において、分析装置１における分析は、マススペクトルのピークを検出し、試料に含まれる特定または非特定の物質の質量電荷数比（ｍ／ｚ）を測定することを含む。一実施例において、当該物質はタンパク質であり、対象物質はアシッドショックプロテインである。分析装置１における分析は、当該マススペクトル上のピークが示すｍ／ｚ（以下、「実測ｍ／ｚ」とも称する）に基づいて、試料中に特定の物質が含まれるか否かを判別すること、試料中の特定の物質の濃度を算出すること、および試料中に含まれる微生物を分類することを含んでもよい。微生物を分類することは、微生物の分類を判別することを含む。本明細書において、特に説明しない限り、微生物の分類とは、科・属・種・株等の少なくとも１つのレベルの分類を示す。微生物の分類を判別することは、「微生物を同定する」とも称される。また、本明細書において、微生物を分類することは、微生物が所定の分類に含まれるか否かを判別することを含む。また、微生物を分類することは、ある微生物を、他の微生物と異なる分類に含まれるか否かを識別することを含む。
　図１を参照して、分析装置１は、制御部１０および測定部２０を含む。
　測定部２０は、高電圧により試料中の物質（たとえばタンパク質）をイオン化し、当該イオンＳをｍ／ｚに相関する飛行時間に応じて分離したのち検出する。測定部２０は、イオン化部２１と、イオン加速部２２と、質量分離部２３と、検出部２４とを備える。図１において、測定部２０におけるイオンＳの移動を矢印Ａ１で模式的に示す。
　イオン化部２１は、試料中の物質をマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法によりイオン化する。イオン化の方法としては、ＭＡＬＤＩ法以外にもエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ：Electrospray　ionization）法等の任意のソフトイオン化法を用いることができる。ＥＳＩ法によりイオン化を行なう場合、分析装置１が液体クロマトグラフをさらに備え、液体クロマトグラフで分離された試料中の物質をイオン化部２１がイオン化する構成にすると、高い分離能を得ることができるため好ましい。
　イオン化部２１は、試料プレートを支持する試料プレートホルダ（図示せず）と、試料プレート上にレーザー光を照射するレーザー装置（図示せず）を含むイオン源を含む。試料プレートに試料が配置された後、試料にマトリックスが添加され、試料が乾燥させられる。その後、試料プレートはイオン化部２１の真空容器内の試料プレートホルダに設置される。マトリックスの種類は特に限定されないが、タンパク質試料を効率よくイオン化する観点からシナピン酸またはα－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）等を用いることが好ましい。
　イオン化部２１は、試料プレートが設置された真空容器を減圧した後、レーザー光を試料プレート上の各試料に照射して順次イオン化を行なう。レーザー光を照射するレーザー装置の種類は、選択したマトリックスに吸収される光を発振することができれば特に限定されず、たとえばマトリックスがシナピン酸またはＣＨＣＡを含む場合には、Ｎ２レーザー（波長３３７ｎｍ）等を好適に用いることができる。イオン化部２１でイオン化されたイオンＳは、図示しない引出電極等による電場により引き出され、イオン加速部２２に導入される。
　イオン加速部２２は、加速電極２２１を備え、導入されたイオンＳを加速させる。加速されたイオンＳの流れは、図示しないイオンレンズにより適宜収束されて質量分離部２３に導入される。
　質量分離部２３は、フライトチューブ２３１を備え、それぞれのイオンＳがフライトチューブ２３１の内部を飛行する際の、飛行時間の違いによりイオンＳを分離する。図１ではリニア型のフライトチューブ２３１が示されているが、リフレクトロン型やマルチターン型等でもよい。試料に含まれるイオンＳを分離して検出することができれば、質量分析の方法は特に限定されない。
　検出部２４は、マルチチャンネルプレート等のイオン検出器を備え、質量分離部２３で分離されたイオンＳを検出し、検出部２４に入射したイオンの数に応じた強度の検出信号を出力する。検出部２４から出力された検出信号は、制御部１０の処理部１１に入力される。図１において、測定部２０の検出部２４からのイオンＳの検出信号の流れを矢印Ａ２で模式的に示す。
　制御部１０は、処理部１１、記憶部１２および入出力部１３を含む。
　処理部１１は、ＣＰＵ等のプロセッサを含んで構成され、分析装置１を制御する動作の主体として機能する。処理部１１は、記憶部１２等に記憶されたプログラムを実行することにより各種処理を行なう。処理部１１は、本開示における「プロセッサ」の一実施例に対応する。
　処理部１１は、装置制御部１１１と、マススペクトル作成部１１２と、マススペクトル分析部１１３と、較正部１１４とを備える。
　装置制御部１１１は、後述する入力部１３１から入力された分析条件に関するデータに基づいて、測定部２０の動作を制御する。図１においては、装置制御部１１１による測定部２０の制御を矢印Ａ３で模式的に示す。
　マススペクトル作成部１１２は、検出部２４が検出したイオンの検出量と、当該イオンの飛行時間とを含む測定データから、飛行時間をｍ／ｚに換算し、各ｍ／ｚに対応する検出量を示すマススペクトルを作成する。
　マススペクトル分析部１１３は、マススペクトルにおいて、マススペクトルのピークを検出する。検出したピークに対応するｍ／ｚを算出する。マススペクトル分析部１１３は、タンパク質データベース等に基づいて、当該マススペクトル上のピークが示す実測ｍ／ｚが対応する物質を判別してもよい。すなわち、マススペクトル分析部１１３は試料に含まれる特定または非特定の物質の実測ｍ／ｚを算出できる。マススペクトル分析部１１３は、さらに、実測ｍ／ｚに基づいて試料中に特定の物質が含まれるか否かを判別したり（試料中の成分同定）、試料中の特定の物質の濃度を算出したり、試料中に含まれる生物を分類したりしてもよい。より一般的には、マススペクトル分析部１１３は、試料中に含まれる物質の構造解析を行ってもよい。
　較正部１１４は、標準物質の実測ｍ／ｚおよび理論ｍ／ｚに基づいてマススペクトルを較正する。理論ｍ／ｚは、一般に理論値、理論ｍ／ｚとも称される値であり、分子量、付加したイオンおよび電荷数を考慮して算出される、理論的な質量電荷比である。質量分析における較正とは、標準物質の実測ｍ／ｚが理論ｍ／ｚに近づくように補正すること、および、その補正をスペクトル全体に適用することである。
　記憶部１２は、不揮発性の記憶媒体を備える。記憶部１２は、理論ｍ／ｚ、マススペクトル作成部１１２が作成したマススペクトル、測定部２０から出力された測定データおよび処理部１１が処理を実行するためのプログラム等を記憶する。記憶部１２は、本開示における「メモリ」の一実施例に対応する。
　入出力部１３は、分析装置１が外部と情報を入出力するためのインターフェイスである。入出力部１３は、入力部１３１、出力部１３２および通信部１３３を含む。
　入力部１３１は、マウス、キーボード、各種ボタンおよび／またはタッチパネル等の入力装置を含んで構成される。入力部１３１は、測定部２０の動作の制御に必要な情報、および処理部１１の行なう処理に必要な情報等を、ユーザから受け付ける。
　出力部１３２は、液晶モニタ等の表示装置、プリンター等を含んで構成される。出力部１３２は、測定部２０の測定に関する情報や、処理部１１の処理の結果等を、表示装置に表示したり、紙媒体に印刷したりする。
　通信部１３３は、インターネット等の無線や有線接続により通信可能な通信装置を含んで構成される。通信部１３３は、処理部１１の処理に必要なデータを受信したり、判別結果等の処理部１１が処理したデータを送信したり、適宜必要なデータを送受信する。
　上記した制御部１０の機能の一部または全部は、測定部２０とは物理的に離れた電子計算機、サーバ等に配置してもよい。
　以上で説明した分析装置１を用いれば、以下で説明するように、アシッドショックプロテインを用いた微生物の分析が可能である。
　［２．アシッドショックプロテインを用いた微生物の分析］
　腸内細菌目に属する微生物は、腸管出血性大腸菌、サルモネラ属菌、赤痢菌、ペスト菌等の病原性の菌を含み、感染症の予防および／または治療において、考慮すべき対象となることもある。更に腸内細菌目に属する微生物は食中毒での疫学調査の対象となることもある等、重要な菌群を含むことが知られている。
　実際に、感染症および／または食中毒の原因菌として疑われる場合には、腸内細菌目の中でもより具体的に属種レベルでの同定および／または株レベルでの識別が求められることもある。これは、同定された属種（菌名）に応じて治療方針が決定されたり、株レベルでの鑑別によって感染経路が特定されたりすることによる。したがって、これらの同定、株識別では高い正確性が求められる。
　このような微生物の同定、識別に関して、従来は微生物の形態学的な特徴や生化学的な特性を利用した方法が用いられてきた。また、近年は質量分析法の一つであるＭＡＬＤＩを用いた方法も利用されるようになり、より正確で迅速な方法の研究と開発とが継続して行なわれている。
　このＭＡＬＤＩを用いた腸内細菌目に属する微生物の分析の一つとして、発明者らは、国際公開第２０２０／２０２８６１号（特許文献１）において、腸内細菌目に属する一部の株を適切な条件下で培養すると、Ａｓｒを産生することを示した。具体的には、腸内細菌目に属する一部の株を、糖を加えた培地において培養した場合、糖を加えない培地において培養した場合には検出されないピークが検出された。また、当該ピークはその分子量からＡｓｒに対応すると考えられた。同様にして、一部の株を酸素濃度が低い状態（たとえば５％以下）で培養した場合にも、Ａｓｒに対応すると考えられるピークが検出された。すなわち、発明者らは、一部の株について、Ａｓｒを産生させるための条件において培養した微生物のマススペクトルを、Ａｓｒを産生させないための条件において培養した微生物のマススペクトルと比較することにより、Ａｓｒのピークを特定した例を示している。特許文献１には、また、異なる株のマススペクトルにおいて、異なるＡｓｒのパターンが見いだされたことも開示されている。
　このようなＡｓｒを用いた微生物の分析のためには、Ａｓｒが産生するための条件において微生物を培養し、Ａｓｒが産生される時期の微生物を回収し、ＭＡＬＤＩ測定のための試料を調製する必要がある。なお、本明細書において、微生物が「Ａｓｒを産生する時期」は、「文字通りＡｓｒ（アシッドショックプロテイン）が遺伝子からの転写、翻訳および翻訳後修飾を経て物質的に産生されることにより、Ａｓｒが存在する時期」を含む。また、「Ａｓｒを産生する時期」は、「既に微生物内にＡｓｒ（アシッドショックプロテイン）が存在する（すなわち、細胞内に蓄積している）が、転写、翻訳および／または翻訳後修飾が行なわれていない時期」を含んでもよい。いずれにせよ、「Ａｓｒが産生される時期」の微生物はＡｓｒ（アシッドショックプロテイン）を含むので、この時期の微生物のマススペクトルにおいては、Ａｓｒのピークが検出される。
　よって、微生物がＡｓｒを産生させるための条件およびＡｓｒを産生する時期が特定できれば、Ａｓｒを発現している状態の微生物が回収できると考えられる。しかし、発明者らは、微生物によって、Ａｓｒを産生する培養条件および時期には差違があることを見いだした。たとえば、発明者らは、微生物が異なると、Ａｓｒを産生するために必要な糖の種類が異なる場合があることを見いだした。また、同じ種類の糖によってＡｓｒを産生する微生物においても、Ａｓｒを産生するために必要な培養時間が違う場合があることを見いだした。
　上記の通り微生物ごとにＡｓｒを産生するための培養条件は異なりうるため、分析対照の微生物が実際にＡｓｒを産生しているかを確認するためには、当該微生物のマススペクトルを測定し、Ａｓｒに対応するピークが検出されるかを確認する必要があった。すなわち、Ａｓｒを用いた微生物の分析を行なうためには、Ａｓｒを産生する時期の微生物を回収できるまで、何度も質量分析を繰り返す必要があり、分析者に時間と費用とを要していた。よって、Ａｓｒを産生する時期の微生物を簡便に検出し、回収する手段が求められていた。
　そこで、本実施の形態に係る微生物の分析の準備方法によれば、ｐＨ（水素イオン指数）指示薬を含む培地を準備し、当該培地においてＡｓｒを産生する条件下で微生物の培養を行なう。そして、培地の色の変化に基づいて、Ａｓｒが産生されている状態であることを検出する。すなわち、微生物がＡｓｒを産生する時期を検出する。そして、当該時期において、微生物を分析のために回収する。これにより、微生物について、Ａｓｒを産生する時期を簡便に検出し、回収できる。以下に、当該Ａｓｒを産生する時期を検出し、回収する方法について、より詳細に説明する。
　［３．アシッドショックプロテインを用いた微生物の分析の準備方法］
　Ａｓｒを産生する時期を検出し、回収する方法の基となる自然現象として、発明者らは、微生物がＡｓｒを産生する時期においては培地が酸性になり、産生しない時期は培地が塩基性になることを見いだした。これは、微生物が酸を産生し、培地が酸性になることにより、微生物がＡｓｒを産生している現象を反映していると考えられる。この培地の酸性度とＡｓｒの産生との関連を利用して、発明者らは培地にｐＨ指示薬を混和して、微生物がＡｓｒを産生する時期を検出する以下の方法を構築した。
　図２は、実施形態１に係るＡｓｒを用いた微生物の分析の準備、および、分析のための処理を示すフローチャートである。図２に示すステップは、たとえば、一般的な微生物の培養および質量分析に用いられる実験器具および実験装置を用いて分析者の手作業で行なわれる。なお、図中において、「Ｓ」は「ＳＴＥＰ」の略称として用いられる。
　Ｓ１において、分析者は、ｐＨ指示薬を含む１以上の培地を準備する。たとえば、分析者は、ｐＨ指示薬を混和した液体培地を作成する。なお、本明細書において、単に培地と記載した場合でも、当該培地において培養される微生物を含む場合もある。
　Ｓ２において、分析者は、微生物を上記培地に植え付ける。たとえば、分析者は、分析対象となる微生物の懸濁液を、上記培地に混和する。
　Ｓ３において、分析者は、培地において、特定条件下で微生物の培養を行なう。より特定的には、分析者は、培地においてＡｓｒを産生させるための第１条件下で微生物の培養を行なう。たとえば、分析者は、微生物の培養に適した温度に保たれるインキュベータに培地を収容する。微生物の培養に適した温度はたとえば約２５℃～約４０℃の間の温度であり、好ましくは約３７℃である。
　Ｓ４において、分析者は、培地の色を識別し、識別結果（色の変化）に基づいて、微生物がＡｓｒを産生する時期を検出する。たとえば分析者は肉眼で色を識別し、識別結果に基づいて、微生物がアシッドショックプロテインを産生する時期を判定する。
　Ｓ５において、分析者は、Ａｓｒを産生する時期に、微生物を分析のために回収する。
　Ｓ６において、分析者は、回収した微生物を用いてＡｓｒを用いた分析を行なう。分析者は、たとえば回収した微生物を分析装置１に設置し、質量分析を行なう。
　なお、Ｓ１～Ｓ６の一部または全体における分析者の作業は、適宜機械化されてもよく、コンピュータによる制御が行なわれてもよい。その際は各作業に必要な公知技術が適宜用いられてもよい。たとえばＳ４は、培地の色情報を取得する装置（たとえばカメラ）、および、取得した色情報に基づいて微生物がアシッドショックプロテインを産生する時期を検出するための装置（たとえばコンピュータ）により行なわれてもよい。
　以下に、各ステップをより詳細に説明する。
　Ｓ１において、ｐＨ指示薬は、ｐＨに応じて色が変化する色素である。ｐＨ指示薬としては、中性からｐＨ６．０以下の変化を検出できる指示薬を選択することが好ましく、更に好ましくはｐＨ５．０以下を検出する指示薬が好ましい。ｐＨ指示薬は、たとえばブロモクレゾールグリーン、メチルレッド、リトマス、ブロモクレゾールパープル、ブロモチモールブルー（ＢＴＢ）、フェノールレッド、ニュートラルレッド、ナフトールフタレインの少なくとも１つを含む。ｐＨ指示薬は、単一で用いられてもよいし、異なる変色域を有する複数のｐＨ指示薬を混和して使用してもよい。Ｓ１において、培地にこれらのｐＨ指示薬を含むことにより、培地のｐＨの変化が色の変化としてモニターできるようになる。一実施例において、ｐＨ指示薬はＢＴＢである。この場合、培地の色が緑色から黄色へと変化することで、中性であった培地が酸性に変化したことが検出できる。
　一実施例において、培地は、シャーレまたはチューブ等の容器に収容される液体培地である。培地が液体培地である場合、微生物および微生物が産生した酸は培地全体に広がるため、培地全体の色が変化することにより、培地における色の変化を識別しやすいというメリットがある。特に、カメラ等の装置を用いた色の識別においては、培地の色むらを考慮する必要が無いため、便利であると考えられる。また、培地を作成するために、固形培地のように寒天を加えて冷まし固める作業が必要でないため、培地作成がより簡便である。また、培養により増加した菌の量を測定する場合においても、培地の濁度を濁度系で測定する等機械的な測定が容易である。すなわち、Ａｓｒを用いた分析の準備がより簡便になる。なお、液体培地の場合、ｐＨ指示薬の混和は培地を作成する際に行なわれるが、微生物が植え付けられる前であれば培地の作成後に加えられてもよい。
　一方、培地はシャーレ等の容器に収容される固形培地であってもよい。この場合、液体培地の場合に比べ流動性が低いので、微生物が産生した酸は菌の近傍のみに局在する。よって、培地全体でなく菌の近傍のみが変色する。一方で、流動性の低さによって、培地を移動させる際の取り扱いがより容易であるというメリットがある。固形培地の場合、ｐＨ指示薬の混和は培地の作成時に行なわれるが、微生物が植え付けられる前であれば培地が冷まし固められた後において培地の表面に滴下されてもよい。
　Ｓ３において、Ａｓｒを産生させるための第１条件は、たとえば、第１培地に糖を加えられているという条件、過培養であるという条件、嫌気的状態で培養されるという条件の少なくとも１つを含む。これらのＡｓｒを産生させるための条件は、発明者らが長年の研究において確認した培養条件である。糖を加えられた培地であるという条件は、たとえば、Ｓ１において培地を準備する際に、糖を加えることで満たされる。なお、培地に加えられる糖は特に限定されないが、単糖類、二糖類、三糖類および四糖類が好ましい。ただし、５以上の単糖が結合して得られた糖でもよい。培地に加えられる単糖類は、たとえば、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、フコース、フクロース、ラムノース、プシコース（アルロースとも呼ばれる）、フルクトース、ソルボース、タガトース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、リブロース、キシルロース、デオキシリボース、セドヘプツロース、ケトテトロース、エリトルロース、アルドテトロース、エリトロース、トレオース、ケトトリオース（ジヒドロキシアセトン）およびアルドトリオース（グリセルアルデヒド）の少なくとも１つである。ケトテトロースとしては、エリトルロースが好ましい。アルドテトロースとしては、エリトロースまたはトレオースが好ましい。これらの単糖のうち１つの糖を加えても良いし、複数種類の糖を組み合わせて用いてもよい。上記糖はグルコースがより好ましい。培地に加えられる二糖類は、たとえば、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、ツラノースおよびセロビオースの少なくとも１つであり、好ましくはラクトースである。培地に加えられる三糖類は、たとえば、ラフィノース、メレジトースおよびマルトトリオースの少なくとも１つである。培地に加えられる四糖類は、たとえば、アカルボースおよびスタキオースの少なくとも１つである。また、培地への糖の添加濃度の範囲は、好ましくは培地中に０．１ｗｔ％以上、更に好ましくは０．５ｗｔ％以上である。本明細書において、過培養とは、通常実験に用いる微生物を培養する期間より長い、第１期間以上の培養を示す。ただし、微生物によって、通常培養する期間および過培養となる第１期間は異なりうる。よって、過培養であるという条件も、微生物により異なりうるが、たとえば、通常１晩培養して実験に用いる微生物を２晩培養することで満たされる。より特定的には、通常約１２～１８時間培養して実験に用いる微生物を約３６時間～４２時間培養することで満たされる。通常嫌気的状態であるという条件は、たとえば酸素濃度が５％以下（好ましくは１％以下）で培養することで満たされる。第１条件下で培養される培地を、以下、「第１培地」とも称する。
　Ｓ４において、ｐＨ指示薬がＢＴＢである場合、第１培地の色が培養開始時の緑色から黄色に変化していれば、微生物中にＡｓｒが存在する状態であると判定できる。すなわち、第１培地が黄色に呈色する時点を検出すれば、微生物がＡｓｒを産生している時点を検出できる。
　Ｓ４において、たとえば、Ａｓｒの産生時期が分かっていない微生物を準備する場合、当該微生物を含む第１培地の色の経時的な変化に基づいて、当該産生時期を検出することが可能である。これにより、Ａｓｒの産生時期が分かっていない微生物についても、Ａｓｒを産生した時期を特定して、微生物を回収することができる。すなわち、当該微生物を回収すべきタイミングを特定できる。また、当然ながら、当該微生物について、Ａｓｒを産生する時期に関する知見が得られる。
　また、特定期間（微生物により変化するが、たとえば１日間）にわたって、ｐＨ指示薬が酸性状態になった場合に示す色を示さない場合、分析対象の微生物は少なくともそのときの培養条件ではＡｓｒを産生しないと判定することができる。より特定的には、第１培地に特定種類の糖が加えられている場合、酸性状態においてｐＨ指示薬が呈する色を第１培地が特定期間にわたって示さないとき、分析対象の微生物は特定種類の糖の代謝によるアシッドショックプロテインの産生を行なわないと推定することができる。この場合、たとえば、Ａｓｒを産生させるために加える糖の種類を変更する等、他の培養条件を試すことができる。これにより、微生物がＡｓｒを産生するための条件検討を行なうことができる。
　なお、既にＡｓｒの産生時期が分かっている微生物を準備する場合にも、培地の色の変化に基づいて、Ａｓｒを産生していることを確認してから菌を回収することができる。これにより、何らかの要因でＡｓｒの産生時期がずれた場合にも、対応することができる。当該何らかの要因とは、たとえば分析者が気づかないうちに第１培地が嫌気的状態になっており、予想より速くＡｓｒが産生されている状態である。もしくは、培地の栄養分が不十分であり、微生物がそもそも培養により増殖していないような状態である。
　Ｓ５において、たとえば分析者は微生物を含む液体培地の一部を質量分析するために採取する。または、固体培地上に増えた微生物のコロニーの一部を質量分析するために採取する。
　また、Ｓ５においては、Ａｓｒを産生する時期のうち、培養された微生物の量が分析のための必要量に達している場合に、微生物を回収することがより好ましい。これにより、回収した微生物の量がＡｓｒを用いた微生物の分析を行なうためには充分でなく、分析が失敗するという事態を避けることができる。換言すると、Ａｓｒを用いた微生物の分析のために必要な微生物の量が確実に確保できる。菌量は、たとえば液体培地においては、培地の懸濁の程度により判定できる。固体培地においては、培地上のコロニーの大きさまたは数により判定できる。分析者は、たとえば菌量が、分析を行なうために充分であると目視または測定により判定した場合に、微生物を回収する。
　Ｓ６において、採取された微生物または微生物を含む培地は、分析装置１において分析される前に適宜調整されてもよい。なお、Ｓ６においては、分析装置１における質量分析に代わり、他のＡｓｒを用いた微生物の分析が行なわれてもよく、その場合もＳ６に含まれるとする。
　図２に示した処理により、分析システム１００は、第１培地において微生物がＡｓｒを産生する時期を簡便に検出し、微生物を回収することができる。すなわち、Ａｓｒを用いた実験の準備段階における、微生物の回収タイミングの判断の簡便化が可能である。
　［４．実施形態２に係る微生物の分析の準備方法］
　上記したように、所定の微生物におけるＡｓｒのピークを検出するためには、Ａｓｒを産生するための条件で培養された微生物のマススペクトルと、Ａｓｒを産生しないための条件で培養された微生物のマススペクトルとを比較することが有用である。
　図３は、実施形態２に係る微生物の分析のための処理を示すフローチャートである。図３のフローチャートは、図２のフローチャートのＳ３がＳ３Ａに変更されたものである。
　図３を参照して、Ｓ３Ａにおいて、分析者は、第１培地において第１条件下で分析対象の微生物の培養を行ない、並行して、第１培地とは異なる培地においてＡｓｒを産生しないための第２条件下で当該分析対象の微生物の培養を行なう。
　第２条件は、第２培地に糖が加えられていないという条件、過培養でないという条件、嫌気的状態でない状態で培養されるという条件の全てを満たすという条件である。糖を加えられた培地でないという条件は、たとえば、Ｓ１において培地を準備する際に、糖を加えないことで満たされる。過培養でないとは、過培養とはいえない第２期間以下の培養を示す。第２期間は上記過培養となる第１期間より短い。ただし、微生物によって、第２期間は異なりうる。よって、過培養でないという条件も、微生物により異なりうるが、たとえば培養期間が１晩以下であるという条件であり、より特定的には培養期間が約１８時間以下であるという条件である。嫌気的状態でないという条件は、たとえば第１培地より酸素濃度が１０％～１５％以上高い条件により満たされる。第２条件下で培養を行なう培地を、以下、「第２培地」とも称する。以下に説明するとおり、第２培地は、第１培地のいわゆるコントロールとなる培地である。
　図３の処理において、第１条件で培養された微生物のマススペクトルと、第２条件で培養された微生物のマススペクトルとを比較することが可能になる。これにより、第１条件で培養された微生物のマススペクトルにおいて検出されたが、第２条件で培養された微生物のマススペクトルにおいては検出されないピークが、Ａｓｒのピークであると推定される。これにより、分析対象となる微生物のＡｓｒのピークが特定できる。
　また、発明者らは、上記のように過培養または嫌気的状態での培養の場合であっても、微生物がＡｓｒを産生する場合があることを見いだしている。換言すると、Ａｓｒを産生させないように糖を加えない培地を用いて培養した場合でも、意図せずに過培養または嫌気的状態となってしまい、Ａｓｒを産生させてしまっている可能性もある。このような培地のマススペクトルと、第１培地から得られたマススペクトルとを比較しても、両方の培地でＡｓｒのピークが検出されるため、Ａｓｒのピークの特定が困難となる。第１培地におけるマススペクトルと、Ａｓｒのピークが検出されないはずの第２培地のマススペクトルとの差が無いため、第１培地においてもＡｓｒのピークが検出されていないと分析者が誤解してしまう可能性もある。この場合、分析対象となる微生物について、少なくともそのときの培養条件下（より特定的には加えた糖の種類）では、Ａｓｒが産生されないという誤った判定を行なってしまう可能性もある。すなわち、Ａｓｒを用いた微生物の分析の準備が滞ってしまう事態が生じえる。
　このような事態を防ぐために、図３の処理に示したように、第２培地においてｐＨ指示薬が酸性を示す色に変化していないことを確認することにより、確実にＡｓｒを産生していない微生物を回収することができる。換言すると、第１培地と第２培地とを比較することで、Ａｓｒのピークを容易に特定できるための準備が整う。すなわち、Ａｓｒを用いた微生物の分析の準備がより簡便になる。
　なお、比較例として、培地のｐＨを確認するために、培地の一部をサンプリングしてｐＨ計等を用いて測定する方法も可能である。しかし、比較例に係る方法において、分析対象以外の微生物がコンタミネーションしないように配慮しながらｐＨを測定することは手間がかかる。よって、本実施の形態に係る微生物の分析の準備方法は、より簡易な方法で培地のｐＨを確認できる点で、比較例よりも優れている。
　［５．実験例］
　以下に、実施形態に従う微生物の分析の準備方法による実験例を示す。
　（５－１．第１実験例）
　第１実験例では、腸内細菌目ハフィニア科のＨａｆｎｉａ　ａｌｖｅｉのＡｓｒを分析した場合を示す。
　第１培地としては、糖を含まないＩＦＯ８０２培地（１ｗｔ％ハイポリペプトン、０．２ｗｔ％酵母エキス、０．１ｗｔ％硫酸マグネシウム）を作成し、使用した。第２培地としては、ＩＦＯ８０２培地にグルコースが０．５ｗｔ％になるように加えた培地を作成し、使用した。ｐＨ指示薬はＢＴＢをそれぞれに０．０１３ｗｔ％になるように加えた。
　これらの液体培地にＨａｆｎｉａ　ａｌｖｅｉのＮＢＲＣ１０５６８５株の懸濁液を少量加えて３７℃で培養し、一定時間毎に呈色の状態を観察した。
　図４は、第１培地、第２培地の各々における色の経時変化を示す図である。図４は、一定時間ごとに、シャーレに収容される培地をカメラで撮影した写真を模式的に表した図である。図４のハッチングのうち、密であるもの（たとえば６１）は緑色～青色を示し、粗であるもの（たとえば６３）は黄色を示し、中くらいのもの（たとえば６２）は黄緑色を示す。
　図４を参照して、培養開始時は、糖を含む第１培地および糖を含まない第２培地ともに中性を示す緑色であった。
　培養開始後６時間において、第１培地は酸性を示す黄色になり、第２培地は塩基性を示す青色になった。すなわち、第１培地ではＡｓｒが産生され、第２培地ではＡｓｒが産生されていないと考えられた。このように、第１培地および第２培地の色が示すｐＨとしてはＡｓｒを用いた分析に適した状態であったが、質量分析を行なうには菌量が少なかったため、サンプリングは行なわなかった。
　さらに培養を続け、培養開始後９時間で菌量も充分に増加し、呈色もＡｓｒの分析に適した状態を維持していたので、サンプリングを行なった。サンプリングした菌からＡｓｒを調製し、ＭＡＬＤＩの装置（島津製作所製、ＭＡＬＤＩ－８０２０）を用いてマススペクトルを得た。
　図５および図６は、第１培地、第２培地の各々から回収された微生物のマススペクトルを示す図である。図５および図６の上段は、第１培地のマススペクトルを示す。図５および図６の下段は、第２培地のマススペクトルを示す。図５および図６の横軸は、ｍ／ｚを示す。縦軸は％強度を示す。図５は約ｍ／ｚ１９００～約ｍ／ｚ８３００の範囲のマススペクトルを示す。図６は、図５の一部である、約ｍ／ｚ１８３０～約ｍ／ｚ２６００の範囲を拡大して表示したマススペクトルである。
　Ｈａｆｎｉａ　ａｌｖｅｉのＮＢＲＣ１０５６８５株は遺伝子情報から、Ａｓｒとして、ｍ／ｚ１９７６．４、ｍ／ｚ２０１２．４、ｍ／ｚ２０６８．４、およびｍ／ｚ４５７９．１の４つのマススペクトルピークが検出されることが予想された。
　図５の上段の第１培地のマススペクトルにおいては、ｍ／ｚ４５７９．１とは誤差が２．２（４８０ｐｐｍ）であるｍ／ｚ４５８１．３のピークが検出された。誤差の小ささから、ｍ／ｚ４５８１．３のピークはＡｓｒに由来すると考えられる。同様にして、図６の上段の第１培地のマススペクトルにおいても、Ａｓｒに由来すると考えられるｍ／ｚ１９７７．２、ｍ／ｚ２０１３．０、ｍ／ｚ２０６９．４のピークが検出された。なお、これらのピークにおいて、それぞれ理論値との誤差は０．８（４００ｐｐｍ）、０．６（３００ｐｐｍ）、１．０（４８０ｐｐｍ）であった。
　以上の第１実験例で示したように、実施形態に係る微生物の分析の準備方法によれば、対象微生物がＡｓｒを用いた分析が可能な量まで増殖した場合に、Ａｓｒが産生されている状態であることを確認して試料を調製できる。
　なお、実施形態に係る微生物の分析の準備方法を用いない場合、すなわち、培地にｐＨ指示薬を混和しない場合、第１培地に分析対象である微生物が代謝できない糖を加えていたときにも気づくことはできない。このような場合、分析者が、微生物が分析に適した量まで増殖したと判定して、Ａｓｒを用いた分析を行なおうとしても不可能である。一方、実施形態に係る微生物の分析の準備方法を用いれば、分析者はｐＨ指示薬の色の変化が起こらないことに気づくことができるので、不可能な分析を試行するという無駄を省くことができる。
　（５－２．第２実験例）
　第２実験例は、過培養による培地のｐＨの変化を示す実験である。図７は、過培養時の培地の色の変化を示す図である。第１培地および第２培地の組成等の実験条件は、第１実験例と同じである。ハッチングが示す色についても、第１実験例と同じである。過培養となる時間は微生物の種類によって変化するが、たとえば通常１晩培養して実験に使用する微生物を、２晩培養した場合を示す。一実施例において、１晩は、１５時間であり、２晩は３９時間である。第２実験例は、第１実験例に使用した第１培地および第２培地をそのまま培養し続けた場合に対応する。
　図７を参照して、培養開始後１晩経過した後は、第１培地は酸性を示す黄色であった。一方、第２培地は、中性～塩基性を示す緑色～青色を示した。
　培養開始後２晩経過した場合、第１培地は酸性を示す黄色のままであった。第２培地は、酸性を示す黄色に変化していた。第２培地からサンプリングした微生物について質量分析を行なった結果、Ａｓｒを産生していることが確認された。
　以上の第２実験例で示したように、糖を含まない第２培地であっても、過培養を行なうと、Ａｓｒが産生される場合が生じ得る。この場合、第２培地の微生物のマススペクトルと第１培地の微生物のマススペクトルとの比較によってＡｓｒを推定しようとしても、双方の試料でＡｓｒが産生されているため、第１培地の微生物のマススペクトルでのみ検出されるピークに基づいてＡｓｒを推定する方法が使えない。よって、過培養された第２培地の微生物は、第１培地と第２培地との比較によるＡｓｒの特定には不適切な状態になっていると考えられる。
　ここで、実施形態に係る微生物の分析の準備方法を用いていない場合、すなわち、培地にｐＨ指示薬を混和していない場合、第２培地が過培養であったことにも気づくことはできない。このような場合、分析者が、第１培地および第２培地の微生物がＡｓｒを用いた分析が可能な量まで増殖したと判定して、第１培地と第２培地との比較によってＡｓｒのピークを特定しようとしても失敗する可能性が高い。一方、第２実験例に示すように、実施形態に係る微生物の分析の準備方法を用いれば、分析者はｐＨ指示薬の色に基づいて過培養に気づくことができるので、失敗する可能性が高い分析を試行するという無駄を省くことができる。
　［態様］
　上述した複数の例示的な実施形態は、以下の態様の具体例であることが当業者により理解される。
　（第１項）一態様に係る微生物の分析の準備方法は、アシッドショックプロテインを用いた微生物の分析の準備方法であって、ｐＨ指示薬を含む１以上の培地を準備するステップと、微生物を培地に植え付けるステップと、培地において特定条件下で微生物の培養を行なうステップと、培地の色を識別し、識別結果に基づいて、微生物がアシッドショックプロテインを産生する時期を検出するステップと、アシッドショックプロテインを産生する時期に、微生物を分析のために回収するステップとを備える。
　第１項に記載の微生物の分析の準備方法によれば、微生物について、アシッドショックプロテインを産生する時期を簡便に検出し、回収できる。
　（第２項）第１項に記載の微生物の分析の準備方法において、１以上の培地は、第１培地を含む。特定条件は、微生物にアシッドショックプロテインを産生させるための第１条件を含む。培養するステップは、第１培地において第１条件下で微生物の培養を行なうステップを含む。第１条件は、第１培地に糖が加えられているという条件、過培養であるという条件、嫌気的状態で培養されるという条件の少なくとも１つを含む。
　第２項に記載の微生物の分析の準備方法に記載の条件によって、微生物にアシッドショックプロテインを産生させ、回収することができる。よって、アシッドショックプロテインを用いた微生物の分析に必要な試料を得ることができる。
　（第３項）第２項に記載の微生物の分析の準備方法において、１以上の培地は、第２培地を含む。特定条件は、微生物にアシッドショックプロテインを産生させないための第２条件を含む。培養するステップは、第２培地において第２条件下で微生物の培養を行なうステップをさらに含む。第２条件は、第２培地に糖が加えられていないという条件、過培養でないという条件、嫌気的状態でないという条件の全てを満たすという条件である。
　第３項に記載の微生物の分析の準備方法によれば、第１条件で培養された微生物のマススペクトルと、第２条件で培養された微生物のマススペクトルとを比較することが可能になる。これにより、第１条件で培養された微生物のマススペクトルにおいて検出されたが、第２条件で培養された微生物のマススペクトルにおいては検出されないピークが、Ａｓｒのピークであると推定される。これにより、分析対象となる微生物のＡｓｒのピークが特定できる。
　（第４項）第１～３のいずれか１項に記載の微生物の分析の準備方法において、時期を検出するステップは、培地の色の経時的な変化に基づいて、微生物がアシッドショックプロテインを産生する時期を検出するステップを含む。
　第４項に記載の微生物の分析の準備方法によれば、Ａｓｒの産生時期が分かっていない微生物についても、Ａｓｒを産生した時期を特定して、微生物を回収することができる。すなわち、当該微生物を回収すべきタイミングを特定できる。
　（第５項）第２または３項に記載の微生物の分析の準備方法において、第１条件が、第１培地に糖が加えられているという条件である場合、時期を検出するステップは、酸性状態においてｐＨ指示薬が呈する色を培地が特定期間にわたって示さないとき、微生物は糖の代謝によるアシッドショックプロテインの産生を行なわないと推定するステップを含む。
　第５項に記載の微生物の分析の準備方法によれば、たとえば、Ａｓｒを産生させるために加える糖の種類を変更する等、他の培養条件を試すことができる。これにより、微生物がＡｓｒを産生するための条件検討を行なうことができる。
　（第６項）第１～３のいずれか１項に記載の微生物の分析の準備方法において、回収するステップは、微生物がアシッドショックプロテインを産生する時期に、微生物の量が分析のための必要量に達している場合に、微生物を回収するステップを含む。
　第６項に記載の微生物の分析の準備方法によれば、回収した微生物の量がＡｓｒを用いた微生物の分析を行なうためには充分でなく、分析が失敗するという事態を避けることができる。換言すると、Ａｓｒを用いた微生物の分析のために必要な微生物の量が確実に確保できる。
　（第７項）第１～３のいずれか１項に記載の微生物の分析の準備方法において、ｐＨ指示薬は、ブロモクレゾールグリーン、メチルレッド、リトマス、ブロモクレゾールパープル、ブロモチモールブルー、フェノールレッド、ニュートラルレッド、ナフトールフタレインの少なくとも１つを含む。
　第７項に記載の微生物の分析の準備方法によれば、培地にこれらのｐＨ指示薬を含むことにより、培地のｐＨの変化が色の変化としてモニターできるようになる。
　（第８項）第１～３のいずれか１項に記載の微生物の分析の準備方法において、培地は、液体培地である。
　第８項に記載の微生物の分析の準備方法によれば、微生物および微生物が産生した酸は培地全体に広がるため、培地全体の色が変化することにより、培地における色の変化を識別しやすい。また、培地を寒天で冷やし固める作業が省ける等、Ａｓｒを用いた分析の準備がより簡便になる。
　（第９項）第１～３のいずれか１項に記載の微生物の分析の準備方法において、培地は、固形培地である。
　第９項に記載の微生物の分析の準備方法によれば、流動性の低さによって、培地を移動させる際の取り扱いがより容易である。
　（第１０項）第１～３のいずれか１項に記載の微生物の分析の準備方法において、微生物の分析は、質量分析装置を用いた微生物の質量分析である。
　第１０項に記載の微生物の分析の準備方法によれば、アシッドショックプロテインを産生する時期に回収した微生物について、マススペクトルを取得し、アシッドショックプロテインのピークを検出できる。そして、当該検出したピークに基づいて微生物を分析することが可能である。
　（第１１項）第１～３項のいずれか１項に記載の微生物の分析の準備方法により回収された微生物を用いて、アシッドショックプロテインを用いた分析を行なう、微生物の分析方法。
　第１１項に記載の微生物の分析方法によれば、アシッドショックプロテインを産生する時期に回収した、アシッドショックプロテインを確実に含む微生物を用いて、アシッドショックプロテインを用いた分析を行なうことが可能である。
　今回開示された実施形態はすべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は、上記した説明ではなく、請求の範囲によって示され、請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
　１　分析装置、１０　制御部、１１　処理部、１２　記憶部、１３　入出力部、２０　測定部、２１　イオン化部、２２　イオン加速部、２３　質量分離部、２４　検出部、１００　分析システム、１１１　装置制御部、１１２　マススペクトル作成部、１１３　マススペクトル分析部、１１４　較正部、１３１　入力部、１３２　出力部、１３３　通信部、２２１　加速電極、２３１　フライトチューブ、Ｓ　イオン。

Claims (11)

  1. 　アシッドショックプロテインを用いた微生物の分析の準備方法であって、
    　ｐＨ指示薬を含む１以上の培地を準備するステップと、
    　前記微生物を前記培地に植え付けるステップと、
    　前記培地において特定条件下で前記微生物の培養を行なうステップと、
    　前記培地の色を識別し、前記識別結果に基づいて、前記微生物がアシッドショックプロテインを産生する時期を検出するステップと、
    　前記アシッドショックプロテインを産生する時期に、前記微生物を前記分析のために回収するステップとを備える、微生物の分析の準備方法。
  2. 　前記１以上の培地は、第１培地を含み、
    　前記特定条件は、前記微生物にアシッドショックプロテインを産生させるための第１条件を含み、
    　前記培養するステップは、
    　　前記第１培地において前記第１条件下で前記微生物の培養を行なうステップを含み、
    　前記第１条件は、第１培地に糖が加えられているという条件、過培養であるという条件、嫌気的状態で培養されるという条件の少なくとも１つを含む、請求項１に記載の微生物の分析の準備方法。
  3. 　前記１以上の培地は、第２培地を含み、
    　前記特定条件は、前記微生物にアシッドショックプロテインを産生させないための第２条件を含み、
    　前記培養するステップは、
    　　前記第２培地において前記第２条件下で前記微生物の培養を行なうステップをさらに含み、
    　　前記第２条件は、第２培地に糖が加えられていないという条件、過培養でないという条件、嫌気的状態でない状態で培養されるという条件の全てを満たすという条件である、請求項２に記載の微生物の分析の準備方法。
  4. 　前記時期を検出するステップは、前記培地の色の経時的な変化に基づいて、前記微生物がアシッドショックプロテインを産生する時期を検出するステップを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の微生物の分析の準備方法。
  5. 　前記第１条件が、第１培地に特定種類の糖が加えられているという条件である場合、
    　前記時期を検出するステップは、酸性状態において前記ｐＨ指示薬が呈する色を前記第１培地が特定期間にわたって示さないとき、前記微生物は前記特定種類の糖の代謝によるアシッドショックプロテインの産生を行なわないと推定するステップを含む、請求項２または３に記載の微生物の分析の準備方法。
  6. 　前記回収するステップは、前記微生物がアシッドショックプロテインを産生する時期に、前記微生物の量が前記分析のための必要量に達している場合に、前記微生物を回収するステップを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の微生物の分析の準備方法。
  7. 　前記ｐＨ指示薬は、ブロモクレゾールグリーン、メチルレッド、リトマス、ブロモクレゾールパープル、ブロモチモールブルー、フェノールレッド、ニュートラルレッド、ナフトールフタレインの少なくとも１つを含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の微生物の分析の準備方法。
  8. 　前記培地は、液体培地である、請求項１～３のいずれか１項に記載の微生物の分析の準備方法。
  9. 　前記培地は、固形培地である、請求項１～３のいずれか１項に記載の微生物の分析の準備方法。
  10. 　前記微生物の分析は、質量分析装置を用いた微生物の質量分析である、請求項１～３のいずれか１項に記載の微生物の分析の準備方法。
  11. 　請求項１～３のいずれか１項に記載の微生物の分析の準備方法により回収された微生物を用いて、アシッドショックプロテインを用いた分析を行なう、微生物の分析方法。
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WO2020202861A1 (ja) * 2019-04-03 2020-10-08 株式会社島津製作所 分析方法、微生物の識別方法および検査方法

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