WO2020202861A1 - 分析方法、微生物の識別方法および検査方法 - Google Patents

分析方法、微生物の識別方法および検査方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2020202861A1
WO2020202861A1 PCT/JP2020/006501 JP2020006501W WO2020202861A1 WO 2020202861 A1 WO2020202861 A1 WO 2020202861A1 JP 2020006501 W JP2020006501 W JP 2020006501W WO 2020202861 A1 WO2020202861 A1 WO 2020202861A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
microorganism
mass spectrometry
analysis method
condition
sugar
Prior art date
Application number
PCT/JP2020/006501
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
児嶋　浩一
田中　耕一
Original Assignee
株式会社島津製作所
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 株式会社島津製作所 filed Critical 株式会社島津製作所
Priority to JP2021511206A priority Critical patent/JP7205616B2/ja
Priority to US17/600,483 priority patent/US20220178941A1/en
Priority to CN202080020690.0A priority patent/CN113574373B/zh
Publication of WO2020202861A1 publication Critical patent/WO2020202861A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2560/00—Chemical aspects of mass spectrometric analysis of biological material
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to an analysis method, a microorganism identification method, and an inspection method.
  • microorganisms and tests for pathogenicity and drug resistance are important in medical treatment and microbial research.
  • microorganisms of the same genus and the same species have different pathogenicity and drug resistance among microorganisms of different strains.
  • enterohemorrhagic Escherichia coli that causes food poisoning and Escherichia coli that exists as an indigenous bacterium in the intestine of a healthy person are of the same genus and species.
  • Such identification of microorganisms of the same genus and the same species but different strains is carried out by a degradability test or the like in which the microorganisms are cultured in the presence of a predetermined sugar and the change in the pH of the medium due to the decomposition of the sugar is differentiated by color development. It was.
  • Patent Document 1 the resistance of a microorganism to an antibiotic is determined by comparing the mass spectrum obtained by mass spectrometry of the microorganism cultured in a medium containing an antibiotic with the reference mass spectrum. ..
  • the analysis method involves preparing a sample containing a microorganism, arranging the microorganism under the first condition, and then performing first mass spectrometry of the substance produced by the microorganism.
  • the first data obtained by the first mass spectrometry, and the second mass spectrometry of the substance produced by the microorganism after the microorganism was placed under the second condition were obtained.
  • Information on the properties or classification of microorganisms contained in the sample based on the differences from the two data and the reference data in which the classification or properties of the microorganism and the data obtained by mass spectrometry of the microorganism are associated with each other.
  • the first condition and the second condition are different in sugar concentration or oxygen concentration in the environment in which the microorganism is arranged.
  • the analysis method of the first aspect comprises arranging the microorganism under the second condition and then performing the second mass spectrometry of the substance produced by the microorganism. Is preferable.
  • the concentration of the sugar is different between the first condition and the second condition, and the sugar is a monosaccharide or a disaccharide. , At least one saccharide selected from the group consisting of trisaccharides and tetrasaccharides.
  • the sugar is allose, altrose, glucose, mannose, growth, idose, galactose, tarose, fucose, fuclaus, lambnorth, psicose, fructose, At least one monosaccharide selected from the group consisting of sorbose, tagatos, ribose, arabinose, xylose, liquisource, ribulose, xylulose, deoxyribose, sedhepturose, ketotetrose, erythrulose, aldotethrulose, erythrulose, threose, ketotriose and aldotriose.
  • the sugar is at least one disaccharide selected from the group consisting of sucrose, lactose, maltose, trehalose, turanose and cellobiose. preferable.
  • the sugar is preferably at least one trisaccharide selected from the group consisting of raffinose, melezitose and maltotriose.
  • the sugar is preferably at least one tetrasaccharide selected from the group consisting of acarbose and stachyose.
  • the difference is the presence or absence of a peak in the mass spectrum or the difference in the intensity or area of the peak.
  • the peak is preferably a peak corresponding to an acid shock protein.
  • the first mass spectrometry and the second mass spectrometry using an aqueous solution containing at least one of an acid and an organic solvent. It is preferred that analytical samples be prepared for at least one of the analyses.
  • the acid is preferably trifluoroacetic acid.
  • the organic solvent is preferably methanol, ethanol, isopropanol or acetonitrile.
  • matrix-assisted laser desorption ionization or electrospray ionization is performed in the first mass spectrometry and the second mass spectrometry. It is preferable to perform ionization.
  • the information is preferably a strain of a microorganism.
  • the method for identifying a microorganism is a method for identifying a microorganism by analyzing the microorganism by the analysis method according to any one of the first to the fourteenth aspects, and the above-mentioned information is a method for identifying a microorganism. It is a classification, and the microorganism is identified by the information.
  • the inspection method is an inspection method for performing the analysis method of any one of the first to thirteenth aspects, and the information is the properties of the microorganism, and the information is based on the information. Inspect the properties of microorganisms.
  • the present invention it is possible to obtain information on the classification or properties of microorganisms by using mass spectrometry based on differences in culture conditions and the like.
  • FIG. 1 is a flowchart showing a flow of an analysis method of one embodiment.
  • FIG. 2 is a flowchart showing the flow of the analysis method of one embodiment.
  • FIG. 3 is a flowchart showing the flow of the analysis method of one embodiment.
  • FIG. 4 is a mass spectrum obtained by culturing Escherichia coli K12 strain in a glucose-containing medium (upper row) and a glucose-free medium (lower row), respectively, and mass spectrometrically analyzing the substance produced by the bacterium.
  • FIG. 4 is a mass spectrum obtained by culturing Escherichia coli K12 strain in a glucose-containing medium (upper row) and a glucose-free medium (lower row), respectively, and mass spectrometrically analyzing the substance produced by the bacterium.
  • FIG. 5 is a mass spectrum obtained by culturing an Escherichia coli environmental isolate in a glucose-containing medium (upper row) and a glucose-free medium (lower row), respectively, and mass spectrometrically analyzing the substance produced by the bacterium.
  • FIG. 6 is a mass spectrum obtained by culturing an Escherichia coli environmental isolate (upper row) and a K12 strain (lower row) in a medium containing glucose and mass spectrometrically analyzing a substance produced by the bacterium.
  • FIG. 6 is a mass spectrum obtained by culturing an Escherichia coli environmental isolate (upper row) and a K12 strain (lower row) in a medium containing glucose and mass spectrometrically analyzing a substance produced by the bacterium.
  • FIG. 7 is a product ion spectrum obtained by tandem mass spectrometry of molecules corresponding to the peaks of m / z 3,823 observed in the mass spectrum when the Escherichia coli K12 strain was cultured in a medium containing glucose.
  • FIG. 8 was obtained by culturing Escherichia coli K12 strain under low oxygen concentration (upper row) and under normal oxygen concentration (about 20%) (lower row), and mass spectrometrically analyzing the substance produced by the bacterium. It is a mass spectrum.
  • FIG. 9 is a mass spectrum obtained by culturing Acinetobacter in a glucose-free medium (upper row) and a glucose-containing medium (lower row), and mass spectrometrically analyzing the substance produced by the bacterium.
  • FIG. 8 was obtained by culturing Escherichia coli K12 strain under low oxygen concentration (upper row) and under normal oxygen concentration (about 20%) (lower row), and mass spectrometrically analyzing the substance produced by the
  • FIG. 10 shows a mass spectrum obtained from Escherichia coli K12 strain after culturing in a glucose-containing medium (first stage from the top) and a glucose-free medium (second stage from the top), and a glucose-containing medium (top). It is a figure which shows the mass spectrum obtained from the Escherichia coli JM109 strain after culturing in the medium containing no glucose (the fourth row from the top), respectively.
  • FIG. 11 is a diagram showing a mass spectrum obtained from the JM109 strain after culturing in a medium containing lactose (upper row) and a mass spectrum obtained from the K12 strain after culturing in a medium containing lactose (lower row). ..
  • the analysis method of the present embodiment is based on the data obtained by performing mass spectrometry (hereinafter referred to as the first mass spectrometry) of the substance produced by the microorganism arranged under the first condition and under the second condition. Based on the difference from the data obtained by performing mass spectrometry (hereinafter referred to as second mass spectrometry) of the substance produced by the arranged microorganism, information on the properties or classification of this microorganism is obtained.
  • the first condition and the second condition are different conditions.
  • the inventors classify or property the microorganism in the first mass spectrometry and the second mass spectrometry. It was found that different data can be obtained depending on the situation. Therefore, it is preferable that at least one of the sugar concentration and the oxygen concentration in the environment in which the microorganism is arranged is different between the first condition and the second condition.
  • the sample prepared for the analysis method of the present embodiment is not particularly limited as long as it contains microorganisms.
  • the microorganism in the sample it is preferable to use one in which the purity of one type of microorganism has been increased by separation culture or the like.
  • the sample is derived from food, medicine, etc. Samples derived from these can be used for inspection for quality control of foods, pharmaceuticals, etc. by the analysis method of the present embodiment.
  • the sample is derived from a substance taken from an environment such as drinking water or soil. The samples derived from these can be used for inspections such as whether the environment from which the samples are derived meets a predetermined standard by the analysis method of the present embodiment.
  • microorganisms contained in the sample are not particularly limited as long as different data can be obtained in the first mass spectrometry and the second mass spectrometry depending on the classification or properties of the microorganisms, but eubacteria are preferable, and Escherichia coli, Acinetobacter or Enterobacter are preferable. More preferred.
  • the medium for culturing the microorganism may be a solid medium such as an agar medium or a liquid medium. It is not particularly restricted but the basic composition of the medium, IFO 802 medium (composition of the aqueous solution: high-poly peptone 1%, 0.2 wt% yeast extract, MgSO 4 ⁇ 7H 2 O 0.1 wt%, pH 7.0) Etc., known ones and the like can be used.
  • IFO 802 medium composition of the aqueous solution: high-poly peptone 1%, 0.2 wt% yeast extract, MgSO 4 ⁇ 7H 2 O 0.1 wt%, pH 7.0
  • the difference between the first condition and the second condition causes a difference in the data obtained by the first mass spectrometry and the second mass spectrometry, and based on the difference, information on the classification or properties of microorganisms can be obtained.
  • the difference between the first condition and the second condition is not particularly limited.
  • the first condition and the second condition have different sugar concentrations in the medium for culturing the microorganisms, or different oxygen concentrations in the gas in contact with the microorganisms. Both the sugar concentration and the oxygen concentration may be different.
  • the sugar concentration under the first condition and the second condition is not limited as long as information on the microorganism or properties can be obtained based on the difference in the obtained data.
  • sugar is not added to the medium under one of the first condition and the second condition, and sugar is added to the medium at an appropriate concentration such as 0.1% or more and 10% or less on the other side. Is preferable.
  • the type of sugar contained in the medium at different concentrations is not particularly limited, but monosaccharides, disaccharides, trisaccharides and tetrasaccharides are preferable.
  • the above sugars contained in the medium are allose, altrose, glucose, mannose, growth, idose, galactose, talose, fucose, fukurosu, ramnorth, psicose (also called allulose), fructose, sorbose, tagatous, ribose.
  • Arabinose, xylose, liquisource, ribulose, xylulose, deoxyribose, sedhepturose, ketotetrose, aldotetrose, ketotriose (dihydroxyacetone) or aldtriose (glyceraldehyde) are preferred.
  • ketotethrulose erythrulose is preferable.
  • aldotethrose erythrose or threose is preferable.
  • a plurality of types of sugars may be used in combination.
  • glucose is more preferable.
  • the sugar contained in the medium is preferably at least one disaccharide selected from the group consisting of sucrose, lactose, maltose, trehalose, turanose and cellobiose.
  • the sugar is more preferably lactose.
  • the sugar contained in the medium is preferably at least one trisaccharide selected from the group consisting of raffinose, melezitose and maltotriose.
  • the sugar contained in the medium is preferably at least one tetrasaccharide selected from the group consisting of acarbose and stachyose.
  • the sugar contained in the medium may be a compound of a monosaccharide, a disaccharide, a trisaccharide or a tetrasaccharide other than those listed above, or a sugar obtained by binding 5 or more monosaccharides.
  • the first condition and the second condition can be obtained.
  • the value of the oxygen concentration is not particularly limited.
  • the difference in oxygen concentration between the first condition and the second condition is preferably 10% or more, and more preferably 15% or more.
  • the atmosphere around the microorganism is air, and under the other condition, the microorganism, the medium, and the oxygen absorber are placed in a closed container or the like to reduce the oxygen concentration. Can be done.
  • the reduced oxygen concentration is preferably 5% or less, and more preferably 1% or less.
  • the oxygen absorber those contained in known products such as Aneropack (registered trademark) can be used.
  • the temperature of the medium at the time of culturing is not particularly limited, preferably 25 ° C to 40 ° C, more preferably 37 ° C, and an appropriate temperature for the growth of microorganisms can be appropriately selected.
  • the culturing time may be appropriately determined based on the growth rate of microorganisms determined according to the selected culturing conditions, and is preferably 12 hours to 36 hours, and can be set to, for example, 18 hours.
  • the culture can be carried out in a short time because it does not require time for the molecules required for color development to accumulate as compared with the conventional degradability test and the like.
  • analytical samples for first and second mass spectrometry are prepared.
  • MALDI matrix-assisted laser desorption / ionization
  • the microorganisms obtained by culturing are recovered, and a solution containing a matrix (hereinafter referred to as a matrix solution) is added to the obtained sample. Then, it is dropped on a sample plate for MALDI and dried. After placing the sample on the sample plate for MALDI, the matrix solution may be added.
  • the type of matrix is not particularly limited, and CHCA ( ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid), sinapic acid, or the like can be used.
  • the solvent for the matrix solution can be prepared using at least one of an acid and an organic solvent.
  • the organic solvent methanol, ethanol, isopropanol or acetonitrile is preferably used.
  • a solvent obtained by adding 0 to 3% by volume of trifluoroacetic acid (TFA) to an aqueous solution containing several tens of volumes of an organic solvent such as acetonitrile can be used.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • a matrix solution may be added to the extract to prepare a sample for analysis. Further, even when mass spectrometry is performed without using MALDI, a sample for analysis can be appropriately prepared by a known method or the like according to the ionization method and the type of mass spectrometer.
  • MALDI-TOFMS Time-of-flight mass spectrometry using MALDI
  • the methods of the first mass spectrometry and the second mass spectrometry include the data obtained by the first mass spectrometry (hereinafter referred to as the first data) and the data obtained by the second mass spectrometry (hereinafter referred to as the second data). It is not particularly limited as long as it is possible to obtain information on the classification or properties of microorganisms based on the difference from (called). For example, any ionization method such as an electrospray method can be used.
  • a mass spectrometer such as a quadrupole mass filter or an ion trap can be used, and in addition to using a single mass spectrometer, multi-step mass analysis can be performed by using a combination of any plurality of arbitrary mass spectrometers. Good.
  • first mass spectrometry and the second mass spectrometry data corresponding to the mass spectrum obtained by the detection of the ionized sample is generated.
  • the mass spectra obtained by the first mass spectrometry and the second mass spectrometry are referred to as a first mass spectrum and a second mass spectrum, respectively.
  • the method of data analysis is not particularly limited as long as information on the classification or properties of microorganisms can be obtained based on the difference between the first data and the second data.
  • the data analysis is preferably performed based on the presence or absence of a predetermined peak in the first mass spectrum and the second mass spectrum or the difference in the magnitude of the peak.
  • Data analysis can be performed using an information processing device such as a personal computer or an arbitrary data analysis device such as a processing device in the mass spectrometer.
  • the sugar concentration in the medium is changed under the first condition and the second condition
  • the following data analysis can be performed.
  • the medium contains sugar
  • the second condition the medium does not contain sugar.
  • a peak that does not appear in the second mass spectrum but appears in the first mass spectrum (hereinafter, referred to as a peculiar peak) is identified.
  • specific peaks can be extracted, for example, having a relative intensity or relative peak area above a certain level with respect to any reference peak.
  • the data analysis apparatus used for data analysis in the analysis method of the present embodiment includes a storage medium for storing reference data as a database, or is configured so that the reference data can be referred to from the storage medium via communication.
  • the m / z of the peculiar peak and the m / z of the reference peak are within the error range based on the accuracy of the first mass spectrometry and the second mass spectrometry.
  • the peculiar peak and the reference peak are associated with each other. If it is determined that it is not within the error range, the peculiar peak and the reference peak are considered to be incompatible.
  • the microorganism contained in the sample can be identified as the microorganism in the strain or the like.
  • the probability that the microorganism contained in the sample is a microorganism corresponding to the reference peak may be calculated based on the number of peculiar peaks associated with the reference peak or the like.
  • Such classification of microorganisms can be performed on different strains of the same genus and the same species, or may be performed on classifications other than strains such as genus and species.
  • the reference peak and the peculiar peak are associated with each other based on the presence or absence of the peculiar peak corresponding to the m / z of the reference peak, but the association is further based on quantitative numerical values such as the intensity and area of the peak. May be done. The same applies below.
  • a method for identifying microorganisms for obtaining information on the classification of microorganisms contained in a sample is provided using the analysis method of the present embodiment.
  • microorganisms such as pathogenicity or drug resistance and the reference peak are associated with each other
  • the properties of microorganisms are characteristics of microorganisms such as sugar assimilation, optimum growth temperature, pathogenicity, and drug resistance, and may include those different within the classification of microorganisms, for example.
  • the probability may be calculated as described above.
  • the pathogenicity to be analyzed is not particularly limited as long as the data can be analyzed based on the difference between the first data and the second data, and is, for example, intestinal bleeding in Escherichia coli.
  • the drug resistance to be analyzed is not particularly limited, and is, for example, antibacterial resistance.
  • the analysis method of the present embodiment is used to obtain information on the properties of microorganisms contained in the sample, and this information provides a method for inspecting microorganisms for testing the properties of microorganisms.
  • the same data analysis can be performed even when the oxygen concentration of the gas in contact with the microorganism is changed during culturing under the first condition and the second condition.
  • the first condition is a low oxygen concentration such as 5% or less
  • the second condition is an oxygen concentration close to air such as 18% or more and 22% or less.
  • the peak that does not appear in the second mass spectrum but appears in the first mass spectrum is set as a peculiar peak.
  • a peak that is detected when the microorganism is cultured at a low oxygen concentration and is not detected when the microorganism is cultured at an oxygen concentration close to air is defined as a reference peak based on past measurement data or theoretical values. Even in this case, information on the classification or properties of microorganisms can be obtained based on the association between the specific peak and the reference peak, as in the case of changing the sugar concentration.
  • FIG. 1 is a flowchart showing the flow of the analysis method of the present embodiment.
  • step S1001 a sample containing a microorganism is prepared.
  • step S1003a and step S1003b are started.
  • step S1003a the microorganism is cultivated under the first condition.
  • step S1005a an analytical sample (hereinafter, referred to as a first analytical sample) containing a substance produced by a microorganism arranged under the first condition is prepared.
  • step S1007a the first mass spectrometry of the sample for the first analysis is performed, and the first data corresponding to the first spectrum is acquired.
  • step S1003b the microorganism is cultivated under the second condition.
  • step S1005b is started.
  • step S1005b an analytical sample (hereinafter, referred to as a second analytical sample) containing a substance produced by a microorganism arranged under the second condition is prepared.
  • step S1007b is started.
  • step S1007b the second mass spectrometry of the second analysis sample is performed, and the data analyzer acquires the second data corresponding to the second spectrum.
  • step S1009 is started.
  • step S1009 information on the classification or properties of microorganisms can be obtained based on the difference in the presence or absence of peaks between the first mass spectrum and the second mass spectrum and the reference data. For example, the reference peak associated with the peculiar peak obtained in the first and second mass analysis is searched from the database.
  • step S1011 is started.
  • step S1011 the information obtained in step S1009 is output. This information is displayed on a display monitor connected to the data analysis device, printed on a printer, or the like, and output.
  • FIG. 2 is a flowchart showing a flow of creating a database including reference data from the data obtained in the first mass spectrometry and the second mass spectrometry in the analysis method of the present embodiment.
  • a database of reference data is pre-created by the method shown in FIG. 2 before performing the analysis method shown in FIG.
  • FIG. 2 shows an example in which the peculiar peak of the first mass spectrum is recorded in the database as reference data, the second mass spectrum may be recorded.
  • step S2001 a sample containing a predetermined type of microorganism is prepared.
  • the type of microorganism may be known, or may be identified by a known method or the like by step S2013.
  • step S2001 both step S2003a and step S2003b are started. Since steps S2003a to S2007a and steps S2003b to S2007b are the same as steps S1003a to S1007a and steps S1003b to S1007b in the flowchart of FIG. 1, the description thereof will be omitted.
  • step S2007a and step S2007b are completed, step S2009 is started.
  • step S2009 the first mass spectrum and the second mass spectrum are compared, and a peak peculiar to the first mass spectrum is specified.
  • step S2011 is started.
  • steps S2001 to S2009 are also performed for the other plurality of types of microorganisms to identify peaks peculiar to the first mass spectrum.
  • step S2013 is started.
  • step S2013 data (reference data) corresponding to the type of microorganism and the m / z of the peculiar peak in the first mass spectrum is stored in the database.
  • step S2013 is completed, the database construction process is completed.
  • reference data corresponding to the database may be stored in sequence as in step S2013.
  • the above-mentioned peculiar peak corresponded to a molecule constituting a part of the acid shock protein (UniProt accession number: P36560) of Escherichia coli K12 strain.
  • the amino acid sequence of the acid shock protein of Escherichia coli K12 strain is "MKKVLALVVA AAMGLSSAAFAAETTTTPAP TATTTKAAPAKTTHHKKQHKAAPAQKAQAA KKHHKNTKAEQKAPEQKAQA AKKHAKKHSHQQPAKPAAQPAA" (SEQ ID NO: 1).
  • the peculiar peak corresponding to m / z 3823 was the molecule corresponding to the 22nd to 58th amino acids in the amino acid sequence of the acid shock protein.
  • the peculiar peak corresponding to m / z 2371 was the molecule corresponding to the 59th to 79th amino acids in the amino acid sequence of the acid shock protein.
  • the peculiar peak corresponding to m / z 2401 was the molecule corresponding to the 80th to 102nd amino acids in the amino acid sequence of the acid shock protein.
  • Shigella sonnei includes a gene encoding an acid shock protein (UniProt accession number: A0A236HJK2) having an amino acid sequence different from that of the acid shock protein of Escherichia coli K12 strain. Therefore, it was presumed that the analytical method of this embodiment can be preferably applied to at least various microorganisms expressing acid shock proteins.
  • an acid shock protein is expressed and a peculiar peak can be obtained.
  • the environment in which the microorganisms are arranged can be made acidic under either the first condition or the second condition.
  • the above-mentioned acid shock protein is an example of a molecule that is specifically expressed under one of the conditions when the sugar concentration and the oxygen concentration are different between the first condition and the second condition, and the present invention is an acid.
  • the peak corresponding to the shock protein is not limited to the specific peak.
  • the molecule and the like are not particularly limited.
  • the first condition and the second condition include obtaining information about the property or classification of a microorganism based on reference data in which the classification or property and the data obtained by mass spectrometry of the microorganism are associated with each other. , The sugar concentration or oxygen concentration in the environment where the microorganisms are placed is different. As a result, it is possible to obtain information on the classification or properties of microorganisms by mass spectrometry based on the difference in culture conditions and the like.
  • the above difference is the presence or absence of a peculiar peak in the mass spectrum or the difference in the intensity or area of the peak. This makes it possible to perform more detailed analysis using mass spectra containing quantitative information on various molecules.
  • the peculiar peak includes the peak corresponding to the acid shock protein. This makes it possible to perform analysis by utilizing the variation of acid shock protein species and strains.
  • the first mass spectrometry will be performed, and the information acquired in the past will be used for the second data that should be obtained by the second mass spectrometry.
  • This modification is particularly useful when the second condition is more basic or general purpose than the first condition, but is not particularly limited.
  • the second data includes the second mass spectrum and the second.
  • the data can include the m / z value of the peak appearing in the mass spectrum.
  • the peculiar peak in the first spectrum can be identified based on the first mass spectrum and the second data.
  • a peculiar peak based on the presence or absence of sugar in the medium it can be associated with reference data based on the presence or absence of sugar to obtain information on the classification or properties of microorganisms.
  • FIG. 3 is a flowchart showing the flow of the analysis method of the present embodiment. Since steps S3001 to S3007 are the same as steps S1001 and S1003a to S1007a in the flowchart of FIG. 1 described above, description thereof will be omitted. When step S3007 is completed, step S3009 is started.
  • step S3009 the data analyzer uses the second data obtained by the second mass spectrometry of the substance produced by the microorganism after the microorganism of the same type as the microorganism contained in the sample is cultured under the second condition. To get.
  • step S3011 is started. Since steps S3011 and S3013 are the same as steps S1009 and S1011 in the flowchart of FIG. 1 described above, the description thereof will be omitted.
  • step S3013 is completed, the process is completed.
  • the first mass spectrometry of the substance produced by the microorganism is performed, the first data obtained by the first mass spectrometry, and the microorganism.
  • the first condition and the second condition are different in sugar concentration or oxygen concentration in the environment in which the microorganism is arranged, in addition to obtaining information on the properties. As a result, the number of mass spectrometrys can be reduced and the analysis can be performed more efficiently.
  • the present invention is not limited to the contents of the above embodiment. Other aspects conceivable within the scope of the technical idea of the present invention are also included within the scope of the present invention.
  • Example 1 In Example 1, the difference between the first condition and the second condition was the presence or absence of sugar in the medium, and two different strains of Escherichia coli were identified using the peculiar peak.
  • Escherichia coli K12 strain and Escherichia coli environmental isolate were prepared.
  • the Escherichia coli environmental isolate was collected from a general environment, applied to a solid medium to obtain an isolate, and then identified as Escherichia coli by a microbial identification method using MALDI.
  • the Escherichia coli K12 strain and the Escherichia coli environmental isolate are of the same genus and the same species, and could not be distinguished by conventional biochemical property tests.
  • E. coli K12 strain The Escherichia coli K12 strain was divided and cultured in IFO 802 medium supplemented with glucose (0.5% by mass) and IFO 802 medium at 37 ° C. for 18 hours, respectively. The cultured microorganisms were centrifuged to discard the supernatant, and a trifluoroacetic acid-acetonitrile aqueous solution was added to the remaining cells to suspend them. The suspended solution was centrifuged to collect the supernatant. The recovered supernatant was diluted with an aqueous acetonitrile solution, dropped onto a plate for MALDI mass spectrometry, and dried. CHCA was added as a matrix to the dried sample and re-dried, and time-of-flight mass spectrometry was performed using a MALDI mass spectrometer (AXIMA Performance, Shimadzu Corporation).
  • MALDI mass spectrometer AXIMA Performance, Shimadzu Corporation
  • FIG. 4 shows a mass spectrum obtained from the K12 strain after culturing in a medium containing glucose (upper row) and a mass spectrum obtained from the K12 strain obtained after culturing in a medium not added with glucose (lower row). It is a figure.
  • the mass spectra obtained were peculiar to m / z 2371, m / z 2401 and m / z 3823, as compared with the case of culturing in a medium without glucose. A peak was observed.
  • E. coli environmental isolates were separated and cultured in IFO 802 medium supplemented with glucose (0.5% by mass) and IFO 802 medium at 37 ° C for 18 hours, respectively.
  • the cultured microorganisms were mass spectrometrically analyzed for Escherichia coli K12 strain by the same method as described above.
  • FIG. 5 shows a mass spectrum (upper) obtained from an environmental isolate after culturing in a medium containing glucose and a mass spectrum (lower) obtained from an environmental isolate after culturing in a medium without glucose. It is a figure which shows.
  • the mass spectra obtained were m / z 2341, m / z 2401 and m / z 3792, as compared with the case of culturing in a medium not added with glucose. A peculiar peak was observed.
  • FIG. 6 shows a mass spectrum obtained from an Escherichia coli environmental isolate after culturing in a medium containing glucose (upper row) and a mass spectrum obtained from an Escherichia coli K12 strain cultivated in a medium containing glucose (lower row). It is a figure which shows.
  • the two mass spectra in FIG. 6 are shown by enlarging a part of the mass spectra in FIGS. 4 and 5. It can be seen that the peaks of m / z 2341, m / z 2401 and m / z 3792 are prominent peculiar peaks of the E. coli environmental isolate.
  • Example 2 In the mass spectrum obtained by mass spectrometry after culturing Escherichia coli K12 strain in a medium containing glucose, the molecule corresponding to m / z 3823 observed as a peculiar peak was ionized by MALDI and tandem mass spectrometry was performed. Data analysis was performed assuming that each peak in the product ion spectrum obtained by tandem mass spectrometry corresponds to a peptide fragment, and the amino acid sequence of the molecule was derived.
  • FIG. 7 is a diagram showing a product ion spectrum obtained by tandem mass spectrometry.
  • the molecule corresponding to m / z 3823 was a peptide having the amino acid sequence of "AETTTTPAPTATTTKAAPAKTTHHKKQHKAAPAQKAQ" (SEQ ID NO: 2).
  • This peptide was found to correspond to the 22nd to 58th amino acids in the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) of the acid shock protein of Escherichia coli K12 strain.
  • the peculiar peak corresponding to m / z 2371 corresponds to the 59th to 79th amino acids in the amino acid sequence of the acid shock protein.
  • the peculiar peak corresponding to m / z 2401 was estimated to correspond to the 80th to 102nd amino acids in the amino acid sequence of the acid shock protein.
  • Example 3 In Example 3, the Escherichia coli K12 strain was used as a sample, and the difference between the first condition and the second condition was the oxygen concentration of the gas in contact with the Escherichia coli K12 strain during culturing, and a peculiar peak was detected.
  • E. coli K12 strain An aqueous solution containing 20 mL of 1% high polypeptone, 0.2% yeast extract, and 0.1% magnesium sulfate was prepared as a medium, and Escherichia coli K12 strain was added. 10 mL of the medium containing E. coli was dispensed, and one of them was adjusted to a low oxygen concentration (0.5% or less) using Aneropack (Mitsubishi Gas Chemical Company), an anaerobic culture system. Escherichia coli was cultured in a medium with a low oxygen concentration and a medium without a low oxygen concentration at 37 ° C. for 24 hours, respectively.
  • Aneropack Mitsubishi Gas Chemical Company
  • the culture broth obtained after culturing was centrifuged, the supernatant was discarded, and 100 ⁇ L of 2.5% trifluoroacetic acid 50% acetonitrile aqueous solution was added to the remaining cells and suspended.
  • the suspended solution was centrifuged and each supernatant was collected individually.
  • the recovered supernatant was diluted 400-fold or 1,600-fold with a 50% aqueous acetonitrile solution, and 0.5 ⁇ L thereof was added dropwise to a plate for MALDI mass spectrometry and dried.
  • FIG. 8 is a diagram showing a mass spectrum obtained from a microorganism cultured under a low oxygen concentration (upper row) and a mass spectrum obtained from a microorganism cultured without a low oxygen concentration (lower row).
  • the mass spectrum obtained was compared with the case where it was cultured without hypoxia.
  • the mass spectra obtained showed peculiar peaks of m / z 2371, m / z 2401 and m / z 3823. Was observed. This peculiar peak was considered to correspond to the same molecule (acid shock protein) as the peculiar peak when cultured in a medium containing sugar.
  • this molecule can be expressed even in culture under anaerobic conditions. That is, it is possible to obtain information on the classification or properties of microorganisms by utilizing the property that acid shock proteins are expressed or not expressed in culture under anaerobic conditions. It is also possible to obtain information on the classification or properties of microorganisms by utilizing the difference in m / z values derived from this molecule.
  • Example 4 In Example 4, Acinetobacter was used as a sample, and the difference between the first condition and the second condition was the presence or absence of sugar in the medium, and a peculiar peak was detected.
  • an environmental isolate of Acinetobacter was prepared.
  • the environmental isolate of Acinetobacter was collected from human feces, applied to a solid medium to obtain an isolate, and then identified as Acinetobacter by the MALDI microbial identification method.
  • ⁇ Acinetobacter culture and mass spectrometry> An aqueous solution (IFO 802 medium) containing 10 mL of 1% high polypeptone, 0.2% yeast extract, and 0.1% magnesium sulfate was prepared, and Acinetobacter was added thereto.
  • An aqueous solution (IFO 804 medium) containing 10 mL of 0.5% high polypeptone, 0.5% yeast extract, 0.5% glucose, and 0.1% magnesium sulfate was prepared, and Acinetobacter was added thereto. Acinetobacter was cultured in both media at 37 ° C. for 18 hours.
  • each culture solution was centrifuged, the supernatant was discarded, and 100 ⁇ L of 2.5% trifluoroacetic acid 50% acetonitrile aqueous solution was added to the remaining cells and suspended.
  • the suspended solution was centrifuged and the supernatant was collected.
  • the recovered supernatant was diluted 100-fold with a 50% aqueous acetonitrile solution, and 0.5 ⁇ L thereof was added dropwise to a plate for MALDI mass spectrometry and dried.
  • FIG. 9 is a diagram showing a mass spectrum (upper) obtained from Acinetobacter after culturing in a medium without glucose and a mass spectrum (lower) obtained from Acinetobacter after culturing in a medium with glucose added. is there.
  • Acinetobacter was cultured in a medium containing glucose
  • a peculiar peak of m / z 8822 was observed in the obtained mass spectrum as compared with the case of culturing in a medium not added with glucose. Therefore, in culturing in a glucose-added medium, the phenomenon that molecules responding to this condition are expressed is observed not only in Escherichia coli but also in other microorganisms, indicating that the analysis method of the above-described embodiment is versatile.
  • m / z 4413 is also a peculiar peak, but this peak corresponds to the divalent ion of the ion corresponding to the peculiar peak of m / z 8822.
  • Example 5 Escherichia coli K12 strain and Escherichia coli JM109 strain were used as samples, and the difference between the first condition and the second condition was the presence or absence of sugar in the medium, and glucose and lactose were used as the sugars. By changing the sugar, the appearance of peculiar peaks was different, and this was used to identify two different strains of E. coli.
  • the Escherichia coli K12 strain was divided and cultured in IFO 802 medium supplemented with glucose (0.5% by mass) and IFO 802 medium at 37 ° C. for 18 hours, respectively.
  • the cultured microorganisms were centrifuged to discard the supernatant, and a trifluoroacetic acid-acetonitrile aqueous solution was added to the remaining cells to suspend them. The suspended solution was centrifuged to collect the supernatant.
  • the recovered supernatant was diluted with an aqueous acetonitrile solution, dropped onto a plate for MALDI mass spectrometry, and dried.
  • CHCA was added as a matrix to the dried sample and re-dried, and time-of-flight mass spectrometry was performed using a MALDI mass spectrometer (AXIMA Performance, Shimadzu Corporation).
  • FIG. 10 shows a mass spectrum obtained from the K12 strain after culturing in a medium containing glucose (first stage from the top) and a mass spectrum obtained from the K12 strain obtained after culturing in a medium not added with glucose (top). 2nd stage), mass spectrum obtained from JM109 strain after culturing in a medium containing glucose (3rd stage from the top), and mass obtained from JM109 strain obtained after culturing in a medium without glucose added. It is a figure which shows the spectrum (fourth stage from the top).
  • Escherichia coli JM109 strain As in the case of Escherichia coli K12 strain, when cultured in a medium containing glucose, peculiar peaks of m / z 2371, m / z 2401 and m / z 3823 were observed in the obtained mass spectrum. (See rectangular parts P1 and P2 surrounded by broken lines). That is, the Escherichia coli JM109 strain also has a gene for acid shock protein, and the gene was expressed by culturing in a medium containing glucose.
  • E. coli K12 strain and E. coli JM109 strain were cultured in IFO 802 medium supplemented with lactose (1% by mass) at 37 ° C. for 18 hours, respectively.
  • the cultured microorganisms were centrifuged to discard the supernatant, and a trifluoroacetic acid-acetonitrile aqueous solution was added to the remaining cells to suspend them. The suspended solution was centrifuged to collect the supernatant.
  • the recovered supernatant was diluted with an aqueous acetonitrile solution, dropped onto a plate for MALDI mass spectrometry, and dried.
  • CHCA was added as a matrix to the dried sample and re-dried, and time-of-flight mass spectrometry was performed using a MALDI mass spectrometer (AXIMA Performance, Shimadzu Corporation).
  • FIG. 11 shows a mass spectrum obtained from the JM109 strain after culturing in a medium containing lactose (upper row) and a mass spectrum obtained from the K12 strain after culturing in a medium containing lactose (lower row).
  • a peculiar peak was observed as in the case of adding glucose in FIG.
  • no peculiar peak was observed as in the case where glucose was not added in FIG. 10 (see arrows A1, A2 and A3).
  • Escherichia coli K12 strain and Escherichia coli JM109 strain express acid shock proteins in the same manner in the medium to which glucose is added, whereas when lactose is added, they are expressed in Escherichia coli K12 strain but not in Escherichia coli JM109 strain. It is possible to identify the strain of the bacterium by utilizing the fact that the mass spectrum patterns obtained by changing the type of sugar are different in this way.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

分析方法は、微生物を含む試料を用意することと、微生物を、第１条件の下に配置した後、微生物が産生した物質の第１質量分析を行うことと、第１質量分析で得られた第１データと、微生物が第２条件の下に配置された後に微生物が産生した物質の第２質量分析が行われて得られた第２データとの差異、および、微生物の分類または性状と、微生物の質量分析で得られるデータとが対応付けられた参照データに基づいて、試料に含まれる微生物の性状または分類についての情報を得ることとを備え、第１条件と第２条件とは、微生物が配置された環境における糖の濃度または酸素濃度が異なる。

Description

分析方法、微生物の識別方法および検査方法
　本発明は、分析方法、微生物の識別方法および検査方法に関する。
　微生物の識別および病原性や薬剤耐性等の検査は、医療や微生物の研究等において重要である。ここで、同属同種の微生物について、異なる株の微生物において病原性や薬剤耐性に違いがあることが知られている。例えば、食中毒を起こす腸管出血性大腸菌と健常者の腸内常在菌として存在している大腸菌とは、同属同種である。このような同属同種であって異なる株の微生物の識別では、所定の糖の存在下で微生物を培養し、糖の分解による培地のｐＨの変化を発色により鑑別する分解性試験等により行われていた。
　このような方法では、発色の有無のような二者択一の判定しかできず、微生物の分類または性状について詳細な情報を得ることが難しかった。より詳細な情報を得るためには、数種類の糖で分解性試験を行う等の必要があり、煩雑であった。この点に関し、特許文献１では、抗生剤を加えた培地で培養した微生物を質量分析して得られたマススペクトルと、基準マススペクトルとの比較により、抗生剤に対する微生物の耐性を判定している。
米国特許第８２９３４９６号明細書
　異なる条件を利用して培養した微生物を質量分析することにより、より多くの情報を得られることが好ましい。
　本発明の第１の態様によると、分析方法は、微生物を含む試料を用意することと、前記微生物を、第１条件の下に配置した後、前記微生物が産生した物質の第１質量分析を行うことと、前記第１質量分析で得られた第１データと、前記微生物が第２条件の下に配置された後に前記微生物が産生した物質の第２質量分析が行われて得られた第２データとの差異、および、前記微生物の分類または性状と、前記微生物の質量分析で得られるデータとが対応付けられた参照データに基づいて、前記試料に含まれる微生物の性状または分類についての情報を得ることとを備え、前記第１条件と前記第２条件とは、前記微生物が配置された環境における糖の濃度または酸素濃度が異なる。
　本発明の第２の態様によると、第１の態様の分析方法において、前記微生物を前記第２条件の下に配置した後、前記微生物が産生した物質の前記第２質量分析を行うことを備えることが好ましい。
　本発明の第３の態様によると、第１または第２の態様の分析方法において、前記第１条件と前記第２条件とは、前記糖の濃度が異なり、前記糖は、単糖類、二糖類、三糖類および四糖類からなる群から選択される少なくとも一つの糖類であることが好ましい。
　本発明の第４の態様によると、第３の態様の分析方法において、前記糖は、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、フコース、フクロース、ラムノース、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース、リボース、アラビノース、キシロース、 リキソース、リブロース、キシルロース、デオキシリボース、セドヘプツロース、ケトテトロース、エリトルロース、アルドテトロース、エリトロース、トレオース、 ケトトリオースおよびアルドトリオースからなる群から選択される少なくとも一つの単糖類であることが好ましい。
　本発明の第５の態様によると、第３の態様の分析方法において、前記糖は、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、ツラノースおよびセロビオースからなる群から選択される少なくとも一つの二糖類であることが好ましい。
　本発明の第６の態様によると、第３の態様の分析方法において、前記糖は、ラフィノース、メレジトースおよびマルトトリオースからなる群から選択される少なくとも一つの三糖類であることが好ましい。
　本発明の第７の態様によると、第３の態様の分析方法において、前記糖は、アカルボースおよびスタキオースからなる群から選択される少なくとも一つの四糖類であることが好ましい。
　本発明の第８の態様によると、第１から第７までのいずれかの態様の分析方法において、前記差異は、マススペクトルにおけるピークの有無またはピークの強度若しくは面積の差であることが好ましい。
　本発明の第９の態様によると、第８の態様の分析方法において、前記ピークは、酸ショックタンパク質に対応するピークであることが好ましい。
　本発明の第１０の態様によると、第１から第９までのいずれかの態様の分析方法において、酸および有機溶媒の少なくとも一つを含む水溶液を用いて前記第１質量分析および前記第２質量分析の少なくとも一つのための分析用試料が調製されることが好ましい。
　本発明の第１１の態様によると、第１０の態様の分析方法において、前記酸は、トリフルオロ酢酸であることが好ましい。
　本発明の第１２の態様によると、第１０の態様の分析方法において、前記有機溶媒は、メタノール、エタノール、イソプロパノールまたはアセトニトリルであることが好ましい。
　本発明の第１３の態様によると、第１から第１２までのいずれかの態様の分析方法において、前記第１質量分析および前記第２質量分析では、マトリックス支援レーザー脱離イオン化またはエレクトロスプレーイオン化によりイオン化を行うことが好ましい。
　本発明の第１４の態様によると、第１から第１３までのいずれかの態様の分析方法において、前記情報は、微生物の株であることが好ましい。
　本発明の第１５の態様によると、微生物の識別方法は、第１から第１４までのいずれかの態様の分析方法により微生物の分析を行う微生物の識別方法であって、前記情報は、微生物の分類であり、前記情報により前記微生物の識別を行う。
　本発明の第１６の態様によると、検査方法は、第１から第１３までのいずれかの態様の分析方法を行う検査方法であって、前記情報は、微生物の性状であり、前記情報により前記微生物の性状の検査を行う。
　本発明によれば、培養条件等の違いに基づいて、質量分析を用い微生物の分類または性状等についての情報を得ることができる。
図１は、一実施形態の分析方法の流れを示すフローチャートである。 図２は、一実施形態の分析方法の流れを示すフローチャートである。 図３は、一実施形態の分析方法の流れを示すフローチャートである。 図４は、大腸菌Ｋ１２株を、グルコースを含む培地（上段）およびグルコースを含まない培地（下段）においてそれぞれ培養し、当該菌により生成された物質を質量分析して得られたマススペクトルである。 図５は、大腸菌環境分離株を、グルコースを含む培地（上段）およびグルコースを含まない培地（下段）においてそれぞれ培養し、当該菌により生成された物質を質量分析して得られたマススペクトルである。 図６は、大腸菌環境分離株（上段）およびＫ１２株（下段）を、グルコースを含む培地においてそれぞれ培養し、当該菌により生成された物質を質量分析して得られたマススペクトルである。 図７は、大腸菌Ｋ１２株をグルコースを含む培地において培養した際に、マススペクトルにおいて観察されるｍ／ｚ　３，８２３のピークに対応する分子をタンデム質量分析した際のプロダクトイオンスペクトルである。 図８は、大腸菌Ｋ１２株を、低酸素濃度下（上段）および通常の酸素濃度（約２０％）下（下段）においてそれぞれ培養し、当該菌により生成された物質を質量分析して得られたマススペクトルである。 図９は、アシネトバクターを、グルコースを含まない培地（上段）およびグルコースを含む培地（下段）においてそれぞれ培養し、当該菌により生成された物質を質量分析して得られたマススペクトルである。 図１０は、グルコースを含む培地（上から１段目）およびグルコースを含まない培地（上から２段目）でそれぞれ培養後の大腸菌Ｋ１２株から得られたマススペクトルと、グルコースを含む培地（上から３段目）およびグルコースを含まない培地（上から４段目）でそれぞれ培養後の大腸菌ＪＭ１０９株から得られたマススペクトルとを示す図である。 図１１は、ラクトースを含む培地で培養後のＪＭ１０９株から得られたマススペクトル（上段）と、ラクトースを含む培地で培養後のＫ１２株から得られたマススペクトル（下段）とを示す図である。
　以下、図を参照して本発明を実施するための形態について説明する。
－第１実施形態－
　本実施形態の分析方法は、第１条件の下に配置された微生物が産生した物質の質量分析（以下、第１質量分析と呼ぶ）を行って得られたデータと、第２条件の下に配置された微生物が産生した物質の質量分析（以下、第２質量分析と呼ぶ）を行って得られたデータとの差異に基づいて、この微生物に性状または分類についての情報を得るものである。
　第１条件と第２条件とは異なる条件である。発明者らは、第１条件と第２条件とで、微生物が配置された環境における糖の濃度または酸素濃度等が異なると、第１質量分析と第２質量分析において、微生物の分類または性状等に応じて異なるデータが得られることを見出した。従って、第１条件と第２条件とでは、微生物が配置された環境における糖の濃度および酸素濃度の少なくとも一つが異なることが好ましい。
（試料について）
　本実施形態の分析方法のために用意される試料は、微生物を含めば特に限定されない。試料における微生物は、分離培養等により一種類の微生物の純度が高められたものを用いることが好ましい。例えば、試料は、食品または医薬品等に由来する。これらに由来する試料は、本実施形態の分析方法により、食品または医薬品等の品質管理を行うための検査に用いることができる。他の例では、試料は飲料水または土壌等の環境から採取された物質に由来する。これらに由来する試料は、本実施形態の分析方法により、試料が由来する環境が所定の基準を満たしているか等の検査に用いることができる。試料に含まれる微生物は、第１質量分析と第２質量分析において、微生物の分類または性状等に応じて異なるデータが得られれば特に限定されないが、真正細菌が好ましく、大腸菌、アシネトバクターまたはエンテロバクターがより好ましい。
（第１条件および第２条件での培養について）
　試料に含まれる微生物は、少なくとも２つに分けられ、第１条件および第２条件のそれぞれの条件下で培養される。第１条件および第２条件において、微生物を培養する培地は寒天培地等の固体培地でも液体培地でもよい。培地の基本的な組成は特に限定されず、ＩＦＯ　８０２培地（水溶液の組成：ハイポリペプトン　１質量％、酵母エキス　０．２質量％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　０．１質量％、ｐＨ７．０）等、公知のもの等を用いることができる。
　第１条件と第２条件との間の違いにより、第１質量分析および第２質量分析で得られるデータに差異が生じ、当該差異に基づいて微生物の分類または性状についての情報が得られるのであれば、第１条件と第２条件との間で異なる点は特に限定されない。好ましくは、第１条件と第２条件とでは、微生物を培養する培地における糖の濃度が異なるか、または微生物の接する気体における酸素濃度が異なる。この糖の濃度および酸素濃度の両方が異なってもよい。
　培地における糖の濃度が異なる場合、得られるデータの差異に基づいて微生物または性状についての情報が得られるのであれば第１条件と第２条件における糖の濃度は限定されない。より明確な結果を得るため、第１条件と第２条件との一方では培地に糖を加えず、他方では培地に糖を０．１％以上１０％以下等、適当な濃度になるように加えることが好ましい。
　第１条件および第２条件において、培地に異なる濃度で含まれる糖の種類は特に限定されないが、単糖類、二糖類、三糖類および四糖類が好ましい。
　培地に含まれる上記糖は、単糖類の場合、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、フコース、フクロース、ラムノース、プシコース（アルロースとも呼ばれる）、フルクトース、ソルボース、タガトース、リボース、アラビノース、キシロース、 リキソース、リブロース、キシルロース、デオキシリボース、セドヘプツロース、ケトテトロース、アルドテトロース、ケトトリオース（ジヒドロキシアセトン）またはアルドトリオース（グリセルアルデヒド）が好ましい。ケトテトロースとしては、エリトルロースが好ましい。アルドテトロースとしては、エリトロースまたはトレオースが好ましい。これらの単糖のうち複数種類の糖を組み合わせて用いてもよい。上記糖は、グルコースがより好ましい。
　培地に含まれる上記糖は、二糖類の場合、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、ツラノースおよびセロビオースからなる群から選択される少なくとも一つの二糖類であることが好ましい。上記糖は、ラクトースがより好ましい。
　培地に含まれる上記糖は、三糖類の場合、ラフィノース、メレジトースおよびマルトトリオースからなる群から選択される少なくとも一つの三糖類であることが好ましい。
　培地に含まれる上記糖は、四糖類の場合、アカルボースおよびスタキオースからなる群から選択される少なくとも一つの四糖類であることが好ましい。
　なお、培地に含まれる上記糖は、上記に列挙した以外の単糖類、二糖類、三糖類または四糖類の化合物の他、５以上の単糖が結合して得られた糖でもよい。
　第１条件と第２条件とで、微生物が接する気体の酸素濃度を異ならせる場合、得られるデータの差異に基づいて微生物の分類または性状についての情報が得られれば第１条件および第２条件の酸素濃度の値は特に限定されない。第１条件と第２条件での酸素濃度の差は１０％以上であることが好ましく、１５％以上であることがより好ましい。好適な例としては、一方の条件では微生物の周囲雰囲気を空気とし、他方の条件では微生物、培地および酸素吸収剤を密閉された容器等に配置する等して酸素濃度を低下させるようにすることができる。この場合、低下された酸素濃度を５％以下にすることが好ましく、１％以下にすることがより好ましい。酸素吸収剤としては、アネロパック（登録商標）等の公知の製品に含まれるものを用いることができる。
　培養の際の培地の温度は、特に限定されず、好ましくは２５℃～４０℃、より好ましくは３７℃であり、微生物の増殖に適当な温度を適宜選択することができる。培養時間は、選択した培養条件に応じて定まる微生物の増殖速度等に基づいて適宜定めればよく、１２時間～３６時間であることが好ましく、例えば１８時間等に設定することができる。質量分析により微生物の分析を行う場合、従来の分解性試験等に比べ、発色に必要な分子が蓄積する時間等が必要ないため、短い時間で培養を行うことができる。
（分析用試料の調製について）
　第１条件および第２条件のそれぞれの下での培養が終わったら、第１質量分析および第２質量分析のための分析用試料が調製される。マトリックス支援レーザー脱離イオン化（以下、ＭＡＬＤＩと呼ぶ）を用いる質量分析を行う場合、培養により得られた微生物を回収し、得られた試料にマトリックスを含む溶液（以下、マトリックス溶液と呼ぶ）を加えてＭＡＬＤＩ用試料プレートに滴下して乾燥させる。試料をＭＡＬＤＩ用試料プレートに配置した後、マトリックス溶液を加えてもよい。マトリックスの種類は特に限定されず、ＣＨＣＡ（α-cyano-4-hydroxycinnamic acid）またはシナピン酸等を用いることができる。マトリックス溶液の溶媒は、酸および有機溶媒の少なくとも一つを用いて調製することができる。この有機溶媒は、メタノール、エタノール、イソプロパノールまたはアセトニトリルを用いることが好ましい。当該溶媒は、例えばアセトニトリル等の有機溶媒を数十体積％含む水溶液にトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）が０～３体積％添加されたもの等を用いることができる。
　なお、培養により得られた微生物からタンパク質を抽出した後、抽出物にマトリックス溶液を加えて分析用試料を調製してもよい。また、ＭＡＬＤＩを用いないで質量分析を行う場合も、適宜イオン化の方法および質量分析計の種類に合わせて公知の方法等で分析用試料の調製を行うことができる。
（第１質量分析および第２質量分析について）
　第１質量分析および第２質量分析におけるイオン化の方法は、ＭＡＬＤＩを用いることが１価のイオンが生成しやすく解析が容易であるため好ましい。また、飛行時間型質量分析が、数ｋＤａ以上等の高質量の分子を精度よく検出する上で好ましい。ＭＡＬＤＩを用いた飛行時間型質量分析（以下、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳと呼ぶ）が、ＭＡＬＤＩと飛行時間型質量分析の利点を併せ持つため特に好ましい。しかし、第１質量分析および第２質量分析の方法は、第１質量分析で得られたデータ（以下、第１データと呼ぶ）と第２質量分析により得られたデータ（以下、第２データと呼ぶ）との差異に基づいて微生物の分類または性状の情報を得ることができれば、特に限定されない。例えば、エレクトロスプレー法等の任意のイオン化の方法を用いることができる。また、四重極マスフィルタまたはイオントラップ等の質量分析器を用いることができ、シングル質量分析計を用いる他、任意の複数の質量分析器を組み合わせて用い、多段階の質量分析を行ってもよい。第１質量分析および第２質量分析では、イオン化された試料の検出により得られたマススペクトルに対応するデータが生成される。第１質量分析および第２質量分析で得られたマススペクトルを、それぞれ第１マススペクトルおよび第２マススペクトルと呼ぶ。
（データ解析について）
　データ解析の方法は、第１データと第２データの差異に基づいて微生物の分類または性状についての情報を得られれば特に限定されない。データ解析は、第１マススペクトルと第２マススペクトルにおける所定のピークの有無または当該ピークの大きさの差に基づいて行うことが好ましい。データ解析は、パーソナルコンピュータ等の情報処理装置や、質量分析装置内の処理装置等の任意のデータ解析装置を用いて行うことができる。
　第１条件と第２条件で培地における糖の濃度を変えた場合、以下のようなデータ解析を行うことができる。第１条件では培地が糖を含み、第２条件では培地が糖を含まないとする。このとき、第２マススペクトルには現れず、第１マススペクトルに現れるピーク（以下、特有ピークと呼ぶ）を同定する。ノイズおよび顕著ではないピークを除くため、特有ピークは、例えば、任意の基準ピークに対して一定以上の相対強度または相対ピーク面積を有するものを抽出することができる。
　一方、過去の測定データまたは理論値等から得られた、微生物の株等の分類における、培地に糖が加えられた場合に検出され、培地に糖が加えられなかった場合に検出されないピーク（以下、参照ピークと呼ぶ）のｍ／ｚが予め取得されている。以下では、微生物の分類または性状と、当該微生物の質量分析で得られるデータである参照ピークとが対応付けられたデータを参照データと呼ぶ。本実施形態の分析方法におけるデータ解析に用いられるデータ解析装置は、参照データをデータベースとして格納する記憶媒体を備えるか、または当該記憶媒体から通信を介し参照データを参照できるように構成されている。
　特有ピークのｍ／ｚと、参照ピークのｍ／ｚとが、第１質量分析および第２質量分析の精度に基づく誤差範囲にあるか否かが判定される。当該誤差範囲にあると判定された場合、特有ピークと参照ピークとは対応付けられる。当該誤差範囲にないと判定された場合、特有ピークと参照ピークは対応していないものとされる。微生物のある株等における参照ピークの全てについて、特有ピークと対応づけられた場合、試料に含まれていた微生物は当該株等の微生物であると識別することができる。あるいは、参照ピークと対応づけられた特有ピークの数等に基づいて、試料に含まれていた微生物が当該参照ピークに対応する微生物である確率を算出してもよい。このような微生物の分類は、同属同種における異なる株について行うことができる他、属や種等の株以外の分類について行ってもよい。
　なお、以上では参照ピークのｍ／ｚに対応する特有ピークの有無に基づいて参照ピークと特有ピークの対応付けを行ったが、さらにピークの強度や面積等の定量的な数値に基づいて対応付けを行ってもよい。以下でも同様である。
　上述のように、本実施形態の分析方法を用い、試料に含まれる微生物の分類についての情報を取得する微生物の識別方法が提供される。
　参照データとして、病原性または薬剤耐性等の微生物の性状と参照ピークとが対応付けられたデータを用いてもよい。微生物の性状とは、糖の資化性や至適生育温度または病原性や薬剤耐性等の微生物の特徴であって、例えば微生物の分類内で異なるものを含むことができる。この場合、例えば、ある特定の性状を持つ微生物が共通して有する参照ピークの全てについて、特有ピークと対応づけられた場合、試料に含まれていた微生物は当該性状を有するとの情報を得ることができる。あるいは上述のように確率を算出してもよい。分析の対象となる病原性は第１データと第２データの差異に基づいてデータ解析できれば特に限定されず、例えば大腸菌における腸管出血性等である。分析の対象となる薬剤耐性も同様に特に限定されず、例えば抗菌耐性等である。
　上述のように、本実施形態の分析方法を用い、試料に含まれる微生物の性状についての情報を取得し、この情報により微生物の性状検査を行う微生物の検査方法が提供される。
　第１条件と第２条件で培養の際、微生物が接する気体の酸素濃度を変えた場合も、同様のデータ解析を行うことができる。第１条件では上記酸素濃度が５％以下等の低酸素濃度であり、第２条件では１８％以上２２％以下等の空気に近い酸素濃度とする。このとき、第２マススペクトルには現れず、第１マススペクトルに現れるピークを特有ピークとする。また、過去の測定データまたは理論値等に基づいて、低酸素濃度で微生物を培養した際に検出され、空気に近い酸素濃度で微生物を培養した際に検出されないピークを参照ピークとする。この場合でも、糖の濃度を変化させた場合と同様、特有ピークと参照ピークとの対応付けに基づいて、微生物の分類または性状についての情報を取得することができる。
　図１は、本実施形態の分析方法の流れを示すフローチャートである。ステップＳ１００１において、微生物を含む試料が用意される。ステップＳ１００１が終了したら、ステップＳ１００３ａおよびステップＳ１００３ｂの両方が開始される。
　ステップＳ１００３ａにおいて、微生物が第１条件の下で培養される。ステップＳ１００３ａが終了したら、ステップＳ１００５ａが開始される。ステップＳ１００５ａにおいて、第１条件の下に配置された微生物が産生した物質を含む分析用試料（以下、第１分析用試料と呼ぶ）が調製される。ステップＳ１００５ａが終了したら、ステップＳ１００７ａが開始される。ステップＳ１００７ａにおいて、第１分析用試料の第１質量分析が行われ、第１マスペクトルに対応する第１データが取得される。
　ステップＳ１００３ｂにおいて、微生物が第２条件の下で培養される。ステップＳ１００３ｂが終了したら、ステップＳ１００５ｂが開始される。ステップＳ１００５ｂにおいて、第２条件の下に配置された微生物が産生した物質を含む分析用試料（以下、第２分析用試料と呼ぶ）が調製される。ステップＳ１００５ｂが終了したら、ステップＳ１００７ｂが開始される。ステップＳ１００７ｂにおいて、第２分析用試料の第２質量分析が行われ、データ解析装置は第２マスペクトルに対応する第２データを取得する。ステップＳ１００７ａおよびステップＳ１００７ｂが終了したら、ステップＳ１００９が開始される。
　ステップＳ１００９において、第１マススペクトルと第２マスペクトルとにおけるピークの有無等の差異、および参照データに基づいて、微生物の分類または性状についての情報が得られる。例えば、第１および第２質量分析で得られた特有ピークと対応付けられる参照ピークがデータベースから検索される。ステップＳ１００９が終了したら、ステップＳ１０１１が開始される。ステップＳ１０１１において、ステップＳ１００９で得られた情報が出力される。この情報は、データ解析装置に接続された表示モニタに表示されたり、プリンター等に印刷されたりして出力される。
　図２は、本実施形態の分析方法において、第１質量分析および第２質量分析で得られたデータから、参照データを含むデータベースを作成する流れを示すフローチャートである。実際には、図１に示された分析方法を行う前に、図２で示された方法により参照データのデータベースが予め作成される。図２では、第１マススペクトルの特有ピークを参照データとしてデータベースに記録する例を示すが、第２マススペクトルについて行ってもよい。
　ステップＳ２００１において、所定の種類の微生物を含む試料が用意される。微生物の種類は、既知でもよいし、ステップＳ２０１３までに公知の方法等で同定を行ってもよい。ステップＳ２００１が終了したら、ステップＳ２００３ａおよびステップＳ２００３ｂの両方が開始される。ステップＳ２００３ａ～Ｓ２００７ａ、およびステップＳ２００３ｂ～Ｓ２００７ｂは、それぞれ図１のフローチャートにおけるステップＳ１００３ａ～Ｓ１００７ａ、およびステップＳ１００３ｂ～Ｓ１００７ｂと同一であるため、説明を省略する。ステップＳ２００７ａおよびステップＳ２００７ｂが終了したら、ステップＳ２００９が開始される。
　ステップＳ２００９において、第１マススペクトルと、第２マススペクトルとを比較し、第１マススペクトルに特有のピークを特定する。ステップＳ２００９が終了したら、ステップＳ２０１１が開始される。ステップＳ２０１１において、他の複数の種類の微生物についても、ステップＳ２００１～Ｓ２００９を行い、第１マススペクトルに特有のピークを特定する。ステップＳ２０１１が終了したら、ステップＳ２０１３が開始される。
　ステップＳ２０１３において、微生物の種類と、第１マススペクトルにおける特有のピークのｍ／ｚを対応させたデータ（参照データ）がデータベースに記憶される。ステップＳ２０１３が終了したら、データベースの構築処理が終了される。
　なお、ステップＳ２００９またはステップＳ２０１１において、ある微生物の特有のピークが特定されたら、順次ステップＳ２０１３のように、データベースに対応する参照データを記憶させてもよい。
（特有ピークの一例について）
　発明者らは、微生物（大腸菌Ｋ１２株）を糖を含む培地で培養した場合を第１条件とし、糖を含まない培地で培養した場合を第２条件とした場合に、第１マススペクトルに観察される特有ピークとして、ｍ／ｚ　２３７１、２４０１および３８２３のそれぞれに対応するピークを特定した。さらに発明者らは、これらに対応する分子をタンデム質量分析により同定した（後述の実施例２参照）。
　上記特有ピークは、大腸菌Ｋ１２株の酸ショックタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｐ３６５６０）の一部を構成する分子に対応していた。大腸菌Ｋ１２株の酸ショックタンパク質のアミノ酸配列は、“MKKVLALVVA AAMGLSSAAF AAETTTTPAP TATTTKAAPA KTTHHKKQHK AAPAQKAQAA KKHHKNTKAE QKAPEQKAQA AKKHAKKHSH QQPAKPAAQP AA”である（配列番号１）。ｍ／ｚ　３８２３に対応する特有ピーク（図４参照）は、酸ショックタンパク質のアミノ酸配列における２２番目から５８番目までのアミノ酸に対応する分子であった。ｍ／ｚ　２３７１に対応する特有ピークは、酸ショックタンパク質のアミノ酸配列における５９番目から７９番目までのアミノ酸に対応する分子であった。ｍ／ｚ　２４０１に対応する特有ピークは、酸ショックタンパク質のアミノ酸配列における８０番目から１０２番目までのアミノ酸に対応する分子であった。
　酸ショックタンパク質に対応するタンパク質を発現する他属の微生物も存在する。例えば、Ｄ群赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ　ｓｏｎｎｅｉ）は、大腸菌Ｋ１２株の酸ショックタンパク質と異なるアミノ酸配列を有する酸ショックタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ａ０Ａ２３６ＨＪＫ２）をコードする遺伝子を備える。従って、本実施形態の分析方法は、少なくとも酸ショックタンパク質を発現する様々な微生物に好ましく適用できることが推定された。第１条件と第２条件との間で糖の濃度または酸素濃度等が異なることにより、微生物が配置された環境が酸性となると、酸ショックタンパク質が発現し特有ピークが取得され得る。従って、本実施形態の分析方法では、第１条件と第２条件とのいずれか一方において、微生物が配置された環境が酸性となるようにすることができる。
　なお、上述の酸ショックタンパク質は、第１条件と第２条件とで糖の濃度や酸素濃度を異ならせた際に、一方の条件で特異的に発現する分子の一例であり、本発明は酸ショックタンパク質に対応するピークのみを特有ピークとして限定するものではない。糖の濃度や酸素濃度等を異ならせた際に第１データと第２データとで差異があり、この差異に基づいて微生物の分類または性状についての情報を得ることができれば、この差異の原因となる分子等は特に限定されない。
　上述の実施の形態によれば、次の作用効果が得られる。
（１）本実施形態の分析方法は、微生物を、第１条件の下に配置した後、微生物が産生した物質の第１質量分析を行うことと、微生物を、第２条件の下に配置した後、微生物が産生した物質の第２質量分析を行うことと、第１質量分析で得られた第１データと、第２質量分析で得られた第２データとの差異、および、前記微生物の分類または性状と、前記微生物の質量分析で得られるデータとが対応付けられた参照データに基づいて、微生物の性状または分類についての情報を得ることとを備え、第１条件と第２条件とは、微生物が配置された環境における糖の濃度または酸素濃度が異なる。これにより、培養条件等の違いに基づいて、質量分析により微生物の分類または性状等ついての情報を得ることができる。
（２）本実施形態の分析方法において、上記差異は、マススペクトルにおける特有ピークの有無またはピークの強度若しくは面積の差である。これにより、様々な分子の定量的な情報を含むマススペクトルを用いてより詳細な解析を行うことができる。
（３）本実施形態の分析方法において、特有ピークは、酸ショックタンパク質に対応するピークを含む。これにより、酸ショックタンパク質の種や株ごとのばらつきを利用して解析を行うことができる。
　次のような変形も本発明の範囲内であり、上述の実施形態と組み合わせることが可能である。以下の変形例において、上述の実施形態と同様の部分に関しては、適宜説明を省略する。
（変形例１）
　上述の実施形態では、第１質量分析と第２質量分析の両方を行って、それぞれに対応するデータを取得した。しかし、第１質量分析と第２質量分析のいずれか一方のみを行い、他方については過去に取得された情報を利用してもよい。
　以下の説明では、第１質量分析を行い、第２質量分析で得られるはずの第２データについては、過去に取得された情報を利用するものとする。本変形例は、特に第２条件が第１条件と比較してより基本的な、または汎用されている条件の場合に有用であるが、特に限定されない。例えば、第１条件を糖を含む培地で微生物を培養することとし、第２条件を糖を含まない培地で微生物を培養することとした場合、第２データは、第２マススペクトルや、第２マススペクトルに現れるピークのｍ／ｚの値を含むデータとすることができる。これにより、第１マススペクトルと第２データとに基づいて、第１スペクトルにおける特有ピークを同定することができる。培地における糖の有無に基づく特有ピークが得られたら、糖の有無に基づく参照データとの対応付けを行い、微生物の分類または性状についての情報を得ることができる。
　図３は、本実施形態の分析方法の流れを示すフローチャートである。ステップＳ３００１～ステップＳ３００７は、上述の図１のフローチャートにおけるステップＳ１００１およびＳ１００３ａ～Ｓ１００７ａとそれぞれ同一であるため説明を省略する。ステップＳ３００７が終了したら、ステップＳ３００９が開始される。
　ステップＳ３００９において、データ解析装置は、試料に含まれる微生物と同一の種類の微生物が第２条件の下で培養された後、この微生物が産生した物質の第２質量分析で得られた第２データを取得する。ステップＳ３００９が終了したら、ステップＳ３０１１が開始される。ステップＳ３０１１およびステップＳ３０１３は、上述の図１のフローチャートのステップＳ１００９およびステップＳ１０１１と同一であるため、説明を省略する。ステップＳ３０１３が終了したら、処理が終了される。
　本変形例の分析方法では、微生物を、第１条件の下に配置した後、微生物が産生した物質の第１質量分析を行うことと、第１質量分析で得られた第１データと、微生物が第２条件の下に配置された後に微生物が産生した物質の第２質量分析が行われて得られた第２データとの差異、および参照データに基づいて、試料に含まれる微生物の分類または性状についての情報を得ることとを備え、第１条件と第２条件とは、微生物が配置された環境における糖の濃度または酸素濃度が異なる。これにより、質量分析の回数を少なくし、より効率的に分析を行うことができる。
　本発明は上記実施形態の内容に限定されるものではない。本発明の技術的思想の範囲内で考えられるその他の態様も本発明の範囲内に含まれる。
　以下に、本実施形態に係る実施例を示すが、本発明は下記の実施例の数値や装置等の条件に限定されるものではない。
（実施例１）
　実施例１では、第１条件と第２条件との間の異なる点を培地における糖の有無とし、特有ピークを用いて２つの異なる株の大腸菌の識別を行った。
＜試料について＞
　試料は、大腸菌K12株と、大腸菌環境分離株とを用意した。大腸菌環境分離株は、一般的な環境から採集し、固形培地に塗布して分離株を得たのちに、MALDIによる微生物同定法により大腸菌と同定した。大腸菌K12株と大腸菌環境分離株は、同属同種であり、従来の生化学的な性状検査では識別できなかった。
＜大腸菌K12株の培養および質量分析＞
　大腸菌K12株を分け、IFO 802培地にグルコース（0.5質量％）を加えた培地と、IFO 802培地とのそれぞれで３７℃、１８時間の条件で培養した。培養後の微生物を遠心して上清を捨て、残った菌体にトリフルオロ酢酸－アセトニトリル水溶液を加えて懸濁した。懸濁後の溶液を遠心分離して上清を回収した。回収した上清をアセトニトリル水溶液で希釈し、MALDI質量分析用プレートに滴下して乾固した。乾固した試料に、マトリックスとしてCHCAを加えて再乾固し、MALDI質量分析装置(島津製作所AXIMA Performance)を用いて飛行時間型の質量分析を行った。
　図４は、グルコースを加えた培地で培養後のK12株から得られたマススペクトル（上段）と、グルコースを加えなかった培地で培養後のK12株から得られたマススペクトル（下段）とを示す図である。大腸菌K12株をグルコースを加えた培地で培養した場合、グルコースを加えない培地で培養した場合との比較から、得られるマススペクトルにはm/z 2371、m/z 2401およびm/z 3823の特有ピークが観察された。
＜大腸菌環境分離株の培養および質量分析＞
　大腸菌環境分離株を分け、IFO 802培地にグルコース（0.5質量%）を加えた培地と、IFO 802培地とのそれぞれで37℃、18時間の条件で培養した。培養後の微生物を大腸菌K12株について上記した方法と同様の方法で質量分析した。
　図５は、グルコースを加えた培地で培養後の環境分離株から得られたマススペクトル（上段）と、グルコースを加えなかった培地で培養後の環境分離株から得られたマススペクトル（下段）とを示す図である。大腸菌環境分離株をグルコースを加えた培地で培養した場合、グルコースを加えない培地で培養した場合との比較から、得られるマススペクトルにはm/z 2341、m/z 2401およびm/z 3792の特有ピークが観察された。
　図６は、グルコースを加えた培地で培養後の大腸菌環境分離株から得られたマススペクトル（上段）と、グルコースを加えた培地で培養後の大腸菌K12株から得られたマススペクトル（下段）とを示す図である。図６の２つのマススペクトルは、図４、図５におけるマススペクトルの一部を拡大して示したものである。m/z 2341、m/z 2401およびm/z 3792のピークが大腸菌環境分離株の顕著な特有ピークであることが分かる。また、m/z 2371、m/z 2401およびm/z 3823のピークが大腸菌K12株の顕著な特有ピークであることが分かる。このように、糖を含む培地で培養した際に産生される物質が異なるという特徴に基づいて、異なる株の識別をすることができた。
（実施例２）
　大腸菌K12株をグルコースを加えた培地で培養した後に質量分析を行って得られたマススペクトルにおいて、特有ピークとして観察されたm/z 3823に対応する分子をMALDIによりイオン化し、タンデム質量分析した。タンデム質量分析により得られたプロダクトイオンスペクトルにおけるそれぞれのピークがペプチド断片に相当するとしてデータ解析し、当該分子のアミノ酸配列を導出した。
　図７は、タンデム質量分析により得られたプロダクトイオンスペクトルを示す図である。このプロダクトイオンスペクトルをデータ解析した結果、上記m/z 3823に対応する分子は、“AETTTTPAPTATTTKAAPAKTTHHKKQHKAAPAQKAQ”（配列番号2）のアミノ酸配列を有するペプチドであると推定された。このペプチドは、大腸菌K12株の酸ショックタンパク質のアミノ酸配列（配列番号1）の22番目から58番目までのアミノ酸に対応していることが分かった。同様な解析を行い、m/z 2371に対応する特有ピークは、酸ショックタンパク質のアミノ酸配列における59番目から79番目までのアミノ酸に対応していると推定された。m/z 2401に対応する特有ピークは、酸ショックタンパク質のアミノ酸配列における80番目から102番目までのアミノ酸に対応していると推定された。
（実施例３）
　実施例３では、大腸菌K12株を試料とし、第１条件と第２条件との間の異なる点を培養の際に大腸菌K12株が接する気体の酸素濃度とし、特有ピークの検出を行った。
＜大腸菌K12株の培養および質量分析＞
　20mLの1% ハイポリペプトン、0.2% 酵母エキス、0.1% 硫酸マグネシウムを含む水溶液を培地として調製し、大腸菌K12株を加えた。大腸菌が加えられた培地を10mLずつ分注し、一方を嫌気培養システムのアネロパック（三菱ガス化学）を用いて低酸素濃度（0.5%以下）とした。低酸素濃度にした培地と、低酸素濃度にしなかった培地とのそれぞれで、37℃、24時間の条件で大腸菌を培養した。培養後に得られた培養液を遠心分離し、上清を放棄し、残った菌体に100μＬの2.5% トリフルオロ酢酸　50% アセトニトリル水溶液を加えて懸濁した。懸濁した後の溶液を遠心分離し、それぞれの上清を個別に回収した。回収した上清を50% アセトニトリル水溶液で400倍、あるいは1,600倍に希釈し、その0.5μＬをMALDI質量分析用プレートに滴下し乾固した。乾固した試料に2.5mg/mL CHCAを重層するように加えて再乾固し、MALDI質量分析装置(島津製作所 AXIMA Performance)を用いて飛行時間型の質量分析を行った。
　図８は、低酸素濃度下で培養した微生物から得られたマススペクトル（上段）と、低酸素濃度下にしないで培養した微生物から得られたマススペクトル（下段）とを示す図である。大腸菌K12株を低酸素濃度下で培養した場合、低酸素化にしないで培養した場合との比較から、得られるマススペクトルにはm/z 2371、m/z 2401およびm/z 3823の特有ピークが観察された。この特有ピークは、糖を含む培地で培養した際の特有ピークと同一の分子（酸ショックタンパク質）に対応していると考えられた。従って、この分子は嫌気性条件の培養でも発現させることが可能と解った。すなわち、嫌気性条件の培養で酸ショックタンパク質が発現する、または発現しないという特性を利用して微生物の分類または性状についての情報を取得することができる。また、この分子に由来するm/zの値の違いを利用して微生物の分類または性状についての情報を取得することも可能である。
（実施例４）
　実施例４では、アシネトバクターを試料とし、第１条件と第２条件との間の異なる点を培地における糖の有無とし、特有ピークの検出を行った。
＜試料について＞
　試料は、アシネトバクターの環境分離株を用意した。アシネトバクターの環境分離株は、ヒトの糞便から採集し、固形培地に塗布して分離株を得たのちに、MALDI微生物同定法によりアシネトバクターと同定した。
＜アシネトバクターの培養および質量分析＞
　10mLの1% ハイポリペプトン、0.2% 酵母エキス、0.1% 硫酸マグネシウムを含む水溶液(IFO 802培地)を調製し、これにアシネトバクターを加えた。10mLの0.5% ハイポリペプトン、0.5% 酵母エキス、0.5% グルコース 、0.1% 硫酸マグネシウムを含む水溶液(IFO 804 培地)を調製し、これにアシネトバクターを加えた。両培地においてアシネトバクターを37℃、18時間の条件で培養した。培養後、それぞれの培養液を遠心分離し、上清を棄て、残った菌体に100μＬの2.5% トリフルオロ酢酸　50% アセトニトリル水溶液を加えて懸濁した。懸濁した溶液を遠心分離し、上清を回収した。回収した上清を50% アセトニトリル水溶液で100倍に希釈し、その0.5μＬをMALDI質量分析用プレートに滴下し乾固した。乾固した試料に0.5μＬの2.5mg/mL CHCAを重層するように加えて再乾固し、MALDI質量分析装置(島津製作所AXIMA Performance)を用いて飛行時間型の質量分析を行った。
　図９は、グルコースを加えなかった培地で培養後のアシネトバクターから得られたマススペクトル（上段）と、グルコースを加えた培地で培養後のアシネトバクターから得られたマススペクトル（下段）とを示す図である。アシネトバクターをグルコースを加えた培地で培養した場合、グルコースを加えない培地で培養した場合との比較から、得られるマススペクトルにはm/z 8822の特有ピークが観察された。従って、グルコースが加えた培地による培養で、この条件に応答する分子が発現する現象は大腸菌だけではなく、他の微生物でもみられ、上述の実施形態の分析方法が汎用的であることを示している。なお、m/z 4413も特有ピークといえるが、このピークはm/z 8822の特有ピークに対応するイオンの二価イオンに対応するものである。
（実施例５）
　実施例５では、大腸菌K12株と大腸菌JM109株を試料とし、第１条件と第２条件との間の異なる点を培地における糖の有無とし、その糖としてグルコースとラクトースを用いた。糖を変えることで、特有ピークの出現が異なり、これを利用して２つの異なる株の大腸菌の識別を行った。
＜大腸菌K12株と大腸菌JM109株の培養(グルコースの有無)および質量分析＞
　大腸菌K12株を分け、IFO 802培地にグルコース（0.5質量％）を加えた培地と、IFO 802培地とのそれぞれで37℃、18時間の条件で培養した。培養後の微生物を遠心して上清を捨て、残った菌体にトリフルオロ酢酸－アセトニトリル水溶液を加えて懸濁した。懸濁後の溶液を遠心分離して上清を回収した。回収した上清をアセトニトリル水溶液で希釈し、MALDI質量分析用プレートに滴下して乾固した。乾固した試料に、マトリックスとしてCHCAを加えて再乾固し、MALDI質量分析装置(島津製作所AXIMA Performance)を用いて飛行時間型の質量分析を行った。
　大腸菌JM109株の場合も、上記の大腸菌K12株の場合と同様に、IFO 802培地にグルコース（0.5質量％）を加えた培地と加えなかった培地で培養し、上記と同様に試料を調製し、質量分析を行った。
　図１０は、グルコースを加えた培地で培養後のK12株から得られたマススペクトル（上から１段目）と、グルコースを加えなかった培地で培養後のK12株から得られたマススペクトル（上から２段目）と、グルコースを加えた培地で培養後のJM109株から得られたマススペクトル（上から３段目）と、グルコースを加えなかった培地で培養後のJM109株から得られたマススペクトル（上から４段目）とを示す図である。大腸菌JM109株の場合も、大腸菌K12株と同様に、グルコースを加えた培地で培養した場合には、得られるマススペクトルにm/z 2371、m/z 2401およびm/z 3823の特有ピークが観察された（破線で囲まれた矩形部分Ｐ１およびＰ２参照）。すなわち、大腸菌JM109株も酸ショックタンパク質の遺伝子を持ち、グルコースを含む培地で培養することで、その遺伝子が発現した。
＜大腸菌K12株と大腸菌JM109株の培養(ラクトース添加)および質量分析＞
　大腸菌K12株および大腸菌JM109株を、IFO 802培地にラクトース（1質量％）を加えた培地で37℃、18時間の条件でそれぞれ培養した。培養後の微生物を遠心して上清を捨て、残った菌体にトリフルオロ酢酸－アセトニトリル水溶液を加えて懸濁した。懸濁後の溶液を遠心分離して上清を回収した。回収した上清をアセトニトリル水溶液で希釈し、MALDI質量分析用プレートに滴下して乾固した。乾固した試料に、マトリックスとしてCHCAを加えて再乾固し、MALDI質量分析装置(島津製作所AXIMA Performance)を用いて飛行時間型の質量分析を行った。
　図１１は、ラクトースを加えた培地で培養後のJM109株から得られたマススペクトル（上段）と、ラクトースを加えた培地で培養後のK12株から得られたマススペクトル（下段）とを示す図である。大腸菌K12株の場合は、図１０のグルコースを加えた場合と同様に特有のピークが観察されている。これに対して、大腸菌JM109株の場合は、図１０のグルコースを加えなかった場合と同様に特有ピークが観察されなかった（矢印Ａ１，Ａ２およびＡ３参照）。すなわち、大腸菌K12株と大腸菌JM109株は、グルコースを添加した培地で酸ショックタンパク質を同様に発現するのに対し、ラクトースを添加した場合は大腸菌K12株では発現するが、大腸菌JM109株では発現しない。このように糖の種類を変えて得られるマススペクトルのパターンが異なることを利用して菌の株識別を行うことが出来る。
　次の優先権基礎出願の開示内容は引用文としてここに組み込まれる。
　日本国特願２０１９－０７１６６３号（２０１９年４月３日出願）

Claims (16)

  1. 　微生物を含む試料を用意することと、
    　前記微生物を、第１条件の下に配置した後、前記微生物が産生した物質の第１質量分析を行うことと、
    　前記第１質量分析で得られた第１データと、前記微生物が第２条件の下に配置された後に前記微生物が産生した物質の第２質量分析が行われて得られた第２データとの差異、および、前記微生物の分類または性状と、前記微生物の質量分析で得られるデータとが対応付けられた参照データに基づいて、前記試料に含まれる微生物の性状または分類についての情報を得ることとを備え、
    　前記第１条件と前記第２条件とは、前記微生物が配置された環境における糖の濃度または酸素濃度が異なる分析方法。
  2. 　請求項１に記載の分析方法において、
    　前記微生物を前記第２条件の下に配置した後、前記微生物が産生した物質の前記第２質量分析を行うことを備える分析方法。
  3. 　請求項１に記載の分析方法において、
    　前記第１条件と前記第２条件とは、前記糖の濃度が異なり、
    　前記糖は、単糖類、二糖類、三糖類および四糖類からなる群から選択される少なくとも一つの糖類である分析方法。
  4. 　請求項３に記載の分析方法において、
    　前記糖は、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、フコース、フクロース、ラムノース、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース、リボース、アラビノース、キシロース、 リキソース、リブロース、キシルロース、デオキシリボース、セドヘプツロース、ケトテトロース、エリトルロース、アルドテトロース、エリトロース、トレオース、 ケトトリオースおよびアルドトリオースからなる群から選択される少なくとも一つの単糖類である分析方法。
  5. 　請求項３に記載の分析方法において、
    　前記糖は、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、ツラノースおよびセロビオースからなる群から選択される少なくとも一つの二糖類である分析方法。
  6. 　請求項３に記載の分析方法において、
    　前記糖は、ラフィノース、メレジトースおよびマルトトリオースからなる群から選択される少なくとも一つの三糖類である分析方法。
  7. 　請求項３に記載の分析方法において、
    　前記糖は、アカルボースおよびスタキオースからなる群から選択される少なくとも一つの四糖類である分析方法。
  8. 　請求項１から７までのいずれか一項に記載の分析方法において、
    　前記差異は、マススペクトルにおけるピークの有無またはピークの強度若しくは面積の差である分析方法。
  9. 　請求項８に記載の分析方法において、
    　前記ピークは、酸ショックタンパク質に対応するピークである分析方法。
  10. 　請求項１から７までのいずれか一項に記載の分析方法において、
    　酸および有機溶媒の少なくとも一つを含む水溶液を用いて前記第１質量分析および前記第２質量分析の少なくとも一つのための分析用試料が調製される分析方法。
  11. 　請求項１０に記載の分析方法において、
    　前記酸は、トリフルオロ酢酸である分析方法。
  12. 　請求項１０に記載の分析方法において、
    　前記有機溶媒は、メタノール、エタノール、イソプロパノールまたはアセトニトリルである分析方法。
  13. 　請求項１から７までのいずれか一項に記載の分析方法において、
    　前記第１質量分析および前記第２質量分析では、マトリックス支援レーザー脱離イオン化またはエレクトロスプレーイオン化によりイオン化を行う分析方法。
  14. 　請求項１から７までのいずれか一項に記載の分析方法において、
    　前記情報は、微生物の株である分析方法。
  15. 　請求項１から１４までのいずれか一項に記載の分析方法により微生物の分析を行う微生物の識別方法であって、
    　前記情報は、微生物の分類であり、
    　前記情報により前記微生物の識別を行う微生物の識別方法。
  16. 　請求項１から１３までのいずれか一項に記載の分析方法を行う検査方法であって、
    　前記情報は、微生物の性状であり、
    　前記情報により前記微生物の性状の検査を行う検査方法。
     
PCT/JP2020/006501 2019-04-03 2020-02-19 分析方法、微生物の識別方法および検査方法 WO2020202861A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2021511206A JP7205616B2 (ja) 2019-04-03 2020-02-19 分析方法、微生物の識別方法および検査方法
US17/600,483 US20220178941A1 (en) 2019-04-03 2020-02-19 Analysis method, microorganism identification method, and testing method
CN202080020690.0A CN113574373B (zh) 2019-04-03 2020-02-19 分析方法、微生物的识别方法以及检查方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2019-071663 2019-04-03
JP2019071663 2019-04-03

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2020202861A1 true WO2020202861A1 (ja) 2020-10-08

Family

ID=72667801

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2020/006501 WO2020202861A1 (ja) 2019-04-03 2020-02-19 分析方法、微生物の識別方法および検査方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20220178941A1 (ja)
JP (1) JP7205616B2 (ja)
CN (1) CN113574373B (ja)
WO (1) WO2020202861A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024005122A1 (ja) * 2022-06-30 2024-01-04 株式会社島津製作所 微生物の分析の準備方法、および、微生物の分析方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007316063A (ja) * 2006-04-28 2007-12-06 National Institute Of Advanced Industrial & Technology 細胞の迅速識別方法及び識別装置
US20080009029A1 (en) * 2006-05-09 2008-01-10 Bruker Daltonik Gmbh Mass spectrometric measurement of microbial resistances
JP2015521035A (ja) * 2012-05-01 2015-07-27 オクソイド・リミテッド 微生物学的分析用の装置及び方法
WO2017168740A1 (ja) * 2016-03-31 2017-10-05 株式会社島津製作所 微生物の識別方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101859305A (zh) * 2009-04-13 2010-10-13 北京市疾病预防控制中心 常见毒物药物液相色谱质谱数据库
DE102013022016B4 (de) * 2013-12-20 2015-07-09 Bruker Daltonik Gmbh Mikroben-Identifizierung durch Massenspektrometrie und Infrarot-Spektrometrie
GB2534331B (en) * 2014-06-02 2017-06-21 Thermo Fisher Scient (Bremen) Gmbh Improved imaging mass spectrometry method and device
EP3155432A1 (en) * 2014-06-10 2017-04-19 Dow AgroSciences LLC Quantitative analysis of transgenic proteins

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007316063A (ja) * 2006-04-28 2007-12-06 National Institute Of Advanced Industrial & Technology 細胞の迅速識別方法及び識別装置
US20080009029A1 (en) * 2006-05-09 2008-01-10 Bruker Daltonik Gmbh Mass spectrometric measurement of microbial resistances
JP2015521035A (ja) * 2012-05-01 2015-07-27 オクソイド・リミテッド 微生物学的分析用の装置及び方法
WO2017168740A1 (ja) * 2016-03-31 2017-10-05 株式会社島津製作所 微生物の識別方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
WEBER, A. ET AL.: "Time-dependent proteome alterations under osmotic stress during aerobic and anaerobic growth in Escherichia coli", JOURNAL OF BACTERIOLOGY, vol. 188, no. 20, 2006, pages 7165 - 7175, XP055745812, ISSN: 0021-9193 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024005122A1 (ja) * 2022-06-30 2024-01-04 株式会社島津製作所 微生物の分析の準備方法、および、微生物の分析方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20220178941A1 (en) 2022-06-09
JP7205616B2 (ja) 2023-01-17
CN113574373B (zh) 2024-02-20
JPWO2020202861A1 (ja) 2020-10-08
CN113574373A (zh) 2021-10-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Madonna et al. Detection of bacteria from biological mixtures using immunomagnetic separation combined with matrix‐assisted laser desorption/ionization time‐of‐flight mass spectrometry
JP4818981B2 (ja) 細胞の迅速識別方法及び識別装置
Lay Jr MALDI‐TOF mass spectrometry of bacteria
Andjelković et al. Foodomics and food safety: Where we are
Barnini et al. Rapid and reliable identification of Gram-negative bacteria and Gram-positive cocci by deposition of bacteria harvested from blood cultures onto the MALDI-TOF plate
US8160819B2 (en) Rapid identification of proteins and their corresponding source organisms by gas phase fragmentation and identification of protein biomarkers
EP1942194A1 (en) Method for identifying a germ isolated from a clinical sample
Sandrin et al. Characterization of microbial mixtures by mass spectrometry
CN108519267B (zh) 通过内部标准物质谱检测微生物的试剂盒
Reich et al. Species identification of bacteria and fungi from solid and liquid culture media by MALDI-TOF mass spectrometry
Everley et al. Liquid chromatography/mass spectrometry characterization of Escherichia coli and Shigella species
Cameron et al. Mass spectrometry approaches to metabolic profiling of microbial communities within the human gastrointestinal tract
EP2850204B1 (en) Methods for inactivation and extraction of acid-fast bacteria for characterization and/or identification using mass spectrometry
CN111239235A (zh) 一种巴尔通体菌株maldi-tof ms的数据库建立方法和鉴定方法
WO2020202861A1 (ja) 分析方法、微生物の識別方法および検査方法
Santos et al. MALDI mass spectrometry imaging and in situ microproteomics of Listeria monocytogenes biofilms
Šebela et al. Intact cell MALDI-TOF mass spectrometric analysis of Chroococcidiopsis cyanobacteria for classification purposes and identification of possible marker proteins
Kumaran et al. Quantification analysis of protein and mycelium contents upon inhibition of melanin for Aspergillus niger: a study of matrix assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI-MS)
Sivanesan et al. A systematic assessment of matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) application for rapid identification of pathogenic microbes that affect food crops: delivered and future deliverables
Zhou et al. Whole-cell matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry for rapid identification of bacteria cultured in liquid media
Hang et al. Fast detection of volatile organic compounds from Staphylococcal blood cultures by CDI-MS
Ahmad et al. High-resolution MALDI-TOF mass spectrometry of bacterial proteins using a Tris-EDTA buffer approach
CN113219115A (zh) 一种基于maldi-tof ms的蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌快速鉴定方法
Theel Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for the identification of bacterial and fungal isolates
WO2024005122A1 (ja) 微生物の分析の準備方法、および、微生物の分析方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 20782159

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2021511206

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 20782159

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1