CN113219115A - 一种基于maldi-tof ms的蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌快速鉴定方法 - Google Patents

一种基于maldi-tof ms的蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌快速鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于MALDI‑TOFMS的蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌快速鉴定方法。它是以50S核糖体蛋白L30、50S核糖体蛋白L31typeB和30S核糖体蛋白S20作为特征蛋白。本发明利用蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌的全基因组测序信息指导MALDI‑TOFMS特征峰的筛选和鉴定，获得能准确区分蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌的MALDI‑TOFMS特征峰，结果准确可靠，为MALDI‑TOFMS区分近缘物种提供思路。

Description

一种基于MALDI-TOF MS的蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌快 速鉴定方法
技术领域：
本发明属于微生物检测领域，具体涉及一种基于MALDI-TOF MS的蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌快速鉴定方法。
背景技术：
蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)是我国常见的食源性致病菌之一，其产生的肠毒素和呕吐毒素可引起腹泻和呕吐两种胃肠道疾病。在2006至2016年期间，蜡样芽胞杆菌在我国食源性致病菌造成的食物中毒事件中排名第三。苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis)是昆虫病原菌，其在形成芽胞的同时产生杀虫晶体蛋白，因此被用作生物杀虫剂。蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌同属蜡样芽胞杆菌群，16S rRNA基因序列相似性大于99％，dDDH(digital DNA-DNAhybridization)值大于物种划分阈值70％，极难区分。在食品风险监测中，蜡样芽胞杆菌是国内和国际上的常规检测对象，苏云金芽胞杆菌作为广泛使用的生物杀虫剂同样常见于食品中，对蜡样芽胞杆菌的准确鉴定造成干扰。因此，蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌的准确区分不可缺少。
我国国家标准检测方法GB 4789.14-2014、美国FDA细菌学分析手册、国际标准ISO7932:2004/AMD 1:2020均依据传统生化方法观察杀虫晶体蛋白来区分蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌，该过程耗时3-4天，受观察者主观判断影响较大。此外，对于苏云金芽胞杆菌某些血清型，如israelensis血清型，它的杀虫晶体更微小，判断难度大。随着分子分型方法和全基因组测序技术的发展，已开发出基于分子方法区分蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌的策略，如基于pycA(丙酮酸羧化酶)基因构建系统发育树可实现对蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌的分类，但需要进行DNA提取、测序、系统发育分析等流程，耗时2-3天，且劳动强度大。基于全基因组序列的分类方法提供了与系统发育一致的标准分类框架，能够准确地区分蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌，常用方法有ANI(average nucleotide identity)、rMLST(ribosomal multilocus sequence typing)等，该过程耗时5-6天、成本高，不适应实验室常规使用及高通量快速检测鉴定的需求。因此亟待建立对蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌快速准确鉴定的方法。
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorptionionizatione time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)是高通量的细菌鉴定方法，通过获得细菌蛋白指纹，与数据库谱图比对完成准确鉴定，该过程仅需几分钟。该方法已用于临床诊断、食品安全、环境监测和生物防御等领域，具有快速、高通量、准确、经济等优点。但目前商业数据分析软件Biotyper对亲缘关系密切的物种分辨率较低，尚不能实现对蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌的准确区分。因此开发基于MALDI-TOF MS的蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌鉴定方法，对近缘物种的快速准确区分具有重要意义。
发明内容：
本发明的目的是提供一种基于MALDI-TOF MS的蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌快速鉴定方法。
本发明的基于MALDI-TOF MS的蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌快速鉴定方法，其是以50S核糖体蛋白L30、50S核糖体蛋白L31 type B和30S核糖体蛋白S20作为特征蛋白。
优选，具体步骤为：将待测细菌涂在靶板上，用MALDI-TOF MS进行检测并采集数据，在容忍度为m/z±3下，蜡样芽胞杆菌的特征峰组合质荷比为m/z 3211，6427，9188和9214，苏云金芽胞杆菌特征峰组合质荷比为m/z 3218，6441，9160和9229。所述特征峰依次为50S核糖体蛋白L30的双电荷离子峰、50S核糖体蛋白L30的单电荷离子峰、50S核糖体蛋白L31type B的单电荷离子峰和30S核糖体蛋白S20的单电荷离子峰。
即已知待测细菌属于蜡样芽胞杆菌群菌株，在容忍度为m/z±3下，当待测细菌具有特征峰组合m/z 3211，6427，9188和9214，待测细菌为蜡样芽胞杆菌；当待测细菌具有特征峰组合m/z 3218，6441，9160和9229，待测细菌为苏云金芽胞杆菌；当待测细菌不具有m/z3211，6427，9188，9214或m/z 3218，6441，9160，9229特征峰组合，待测细菌为蜡样芽胞杆菌群菌株。
优选，所述的将待测细菌涂在靶板上是将待测细菌涂在靶板上，加体积分数70％甲酸，待其干燥，再加入含10mg/mLα-氰基-4-羟基肉桂酸的标准溶液，待其干燥，所述的标准溶液是按体积分数计，包括50％乙腈、47.5％水和2.5％三氟乙酸。
优选，所述的待测细菌是经营养琼脂平板纯化的单菌落待测细菌。
优选，所述的MALDI-TOF MS进行检测是以阳离子线性模式采集2-20kDa范围的谱图。
本发明的第二个目的是提供50S核糖体蛋白L30、50S核糖体蛋白L31 type B和30S核糖体蛋白S20作为特征蛋白在用MALDI-TOF MS鉴别蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌中的应用。
优选，所述的50S核糖体蛋白L30的双电荷离子峰、50S核糖体蛋白L30的单电荷离子峰、50S核糖体蛋白L31 type B的单电荷离子峰和30S核糖体蛋白S20的单电荷离子峰在容忍度为m/z±3下，依次对应蜡样芽胞杆菌的特征峰组合质荷比为m/z 3211，6427，9188和9214，或苏云金芽胞杆菌特征峰组合质荷比为m/z 3218，6441，9160和9229。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明利用蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌的全基因组测序信息指导MALDI-TOF MS特征峰的筛选和鉴定，获得能准确区分蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌的MALDI-TOF MS特征峰，结果准确可靠，为MALDI-TOF MS区分近缘物种提供思路。
(2)本发明构建的蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌MALDI-TOF MS鉴定平台缩短了鉴定时间，从传统鉴定需2-3天或基于全基因组的系统发育分析需5-6天缩短至3-5分钟；且操作过程简单，减少人力和耗材成本；在已拥有仪器条件下能经济地实现高通量鉴定蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌。
附图说明
图1为蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌全细胞蛋白指纹图谱，其中A、B、C为对应特征峰的结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例及其附图对本发明进行详细描述。
实施例1：基于全基因组数据挖掘蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌潜在MALDI-TOFMS特征峰
检索GTDB(https://gtdb.ecogenomic.org/)、rMLST(https://pubmlst.org/rmlst)和NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/)三个数据库中蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌的分类信息，106株蜡样芽胞杆菌和175株苏云金芽胞杆菌在三个数据库中具有一致的物种信息。下载菌株全基因组序列后，使用Prokka对全基因序列进行注释，使用TBtools将核糖体蛋白序列提取出来。依据氨基酸链N端第二个氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸或半胱氨酸时考虑N-端甲硫氨酸切除的原则，分析核糖体蛋白N-端甲硫氨酸切除情况，使用蛋白质分子质量计算器(https://web.expasy.org/compute_pi)计算核糖体蛋白的分子质量。依据核糖体蛋白的分子质量分布情况，以灵敏度大于95％为阈值标准，筛选出13个具有显著质量差异的核糖体蛋白(表1)，其中11个核糖体蛋白分子量在MALDI-TOF MS的检测范围2-20kDa内，为潜在MALDI-TOF MS特征峰。
表1基于全基因组数据挖掘的蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌间质量差异显著的核糖体蛋白
Figure BDA0003071936610000051
Figure BDA0003071936610000061
实施例2筛选和鉴定蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌的MALDI-TOF MS特征峰
选取35株蜡样芽胞杆菌、44株苏云金芽胞杆菌和各自对应的ATCC标准菌株进行实验，菌株划线于LB琼脂，在37℃培养16小时。用无菌牙签将菌落直接涂在靶板上，加1μL体积分数70％甲酸水溶液，待其干燥，加1μL含10mg/mLα-氰基-4-羟基肉桂酸的标准溶液(按体积分数计，包括50％乙腈、47.5％水和2.5％三氟乙酸)，干燥后等待检测。MALDI-TOF MS检测采用200Hz smartbeam固态激光，以阳离子线性模式采集2-20kDa范围的谱图，每个样品激光轰击240次，每次实验前使用BTS(bacterial test standard)进行校正。采集到的质谱图通过R包MALDIquant转换为mzXML文件，导入Mass-Up软件进行强度转换(平方根法)、谱图平滑(Savitzky–Golay法)、基线校正(TopHat法)、归一化(总离子流法)、峰检测(MassSpecWavelet法)、组内和组间对齐(Forward法)，最后通过软件的生物标志物发现模块筛选特征峰，并以灵敏度大于95％为阈值进一步筛选MALDI-TOF MS特征峰。图1展示蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌的特征峰，蜡样芽胞杆菌特征峰有m/z 3211，6427，9188和9214，苏云金芽胞杆菌特征峰有m/z 3218，6441，9160和9229，特征峰容忍度为m/z±3。特征峰的鉴定通过实验测得m/z与基因组分析计算的核糖体蛋白理论m/z比对完成，鉴定结果见表2，m/z 3211和3218代表50S核糖体蛋白L30的双电荷离子峰，m/z 6427和6441代表50S核糖体蛋白L30，m/z 9188和9160代表50S核糖体蛋白L31 type B，m/z 9214和9229代表30S核糖体蛋白S20。
表2 MALDI-TOF MS实际检测中蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌的特征峰及其表征
Figure BDA0003071936610000071
注：*表示双电荷离子峰
实施例3蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌MALDI-TOF MS特征峰的特异性评估结果
依据国家标准和国际标准食品微生物检验中常见食源性致病菌，选取13株常见食源性致病菌进行蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌MALDI-TOF MS特征峰的特异性检验。菌株通过实施例2中培养和制样步骤获得MALDI-TOF MS谱图，特异性结果如表3所示。本发明的蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌MALDI-TOF MS特征峰与常见食源性致病菌的质谱峰不重叠，因此对蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌具有特异性。本发明的特征峰可作为区分蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌的特异MALDI-TOF MS峰。
表3蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌MALDI-TOF MS特征峰在非目标菌中的特异性检验结果
Figure BDA0003071936610000081
注：表中“—”表示无特征峰，“+”表示有特征峰。

Claims (7)

1.一种基于MALDI-TOF MS的蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌快速鉴定方法，其特征在于，是以50S核糖体蛋白L30、50S核糖体蛋白L31 type B和30S核糖体蛋白S20作为特征蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将待测细菌涂在靶板上，用MALDI-TOF MS进行检测并采集数据，当待测细菌具有特征峰组合m/z 3211，6427，9188和9214，待测细菌为蜡样芽胞杆菌；当待测细菌具有特征峰组合m/z 3218，6441，9160和9229，待测细菌为苏云金芽胞杆菌。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的将待测细菌涂在靶板上是将待测细菌涂在靶板上，加体积分数70％甲酸，待其干燥，再加入含10mg/mLα-氰基-4-羟基肉桂酸的标准溶液，待其干燥，所述的标准溶液是按体积分数计，包括50％乙腈、47.5％水和2.5％三氟乙酸。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的待测细菌是经营养琼脂平板纯化的单菌落待测细菌。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的MALDI-TOF MS进行检测是以阳离子线性模式采集2-20kDa范围的谱图。
6.50S核糖体蛋白L30、50S核糖体蛋白L31 type B和30S核糖体蛋白S20作为特征蛋白在用MALDI-TOF MS鉴别蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的50S核糖体蛋白L30的双电荷离子峰、50S核糖体蛋白L30的单电荷离子峰、50S核糖体蛋白L31 type B的单电荷离子峰和30S核糖体蛋白S20的单电荷离子峰在容忍度为m/z±3下，依次对应蜡样芽胞杆菌的特征峰组合质荷比为m/z 3211，6427，9188和9214，或苏云金芽胞杆菌特征峰组合质荷比为m/z3218，6441，9160和9229。
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