CN106841371A - 一种利用飞行时间质谱鉴别蓝藻细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用飞行时间质谱鉴别蓝藻细胞的方法，包括如下步骤：(1)对待鉴别蓝藻细胞样品进行前处理；(2)将步骤(1)处理后的样品滴入样品板上，再滴入基质溶液，室内风干；(3)将步骤(2)得到的样品板放入飞行时间质谱测定仪进行测定，以核糖体蛋白质作为生物标识物，测定出的图谱与所选择的特征核糖体蛋白理论峰值进行比对后实现对蓝藻种类的鉴别。用本新发明方法，可以快速、简便、直接地测定蓝藻细胞，并进行分类鉴别，结果准确，降低人力和时间成本，测定程序可以标准化，最终实现蓝藻鉴别的在线、程序化操作。

Description

一种利用飞行时间质谱鉴别蓝藻细胞的方法
技术领域
本发明涉及一种飞行时间质谱直接测定蓝藻细胞的检测技术，属于蛋白质组学和环境分析化学技术领域。
背景技术
蓝藻作为原始而古老的藻类原核生物，气温较高时尤其是夏季，在适宜的水文、气象条件下易在富营养化的湖泊、水库以及河流中大量繁殖形成蓝藻水华。而许多蓝藻尤其是淡水蓝藻中最常见的铜绿微囊藻会产生微囊藻毒素为代表的有毒次生代谢产物，对人畜的肝脏及皮肤产生极大伤害，严重危害水体环境以及人类自身健康和生命安全。因此，对蓝藻水华中优势种群铜绿微囊藻的鉴别尤为重要。
目前对蓝藻的鉴别技术主要有：浮游植物半定量活检法，卫星遥感技术以及16SrRNA基因序列方法等，此类方法或耗时或耗力，需要具备丰富的专业知识以及复杂的前处理步骤，无法直接测定蓝藻细胞且鉴别的精确性不足。因此，快速、简便、高精度地鉴别蓝藻的需求迫在眉睫。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)是一种软离子电离技术，且这一分析化学的手段在迅速、准确识别其它微生物方面有成功应用案例，但对蓝藻的鉴别还未有适宜的方法，特别是前处理的步骤，基质的选择和蛋白质结晶的方法一直是研究的重点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种以核糖体蛋白质为生物标识物，快速、简便、直接地测定蓝藻细胞并进行分类鉴别的飞行时间质谱方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种利用飞行时间质谱鉴别蓝藻细胞的方法，包括如下步骤：
(1)对待鉴别蓝藻细胞样品进行前处理；
(2)将步骤(1)处理后的样品滴入样品板上，再滴入基质溶液，室内风干；
(3)将步骤(2)得到的样品板放入飞行时间质谱测定仪进行测定，以核糖体蛋白质作为生物标识物，测定出的图谱与所选择的特征核糖体蛋白理论峰值进行比对后实现对蓝藻种类的鉴别。
步骤(1)中，所述的前处理，无需提纯蛋白质，只需破碎和离心即可获得核糖体亚单位。
步骤(1)中，所述的前处理具体过程为：将样品进行超声波除泡，离心后去除上清液，取沉淀物离心后再取沉淀，所得沉淀加入TMA-1缓冲液混匀，移入装有氧化锆-二氧化硅微粒的细胞破碎专用离心管，置入细胞破碎仪进行机械破碎；将机械破碎后的样品低速离心后取上清液；上清液再经高速离心后获得核糖体亚单位沉淀物。
其中，所述的TMA-1缓冲液为含10mM pH 7.8Tris-HCl缓冲液，30mM的氯化铵，10mM的氯化镁以及6mM的2-巯基乙醇。
其中，所述的低速离心，离心条件为5800g，4℃，离心25分钟；所述的高速离心，离心条件为64000g，4℃，离心4小时。
步骤(2)中，将步骤(1)处理后的样品加入混合液A混匀后，再取2μL滴于样品板靶位上，再滴入1.5μL基质溶液覆盖，在空气中自然风干；所述的混合液A为含50％v/v乙腈和1％v/v三氟乙酸的水溶液；所述的基质溶液为含10mg芥子酸，0.5mL混合液A和0.5mL蒸馏水的混合溶液。本发明的基质溶液为测定结果中目标峰值的离子强度最强的芥子酸(SA)，而非α氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)和2，5-二羟基苯甲酸(DHB)。
步骤(3)中，所述的生物标识物为13个核糖体蛋白质，分别为L32，S21，L33，L35，S18，L29，L31，L28，S16，S19，S15，S20以及S14。这些生物标识物的选定为测定的54株保存的蓝藻藻株均存在的，而且在的多次重复测试中都可以检测到的离子强度最强的13个核糖体蛋白质。根据目前已公布的20株的铜绿微囊藻的全部或部分基因序列，得知在不同的株之间，某些核糖体蛋白质的分子量是不同的，即如果能够实际测定到这些不同，就可以把它们区别开来。在我们的实际测量中，确实观察到了同一个核糖体蛋白质在不同的株之间的不同分子量，所以，据此方法，可以实现在株水平的鉴别(高于属和种的水平)。
步骤(3)中，所述的飞行时间质谱测定仪为配备N2的激光脉冲仪的Axima CFRPlus型飞行时间质谱测定仪，设定条件：m/z为2000-40000Da，氮气激光脉冲仪λ为337nm，脉冲宽度3ns，频率10Hz，平均不同位置发射500下激光脉冲，正线性模式。
步骤(3)中，将所测图谱选取范围为m/z 6000-12000Da，对实际检测到的峰值，与13个特征核糖体蛋白L32，S21，L33，L35，S18，L29，L31，L28，S16，S19，S15，S20以及S14的理论峰值进行比对后鉴别是否是铜绿微囊藻，同时确定具体株型。
不同铜绿微囊藻具体株型的理论峰值可以检索氨基酸序列：National Centerfor Biotechnology Information(http：//www.ncbi.NLM.NIH.gov/)；可以计算等电点及理论分子量工具：Bioinformatics Resource Portal(http：//www.expasy.org/)查询和计算得到。
有益效果：本发明的利用飞行时间质谱鉴别蓝藻细胞的新方法是基于核糖体蛋白为生物标识物提出的一种蓝藻鉴定方法，有以下优势：
1、本方法所确定的生物标识物：L32，S21，L33，L35，S18，L29，L31，L28，S16，S19，S15，S20以及S14为所测定的54株保存的蓝藻藻株多次重复测试中都测到的13个核糖体蛋白质。且多个核糖体蛋白反映了分子进化过程和亲缘关系，与之前鉴别蓝藻的技术方法相比，鉴别的精确度更高，可实现在蓝藻株水平上的鉴别，并在分辨产毒素株/非产毒素株的精确鉴定上有一定突破。
2、前处理中无需提纯蛋白质和16S rRNA基因序列方法包括的PCR扩增，只需简单地离心加机械破碎即可获得核糖体亚单位，与16S RNA基因序列等方法相比，前处理的步骤大大简化且更加快速。
3、本方法选择SA(芥子酸)为基质与常用基质CHCA(α-氰基-4-羟基肉桂酸)相比，获得峰值的离子强度更强。
4、本方法的新型蛋白质原位结晶方法与通常的混合结晶方法相比，得到的质谱图中被检测的特征核糖体蛋白质的特征峰值信号更强和更稳定。
5、本方法可直接测定蓝藻细胞，所需的样品剂量需求小，操作简单，不易受样品状态与仪器的影响，结果准确，降低了人力和时间成本，测定程序可以标准化，最终实现蓝藻鉴别的在线、程序化操作。
附图说明
图1为本发明实施例中样品①的质谱图；
图2为本发明实施例中样品②的质谱图；
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：
本实施例中，在2016年水华易爆发期5月30日的内太湖梅园水厂外取水样作为待测样品，通过浮游植物网采集100mL水样于塑料瓶中。将水样移入15ml离心管中并编号①和②，为后续对比参照做准备，将做好标记的样品进行超声波轻微除泡后，置入离心机在9100g，4℃下离心10分钟。离心后去除上清液，用移液枪移出底部沉淀物至1.5mL离心管内(离心管提前称量自重编号并记录)在20400g，4℃下离心10分钟，上一步操作后各样品加入160μL的TMA-1缓冲液混匀，TMA-1缓冲液含10mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(pH 7.8)，30mM的氯化铵，10mM的氯化镁以及6mM的2-巯基乙醇，配置好的TMA-1缓冲液放置在冰箱4℃保存。将加入缓冲液后的样品移入提前备好的含160mg氧化锆-二氧化硅微粒的细胞破碎专用离心管，置入细胞破碎仪进行机械破碎，在3000r/min下破碎两次，每次45s，间隔30s。将机械破碎后样品移入1.5mL离心管中在5800g，4℃下离心25分钟后，用移液枪将上清液移入1.5mL离心管(专用)在64000g，4℃下高速离心4小时，该超高速离心机需提前打开电源使温度降至4℃后再放入待离心样品。上述所有离心操作及机械破碎都需进行配平，可使用缓冲液进行配平。
将样品①经过前处理步骤后去除上清液，留下沉淀物并加入10μL混合液A(含50％v/v乙腈和1％v/v三氟乙酸的水溶液)，使用移液枪头击打混匀，移取2μL该样品和10μL基质SA溶液(含10mg SA，0.5mL混合液A和0.5mL蒸馏水)混匀，吸取2uL混合样品滴入专用样品板靶位上(如不立即点样，需将该样品放入冰箱4℃保存)，注意溶液在通风橱配制，下滴液小心滴在靶点上，使其尽量不蔓延。
将样品②经过前处理步骤后去除上清液，留下沉淀物并加入10μL混合液A(配方同上)，使用移液枪头击打混匀，吸取2μL该样品滴入专用样品板靶位上(如不立即点样，需将该样品放入冰箱4℃保存)，再滴入1.5μL基质SA溶液覆盖，注意使下滴液不蔓延，保持在靶位内。
将点样后的样品板放在空气中室温下自然风干，置入日本岛津公司Axima CFRPlus型MALDI-TOF MS仪中进行测定。设定条件：m/z为2000-40000Da，氮气激光脉冲仪λ为337nm，脉冲宽度3ns，频率10Hz，正线性模式，注意检测器气压需达到真空状态才能进行操作。
将所测图谱选取范围为m/z 6000-12000Da，依据13个特征核糖体蛋白L32，S21，L33，L35，S18，L29，L31，L28，S16，S19，S15，S20以及S14理论峰值进行标注，样品①的质谱图见图1，样品②的质谱图见图2，并进行对比分析后鉴别蓝藻种类。13个特征核糖体蛋白的m/z理论值见表1，单位：Da。
表1
在本实施例中，样品①选择常用混合结晶方式，结合本发明方法的其它操作步骤后得出质谱图中检测出的特征峰与误差情况见表2，单位：Da。
表2
L32 S21 L33 L35 S18 L29 L31 L28 S16 S19 S15 S20 S14
5.9 7 0.8 7.2 / / 6.9 / 7.5 / 11.3 7.6 /
样品②使用本发明新型蛋白质原位结晶方式得出的质谱图中检测出特征峰与误差情况见表3，单位：Da。
表3
L32 S21 L33 L35 S18 L29 L31 L28 S16 S19 S15 S20 S14
1.8 2.2 -2.2 1.6 -1.4 / 0.9 / 1.6 16.2 5.8 1.7 /
对特征峰的鉴定及误差分析发现，采用常用混合结晶方式能够识别出8个特征核糖体蛋白质，而采用本发明的新型点样方法能够成功识别出10个特征核糖体蛋白质，且误差也大幅降低。比较这两种方式的质谱图(附图1和附图2)，新型蛋白质原位结晶方式下的图谱信号也更强更加稳定。以上结果表明，利用飞行时间质谱鉴别蓝藻细胞的新方法能够成功鉴别实际湖泊中的蓝藻样品且在鉴别蓝藻的稳定性和准确性上都比常用混合结晶方式更优异。

Claims (9)

1.一种利用飞行时间质谱鉴别蓝藻细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)对待鉴别蓝藻细胞样品进行前处理；
(2)将步骤(1)处理后的样品滴入样品板上，再滴入基质溶液，室内风干；
(3)将步骤(2)得到的样品板放入飞行时间质谱测定仪进行测定，以核糖体蛋白质作为生物标识物，测定出的图谱与所选择的特征核糖体蛋白理论峰值进行比对后实现对蓝藻种类的鉴别。
2.根据权利要求1所述的利用飞行时间质谱鉴别蓝藻细胞的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的前处理，无需提纯蛋白质，只需破碎和离心即可。
3.根据权利要求2所述的利用飞行时间质谱鉴别蓝藻细胞的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的前处理具体过程为：将样品进行超声波除泡，离心后去除上清液，取沉淀物离心后再取沉淀，所得沉淀加入TMA-1缓冲液混匀，移入装有氧化锆-二氧化硅微粒的细胞破碎专用离心管，置入细胞破碎仪进行机械破碎；将机械破碎后的样品低速离心后取上清液；上清液再经高速离心后获得核糖体亚单位沉淀物。
4.根据权利要求3所述的利用飞行时间质谱鉴别蓝藻细胞的方法，其特征在于，所述的TMA-1缓冲液为含10mM pH 7.8Tris-HCl缓冲液，30mM的氯化铵，10mM的氯化镁以及6mM的2-巯基乙醇。
5.根据权利要求2所述的利用飞行时间质谱鉴别蓝藻细胞的方法，其特征在于，所述的低速离心，离心条件为5800g，4℃，离心25分钟；所述的高速离心，离心条件为64000g，4℃，离心4小时。
6.根据权利要求1所述的利用飞行时间质谱鉴别蓝藻细胞的方法，其特征在于，步骤(2)中，将步骤(1)处理后的样品加入混合液A混匀后，再取2μL滴于样品板靶位上，再滴入1.5μL基质溶液覆盖，在空气中自然风干；所述的混合液A为含50％v/v乙腈和1％v/v三氟乙酸的水溶液；所述的基质溶液为含10mg芥子酸，0.5mL混合液A和0.5mL蒸馏水的混合溶液。
7.根据权利要求1或3所述的利用飞行时间质谱鉴别蓝藻细胞的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的生物标识物为13个核糖体蛋白质，分别为L32，S21，L33，L35，S18，L29，L31，L28，S16，S19，S15，S20以及S14。
8.根据权利要求1所述的利用飞行时间质谱鉴别蓝藻细胞的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的飞行时间质谱测定仪为配备N2的激光脉冲仪的Axima CFR Plus型飞行时间质谱测定仪，设定条件：m/z为2000-40000Da，氮气激光脉冲仪λ为337nm，脉冲宽度3ns，频率10Hz，平均不同位置发射500下激光脉冲，正线性模式。
9.根据权利要求1所述的利用飞行时间质谱鉴别蓝藻细胞的方法，其特征在于，步骤(3)中，将所测图谱选取范围为m/z 6000-12000Da，对实际检测到的峰值，与13个特征核糖体蛋白L32，S21，L33，L35，S18，L29，L31，L28，S16，S19，S15，S20以及S14的理论峰值进行比对后鉴别是否是铜绿微囊藻，同时确定具体株型。
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