JPS5920359B2 - ポリリジンの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 この発明はポＩＪ ＩＪリジンリジンの結合残基数：２
０〜３０）（以下単（こ「ポリリジン」と称する）の新
規な製造法に関するものである。

この発明の目的物質のポリリジンはＬ−リジンの重合体
で、例えばアレルギー研究用の試薬、酵素の固定化剤等
として有用な物質であり、既（こその有機合成法は知ら
れている。

（例えば、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカ
ル・ソサエティー第７８巻第７６４頁参照）。

しかしながら、有機合成法においては、原料として高価
なＬ −ＩＪリジン使用しなければならない欠点があっ
た。

この発明者等はストレプトマイセス属に属する菌がポＩ
Ｊ ＩＪリジン生産するという新知見を得、さらに鋭意
研究の結果この発明を完成した。

ストレプトマイセス属に属するポリリジン生産菌のうち
、この発明者等が和歌山県橋本市をごて採集した土壌よ
り新らたに分離した株（Ａ３４６−Ｄと番号を付す）は
次のような菌学的性質を有する。

（１） 形態学的性質 シュークロス・硝酸塩寒天培地上で３０℃、１０日間生
育したＡ３４６−Ｄ株の気菌糸および基中菌糸を顕微鏡
で観察した結果を次に示す。

■ 胞子形成菌糸の分校法および形態 単純分枝、閉鎖らせん状（ｃｌｏｓｅｄ ５ｐｉｒａｌ
）■ 胞子の数 数１０個 ■ 胞子の表面構造および大きさ 胞子は円ないし楕円形で大きさは約１．２〜１．５μで
あり、その表面構造はスパイニー（Ｓｐｉｎｙ） で
ある。

■ 鞭毛胞子、菌核および胞子のうの有無存在が認めら
れない。

■ 胞子柄の着生位置 気菌糸上 （２）各種培地上番こおける生育状態 下記の各種培地上における性状はそれぞれ３０℃で１０
〜１４日間培養後の観察結果である。

（３）生理的性質 ■ 生育温度範囲 約１５〜４０℃。

生育最適温度：３０℃附近。■ ゼラチンの液化、でん
粉の加水分解および脱脂牛乳のペプトン化。

すべて陽性 ■ 脱脂牛乳の凝固 陰性 ■ メラニン様色素の生成 チロシン寒天培地上では褐色の色素を生成する。

■ 細胞壁組成 細胞壁組成成分中のジアミノピメリン酸の型についてベ
ラカー（Ｂｅｃｋｅｒ）らの方法〔アプライド・マイク
ロバイオロジー第１３巻第２３６頁（１９６５年）＃照
〕により分析した結果、Ｌ、Ｌ型であった。

（４）各種炭素源の同化性（プリドハム・ゴツトリーブ
寒天培地上） Ｌ−アラビノース − Ｄ−キシロース − Ｄ−グルコース 士 Ｄ−フラクトース ＋ Ｌ−ラムノース − Ｄ−かラクトース 士 シュークロース − ラフィノース − Ｄ−マンニトール 士 ｌ−イノシトール ＋ サリシン − 註）十：同化する、−：同化しない。

上記の菌学的性質からＡ３４６Ｄ株はストレプトマイセ
ス属に属することは明らかである。

そこで、ｌ５Ｐ（インターナショナル・ストレプトマイ
セス・プロジェクト）報告しインターナショナル・ジャ
ーナル・オブ・システマテイツク・バクテリオロジー第
１８巻第６９〜１８９頁、第２７９〜３９２頁（１９６
８年）、同第１９巻第３９１〜５１２頁（１９６９年９
および同第２２巻第２６５〜３９４頁（−１９７２年）
参照〕およびパージエイズ・マニュアル・オブ°テ゛タ
ミネイティブ・バクテリオロジー第８版を参照して類縁
菌種を検索した。

その結果、Ａ３４６Ｄ株はストレフトマイセス・アルプ
ラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ−ｃｅｓ ａｌｂｕｌｕｓ
）に最も近似していることが判明した。

しかしながら、ストレプトマイセス・アルプラスはサリ
シンを同化するがｙ％３４６Ｄ株はサリシンを同化しな
い点、およびストレプトマイセス・アルプラスはポＩＪ
ＩＪリジン生産しない点等を考慮して、Ａ３４６Ｄ株
をストレプトマイセス・アルプラスの新亜種（５ｕｂｓ
ｐｅｃｉｅｓ）と認め、ストレプトマイセス・アルプラ
ス・サブスピーシーズ・リジノポリメラス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏ−ｍｙｃｅｓ ａｌｂｕｌｕｓ ５ｕｂｓｐ、
、ｌｙｓｉｎｏｐｏ−１ｙｍｅｒｕｓ）Ａ３４６−Ｄと
命名した。

このストレプトマイセス・アルプラス・サブスピーシー
ズ・リジノポリメラスＡ３４６Ｄ株は工業技術院微生物
工業技術研究所に微工研菌寄第３８３４号として寄託さ
れている。

ストレプトマイセス属に属する微生物がポリリジンを生
産することは知られていない。

ストレプトマイセス属に属するポリリジン生産菌は、例
えば紫外線、Ｘ線等の照射処理、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニ
トロ−Ｎ−ニトロングアニジン（ＮＴＧ）、５−ブロモ
ウラシル、２−アミノプリン等の薬剤Ｑこよる処理、形
質転換、形質導入、接合等の通常用いられる菌株変異処
理方法（こよってポＩＪ ＩＪリジン生産能を高めて使
用することができる。

ストレプトマイセス属に属するポリリジン生産菌を培地
に培養して得られる培養物からポＩＪ ＩＪリジン分離
、採取するこの発明のポＩＪ ＩＪリジン製造法におけ
る培養方法は原則的には一般微生物の培養方法に準する
が、通常は液体培地による好気的培養法が有利である。

培養（こ用いられる培地としては、ストレプトマイセス
属に属するポリリジン生産菌が利用する栄養源を含有す
る培地であればよい。

すなわち、合成培地、半合成培地あるいは天然培地が用
いられ、培地の組成として例えばグルコース、フラクト
ース、グリセリン、糖蜜、でん粉、液化でん粉等が炭素
源に用いられ、肉エキス、カゼイン加水分解物、ペプト
ン、グルテンミール、コーンミール、綿実粕、大豆粉、
コーンスチーブリカー、乾燥酵母、りん酸アンモニウム
、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、尿素等が窒素
源として用いられる。

また、例えばりん酸水素２ナトリウム、りん酸２水素カ
リウム、炭酸カルシウム、硫酸第一鉄、硫酸マグネシウ
ム、硫酸銅、硫酸亜鉛、塩化マンガン、塩化マグネシウ
ム等の金属のりん酸塩、硫酸塩、炭酸塩、塩化物等の無
機塩も必要に応じて添加される。

また、培養中発泡の著しい時には、例えば大豆油、亜麻
仁油等の植物油、オクタデカノール、テトラデカノール
、ヘプタツール等の高級アルコール類、シリコン化合物
等の消泡剤を適宜添加すればよい。

培養温度は３０℃前後が適当である。

また培養容量の増大に従って適宜種培養を行なうと好結
果が得られることが多い。

本培養の培養時間は２４〜１００時間位が適当であり、
培地の濃厚化に従って、培養時間をさら（こ延長しても
よい。

以上述べた培養条件は使用生産菌株の特性に応じてそれ
ぞれ最適の条件を選択して適用される。

このようにして培養物中に蓄積されたポリリジンは主に
培養液中に含有されているので、遠心分離またはろ過に
より培養物から菌体を除去した後、ろ液から一般発酵生
産物の製造に用いられる常用の手段によって分離、採取
、精製される。

すなわち、減圧濃縮、凍結乾燥、鼎媒抽出、液性変換、
例えば陰イオン交換樹脂、陽イオン交換樹脂、非イオン
性吸着樹脂等の樹脂による処理、例えば活性炭等の吸着
剤による処理、結晶化、再結晶等の手段を単独、あるい
は任意の順序に組合わせ、また反復して用いてろ液から
ポＩＪ ＩＪリジン分離、採取、精製される。

次に、この発明を実施例により説明する。

実施例 グリセロール５０２、硫酸アンモニウム１０ｖ１酵母エ
キス５７、硫酸マグネシウム（７水化物）０．５ｖ１硫
酸亜鉛（７水化物）０．０４Ｓ’および硫酸第一鉄（７
水化物） ０．０３ ｆヲ０．０２Ｍ’）ん酸緩衝液（
ＫＨ２ＰＯ４−Ｎ ａ ２ＨＰＯ，） （ｐＨ６，８）
Ｉ Ｌ＆こ加えて調製した培地を５を容三角フラスコ
３８本（こそれぞれ注入し、１２０℃で２０分間滅菌す
る。

これらに、ス］・レプトマイセス・アルプラス゛サブス
ピーシーズ・リジノポリメラス３４６−Ｄ株の斜面培養
物を１白金耳ずつ接種し、３０℃で２日間振とう培養す
る。

培養終了後、培養物をろ過し、ろ液を水酸化ナトリウム
水溶液でｐＨ８，５ｆこ調整し、生ずる沈殿をろ去する
。

ろ液を陽イオン交換樹脂アンバーライトＩＲｃ−５０（
Ｈ＋型）（商標、ローム・アンド・ハース社製）を充て
んしたカラム（こ通し、有効物質を吸着させる。

カラムを０．２Ｎ酢酸で洗浄後、有効物質を０．ＩＮ塩
酸で溶出する。

溶出液を水酸化ナトリウム水溶液で中和し、減圧濃縮す
る。

濃縮物に加温下（４０℃）、混メタノール（４０℃）を
加え、イつずか（こ生ずる沈殿をろ去し、ろ液を冷蔵庫
（５℃）中に放置すると沈殿が生ずる。

この沈殿をろ過して集め、乾燥すると粗粉末３１７が得
られる。

この粗粉末を水１５０ｍ７！およびメタノール６２５Ｔ
Ｉｌの混液に＠解する。

この酢液に、加温下（３０℃）エーテル１００ｒｎｌお
よびエタノール２００ｍ１！からなる混液を沈殿が生じ
はじめるまで添加する。

次いでこれを冷蔵庫（５℃）に放置して沈殿を完了させ
る。

この沈殿をろ取し、再び水に溶解し、活性炭で処理して
脱色する。

処理後の水溶液にエーテル−エタノール（１：１）の混
液を加えて沈殿を生じさせ、次いで冷蔵庫（５℃）に放
置する。

沈殿をろ取し、乾燥すると白色粉末状のポＩＪ ＩＪリ
ジン塩酸塩６．１ｆが得られる。

ここで得られたポリリジンは加水分解後、アミノ酸自動
分析機で分析するとリジンのみが検出され、リジンの結
合残基数をカルボキシメチルセルロースを使用するカラ
ムクロマトグラフィーによる方法〔ジャーナル・オブ・
クロマトグラフィー第９巻第２３３〜２３５頁（１９６
２年）参照〕で測定すると２０〜３０の間にあるという
結果が得られた。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ストレプトマイセス属に属するポリリジン（リジン
   の結合残基数＝２０〜３０）生産菌を培地に培養し、得
   られる培養物からポリリジン（リジンの結合残基数：２
   ０〜３０）を分離、採取することを特徴とするポリリジ
   ンの製造法。