JPS6055065B2 - ５−アミノ−２−カルボキシ−４−オキソ−１，４，５，６−テトラヒドロピリジン−３−酢酸誘導体 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は一般式（Ｉ） １１０Ｒ・ ゛−Ｃ画一閥゛ （Ｉ） で示される新規な５−アミノー２−カルボキシー４−オ
キソー１、４、５、６−テトラヒドロピリジンー３−酢
酸誘導体及びその塩に関する。

ただし、上記一般式（Ｉ）においてＲ”、Ｒ゜及びＲ３
は同一又は異なり、各々水素原子：メチル基、エチル基
、プロピル基、ブチル基、ペンチル基などのアルキル基
；又はホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチ
リル基、ペンチリル基などのアシル基を表わす。Ｒ゛及
びＲ５は同一又は異なり、各々ヒドロキシ基；メトキシ
基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基、ペントキ
シ基などのアルコキシ基；又はアミノ基を表わす。本発
明により提供される前記一般式（１）で示される５−ア
ミノー２−カルボキシー４−オキソー１，４，５，６−
テトラヒドロピリジンー３−酢酸誘導体及びその塩は、
アミノ基転移酵素であるグルタメイト●オキサロアアセ
テート●トランスアミナーゼ（ＧｌｕｔａｍａｔｅＯｘ
ａｌＯａｃｅｔａｔｅＴｒａｒｌＳａｍｉｒｌａＳｅ）
（以下、ＧＯＴと称す）の活性を強力に阻害する作用を
有するため、アスパラギン酸を多量に必要とする白血球
の増殖を抑制することができ、白血病の処置に有用であ
る。ＧＯＴはアミノ基転移酵素として最もよく知られて
おり、生体内で次の可逆反応の触媒作用を有している。
このようにＧＯＴは生体内のアミノ酸代謝に極めて重要
な役割を果たしているが、心筋硬塞や肝疾患などの疾病
時にはその心筋や肝組識などに存在しているＧＯＴが血
液中に漏出してくるため、血液中のＧＯＴの検査がそれ
ら疾病の診断の一つの指標となる。本発明の一般式（１
）で示される５−アミノー２−カルボキシー４−オキソ
ー１，４，５，６−テトラヒドロピリジンー３一酢酸誘
導体及びその塩は、後述の試験例１に示すようにＧＯＴ
の起源によつて阻害特異性を有するため、上記疾病の臨
床検査薬として利用できる〔ビタミン関巻３号１０３〜
１１頂（１９７９年）及び臨床病理、臨時増刊特集第２
９号第６４〜羽頁（１９７７年）参照〕。また本発明の
一般式（１）で示される５ーアミノー２−カルボキシー
４−オキソー１，４，５，６−テトラヒドロピリジンー
３一酢酸誘導体及びその塩は、後述の試験例２に示すよ
うに苦味がなく良質の呈味性を示すため調味料としても
有．用である。本発明者らは、このたび、ストレプトマ
イセス属に属する特定の放線菌が下記の式（１−ａ）で
示される５−アミノー２−カルボキシー４−オキソー１
，４，５，６−テトラヒドロピリジンー３一酢酸を代謝
生産することを見出した。

上記の５−アミノー２−カルボキシー４−オキソー１，
４，５，６−テトラヒドロピリジンー３一酢酸を生産す
る能力を有する放線菌としては、ストレプトマイセス●
スマネンシス●ノボ●エスピーＮＫ−２３（Ｓｔｒｅｐ
ｔＯｍｙｃｅｓｓｕｍａｎｅｒｌｓｉｓｎＯｖ．ｓｐ．
ＮＫ−２３）菌株（微工研菌寄第５８４８号）があり、
その菌株の採集地及び菌学的性質を次に示す。

Ｉ採集地 ストレプトマイセス●スマネンシス●ノボ●エスピーＮ
Ｋ−２３菌株は兵庫県神戸市須磨区の土壌より分離した
。

■ 菌学的性質 （ａ）形態 本菌において気菌糸は単純分枝をなしており、その先端
に連鎖した分生胞子（双胞子以上）を形成する。

その色調は灰色である。胞子は平滑な表面をしており、
鞭毛胞子及び胞子嚢を有さない。胞子鎖は開型の不完全
な螺旋をつくり、その着生位置は気菌糸上である。また
本菌は菌核を形成せず、その細胞壁はＬＬ−ジアミノピ
メリン酸を含む。（ｃ）生理的性質 １最適生育条件 ２生育の範囲 ３硝酸塩の還元 ４ゼラチンの液 化 ５スターチの加 水分解 ６脱脂牛乳の凝 固、ペプトン 化 ７メラニン様色 素の生成 ＰＨ：７．２、温度：３００Ｃ ＰＨ：５．３〜９．屯 温度：１４．５〜３ｒｃ シユクロース・硝酸塩培地 て生育した菌に亜硝酸塩の 存在が認められた。

肉汁ゼラチン穿刺培養にお いてゼラチンの強い液化が 認められた。

陽性 脱脂牛乳培地での培養では ペプトン化は進行するが、 凝乳化は認められない。

チロシ寒天培地上及びペ プトン・イースト・鉄・寒 天培地上ではメラニン様色 素は認められない。

０炭素源の資化性 プリドハム・ゴ下ソーブ寒天培地上での炭素源の資化性
を１生育が良好に認められる、２生育が疑わしくその判
定が難しい、３生育が認められないの３段階で調べ、そ
の結果を次に示す。

１生育が良好に認められる炭素源： Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ
−ガラクトース、ラムノース、Ｄーフラクトース、麦芽
糖、シユクロース、乳糖、Ｄ−トレハロース、ラフィノ
ース、サリシン、イヌリン、グリセリン、コハク酸ナト
リウム、クエン酸ナトリウム７４３生育が認められない
炭素源： “・ Ｌ−アラビノース、キチン、セルロース、イノシツト、
マンニット、酢酸ナトリウム上記の菌学的性質を有する
ストレプトマイセス●スマネンシス●ノボ●エスピーＮ
Ｋ−２３菌株の゛分類学上の位置を、バージーズ・マニ
ュアル・オブ・デイターミネイテイブ●バクテリオロジ
ー第８版（Ｂｅｒｇｅｙ′ＳＭａｎｕａｌＯｆＤｅｔｅ
ｍｌｌｎａｔｉｖｅＢａｃｔｅｒｉＯｌＯｇｙ，８ｔｈ
ｅｄ．） ；イー、ビー、シャーリング及びデイー、ゴ
ツドリーブ、インターナショナル●ジャーナル●オブ●
システマチツク●バクテリオロジー（Ｅ．Ｂ．Ｓｈｉｒ
ｌｌｒＬｇａｎｄＤ．ＧＯｔｔｌｌｅｂ，Ｉｎｔｅｍａ
ｔｉＯｎａｌＪＯｕｒｒｌａｌＯｆＳｙｓｔｅＭａｔｉ
ｃＢａｃｔｅｒｉＯｌＯｇｙ）第１８巻第６９頁、第２
７９頁（１９６８年）、同第１捲第３９１頁（１９６弥
）及び同第坐巻第２６５頁（１９ｎ年）に掲載されたＩ
ＳＰ報告（ＩＳＰ：ＩｎｔｅｍａｔｉＯｎａｌＳｔｒｅ
ｐｔＯｍｙｃｅｓＰｒＯｊｅｃｔ）；並びにエス、エイ
、ワックスマン、ザ、アクチノマイセチス（Ｓ．Ａ．Ｗ
ａｋｓｍａｎ，′ＮｌｅＡｃｔｉｎＯｍｙｃｅｔｉｓ）
第２巻により検索した。

本菌に比較的近縁と思われる菌としてストレプトマイセ
ス●テンダエ（Ｓｔｒ′ＥｐｔＯｍｙｃｅｓｔｅｎｄａ
ｅ）、ストレプトマイセス●カエシウス（Ｓｔｒｅｐｔ
Ｏｍｙｃｅｓｃａｅｓｉｕｓ）、ストレプトマイセス●
カナリウス（Ｓｔｒ″ＥｐｔＯｍｙｃｅｓｃａｒｌａｒ
ｉｕｓ）、アクチノマイセス●ビオラセオラタス（Ａｃ
ｔｉｎＯｍｙｃｅｓｖｉＯｌａｃｅＯｌａｔｕｓ）及び
コリネバクテリウム●ニグラ（ＣＯｒｙｒ）Ｅｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍｎｉｇｒａ）が挙げられるが、ストレプトマ
イセス・テンダエ及びストレプトマイセス・カエシウス
はそれぞれアラビノース、マンノース、ラフィノース及
びイノシツトの資化性において本菌と異なり、またスト
レプトマイセス●カナリウス、アクチノマイセス●ビオ
ラセオラタス及びコリネバクテリウム・ニグラはそれぞ
れアラビノース、マンノース及びイノシツトの資化性に
おいて本菌とは異なる。

従つて、本菌のストレプトマイセス●スマネンシス●ノ
ボ●エスピーＮＫ−２３菌株はストレプトマ．イセス属
に属する新菌種を構成する放線菌てあると判定した。式
（１−ａ）で示される５−アミノー２−カルボキシー４
−オキソー１，４，５，６−テトラヒドロピリジンー３
一酢酸の生産は、当該化合物を−生産するストレプトマ
イセス属に属する放線菌を栄養培地で培養することによ
り行なわれる。

培養方法は原則的には一般微生物の培養で採用される方
法と同じてあるが、通常は液体培地による振盪培養法又
は通気攪拌培養法が用いられる。培地としては上記の生
産菌が資化利用できる栄養源を含有するものであればよ
い。炭素源としてはキシロース、グルコース、マンノー
ス、ガラクトース、ラムノース、フラクトース、麦芽糖
、シユクロース、乳糖、トレハロース、ラフィノース、
デキストリン、デンプン、糖蜜、グリセリンなどが用い
られる。窒素源としてはペプトン、ポリペプトン、肉工
キズ、大豆粉、コーンステイープリカ・−、酵母工キズ
などの有機窒素源；硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム
、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなどの無機窒素
源などが用いられる。これらの炭素源及び窒素源は通常
０．１〜１０重量％の範囲で加える。またこの他に、必
要に応じて燐酸２水素カリウム、燐酸水素２カリウムな
どの燐酸塩；さらに塩化カリウム、塩化ナトリウム、炭
酸カルシウム、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸亜鉛、
硫酸マンガン、硫酸銅などの無機塩を少量添加する。な
お、炭酸カルシウムはカルシウムイオン源として、また
培地のＰＨ低下を防ぐために加えられる。また必要に応
じて、ビタミン類又はアラニン、グルタミン酸、アスパ
ラギン酸などのアミノ酸を加えることもできる。代表的
な培地としては、例えばブドウ糖ブイヨン培地（組成：
ブドウ菌２．０％、ポリペプトン１．０％、肉工キズ１
．０％、塩化ナトリウム０．２５％）、大豆粉培地（組
成：大豆粉２．０％、可溶性デンプン２．０％、塩化ナ
トリウム０．５％、炭酸カルシウム０．２％）、コーン
ステイーブリカー培地（組成：ペプトン０．５％、コー
ンステイープリカー１．５％、塩化ナトリウム０．５％
、ブドウ糖１．０％）、デユラニー培地（組成：グルコ
ース１．０％、燐酸１水素アンモニウム０．４％、塩化
ナトリウム０．５％、燐酸水素２カリウム０．２％、硫
酸マグネシウム・７水和物０．１％、塩化カルシウム０
．０４％、硫酸第一鉄・７水和物０．００２％、硫酸亜
鉛・７水和物０．００１％；ＰＨ：７．２）プリドハム
培地（組成：グルコース１０．０ｆ１硫酸アンモニウム
２．６４Ｖ１燐酸水素２カリウム５．６５ｙ１燐酸２水
素カリウム２．３８ｆ１硫酸マグネシウム・１水和物１
．００ｙ１硫酸銅・５水和物６．４ｍ９、塩化マンガン
・４水和物７．９Ｔ！Ｌ９、硫酸第一鉄・７水和物１．
１ｍ９、硫酸亜鉛・７水和物１．５ｍ９、蒸留水１００
０ｍ１；ＰＨ：７．２）又はこれらの改変培地などがあ
る。培養液の発泡を防ぐために消泡剤を適宜加えること
ができる。培養温度は２０〜３７Ｃ１好ましくは２５〜
３０℃である。培地のＰＨは５．０〜８．５好ましくは
６．０〜７．５であり、至適ＰＨは７．２である。通常
、１〜１０日間の振盪培養又は通気攪拌培養により５−
アミノー２−カルボキシー４−オキソー１，４，５，６
−テトラヒドロピリジンー３一酢酸の発酵生産量は最大
に達する。このようにして培養液中に蓄積された５−ア
ミノー２−カルボキシー４−オキソー１，４，５，６−
テトラヒドロピリジンー３一酢酸を分離・採取するには
、まず培養液中の菌体その他の不溶成分を濾過又は遠心
分離などにより分離除去する。

得られた培養濾液又は上清に酸を加えてＰＨを３〜５望
ましくは４に調整し、これに適量の活性炭を加えて数時
間放置する。濾過又は遠心分離などにより活性炭を除去
したのち、得られた溶液をアンモニア水、水酸化ナトリ
ウム水溶液などのアルカリ水溶液て中和する。ついで、
無機塩類を沈澱させ、これを濾別又は遠心分離などによ
り除去する。得られた溶液と上記の沈澱物を洗滌した洗
滌液とを合わせ、この溶液から５−アミノー２−カルボ
キシー４−オキソー１，４，５，６−テトラヒドロピリ
ジンー３一酢酸を沈澱させる。沈澱物を遠心分離などに
より集め、これを水溶液とする。次に、この水溶液につ
いて弱酸性ないしは強酸性陽イオン交換樹脂、例えばＮ
計ビ１１ｔｅＣＧ−５０、ＡｍｂｅｒｌｌｔｅＣＧ−１
２０、ＤＯｗｅｘ５Ｏなどのカラムを用い、溶出液とし
て例えばアンモニア水を用いてカラムクロマトグラフィ
ーを行ない、ついで得られた活性画分について弱塩基性
ないしは強塩基性陰イオン交換樹脂、例えばＡｒｒｌｂ
ｅｒｌｉｔｅＣＧ−Ａ．ＳＤＯＷｅＸｌ、ＤＯｗｅｘ２
などのカラムを用い、溶出液として例えば水酸化アンモ
ニウムー塩化アンモニウム緩衡液を用いてカラムクロマ
トグラフィーを行なう。後者のカラムクロマトグラフィ
ーにより得られた活性画分に塩酸などの酸を加えること
によりＰＨを３〜５に調整し、ついでこの溶液について
活性炭カラムクロマトグラフィーを行なう。得られた溶
出液をアルカリで中和し、濃縮乾固する。得られた固形
物を少量の水に溶解し、この水溶液をゲル濾過すること
により無機塩類を除去する。得られた活性画分を濃縮し
、これに非溶媒を加えることにより溶液から５−アミノ
ー２−カルボキシー４−オキソー１，４，５，６−テト
ラヒドロピリジンー３一酢酸の結晶を析出させる。この
際、結晶化を促進させるために例えば酢酸を加えること
ができる。このようにして得られた粗結晶を再結晶する
ことにより純粋な５ーアミノー２−カルボキシー４−オ
キソー１，４，５，６−テトラヒドロピリジンー３一酢
酸を得るＥことができる。微生物起源の５−アミノー２
−カルボキシー４一オキソー１，４，５，６−テトラヒ
ドロピリジンー３一酢酸を公知の方法によりハロゲン化
、アルキル化、アシル化、エステル化又はアミド化す７
ることにより、また得られた化合物をさらに上記の反応
又は加水分解などの処理に供することにより、５−アミ
ノー２−カルボキシー４−オキソー１，４，５，６−テ
トラヒドロピリジンー３一酢酸の種々の誘導体を容易に
製造することができフる。

代表的誘導体を挙げると下記のとおりてある。一般式（
１）で示される５−アミノー２−カルボキシー４−オキ
ソー１，４，５，６−テトラヒドロピリジンー３一酢酸
誘導体は、種々の酸と酸付加塩を形成し、また種々の塩
基とも塩を形成する。

上記の酸としては塩化水素酸、臭化水素酸、ヨウ化水素
酸、硝酸、硫酸、燐酸、酢酸、クエン酸、マレイン酸、
コハク酸、乳酸、酒石酸、グルコン酸、安息香酸、メタ
ンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸
、ｐ−トルエンスルホン酸などが挙げられ、また塩基と
しては水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アン
モニウム、トリエチルアミン、プロカイン、ジベンジル
アミン、エフエナミン、Ｎ，Ｎ′−ジベンジルエチレン
ジアミン、Ｎ−エチルピペリジンなどが挙げられる。以
下、実施例及び試験例によつて本発明の詳細な説明する
。

実施例１ ５−アミノー２−カルボキシー４−オキソー１，４，５
，６−テトラヒドロピリジンー３−酢酸の発酵生産スト
レプトマイセス●スマネンシス●ノボ●エスピーＮＫ−
２３菌株（工業技術院微生物工業技術研究所、微生物保
管委託申請書受理番号第５８４８号）を次に示す方法で
培養した。

培地〔組成：グノルコース２％、ポリペプトン１％、肉
工キズ１％、塩化ナトリウム０．２５％、アデカノール
（消泡剤）０．０３％及び蒸留水；ＰＨ：７．２〕の１
４ｅを２０ｅ容発酵槽に入れ、１２０℃で１紛間、蒸気
殺菌を行なつた。予め上記の培地と同じ培地て往復振盪
機にて２日間増殖させた種菌を上記の２０ｅ容発酵槽あ
たり０．５ｅ宛添加し、３（代）で６時間通気攪拌培養
（攪拌速度：２５０ｒ．ｐ．ｍ．；通気量：１２ｅ／分
）を行なつた。この培養を４培養基分行ない、これらの
培養液を集め、遠心分離機て菌体を除去し、培養上清５
１ｅを得た。培養上清に６規定の塩酸を加えてＰＨを４
．０に調整したのち、これに粉末状の活性炭を加え、断
続的に１時間攪拌した。濾過により活性炭を除去し、そ
の濾液に濃アンモニア水を加えて中和した。この溶液を
ロータリー・エバボレーター（容器温度：５００Ｃ）で
約１／１００の容積まで濃縮した。濃縮中に生じた沈澱
を濾別し、沈澱を少量の冷却した９０％メタノールで洗
滌した。得られた濾液とメタノール洗滌液を合わせ、こ
れにメタノールを加えてメタノール終濃度が８０％とな
るようにした。この溶液を冷却下に１時間放置したのち
、遠心分離機によりその上清２，４００ｍｔを得た。得
られた上清２，４００ｍ１に濃酢酸１２０ｍ１を加え、
さらにエタノール９，０００ｍ１を加えて発酵生産物を
沈澱させた。そのまま低温下に１夜放置後、得られた沈
澱を遠心分離した。この発酵生産物を水４ｅに溶かした
。予め水で充分に洗滌しておいた強酸性陽イオン交換樹
脂ＤＯｗｅｘ５ＯＷＸ４カラム（Ｈ＋型、１００〜２０
０メッシュ、直径５×２２Ｃ１ｎ１３９０ｍｔ）に上記
の発酵生産物の水溶液２ｆを流し、カラムに発酵生産物
を吸着させた。

次に、このカラムを塩素イオンの検出がなくなるまで水
で洗滌したのち、直ちに２．８％アンモニア水て発酵生
産物を溶出させた。溶出液を３００ｍ１ずつ分画し、そ
の第１番目及び第２番目の活性画分を集めた。残りの発
酵生産物の水溶液２ｅについて同様の操作を行なつた。
得られた活性画分１．２ｅに水を加えて約２倍に希釈し
た。予め水で充分に洗滌しておいた強塩基性陰イオン交
換樹脂ＤＯｗｅｘｌＸ４カラム（０Ｈ一型、１００〜２
００メッシュ、直径４×３１ｃｗｉ、３９０ｍ１）に上
記の希釈液を流し、カラムに発酵生産物を吸着させた。
このカラムを５０ｎ１Ｍ水酸化アンモニウムー塩化アン
モニウム緩衝液（ＰＨｌＯ．Ｏ）の約１′で洗滌し、つ
いで５０ｒｒ１Ｍ水酸化アンモニウムー塩化アンモニウ
ム緩衝液（ＰＨｌＯ．Ｏ）の１′と１Ｍ塩化アンモニウ
ムの１ｅとを用いて塩化アンモニウムの直線的濃度勾配
溶出を行なつた。溶出液を１５ｍ１ずつ分画し、第６６
〜８幡目の活性画分を集めることにより発酵生産物の溶
出液２２５ｍ１を得た。この溶出液に６規定の塩酸を加
えることによりＰＨを４に調整した。これを活性炭カラ
ム（直径２×１９ｃｍ）に流し、ついで水て溶出させた
。素通りしてくる画分を集め、これをアンモニアで中和
後、ロータリー・エバポレーターで濃縮乾固した。得ら
れた発酵生産物を少量の水に溶解し、この水溶液３４ｍ
１を０．１％アンモニア水で平衡化したＳｅｐｈａｄｅ
ｘＧ−１５カラム（直径４．５×２４．５ｃｒｎ１３９
０ｍ１）に流し、ついで０．１％アンモニア水を用いて
ゲル濾過を行なつた。この濾液をロータリー・エバポレ
ーターを用いて濃縮し、これに等溶量のメタノールを加
えた。このときに生じた不定形の沈澱を、溶液を４０℃
に加温するとともに少量の水を加えることにより完全に
溶解した。ついで、得られた溶液に少量の酢酸を加え、
４℃で放置して結晶を析出させた。析出した粗結晶を濾
過により集め、これに水１００ｍ１を加え、４０℃で加
温してその結晶を完全に溶かした。この溶液をそのまま
４℃で放置することにより再結晶を行なつた。得られた
結晶を遠心分離により集め、少量のメタノールで洗滌後
、五酸化燐で一夜乾燥させることにより５−アミノー２
−カルボキシー４−オキソー１，４，５，６−テトラヒ
ドロピリジンー３一酢酸〔化合物（１）と称す〕の結晶
を７３６ｍ９得た（培養液５１ｅからの回収率１１％）
。５−アミノー２−カルボキシー４−オキソー１，４，
５，６−テトラヒドロピリジンー３一酢酸のＸ線結晶構
造解析上記で得られた５−アミノー２−カルボキシー４
−オキソー１，４，５，６−テトラヒドロピリジンー３
一酢酸の結晶構造をＸ線により解析した。

解析用の単結晶はメタノール／水の等容混合溶液中で再
結晶させることにより得た。結晶は斜方晶系に属し、空
間群はＰ２ｌ２ｌ２ｌてあり、格子定数はａ＝１０．８
４８Ａ，ｂ＝１４．２３５Ａ，Ｃ＝６．９１９Ａであつ
た。

Ｘ線回折強度測定は強力形単結晶自動Ｘ線回折装置・ロ
ータ層℃（理学電機株式会社製）を用いて行ない、２θ
≦１２５機の反射１６羽個の強度データを集めた。

これにより下記の分子構造が決定された。Ｒ因子は４．
０％であつた。（なお、単位格子中には結晶溶媒のメタ
ノール分子が５−アミノー２−カルボキシー４−オキソ
ー１，４，５，６−テトラヒドロピリジンー３一酢酸分
子と１対１の割合で存在する。

）実施例２ 化合物（１）２．１ｙ１２−クロルー１−メチルーピリ
ジニウム アイオダイド１０ｆ及びメタノール０．８ｙ
を塩化メチレン１００ｍ１に加え、得られた溶液に室温
下で攪拌しながらトリエチルアミン８ｆを滴下した。

滴下後、室温下で約３時間攪拌を続けたのち、得られた
反応液を水にあけ、ついで塩化メチレン２００ｍ１で抽
出した。抽出液を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧
濃縮し、ついでシリカゲルクロマトグラフィーにより分
離し、化合物（２）を２．２ｆ得た。実施例３ 実施例２においてメタノール０．８ｙの代りにエタノー
ル１．２′を用いる以外は実施例２と同様の方法により
化合物（３）を２．４ｙ得た。

実施例４ 化合物（２）１．２ｙ及び炭酸カリウムを乾燥アセトン
１５ｍ１に加え、得られた溶液に室温下で攪拌しながら
硫酸ジメチル１．２５ｙを加えた。

そのまま室温ζ下で５時間攪拌したのち、得られた反応
液から固形物を濾別し、減圧によりアセトンを除去した
。その残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにより分離
し、化合物（４）を０．８ｆ得た。実施例５ 化合物（４）１．２ｙを水酸化ナトリウム０．８ｙの５
０％メタノール水溶液２０ｍ１に加え、室温下で一夜攪
拌したのち、得られた反応液を水にあけ、１規定の塩酸
で中和し、ついで酢酸エチルで抽出した。

抽出液を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮し、
その残渣をベンゼンで再結晶することにより化合物（５
）を０．９ｙ得た。実施例６ 化合物（２）１．２ｙを水酸化ナトリウム０．２ｙの５
０％メタノール水溶液２０ｍ１に加え、室温下で２＠間
攪拌したのち、得られた反応液に１規定の塩酸を加える
ことにより中和し、ついで酢酸エチルで抽出した。

抽出液を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮し、
ついでシリカゲルクロマトグラフィーにより分離し、化
合物（６）を０．５ｆ得た。実施例７化合物（３）１．
３ｙを水酸化ナトリウム０．２ｙの５０％メタノール水
溶液２０ｍ１に加え、室温下で２柵間攪拌したのち、得
られた反応液を水にあけ、１規定の塩酸で中和し、つい
で酢酸エチルで抽出した。

抽出液を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、シリカゲルク
ロマトグラフィーにより分離し、化合物（７）を０．６
ｆ得た。実施例８ 化合物（７）１．３ｆ１２−クロルー１−メチルーピリ
ジニウム アイオダイド２．５ｆ及びメタノール０．５
ｙを塩化メチレン５０ｍ１に加え、得られた溶液に室温
下で攪拌しながらトリエチルアミン２ｆを滴下した。

滴下後、室温下で約２時間攪拌を続けたのち、得られた
反応液を水にあけ、ついで塩化メチレン１００ｍ１で抽
出した。抽出液を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧
濃縮し、その残渣に乾燥ベンゼン５０ｍ１を加えた。こ
の溶液にアセチルクロライド０．３８ｆを滴下し、つい
でトリエチルアミン１．０ｆを加えて室温下で３時間攪
拌を続けた。得られた反応液を水にあけ、ついでジエチ
ルエーテルで抽出した。抽出液を無水硫酸マグネシウム
で乾燥後、減圧濃縮し、ついでシリカゲルクロマトグラ
フィーにより分離し、化合物（８）を０．８ｙ得た。実
施例９ 化合物（７）１．３ｙを塩化チオニル１．１ｙの乾燥ジ
エチルエーテル２０ｍ１溶液に加え、室温下で２４ＪＩ
Ｉ１間攪拌した。

得られた反応液から過剰の塩化チオニル減圧下に留去し
た。その残渣をアンモニアで飽和したエタノール溶液２
０ｍ１に加え、室温下で一夜攪拌した。得られた反応液
を減圧濃縮し、ついでシリカゲルクロマトグラフィーに
より分離し、化合物（９）を０．７ｆ得た。実施例１０ 化合物（２）１．２ダ及び炭酸カリウム２．４ｙを乾燥
アセトン２０ｍ１に加え、得られた溶液に室温下で攪拌
しながら硫酸ジメチル２ダを加え、そのまま一夜１攪拌
を続けた。

得られた反応液から固形物を濾別し、その濾液を減圧濃
縮したのち、シリカゲルクロマトグラフィーで分離し、
化合物（１１を１．０ｆ１得た。実施例１１ 実施例１０において炭酸カリウム２．５ｙを用い、こか
つ硫酸ジメチル２ｙの代りに硫酸ジエチル２．５ｙを用
いる以外は実施例１０と同様の方法により化合物（１１
）を１．１ｙ得た。

実施例１２ 化合物（１１）１．１ｙを水酸化ナトリウム１．０ｇの
５０％メタノール水溶液２０ｍ１に加え、室温で一夜攪
拌した。

得られた反応液を水にあけ、１規定の塩酸で中和し、つ
いで酢酸エチルで抽出した。抽出液を無水硫酸マグネシ
ウムで乾燥後、減圧濃縮し、得られた残渣をベンゼンで
再結晶することにより化合物（１２）を０．５ｙ得た。
実施例１３ 化合物（１）１．１ｙの１，２ージメトキシエタンの２
０ｍｔ溶液にアセチルクロライド１．６ｆを加え、つい
でトリエチルアミン２．５ｙを加え、室温下で約５時間
攪拌した。

得られた反応液を水にあけ、１規定の塩酸を加えること
によりＰＨを４に調整したのち、酢酸エチルで抽出した
。抽出液から溶媒を減圧除去後、得られた残渣を水酸化
カリウム０．３ｙの５０％メタノール水溶液２０ｍ１に
加え、室温下で一夜攪拌した。ついで、得られた反応液
に１規定の塩酸を加えることによりＰＨを約４に調整し
たのち、酢酸エチルで抽出した。この抽出液を乾燥後、
減圧濃縮し、その残渣を乾燥塩化メチレン３０ｍ１に加
えた。得られた溶液に２−ク畦レー１−メチルーピリジ
ニウム アイオダイド５．２ｙ及びエタノール０．７ｙ
を加え、ついで室温下で攪拌しながらトリエチルアミン
４．２ｙを滴下し、そのまま約３時間攪拌を続けた。得
られた反応液を水にあけ、ついで塩化メチレンで抽出し
た。抽出液を無水硫酸マグネシウムで乾燥後、減圧濃縮
し、ついでシリカゲルクロマトグラフィーで分離し、化
合物（１３）を０．７ｆ得た。実施例１４ 化合物（１）１．１ｆ１を１，２ージメトキシエタン２
０ｍ１に加え、この溶液に塩化チオニル２．５ｆを加え
、室温下て２橢間攪拌した。

得られた反応液から過剰の塩化チオニルを減圧下に留去
した。その残渣をアンモニアで飽和したエタノール溶液
５０ｍ１に加え、室温下で２碕間攪拌した。得られた反
応液を水にあけ、ついで酢酸エチルで抽出し、この抽出
液をシリカゲルクロマトグラフィーで分離し、化合物（
１４）を０．７ｙ得た。試験例１ ５−アミノー２−カルボキシー４−オキソー１，４，５
，６−テトラヒドロピリジンー３−酢酸のＧＯＴ阻害活
性の測定５−アミノー２−カルボキシー４−オキソー１
，４，５，６−テトラヒドロピリジンー３一酢酸のＧＯ
Ｔ阻害活性を２，４ージニトロフェニルヒドラジン比色
法〔臨床病理、臨時増刊特集第２９号第６４〜８３頁（
１９７７年）参照〕に準じ、次の方法により測定した。

その結果を第１表に示す。ＧＯＴ液（注１）０．８ｍ１
とピリドキサール５″一燐酸塩水溶液（注２）０．１ｍ
１との混合液に５−アミノー２−カルボキシー４−オキ
ソー１，４，５，６−テトラヒドロピリジンー３一酢酸
水溶液０．１ｍ１を加え、３ｒＣで正確に１紛間予備加
熱を行なう。これに基質溶液（注３）０．５ｍ１を加え
、３７℃で１紛間反応させたのち、アニリンのクエン酸
塩水溶液（注４）０．５ｍ１を加えて反応を停止させる
。直ちに、この反応液に２，４ージニトロフェニルヒド
ラジン水溶液（注５）０．５ｍ１を加え、その５分後に
０．乃規定の水酸化ナトリウム水溶液３ｍ１を加える。
そのまま室温下に３０〜６紛間放置したのち、この水溶
液の５００ｒ１ｍの吸光度（この値をＣとする）を分光
光度計（１８１型、日立製作所製）で測定する。対照と
して、上記の５−アミノー２−カルボキシー４−オキソ
ー１，４，５，６−テトラヒドロピリジンー３一酢酸水
溶液の代りに同容量の水を用いて行なつた反応液につい
て上記と同様にして５００ｎｒｎの吸光度（この値をＡ
とする）を測定する。一方、上記の５−アミノー２−カ
ルボキシー４−オキソー１，４，５，６−テトラヒドロ
ピリジンー３一酢酸水溶液の存在下又は不存在下の反応
において、それぞれＧＯＴ液とアニリンのクエン酸塩水
溶液の添加順序を逆にして得られた溶液について上記と
同様にして吸光度（前者の存在下の溶液の値をＤとし、
後者の不存在下の溶液の値をＢとする）を測定する。次
式により５−アミノー２−カルボキシー４−オキソー１
，４，５，６−テトラヒドロピリジンー３一酢酸のＧＯ
Ｔ阻害活性（％）を求める。その結果を第１表に示す。
（注１）ＧＯＴ液： 市販の豚の心臓起源のＧＯＴ（ベーリンガー社製、カタ
ログＮＯ．ｌＯ５臥２ｍ９／ｍｌ）を上記測定条件下で
の吸光度変化が０．４〜０．５となるようにシーラム●
アルブミン０．１ｍ９／ｍｌを含む０．１Ｍトリス塩酸
緩衝液（ＰＨ７．４）で希釈して得る。

（注２） ピリドキサール５″一燐酸塩水溶液：ピリド
キサール５″一燐酸塩１ｍ９を水１０ｍ１に溶解して得
られた液（冷凍保存）を、水で１＠に希釈して得る。

（注３） 基質溶液： Ｌ−アスパラギン酸１．３３ｙ（１０ｍｍ０Ｉｅ）及び
α−ケトグルタル酸１４．６ｍ９（０．１ｍｍ０１ｅ）
を０．３Ｍホウ酸緩衝液（ＰＨ８．５）５０ｍ１に溶解
し、ついでこの溶液に水酸化ナトリウムを加えてＰＨを
８．５に調整して得る。

（注４） アニリンのクエン酸塩水溶液：クエン酸２０
ｙを水２０ｍ１に溶解し、ついでアニリン２０ｍ１を加
えて得た溶液を、水で６倍に希釈して得る。

（注５）２，４ージニトロフェニルヒドラジン水溶液：
水９５ｍ１に濃塩酸５ｍ１を加え、ついで２，４ージニ
トロフェニルヒドラジン０．０４ｙを溶解して得る。

上記と同様の測定方法により、麦芽起源のＧＯＴｌ豚の
心臓起源のグルタミン酸●ピルビン酸トランスアミナー
ゼ（以下、ＧＰＴと称す）、豚の筋肉起源のホスホリラ
ーゼ、牛の肝臓起源のグルタメート・デヒドロゲナーゼ
、羊の脳起源のグルタミン●シンセターゼ、プロテアー
ゼ（ズブチリシン）及び豚の膵臓起源のα−アミラーゼ
（パンクレアーゼ）に対する５−アミノー２−カルボキ
シー４−オキソー１，４，５，６−テトラヒドロピリジ
ンー３一酢酸の酵素阻害活性（％）を調べ、その結果を
第１表に示す。

試験例２ ５−アミノー２−カルボキシー４−オキソー１，４，５
，６−テトラヒドロピリジンー３−酢酸の呈味性試験５
−アミノー２−カルボキシー４−オキソー１，４，５，
６−テトラヒドロピリジンー３一酢酸の第２表に示す５
種類の濃度の水溶液を調製し、これらの水溶液と蒸留水
を試料とし、１７名からなるパネルにより官能検査を行
なつた。

なお、官能検査は試料の内容がわからない状態で行ない
、呈味性は下記の基準で判別するようにした。その結果
を第２表に示す。旨味呈味性の有無 ０・・・・・・旨味を感じる ×・・・・・・旨味を感じない 呈味性の判定基準 −・・・・・・味を惑じない ＋・・・・・・味を僅かに感じる 丑・・・・・・味を強く感じる ＋・・・・・・味を非常に強く感じる 対照化合物としてグルタミン酸ナトリウムを用いて同一
パネルにより上記と同様の官能検査を行３表に示す。

第２表及び第３表から明らかなように、５−アミノー２
−カルボキシー４−オキソー１，４，５，６−テトラヒ
ドロピリジンー３一酢酸とグルタミン酸ナトリウムの旨
味の閾値（パネルの約５０％のパネラーが感じる最低濃
度）はいずれも約０．０３％である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＾１、Ｒ＾２及びＲ＾３は同一又は異なり各
   々水素原子、アルキル基又はアシル基を表わし、Ｒ＾４
   及びＲ＾５は同一又は異なり各々ヒドロキシ基、アルコ
   キシ基又はアミノ基を表わす。 ）で示される５−アミノ−２−カルボキシ−４−オキソ
   −１，４，５，６−テトラヒドロピリジン−３−酢酸誘
   導体及びその塩。