JPS584039B2 - 抗生物質ｄｍｂおよびその製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規アミノグリコシド系抗生物質３′・４′−
ジデオキシ−６”Ｎ−メチルブチロシン（以下、単にＤ
ＭＢと略称する）−ＡまたはＤＭＢ−Ｂあるいはそれら
の薬理的に許容し得る酸付加塩、並びにそれらの製法に
関する。

ストレプトマイシン、ネオマイシンの発見以来アミノグ
リコシド系抗生物質は、放線菌その他の微生物の培養液
中より数多く単離されている。

例エハハロモマイシン、カナマイシン、ケンタマイシン
、アミノデオキシカナマイシン、リポスタマイシン、リ
ビドマイシン等が化学療法剤として現在使用されまたは
使用されようとしていることは周知のごとくであるが、
これらの抗生物質の使用と並行して、これら抗生物質に
対する耐性菌の出現頻度が次第に高まりつつあることも
周知である。

この感受性菌の耐性獲得が分子内の水酸基あるいはアミ
ン基のアセチル化、リン酸化あるいはアデニル化による
不活性化に基くことが、梅沢浜夫等〔「アドバンス・イ
ン・カーボノ・イドレート・ケミストリー・アンド・バ
イオケミストリー」３０巻、１８３〜２２５頁（１９７
４年）〕によって解明されて以来、不活性化に関与する
官能基を除去するか、または適当な基の導入によって保
護せんとする意図のもとに、半合成的あるいは純化学的
に新しいアミノグリコシド系抗生物質を創製せんとする
試みが最近活発化しつつある。

本発明の目的抗生物質たるＤＭＢ−ＡおよびＤＭＢ−Ｂ
もこのような意図のもとに創製された新規抗生物質であ
り、後記抗菌スペクトルの項で詳記するように、カナマ
イシン、ネオマイシン、リポスタマイシン、ブチロシン
、ケンタマイシン等に対しては勿論、化学的修飾によっ
て製造された３′・４′−ジデオキシ−カナマイシン（
ジベカシン）に対して耐性である細菌類に対しても感受
性菌と同様な抗菌活性を示すというすぐれた特徴を有す
る。

また本発明の目的抗生物質製造の大きな特徴の一つは、
以下に詳記するように、純化学的方法ではなくブチロシ
ン生産菌の変異株を使用して生合成的に上記ＤＭＢ−Ａ
およびＤＭＢ−Ｂを製造するという新しい手法を利用し
ている点である。

すなわち本発明の抗生物質は、バチルス・サーキュラン
スに属し、ネアミンまたはデオキシストレプタミンの非
存在下にはブチロシンを生産しないがネアミンの存在下
にはプチロシンを生産し得る菌株を３′・４′−ジデオ
キシ−６′−Ｎ−メチルネアミンの存在下に培養し、そ
の培養物よりＤＭＢ−ＡまたはＤＭＢ−Ｂを単一な状態
であるいはそれらの混合物（以下ＤＭＢ複合体と称す）
の状態で採取することにより製することが出来る。

本発明において、目的とする抗生物質の製造に使用する
菌株は、バチルス・サーキュランスの変異誘導により取
得されるネアミンまたはデオキシストレプタミンの非存
在下にはブチロシンを生産しないがネアミンの存在下に
はプチロシンを生産し得る菌株である。

これらの変異株は本発明者等によって土壌中より分離さ
れ、ブチロシン生産菌として報告されているバチルス・
サーキュランス）ＮＲＲＬ−Ｂ−３ ３ １ ３株（特
公昭４９−１６６３０号）に近似の菌株と同定されたＭ
ＣＲＬ５００１株を、Ｎ−メチルーＮ′一二トロ−Ｎ−
ニトロソグアニジン処理あるいは紫外線照射の如き変異
誘導手段によって変異させて所望の変異特性を有するに
到った変異株である。

このような変異株の例としては、バチルス・サーキュラ
ンスに属し、ネアミンの非存在下にはブチロシンを生産
しないがネアミンの存在下にはプチ口シンを生産し得る
菌株ＭＣＲＬ５００３株（以下、単にＭＣＲＬ５００３
株と略称する）、あるいはバチルス・サーキュランスに
属し、ネアミンまたはデオキシストレプタミンの非存在
下にはプチ口シンを生産しないがネアミンの存在下には
ブチロシンを生産し得る菌株ＭＣＲＬ５００４株（以下
、単にＭＣＲＬ５００４株と略称する）があげられる。

上記ＭＣＲＬ５００３株はバチルス・サーキュランス（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ − ｃｉｒｃｕｌａｎｓ ） Ｍ
Ｃ Ｒ Ｌ５００３株として、またＭＣＲＬ５００４株
はバチルス・サーキュランス（ Ｂａｃｉｌｌｕｓ −
ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）ＭＣＲＬ５００４株としてそれ
ぞれ工業技術院微生物工業技術研究所（以下、微工研と
略称する）に寄託されている（ＭＣＲＬ５００３株：微
工研菌寄第３３４６号、ＭＣＲＬ５００４株：同第３３
４７号）。

これらのＭＣＲＬ５００３株およびＭＣＲＬ５００４株
の菌学的性状は下記に示す通りである。

（１）形態学的性状 第１表に示す通りである。

（ＩＩ）各種培地上における培養所見 第２表に示す通りである。

（ｉｉｉ） 生埋的性状 ＭＣＲＬ５００３株およびＭＣＲＬ５００４株の両菌株
とも好気性で、ｐＨ５．９〜９．７の範囲で生育し、そ
れらの生育最適ｐＨは７．０である。

ＭＣＲＬ５００３株の生育温度は１４〜４４゜Ｃで、そ
の最適温度は３９゜Ｃであるが、ＭＣＲＬ５００４株の
生育温度は１１〜４５℃で、その最適温度は４０℃であ
り、両菌株は生育温度およびその最適温度において差異
を示す。

また両菌株とも３％塩化ナトリウム含有液では．生育し
ない。

その他生理的性状としては両菌株とも同様の性状を示す
。

すなわち両菌株とも硝酸塩の還元能、メチルカルビノー
ルの生成能、インドールの生成能、硫化水素の生成能を
示さず、Ｏ−ＦテストにおいてＤ−グルコースから酸お
よびガスを生成しないが、メチルレッドテストは陽性で
ある。

また両菌株ともウレアーゼ活性、オキシダーゼ活性を示
さないが、カタラーゼ活性をわずかに示す。

また更にでん粉、ゼラチン、カゼインを共によく分解し
、クエン酸、硝酸塩は利用しないが、アンモニウム、グ
ルタミン酸塩は利用する。

菌体外色素の生成は認められない。

■ 基礎培地上における糖の利用性 第３表に示す通りであり、Ｄ−マンニットに対する挙動
においてのみ両菌株間に差が認められる。

ＭＣＲＬ５００３株およびＭＣＲＬ５００４株は上記に
示す如き菌学的性状を有するが、これら菌株と該菌株の
親株たるＭＣＲＬ５００１株とは、該親株が通常の培地
にて培養時ブチロシンを蓄積するに反してＭＣＲＬ５０
０３株はプチロシンの構造単位であるネアミンを含ま
ない培地ではプチロシンを全くもしくは殆ど蓄積せず、
ネアミンを培地に添加する場合にはじめてプチロシンを
蓄積するようになる点で、またＭＣＲＬ５００４株はプ
チロシンの構造単位であるネアミンおよび（または）テ
オキシストレプタミンを添加しない培地ではプチロシン
を蓄積せず、ブチロシン蓄積のためには培地にネアミン
またはデオキシストレプタミンの添加を必要とする点で
それぞれ相違している。

すなわちＭＣＲＬ５００３株はネアミンーネガティブな
性質を有する変異株、また後者のＭＣＲＬ５００４株は
ネアミンおよびデオキシストレプタミン−ネガテイブな
性質を有する変異株ということが出来る。

このネアミンーネガティブな性質が両変異株に共通な性
質であり、この特性のために本発明の目的抗生物質たる
ＤＭＢの生産が可能となる。

すでにバチルス・サーキュランスに属し、プチロシン生
産能を有する菌株から変異誘導された変異株としてテオ
キシストレプタミンーネガスイブな性質を有する変異株
３０１ −２ｂ株がＣ．Ａ， Ｃｌａｒｉｄｇｅ等によ
って報告されているＣ Ｄｅｖｅｌ ．Ｉ ｎｄｕｓｔ
ｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ．、１５、１０１〜１
１３頁（１９７４年）〕。

しかしながらその報文によれば、この３０１−２ｂ株は
ネアミンが存在するもプチロシンを蓄積せず、この点Ｍ
ＣＲＬ５００３株およびＭＣＲＬ５００４株とは明らか
に異なっている。

そして現在までにバチルス・サーキュランスに属する菌
株でネアミンーネガティブな性質を有する変、異株の報
告はない。

尚、バチルス・サーキュランスに属する菌株から上記の
如きネアミンまたはデオキシストレプタミンーネガテイ
ブな性質を有する変異株を得るための変異方法としては
、前記Ｎ−メチルＮ／−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジ
ン処理あるいは紫外線照射の他、細菌類の変異誘導法例
えばアクリジンオレンジの如き変異剤による処理、Ｘ−
線照射、６０Ｃｏ−照射等の方法をいずれも採用するこ
とが出来る。

また変異株としては単にバチルス・サーキュランスＭＣ
ＲＬ５００１株より誘導された上記２変異株にのみ限定
されるものではなく、ブチロシン生産性を示す他のバチ
ルス・サーキュランスに属する菌株あるいはその亜種よ
り誘導されるネアミンーネガティブな性質を有する変異
株もまた使用に供することが出来る。

上記の如き菌学的性状を有するＭＣＲＬ ５００３株またはＭＣＲＬ５００４株の培養法としては
液体培地中での振とう培養法あるいは深部通気かくはん
培養法が適当である。

培地成分としては通常細菌類の培養に繁用される各種の
培地源が使用出来る。

例えば炭素源としてはでん粉、シヨ糖、麦芽糖、ブドウ
糖、グリセロール等、窒素源としては大豆粉（脱脂）；
ペプトン、肉エキス、アミノ酸、硝酸塩、アンモニ、ウ
ム塩等が使用され、これらの炭素源、窒素源において、
炭素源としてグリセロールが、また窒素源として大豆粉
が好適である。

その他ナトリウム塩、マグネシウム塩、リン酸塩、カル
シウム塩、鉄塩、亜鉛塩等無機塩類、ビタミン類、有機
酸等菌の生育促進物質等が適宜使用される。

また培養にあたっては、シリコーン油、植物油、界面活
性剤等の消泡剤が使用される。

液体培養に際しては培地のｐＨは７．５附近、培養温度
は２７〜３２℃附近にあるのが好ましい。

上記の如き培地源を含有する培地に基質たる３′・４
′−ジデオキシ−６’−Ｎ−メチルネアミンを１００〜
１００ｍｃｇ／ｍｌの割合で添加し、上記ＭＣＲＬ５０
０３株または５００４株を接種して上記培養条件下に４
〜１０日間振とうあるいは通気培養することにより培養
液中に目的とする抗生物質ＤＭＢが蓄積される。

この場合、上記基質は培養の開始時から添加しても、ま
た培養中適当な時期例えば培養開始２４〜４８時間後に
添加してもよい。

後者の場合には基質の添加後３〜７日目にＤＭＢの蓄積
量が最大となる。

ＤＭＢの生成を確認するには、例えば下記方法が採用さ
れる。

すなわち、上記培養液を通常の抗生物質の力価検定法例
えばディスク法あるいはカップ法により被検定菌バチル
ス・ズブチリスに対する抗菌力を測定する。

培養の経過にともなって培養液の抗菌力が増大すること
を確かめた上で次のように検出する。

まず培養液２０ｍｌを水で適当に稀釈したのち遠心分離
する。

上澄液をアンバーライトＩＲＣ−５０（ＮＨ４＋型）樹
脂と接触させて活性成分を吸着させ、ついでこの樹脂を
水、０．ＩＮアンモニア水で順次洗浄する。

この樹脂より該活性成分を１．０Ｎアンモニア水で溶出
し、溶出液を減圧濃縮する。

濃縮液をシリカゲルＧＦ２５４およびアルミナ薄層プレ
ートにスポットし、クロロホルムーメタノール−２８％
アンモニア水（１：３：２）、クロロホルムーメタノー
ル−１７％アンモニア水（１：４：３）でそれぞれ展開
する。

シリカゲルＧＦ２５４の薄層プレート上にはＲｆ０．２
５にニンヒドリン陽性かつ抗菌活性（バイオオートグラ
フイーにて検出）を有するＤＭＢのスポットが認められ
、他方アルミナの薄層プレート上には２回展開後、Ｒｆ
０．３５およびＲｆ０．０９にニンヒドリン陽性かつ抗
菌活性を有するＤＭＢのスポットが認められる。

上記の如く、本発明方法によって生産されるＤＭＢには
２種類の成分が存在することが明らかである。

以下アルミナプレート上でＲｆＯ．３５を示す物質をＤ
ＭＢ−Ａ、またＲｆＯ．０９を示す物質をＤＭＢ−Ｂと
それぞれ称する。

培養終了後、培養液中に蓄積されたＤＭＢの抽出精製に
は、アミノグリコシド系抗生物質の抽出精製に一般に用
いられる各種精製法がいずれも採用出来るが、とりわけ
カチオン交換樹脂〔例えばアンバーライトＩＲＣ−５０
、アンバ−ライトＣＧ−５０（いずれもローム・アンド
・ハース社製）〕、およびカチオン交換性セファデツク
ス〔例えばＣＭ−セファデツクス（ファルマシア社製）
〕に対し吸脱着処理する例えば下記の如き方法が好適に
採用される。

すなわち、培養終了液を水で適当に稀釈し、飽和シュウ
酸水溶液を加えてｐＨ２．５に調整する。

この水溶液をロ過あるいは遠心分離し、菌体および沈で
ん物を除去する。

ロ液または上澄液を６Ｎアンモニア水でｐＨ７．０に調
整する。

この溶液中９バチルス・ズブチリスに対し抗菌活性を示
す成分をアンバーライトＩＲＣ−５０（ＮＨ４＋型）に
吸着させる。

この樹脂を水、０．１Ｎアンモニア水で洗浄したのち、
１Ｎアンモニア水で溶出することにより、ＤＭＢ活性区
分が得られる。

このＤＭＢ活性区分の水溶液をアンバーライトＣＧ−５
０（ＮＨ４＋型）樹脂と接触させてＤＭＢ活性区分を吸
着させる。

この樹脂を水、０．１Ｎアンモニア水および０．２５Ｎ
アンモニア水で洗浄したのち、該活性区分を ０．５Ｎアンモニア水で溶出し、溶出液を分画すること
により、ＤＭＢ−Ｂ含有区分並びにＤＭＢ−ＡおよびＤ
ＭＢ −Ｂ含有区分がそれぞれ得られる。

かくして得られるＤＭＢ−ＡおよびＤＭＢ一Ｂ含有区分
は、ＣＭ−セファデソクスに吸着させたのちアンモニア
水の濃度を段階的に上昇させる溶出操作を繰り返すこと
によってＤＭＢ−ＡまたはＤＭＢ−Ｂが単一成分として
得られる。

ＤＭＢの成分たるＤＭＢ−ＡとＤＭＢ−Ｂとの生成割合
は、前記アルミナ薄層プレートに展開後ピリドキサール
ー硝酸亜鉛−ピリジン溶液を噴霧し、５０℃、１０分間
加熱したのち励起光として３８０ｎｍで照射して出現す
る螢光量を４６０ｎｍで測定することにより求めること
が出来る。

現段階におけるＤＭＢ−ＡとＤＭＢ−Ｂとの生成割合は
約１：５〜１０であり、この比率は培養条件等を変更す
ることにより変化する。

上記の如くして得られたＤＭＢ−ＡおよびＤＭＢ−Ｂは
元素分析値および熱天秤分析法より、いずれも炭酸塩の
状態にあることが判明した。

これらの炭酸地は常法によって処理することにより遊離
塩基に誘導することが出来、また塩交換反応させること
により薬理的に許容し得る各種酸付加塩に誘導すること
が出来る。

またＤＭＢ−ＡとＤＭＢ−Ｂとは後記構造式から明らか
な如く、同一組成を有し、互に立体異性体の関係にある
。

これらのＤＭＢ−Ａ，ＤＭＢ−Ｂの各炭酸塩およびＤＭ
Ｂ−Ａ：ＤＭＢ一Ｂの成分比率が１：３と実測されたＤ
ＭＢ複合体の炭酸塩の物理化学的性状は下記に示す通り
である。

（１）外観 ＤＭＢ−Ａ炭酸塩 ： 白色無定形粉末 ＤＭＢ−Ｂ炭酸塩 ： 同上 ＤＭＢ複合体炭酸塩：同上 （２）融点：いずれも明確な融点を示さない。

（３）元素分析値（％） ＤＭＢ−Ａ炭酸塩：Ｃ，４１．０８； Ｈ、６．９８；Ｎ，１０．０１ ＤＭＢ−Ｂ炭酸塩：Ｃ，４１．１０； Ｈ、６．９０；Ｎ， ９．７ ３ ＤＭＢ複合体炭酸塩：Ｃ，４１．１４； Ｈ， ６．７ ７ ；Ｎ， １ ０．１ ２尚、Ｃ２２
Ｈ４３Ｎ５Ｏ１０・２Ｈ２ＣＯ３・２Ｈ２０としての計
算値はＣ４１．３２％、Ｈ７．３６％、Ｎ１０．０４％
である。

上記分析結果よりＤＭＢは炭酸塩の状態にあることが判
る。

このことは熱天秤のデータからも支持される。

（４）比旋光度（ロ）６２ （Ｃ＝０．１、Ｈ２０）Ｄ
ＭＢ−Ａ炭酸塩：＋２００±５° ＤＭＢ−Ｂ炭酸塩：＋２４°±５° ＤＭＢ複合体炭酸塩：＋２０°±５° （５）紫外線吸収スペクトル ＤＭＢ−Ａ炭酸塩：水溶液において末端吸収を示す。

ＤＭＢ−Ｂ炭酸塩：水溶液において末端吸収を示す。

ＤＭＢ複合体炭酸塩：水溶液において未端吸収を示す。

（６）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒｃｍ−１）ＤＭＢ
−Ａ炭酸塩：第１図 ＤＭＢ−Ｂ炭酸塩：第２図 ＤＭＢ複合体炭酸塩：第３図 （７）溶媒に対する溶解性 ＤＭＢ−Ａ炭酸塩：水に易溶。

メタノールエタノールに可溶。

アセトン、ｎ−ブタノール、ベンセン、クロロホルムニ
不溶。

ＤＭＢ−Ｂ炭酸塩：水に易溶。

メタノールエタノールに可溶。

アセトン、ｎ−ブタノー・ル、ベンゼン、クロロホルム
に不溶。

ＤＭＢ複合体炭酸塩：水に易溶。

メタノールエタノールに可溶。

アセトン、ｎ−ブタノール、ベンセン、クロロホルムニ
不溶。

（８） Ｒｆ値 下記第４表に示す通りである。

（９）塩の形成性 ＤＭＢ−Ａ，ＤＭｌ３−ＢおよびＤＭＢはいずれも塩基
性物質であり、各種の酸例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸
、リン酸の如き無機酸、酢酸、ピルビン酸、酒石酸、コ
ハク酸、マロン酸、アスパラギン酸の如き有機酸等と塩
を形成する。

ここに１例として硫酸塩の物理化学的性状を示す。

（１）外観 ＤＭＢ−
Ａ硫酸塩 ： 白色無定形粉末 ＤＭＢ−Ｂ硫酸塩 ： 白色無定形粉末 ＤＭＢ複合体硫酸塩：同上 （ｉｉ）融点：いずれも明確な融点を示さない。

（ｉｉｉ） 比旋光度（ロ）５２（ Ｃ＝ ｏ． ｌ
， Ｈ２０ ）ＤＭＢ−Ａ硫酸塩：＋１８．９°±５° ＤＭＢ−Ｂ硫酸塩：＋２５．９°±５° ＤＭＢ複合体硫酸塩：＋２４．１°±５°（１０）加水
分解生成物 第５表に示す通りである。

Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ）プレート上にて展開（展開溶媒
；酢酸エチル：ピリジン：酢酸：水−５：５：１：３、
およびｎ−ブタノール：ピリジン：水−６：４：３）後
、アニリンフタレート試薬にて発色、同時に展開発色さ
せたキシロースおよびリボースの標準品と比較同定した
ことを示す。

また＊＊＊＊は上記同一のセルロース薄層プレート上に
展開後、ニンヒドリンおよびアニリンフタレートで発色
し、それぞれの標品と比較同定したことを示し、使用展
開溶媒は上記酢酸エチル−ピリジン−酢酸−水（５：５
：１ ：３）およびｎ−ブタノール−ピリジン−酢酸−
水（１５：１０：３：１２）を使用した〕以上のデータ
ー、特に加水分解生成物の分析」データから、ＤＭＢ−
ＡおよびＤＭＢ−Ｂの化体ＣＨ３−ＨＮ 学構造は下記式で示す如く決定された。

（但し、式中Ｒ１が水酸基、Ｒ２が水素原子である場合
ＤＭＢ−Ａ、またＲ１が水素原子、Ｒ２が水酸基である
場合にＤＭＢ−Ｂを表わす。

）上記の如き物理化学的性状を示すＤＭＢ−Ａ炭酸塩お
よびＤＭＢ −Ｂ炭酸端の生物活性は下記に示す通りで
ある。

（１）抗菌スペクトル 第６表に示す通りである。

表中培地の欄ローマ数字および備考の欄略号は下記を示
す。

■：ハート・インフユージョン寒天培地（栄研）■：１
０％馬血清添加プレイン・ハート・インフユージョン寒
天培地（デイフイコ）■：ツアイスラー寒天培地（２％
ブドウ糖添加２０％馬血液寒天培地）■：キルヒナー液
体培地（栄研） ＢＵＡ：ブチロシンＡ ＢＵＢ ：ブチ口シンＢ ＤＫＢ ：ジベカシン ＧＭ：ゲンタマイシン複合体 ＫＭ：カナマイシン ＫＭＢ：カナマイシンＢ ＮＭ：ネオマイシン ＲＢ：リボスタマイシン ＳＭコストレプトマイシン 上記第２表から明らかな如く、ＤＭＢ−ＡおよびＤＭＢ
−Ｂはグラム陽性菌、ダラム陰性菌、抗酸性菌に対し抗
菌活性を有している，特に代表的なアミノグリコシド系
抗生物質例えばストレプトマイシン、ネオマイシン、カ
ナマイシン、カナマイシンＢ、リボスタマイシン、ケン
タマイシン、ジベカシン、プチ口シンと交叉耐性を示さ
ない点は本抗生物質の特徴である。

ＤＭＢ−Ａ，ＤＭＢ−Ｂの嫌気性菌に対する作用は微弱
で、更にかび類、酵母類には作用を有しない。

（２）急性毒性 ＤＭＢ−ＡおよびＤＭＢ−Ｂは低毒性であり、これらの
物質をマウス尾静脈に３００ｍｇ／ｋｇ量注射するも、
マウスは何らの異常を示さない。

実施例 １ （１）培養 ヌトリエント寒天斜面培地に培養した ＭＣＲＬ５００４株を、ポリペプトン１．０％、牛肉エ
キス１．０％、塩化ナトリウム０．５％を含む液体培地
（ ｐＨ ７．２ ）に接種し、３０℃、毎分１８０〜
１９０回転で４０時間しんとう培養し、これを種母液と
する。

グリセロール４．０％、大豆粉２．０％、硫酸マグネシ
ウム０．０５％、塩化カルシウム０．００４％、硫酸第
１鉄０．０００５％、硫酸亜鉛０．００００５％、シリ
コーンＫＭ−７５（信越化学社製）０．０２ｍｌ／ｌを
含む培地（ｐＨ７．５）を３０ｍｌ宛２５０ｍｌ容三角
フラスコに分注し、加熱滅菌する。

これに上記種母液を移植率３％の割合で移植し、更に３
′・４’−ジデオキシ−６′−Ｎ−メチルネアミンを終
濃度２００ｍｃｇ／ｍｌとなるように添加する。

３０℃、毎分１８６回転で７日間培養するとＤＭＢの蓄
積が認められた。

（２）抽出 上記（１）で得た培養終了液３ｌに水を加えて全量１６
Ｊとする。

これに飽和シュウ酸水溶液を・加えてｐＨ２．５に調整
し、１時間か《ほんののち遠心分離して菌体および沈で
ん物を除去する。

上澄液に６Ｎアンモニア水を加えてｐＨ７．０５とし、
アンバーライトＩ ＲＣ−５ ０ （ＮＨ４＋型）３０
０ｍｌを充填せるカラム（５Ｘ１６Ｃ１ｒＬ）に導通し
てＤＭＢ活性区分を吸着させる。

このカラムを水および０，ＩＮアンモニア水３ｌで洗浄
したのち、ＩＮアンモニア水４ｌを導通し活性成分（バ
チルス・ズブチリスに抗菌活性を有する）を溶出する。

この溶出液を減圧濃縮乾固することにより、ＤＭＢ活性
区分５．６１を得る。

この活性区分５．６１を水４００ｙｄに溶解し、２Ｎ硫
酸にてｐＨ ７．０に調整したのちアンバーライトＣＧ
−５０（ＮＨ４＋型）４０ｍｌを充填せるカラム（ １
．６ Ｘ １ ０ｃｒｒＬ）に導通し、該区分を吸着さ
せる。

このカラムを水、０．ＩＮアンモニア水および０．２５
Ｎアンモニア水で洗浄したのち、０．５Ｎアンモニア水
にて活性成分を溶出する。

溶出液は１００ｍ７宛分画捕集する。各分画はアルミナ
プレートを用いる薄層クロマトグラフイー（展開溶媒：
クロロホルム：メタノール：１７％アンモニア水−１
：４ ：３）を行ない、バチルス・ズブチリスを被検菌
としてバイオオートグラフイーおよび螢光発色法を用い
て含有成分を調べた結果、フラクション＆４にはＤＭＢ
−Ｂが、フラクション＆５〜８にはＤＭＢ−ＡおよびＤ
ＭＢ−Ｂが含まれていることが認められた。

各両分を凍結乾燥することにより、ＤＭＢ−Ｂ炭酸塩含
有区分８９ｍ９、ＤＭＢ−Ａ炭酸塩およびＤＭＢ−Ｂ炭
酸地含有区分２０９ｍ９が得られた。

（３）精製 上記（２）で得たＤＭＢ−Ａ炭酸塩およびＤＭＢ−Ｂ炭
酸塩含有区分２００ｍｌを水１０ｍｌに溶解し、ＣＭ−
セファデックス（ＮＨ４＋型）５ｍｌを充填せるカラム
（０．８Ｘ１０ＣｒｒＬ）に導通してＤＭＢ−Ａおよび
ＤＭＩ３−Ｂを吸着させる。

このカラムを水洗後、０．ＩＮアンモニア水および０．
１５Ｎアンモニア水各１５ｍｌで展開したのち、０．２
Ｎアンモニア水にて溶出し、溶出液は３ｍｌ宛分画捕集
する。

各分画につき上喧２）と同様にして含有成分を調べ、各
両分を凍結乾燥することにより、フラクションＡ．６４
〜７４よりＤＭＢ−Ｂ炭酸塩４３ｍ９、フラクション＆
７５〜１２０よりＤＭＢ複合体炭酸塩（成分比：ＤＭＢ
−Ａ ： ＤＭＢ−Ｂ＝３ ： １ ） １ ０ ５ｍ
９が得られた。

（４）ＤＭＩ３−Ｂの精製 上記（２）で得たＤＭＢ−Ｂ炭酸塩含有区分８０〜を水
３ｍｌに溶解し、ＣＭ−セファデツクス（ＮＨ４＋型）
６ｍｌを充填せるカラム（０．８×１２ｃｍ）に導通し
、ＤＭＢ−Ｂを吸着させる。

このカラムを水洗後、０．１Ｎアンモニア水および０．
１５Ｎアンモニア水各１２ｍｌで展開し、更に０． ２
Ｎアンモニア水にて溶出し、溶出液は３ｍｌ宛分画捕
集する。

各分画につき上記（２）と同様にして含有成分を調べ、
フラクションＮｏ１２１〜１３５よりＤＭＢ−Ｂ炭酸塩
５６ｍｇが得られた。

（５）ＤＭＢ−Ａの分離精製 上記（３）と同様にして得たＤＭＢ複合体炭酸塩（成分
比；ＤＭＢ−Ａ：ＤＭＢ−Ｂ＝３：１）１２６ｍｇを水
４ｍｇに溶解し、ＣＭ−セファテツクス（ＮＨ４＋型）
６ｍｌを充填せるカラム（１．８×１２ｃｍ）に導通し
、ＤＭＢ−ＡおよびＤＭＢ一Ｂを吸着させる。

このカラムを水洗後、０．１Ｎアンモニア水および０．
１５Ｎアンモニア水各１０ｍｌで展開したのち、０．２
Ｎアンモニア水で溶出し、溶出液はＳｒｒＬｌ宛分画捕
集する。

各分画につき上記（２）と同様にして含有成分を調べ、
フラクションＮｏ４７〜６２゛よりＤＭＢ複合体炭酸塩
（成分比；ＤＭＢ−Ａ：ＤＭＢ−Ｂ＝１ ：３）２６ｍ
ｇ、またフラクションＮｏ６３〜９７よりＤＭＢ−Ａ炭
酸地８４ｍｇがそれぞれ得られた。

実施例 ２ ハートインフユージョン寒天斜面培地に培養したＭＣＲ
Ｌ５００３株を、グルコース０．４％、酵母エキス０．
８％、麦芽エキス２．０％を含む液体培地（ｐＨ ７．
５ ）に接種し、３０℃で４０時間しんとう培養し、種
母液とする。

この種母液を実施例１（１）と同様の培養培地１００ｍ
ｌに移植率３％の割合で移植し、３０℃、毎分１８６回
転で４８時間培養する。

これに３′・４′−ジデオキシ−６’一Ｎ−メチルネア
ミンを終濃度１００ｍｃｇ／ｍｌとなるように添加し、
更に同一培養条件で５日間培養する。

ＤＭＢとして１２０ｍｃｇ／ｍｌ（転換収率約５３％）
の蓄積が認められた。

実施例 ３ （ＤＭＢ−Ａ硫酸塩の調製） ＤＭＢ−Ａ炭酸塩１０■を水１０ｍｌに溶解し、０．１
Ｎ硫酸にてｐＨ６．０５に調整する。

室温にて１時間かくはんする。

反応液を真空凍結乾燥したのち水０．３蛯に溶解し、ア
セトン６ｍｌを加える。

析出した結晶を口取することにより、ＤＭＢ−Ａ硫酸塩
（水和物）７．８ｍｇを得る。

実施例 ４ （ＤＭＢ−Ｂ硫酸地の調製） ＤＭＢ−Ｂ炭酸塩１０ｍｇを実施例３と同様に処理する
ことにより、ＤＭＢ−Ｂ硫酸塩８．０ｍｇを得る。

【図面の簡単な説明】

第１図はＤＭＢ−Ａ炭酸地の赤外線吸収スペクトル、第
２図はＤＭＢ−Ｂ炭酸地の赤外線吸収スペクトル第３図
はＤＭＢ複合体炭酸塩の赤外線吸収スペクトルである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １３′・４′−ジデオキシ−６′−Ｎ−メチルブチロシ
   ンーＡ、３′・４′−ジデオキシ−６′−Ｎ−メチルブ
   チロシンーＢまたはそれらの薬理的に許容し得る酸付加
   塩。 ２ 酸付加塩が炭酸塩である特許請求の範囲第１項記載
   の化合物。 ３ 酸付加塩が硫酸塩である特許請求の範囲第１項記載
   の化合物。 ４ バチルス・サーキュランスに属し、ネアミンまたは
   デオキシストレプタミンの非存在下にはプチロシンを生
   産しないが、ネアミンの存在下にはブチロシンを生産し
   得る菌株を３′・４′−ジデオキシ−６’−Ｎ−メチル
   ネアミンの存在下に培養し、その培養物より３′・４′
   −ジデオキシ−６′一Ｎ−メチルブチロシンーＡまたは
   ３′・４′−ジデオキシー６′−Ｎ−メチルブチロシン
   −Ｂを単一な状態であるいはそれらの混合物の状態で採
   取するか、またはそれらを更に常法によって酸付加塩に
   変換することを特徴とする３′・４′−ジデオキシ−６
   ’ −Ｎ −メチルブチロシン−Ａまたは３′・４′−
   ジデオキシ−６’−Ｎ−メチルブチロシンＢあるいはそ
   れらの薬理的に許容し得る酸付加塩の製法。 ５ 菌株がバチルス・サーキュランス・ＭＣＲＬ５００
   ３株である特許請求の範囲第４項記載の製法。 ６ 菌株がバチルス・サーキュランス・ＭＣＲＬ５００
   ４株である特許請求の範囲第４項記載の製法。