JPS6260392B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規なアンジオテンシン変換酵素阻
害物質に関するものである。

アンジオテンシン変換酵素はアンジオテンシ
ンをアンジオテンシンに変換する酵素であ
り、アンジオテンシンは血圧上昇作用を有する
ところからアンジオテンシン変換酵素阻害物質
は血圧降下剤として有用である。

本発明者らは新規なアンジオテンシン変換酵
素阻害物質の取得を目的としてこの酵素阻害物質
を産生する微生物を広く検索した結果、山口県小
野田市内の土壌より分離した放線菌がこの目的に
適合するものであることを見出してこれに基いて
本発明を完成するに至つた。

以下、本発明を詳細に説明する。

まず、実施例で得られた本発明のアンジオテン
シン変換酵素阻害物質の理化学的性質を示す。

(1) アンジオテンシン変換酵素に対する阻害作
用 ラツトの肺より得られたアンジオテンシンＩ
変換酵素に対する阻害作用を後述する酵素阻害
活性測定方法に従つて測定したところ、このア
ンジオテンシン変換酵素を阻害するのに必要
な酵素阻害物質の量は22ndlであつた。

(2) 構成物質 6N塩酸中110℃で20時間加水分解して得られ
た加水分解物をアミノ酸自動分析計によつて測
定したところ、フエニルアラニンと、面積比が
約２倍の未同定のニンヒドリン陽性物質とが検
出された。

(3) 融 点 300℃までは融点を示さない。

(4) 比旋光度 〔α〕_D＝−110゜（Ｃ＝0.075、0.01NNaOH） (5) 紫外線吸収スペクトル 250mg／の水溶液について紫外線吸収スペ
クトルを測定した結果を第１図に示す。

(6) 赤外線吸収スペクトル KBr錠剤法で測定した赤外線吸収スペクトル
を第２図に示す。

(7) 溶剤に対する溶解性 0.1N水酸化ナトリウム水溶液に可溶、水、
メタノールに難溶、エーテル、アセトン、ｎ−
ヘキサンに不溶 (8) 呈色反応 ヨウ素反応に陽性、ニンヒドリン、α−ナフ
トール硫酸反応に陰性 (9) 物質の色など 白色結晶性粉末 (10) 薄層クロマトグラフイー シリカゲルプレート（60F254、メルク社
製）を用い、各種の展開溶媒についてRf値を
測定した結果を下表に示す。

展開溶媒 Rf値 ｎ−ブタノール：酢酸：水（４：１：１） 0.35 ｎ−ブタノール：ｎ−プロパノール：水（２：
１：３、上層） 0.21 70％イソプロパノール水溶液 0.46 以上の理化学的性質を有するアンジオテンシン
変換酵素阻害物質は見出されないところから、
本発明の酵素阻害物質は新規であると判断し、
I5B1と命名した。

本発明のアンジオテンシンＩ変換酵素阻害物質
I5B1は、例えば本発明者らが山口県小野田市内
の土壌より分離した放線菌No.937ZE−１株を培養
することによつて産生させることができる。この
放線菌No.937ZE−１は微工研菌寄第7132号として
工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されてい
る。

放線菌No.937ZE−１の菌学的性質を次に示す。

(a) 形態 イースト・麦芽寒天培地及びオートミール寒
天培地上で白色の気菌糸を形成しその先端に５
〜15個の胞子が連鎖して螺旋状あるいは開環状
を呈する。胞子の表面は平滑で楕円形であり、
大きさは0.5〜0.8×1.0〜1.5μである。種々の
培地上で球状あるいは不定形の直径５〜40μ程
度の胞子のうを形成する。遊走胞子は観察され
ない。通常、基生菌糸は分断せず、菌核形成は
認められない。また、各種培地上に結晶物質を
多く産生する。

(b) 各培地における生育状態 各種培地上で28℃、２週間培養したときの生
育及び色の特徴を次に示す。なお、色名は日本
色彩研究所監修の色の「標準色表Ａ」（1970
年）に準じて表示した。

シユクロース・硝酸塩寒天培地 増殖(G)：貧弱 気菌糸（AM）：貧弱、白色 表面色（Ｒ）：無色 可溶性色素（SP）：なし 胞子のう（SG）：なし グルコース・アスパラギン寒天培地 Ｇ：貧弱 AM：貧弱、白色 Ｒ：無色 SP：なし SG：豊富、球状あるいは不定形 グリセリン・アスパラギン寒天培地 Ｇ：貧弱 AM：貧弱、白色 Ｒ：無色 SP：なし SG：豊富、球状 スターチ寒天培地 Ｇ：中程度 AM：貧弱、白色 Ｒ：無色ないし白色 SP：なし SG：豊富、球状あるいは円筒状 チロシン寒天培地 Ｇ：中程度 AM：なし Ｒ：あさい黄みのブラウン SP：うす茶褐色 SG：少数、球状 栄養寒天培地 Ｇ：良好 AM：なし Ｒ：強い黄みのオレンジ SP：なし SG：中程度、球状 イースト・麦芽寒天培地 Ｇ：良好 AM：中程度、白色 Ｒ：あさい黄みのブラウン SP：なし SG：豊富、球状 オートミール寒天培地 Ｇ：良好 AM：中程度、白色 Ｒ：うすい紫みのピンク SP：なし SG：普通、球状 ペプトン・イースト鉄寒天培地 Ｇ：良好 AM：なし Ｒ：さえた黄みの橙 SP：なし SG：少数、球状 カザミノ酸ツアペツク寒天培地 Ｇ：貧弱 AM：貧弱、白色 Ｒ：無色 SP：なし SG：なし ベネツト寒天培地 Ｇ：良好 AM：なし Ｒ：あさい赤みのオレンジ SP：なし SG：普通、球状 (c) 生理的性質 生育温度範囲：17〜45℃ ゼラチンの液化：陽性（グルコース・ペプ
トンゼラチン培地） デンプンの分解：陽性（スターチ寒天培
地） 脱脂牛乳の凝固：陰性 ペプトン化：陽性 メラニン様色素の生成 チロシン寒天培地：陰性 ペプトン・イースト鉄寒天培地：陰性 硝酸塩の還元：陽性 (d) 炭素源の同化性 プリドハム・ゴツドリーブの基礎培地に酵母
エキス0.01％及び各々の糖１％を添加して検討
した。

Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−グ
ルコース、Ｄ−フラクトース、シユクロース、
イノシトール、Ｌ−ラムノース、Ｄ−マンニト
ール、メリビオース、マルトース、トレハロー
ス、Ｄ−ガラストース、Ｄ−マンノース及び可
溶性デンプンをよく利用するが、グリセロー
ル、ラフイノース及びＤ−ソルビツトを利用し
ない。

(e) 細胞壁組成 細胞壁中のアミノ酸として、メソ−ジアミノ
ピメリン酸及びグリシンを含有する。糖として
は、リボース、マンノース、グルコース及びマ
デユロースが検出されたがアラビノース及びキ
シロースは検出されなかつた。このような細胞
壁はLechevalerらの分類（Int.J.System
Bacteriol.、vol.20、p435（1970））によれば
型に属し、全菌体中の糖はＢパターンに属す
る。

以上の性状からNo.937ZE−１株の属を「バージ
エイス・マニユアル・オブ・デターミネイテイ
ブ・バクテリオロジー」（第８版）で検索する
と、細胞壁型が型でＢタイプの糖パターンを示
す属は見当らない。一方、形態的特徴からは、球
状あるいは不定形の胞子のうを形成し、かつ遊走
胞子を有しない点でストレプトスポランジウム
（Streptosporangium）属及びアモルフオスポラ
ンジウム（Amorphosporangium）属の放線菌に
類似しており、また、気菌糸上に胞子の連鎖があ
りかつ胞子のうを有する点ではストレプトアロテ
イチユス（Streptoalloteichus）属にも類似して
いる。しかしながら、いずれの属とも細胞壁組成
が異なつているところから新属に分類される可能
性を否定できない。そこで、現時点では本菌株の
分類学上の位置づけが困難であるため、放線菌No.
937ZE−１菌とした。

このNo.937ZE−１菌は他の放線菌の場合にみら
れるようにその性状が変化しやすく、例えば紫外
線、放射線、高周波、化学薬品等を用いた変異処
理によつて容易に変異株を取得できるが、この変
異株であつても本発明の酵素阻害物質I5B1を産
生しうるものであれば本発明の酵素阻害物質
I5B1の取得に利用できることはいうまでもな
い。

No.937ZE−１菌などのI5B1生産菌を培養する培
地には通常の微生物用の液体培地を用いればよ
い。すなわち、I5B1生産菌が資化しうる炭素
源、窒素源及び無機塩類を含有し、さらに必要で
あれば有機栄養物を含有するものであればよい。
炭素源としては、例えばラクトース、グルコー
ス、マルトース、シユクロース及び可溶性デンプ
ン等の炭水化物などを用いることができる。窒素
源としては、例えば硫酸アンモニウム、塩化アン
モニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム
塩、硝酸ナトリウム等の硝酸塩、アミノ酸類、な
らびにペプトン、大豆粉等が用いられる。無機塩
類としては塩化ナトリウム、リン酸１カリ、リン
酸２ナトリウム等のリン酸塩及び硫酸マグネシウ
ム等が用いられ、有機栄養物としては、アミノ
酸、ビタミン及びこれらを含有するペプトン、酵
母エキス等が適宜用いられる。

培養条件も通常の条件でよく、PH５〜10程度、
温度15〜35℃程度で振盪培養あるいは通気撹拌培
養すればよい。

培養終了後は、培養物から本発明のI5B1を分
離取得する。I5B1は大部分が培養液中に蓄積
されるところから、必要によりまず菌体を除去し
てから分離操作を行なう。分離方法としては、強
塩基性陰イオン交換樹脂などを用いたイオン交
換、吸着、分配、ゲル過等のクロマトグラフイ
ー及びブタノール抽出等を適宜組合せて行なえば
よい。

例えば、菌体を除去した培養液を多孔性吸着
樹脂であるアンバーライトXAD−（ローム・
アンド・ハース社製）に流してI5B1を吸着さ
せ、水で洗浄した後、60％メタノール水で溶出す
る。活性画分を集めて減圧濃縮し、セフアデツク
スＧ−25（フアルマシア社製）を用いてゲル過
を行ない、水で溶出する。溶出液を凍結乾燥し
て、I5B1の粗製粉末を得る。さらに、アンバー
ライトXAD−を用いたクロマトグラフイーを
繰返すことによつて精製することができる。純粋
なI5B1はこの精製品の水溶液（PH7.0）をPH３〜
５程度の弱酸性にすることによつて白色結晶性粉
末として得ることができる。

以上述べた方法は一例であり、培地組成、培養
条件、I5B1の生産量等に応じ、さらに適切な方
法を工夫することができる。例えば、前述の分離
方法の一部を省略し、反復もしくは順序を変えて
行なうことは有効であり、また、他の分離方法、
例えばセルロースを用いたクロマトグラフイーを
組込むことも有効である。

本発明の酵素阻害物質I5B1はアンジオテンシ
ンＩ変換酵素に対する阻害活性が強く、血圧降下
剤等に有用である。

酵素阻害活性の測定方法を次に示す。

0.3M塩化ナトリウムを含む0.1Mトリス−塩酸
緩衝液PH8.0に溶解させた試料液0.125ml及び0.3M
の塩化ナトリウムを含む0.3Mトリス−塩酸緩衝
液PH8.0に溶解させた16.0mMp−ニトロベンゾイ
ルグリシルグリシルグリシン0.2mlを混合して、
37℃にて５分間加温する。これに0.3Mの塩化ナ
トリウムを含む0.1Mトリス−塩酸緩衝液PH8.0に
溶解したアンジオテンシンＩ変換酵素液0.1mlを
加えて37℃で反応させ、アンモニア水0.1mlを加
えて反応を停止させる。反応液の一定量を高速液
体クロマトグラフイーのカラムに導入し、生じた
ｐ−ニトロベンゾイルグリシン量（Ｉ_s）を求
め、ｐ−ニトロベンゾイルグリシンの標準品を用
いて得た検量線を利用して定量する。一方、試料
溶液のかわりに0.3Mの塩化ナトリウムを含む
0.1Mトリス−塩酸緩衝液PH8.0を用い、同様に処
理してｐ−ニトロベンゾイルグリシン量（Ｉ_s）
を求める。さらに、アンジオテンシンＩ変換酵素
液を加えずに同様の処理を行ない、最後に同酵素
液0.1mlを加えてｐ−ニトロベンゾイルグリシン
量（Ｉ_b）を求める。その結果、阻害率は Ｉ_ｃ−Ｉ_ｓ／Ｉ_ｃ−Ｉ_ｂ×100（％） を用いて算出する。

以下、実施例を示す。

実施例 グルコース１％、グリセロール１％、大豆粉１
％、酵母エキス0.25％、肉エキス0.1％、硫酸ア
ンモニウム0.5％、塩化ナトリウム0.4％、炭酸カ
ルシウム0.4％、リン酸二カリウム0.05％及び硫
酸マグネシウム0.05％からなる培地をPH7.2に調
整してから500ml容の三角フラスコに50mlを分注
し、120℃で20分間滅菌した。この培地に放線菌
No.937ZE−１（微工研菌寄第7132号）を１白金耳
接種し、28℃で７日間210rpmにて振盪培養して
種培養液を得た。

乳糖３％、大豆粉1.5％、酵母エキス0.25％、
肉エキス0.1％、硫酸アンモニウム0.5％、塩化ナ
トリウム0.4％、炭酸カルシウム0.4％、リン酸二
カリウム0.05％及び硫酸マグネシウム0.05％から
なるPH7.2の培地３を５容のジヤーフアーメ
ンターに入れ、120℃で30分間滅菌した。この培
地に前述の種培養液を加え、毎分３の無菌空気
を送りながら500rpmで撹拌しつつ28℃で112時間
培養を行なつた。

培養液に３％の過助剤を加えて菌体を別
し、2.5の培養上清液を得た。この培養上清液
1.3μのアンジオテンシン変換酵素阻害率は
50％であつた。この倍養上清をアンバーライト
XAD−500mlを充填したカラムに通液し、さら
に水洗を行なつてから、60％メタノールを流して
I5B1を溶出させた。約500mlのこの溶出液を減圧
濃縮後セフアデツクスＧ−25を充填した３cm×
110cmのカラムに流してゲル過を行なつた。
I5B1活性画分を集めて凍結乾燥し、粗製粉末を
得た。

この粗製粉末を少量の水で溶解し、アンバーラ
イトXAD−のカラムに注ぎ、水で溶出した。
活性画分を集めて、さらにこのアンバーライト
XAD−のカラムクロマトグラフイーを繰返し
て精製し、凍結乾燥して黄色粉末を得た。この粉
末を少量の水で溶解し、PH５として４℃に放置
し、I5B1の白色結晶粉末0.23mgを得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の酵素阻害物質I5B1の紫外線
吸収スペクトルであり、第２図は赤外線吸収スペ
クトルを表わしている。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 下記の理化学的性質を有するアンジオテンシ
   ンＩ変換酵素阻害物質I5B1 (1) 構成物質 6N塩酸中110℃で20時間加水分解した加水分
   解物中にはフエニルアラニン及びアミノ酸分析
   計における面積比が大略その２倍のニンヒドリ
   ン陽性物質が含まれている。 (2) 旋光度 〔α〕_D＝−110゜（Ｃ＝0.075、0.01NNaOH） (3) 融 点 300℃まで融点を示さない。 (4) 溶解性 0.1N水酸化ナトリウム水溶液に可溶、水、
   メタノールに難溶、エーテル、アセトン、ｎ−
   ヘキサンに不溶 (5) 呈色反応 ヨウ素反応に陽性、ニンヒドリン、α−ナフ
   トール硫酸反応に陰性。