JPS5835677B2 - 新菌種ストレプトミセス・カツラハマヌス - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新菌種ストレプトミセス・カツラハマヌスに
関する。

クラバラン酸は、式（Ｉ） で示される化合物であって、ごく最近コールらによって
、ストレプトミセス・クラバリゲルス（Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ ｃｌａｖｕｌ ｉｇｅｒｕｓ）の培養物か
ら単離され（コールら；公開特許公報特開昭５０−１４
２７８９およびジャーナル・オブ・アンティバイオティ
ックス、第２９巻、６６８頁、１９７６年に記載）、β
−ラクタマーゼ阻害物質として注目されている化合物で
ある。

本物質は、それ自身、ダラム陽性および陰性菌に対し、
抗菌活性を有し、感染症の治療に用いられうる他、その
β−ラクタマーゼ阻害作用を利用して、ペニシリンやセ
ファロスポリン類と併用することによって、ペニシリン
やセファロスポリン類の抗菌活性を増大させることがで
きる。

また、本化合物は、新しい半合成β−ラクタム化合物の
出発原料となりうろことも予想され、極めて重要な化合
物である。

しかるに、その生産は、ストレプトミセス・クラバリゲ
ルスの１菌株ＮＲＲＬ３５８５について知られている昏
こすぎす、その生成量も、工業的に必ずしも十分なもの
ではない。

本発明者らは、新規なβ−ラクタム抗生物質を生産する
微生物を得る目的で鋭意スクリーニングを続けている過
程で、高知市の土壌より分離された１菌株Ｔ−２７２株
が、極めて著量のβ−ラクタム化合物を生産することを
見出し、そのβ−ラクタム化合物を結晶として単離し、
その理化学的性状を調べたところ、本化合物は、クラバ
ラン酸（Ｉ）と全く一致することが明らかになった。

一方、生産菌Ｔ −２７２株の菌学的性状について種々
検討を加えたところ、本菌はストレプトミセス属に属す
るが、公知のいずれの種にも属さない新菌種に属する微
生物であることを見出し、この新菌種をストレプトミセ
ス・カツラハマヌスと命名した。

これらの知見に基づきさらに研究した結果、本発明を完
敗するに至った。

本発明は、気菌糸が灰青色ないし灰緑色（イースト麦芽
寒天またはスターチ無機塩寒天上）で、胞子鎖がオープ
ンスパイラル状で胞子表面が平滑であり、ゼラチンは液
化するが硝酸塩を還元せず、メラニン様色素を産生せず
、プリドハム・ゴツトリーフ寒天培地上でＤ−マンニト
ール、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクト
ースおよびラフィノースのいずれをも単一炭素源として
利用せず、かつクラバラン酸生産能を有する新菌種スト
レプトミセス・カツラハマヌスである。

以下に、Ｔ−２７２株の分類学的諸性質を夕１配し、こ
の株がストレプトミセス属の新菌種に属するものである
ことを明らかにする。

Ｔ−２７２株の菌学的性状 ａ）形態学的特徴 気菌糸は比較的長く伸長し、単軸分岐する。

その先端の形態は一般にオープンスパイラル状であるが
、培地によっては曲状またはループ状も含まれる場合が
ある。

胞子鎖は１０個以上の胞子よりなり、その形は、楕円体
ないし短円筒状で、大きさは０．６〜０．８Ｘ０．９〜
１．２μ、表面構造は平滑状である。

鞭毛胞子、胞子のうの形成は認められない。

ｂ）各種培地における生育状態 Ｔ −２７２株の各種培地における生育状態を表１に示
す。

Ｃ）生理的性質 １）生育温度 至適温度は２５〜２８℃で、３７℃では生育しない。

２）生育ｐＨ ｐＨ６〜１０で生育、至適ｐＨは８〜９゜３）ゼラチン
の液化：陽性 ４）デンプンの加水分解：陽性（中程度）５）脱脂牛乳
の凝固、ペプトン化：凝固せず、ペプトン化する。

６）硝酸塩の還元：陰性 ７）メラニン様色素の生成：陰性 ８）セルロースの加水分解：陰性 ｄ）炭素源の利用性 プリドハム・ゴドリーブ寒天培地で調べた結果を表２に
示す。

ｅ）細胞壁構Ｅｉｆｆｉｌｆｆ分：Ｌ、Ｌ−ジアミノピ
メリン酸を含む。

以上の性状からＴ−２７２株は、まずストレプトミセス
属に属していることは明らかである。

ワックスマン著、ザ・アクチノミセテス（ＴｈｅＡｃ
ｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ ）第２巻（１９６１年）、シ
ャーリングおよびゴツトリーブのｌ５Ｐ（インターナシ
ョナル・ストレプトミセス・プロジェクト（Ｉｎｔｅｒ
ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｐｒｏ
ｊｅｃｔ ） ）報告（インターナショナル・ジャーナ
ル・オブ・システマテインク・バクテリオロジー（Ｉｎ
ｔｅｒ−ｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓ
ｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ）、
第１８巻、６９頁、２７９頁（１９６８）、同第１９巻
、３９１頁（１９６９）、同第２２巻、２６５頁（１９
７２））およびバーシーズ・マニュアル・オブ・デター
ミネイティブ・バクテリオロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ
Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｅｔｅｒ而ｎａ 面 ｉ ｖ
ｅＢａｃｔｅｒｉｏｌ ｏｇｙ ）第７版（１９６１）
、第８版（１９７４）およびその後報告された放線菌の
新種発表文献の中から検索すると、Ｔ−２７２株のよう
に、気菌糸が灰青色ないし灰緑色で、胞子鎖がらせん状
、胞子表面が平滑である菌種は、極めて少ないが、Ｔ−
２７２株とやや類似するものとしては、ストレプトミセ
ス・アマフサエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａ
ｍａｋｕｓａｅｎｓｉｓ Ｎａｇａｔｓｕ ｅｔａｌ）
（ジャーナル・オブ・アンティビオティックス（Ｊｏｕ
ｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ）シリーズ
Ａ・第１６巻、２０７頁（１９６３）およびストレプト
ミセス・トサエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔ
ｏｓａｅｎｓｉｓＫｏｕｎｅ ｅｔ ａｌ ） （特
許公報特公昭４９−１８７１）があげられる。

Ｔ−２７２株の性状をこれら２株の原記載と比較すると
ともに、さらにストレプトミセス・アマフサエンシス
Ｉ Ｓ Ｐ ５２１９（ＩＦＯ１２８３５）およびスト
レプトミセス・トサエンシスＦｅｒｍＰ−６０１とＴ−
２７２株とを同一条件下で培養して性質を比較した。

Ｔ−２７２株とこれら２菌種との主な相違点を表３にま
とめた。

これによると、ストレプトミセス・アマフサエンシスと
は、気菌糸の形態が明らかに異なり、さらに、本菌がメ
ラニン様色素を形成するのに対し、Ｔ−２７２株は、メ
ラニン様色素を形成しない点から明確に区別された。

また、ストレプトミセストサエンシスとも、気菌糸の形
態が明らかに異なること、および炭素源の利用性が全く
異なる点さらに、硝酸塩の還元性の点でも異なり明らか
に別種の菌株と考えられる。

さらに、従来、クラバラン酸を生産することが知られて
いるストレプトミセス・クラバリゲルスＮＲＲＬ３５８
５（ヒゲンス・カスドナー、インターナショナル・ジャ
ーナル・オブ・システマテイツク・バクテリオロジー、
第２１巻 ３２６頁（１９７１））とも比較したが、Ｎ
ＲＲＬ３５８５株の場合には気菌糸の形態に特徴があり
、直・曲状で、短い種棒状の数個の胞子よりなる側枝が
形成される。

これに対して、Ｔ−２７２株は、オープンスパイラル状
であり、したがって全く異なる種に属することは明らか
である。

以上の事実から、Ｔ−２７２株はストレプトミセス属の
既知菌種のいずれにも属さず、新菌種と認められ、本菌
が分離された土壌の採取地にちなんで、ストレプトミセ
ス・カツラハマヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｋａ
ｔｓｕｒａｈａｍａｎｕｓ）と命名された。

Ｔ−２７２株は、財団法人発酵研究所および工業技術院
微生物工業技述研究所に、ＩＦＯ１３７１６、ＦＥＲＭ
−ＰＡ３９４４としてそれぞれ寄託されている。

ストレプトミセス・カツラハマヌスの性状は、上記の通
りであるが、クラバラン酸の生産においては、ストレプ
トミセス・カツラハマヌスに属する株はすべて使用する
ことができる。

また、放線菌とりわけストレプトミセス属に属する微生
物の諸性質は一定なものではなく、自然的にあるいは人
工的に容易に変異することは周知のことであり、本菌種
の場合もその例外ではなく、たとえば紫外線、エックス
線、放射線照射、薬品（例、亜硝酸ナトリウム、Ｎ−メ
チル−に−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンなど）処理
などの人工的変異手段で容易に変異しうるものであり、
このような変異株であっても、クラバラン酸生産能を有
するものはすべて使用することができる。

本菌の培養に際しては、培地中に炭素源としてたとえば
グルコース、シュークロース、マルトース、スターチ、
グリセリン、デキストリン、水あめ、糖蜜、油脂類（例
、大豆油、オリーブ油など）、アルコール類（例、エタ
ノール）、有機酸類（例、コハク酸、リンゴ酸など）な
ど菌が資化しうるものが適宜用いられる。

窒素源としては、たとえば大豆粉、コーン・ステイープ
・リカー、綿実粉、肉エキス、ペプトン、尿素、乾燥酵
母、酵母エキス、アンモニウム塩類（例、Ｍアンモニウ
ム、塩化アンモニウムなど）、硝酸塩類（例、硝酸ソー
ダ、硝酸アンモニウムなど）などが有利に使用される。

無機塩としては、たとえば炭酸カルシウム、塩化ナトリ
ウム、塩化カリウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウ
ムなどが挙げられ、さらに、菌の発育を助はクラバラン
酸の生産を促進する有機または無機の化合物（例、ビタ
ミン類、核酸塩基類、アミノ酸類など）などを適宜添加
してもよい。

培養は、液状でも固状でもよく、また液状の場合、静置
あるいは振盪培養のいずれでもよいが、好気的条件下に
深部培養するのが一般に有利である。

又培養温度はおよそ１８°〜３５℃の範囲が望ましく、
培地のｐＨは約５〜１０、好ましくは約７〜９の範囲で
、およそ２４〜２４０時間培養するのが好ましい。

生成したクラバラン酸の大部分は培養ｐ液中に存在する
ので、通常培養物を遠心分離あるいは沢過して菌体を除
去した液体部分からこれを採取するのがよい。

クラバラン酸の採取には、微生物の生産する代謝産物を
採取するのに通常用いられる手段が適宜に利用されうる
。

すなわち、イオン交換樹脂、活性炭、セルロース、シリ
カゲル、非イオン性ポーラスポリマーなどを用いるクロ
マトグラフィー、ゲル濾過法、溶媒抽出法などを組合せ
ることにより、有利に所期の目的を達することができる
。

なお、クラバラン酸の検出、定量には、電気泳動、薄層
クロマトグラフィーまたはペーパークロマトグラフィー
で分別後、被験菌に対する抗菌力を測定する方法、また
はβ−ラクタマーゼ阻害活性を調べる方法（コールら、
特開昭５０１４２７８９）が用いられる。

またクラバラン酸の同定には元素分析、核磁気共鳴スペ
クトル、赤外線吸収スペクトル、紫外部吸収スペクトル
、Ｆ紙電気泳動および薄層クロマトグラフィーなどが用
いられる。

クラバラン酸はかかる操作を組合せることにより遊離あ
るいはその塩、たとえばナトリウム、カリウム、リチウ
ムなどのアルカリ金属塩、カルシウム、マグネシウムな
どのアルカリ土類金属塩として採取される。

新菌種ストレプトミセス・カツラハマヌスを用いること
により、極めて著量のクラバラン酸を生成蓄積せしめる
ことができるので、工業上有利な方法である。

以下に実施例をもってさらに詳細に本発明の詳細な説明
する。

実施例 １ グルコース３％、コーンスターチ３％、綿実粉１％、大
豆粉０．５％、酵母エキス０．５％、ポリペプトン０．
５％、コーン・ステイープ・リカー０．５％および炭酸
カルシウム１％からなる種培地３０ｍ１を２００ｍ１容
三角フラスコに分注、滅菌後、これにストレプトミセス
・カツラハマヌスＴ−２７２（ＩＦＯ１３７１６，ＦＥ
ＲＭ−ＰＡ３９４４）を−白金耳づつ接種し、回転式振
盪培養機上で２８℃３日間培養した。

この種培養物を、２００ｍ１容三角フラスコに、綿実粉
（フロフロ（ＴｒａｄｅｒｓＯｉｌ Ｍｉｌｌ Ｃｏ、
米国製））２％、大豆粉２％および表４に示す種類
および量の炭素源を添加した組成の培地（１））（６，
５） ３ ｏｍｌを入れ、滅菌、冷却した発酵培地にＬ
５ｍｌ宛接種Ｃ１回転式振盪培養機上で２８℃で培養し
、５日目に培養物を取り出し、遠心分離にて菌体を除い
た上澄液について、クラバラン酸の生成量を調べ、表４
に示す結果を得た。

実施例 ２ グルコース３％、コーン・スターチ３％、綿実粉１％、
大豆粉０．５％、酵母エキス０．５％、ポリペプトン０
．５％、コーン・ステイープ・リカー０．５％および炭
酸カルシウム１％からなる種培地５００７７２ｇを２１
容坂ロフラスコに分注し、滅菌後これにストレプトミセ
ス・カツラハマヌス Ｔ２７２（ＩＦＯ１３７１６，Ｆ
ＥＲＭ−ＰＡ３９４４）の１斜面培養を接種し、往復式
振盪培養機上で２８℃、３日間培養した。

別にステンレス製５０１３容発酵槽に、グルコース３％
、コーンスターチ３％、綿実粉１．５％および大豆粉１
．５％からなる培地（ｐＨ６，５） ３ｏ１！を仕込み
、常法により滅菌冷却した。

これに上記種培養液を無菌的に接種し、２８℃で通気攪
拌培養（通気毎分３０１、攪拌毎分２８０回転）した。

９０時間培養後、培養物をとり出し、済過によって菌体
を除き、培養済液２５Ａ’を得た。

このろ液中には、１１５０μｇ／ｍｌのクラバラン酸が
含まれていた。

このろ液を強塩基性アニオン交換樹脂アンバーライトＩ
ＲＡ−４０２（ローム アンド ハース社、米国）ＣＩ
型６１を充填したカラムに通液しクラバラン酸を吸着さ
せる。

吸着後１５１！の水で水洗し０．５ Ｍ食塩水で溶出す
る。

クラバラン酸を含む区分１５１を２１の活性炭カラムに
通液する。

通液後５１１の水で水洗した後７％ブタノール水で溶出
し、クラバラン酸を含む区分５Ａ？（水洗液及び溶出液
）を集め濃縮する。

濃縮液を３１のセルロースカラムに通し、７５％プロパ
ツール水で展開し、クラバラン酸区分を濃縮する。

次いでこの濃縮液を１１１のセファデックスＧ−１５（
ファルマシア社製）でゲル済過精製した後、活性炭５０
０ｍ１に吸着させ１０％メタノール水で溶出する。

クラバラン酸を含む区分を集め苛性ソーダ溶液でｐＨ７
，０に中和した後、濃縮し、濃縮液にエタノールを滴下
して冷保すると結晶が析出する。

これを炉取乾燥し２．３ｇの結晶を得た。

この結晶母液より同様にして更に１．１ｇの第二結晶を
得た。

別にストレプトミセス・クラバリゲルスＮＲＲＬ−３５
８５を用い、コールらの方法に従って調整したクラバラ
ン酸ナトリウムとストレプトミセス・カツラハマヌスＴ
−２７２株より上述の様にして得られた結晶とを比較し
たところ、それらの抗菌スペクトル、元素分析値、赤外
線吸収スペクトル（ＫＢｒ ディスク、第１図参照）、
核磁気共鳴スペクトル（Ｄ２０．６０ＭＨｚ、第２図参
照）、薄層クロマトグラフィーおよび電気泳動的挙動等
全ての理化学的性状が一致した。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ストレプトミセス・カツラハマヌスＴ−２７
２の培養物から得られたクラバラン酸ナトリウムの赤外
線吸収スペクトル（ＫＢｒ法）を、第２図は、ストレプ
トミセス、カツラハマヌスＴ２７２の培養物から得られ
たクラバラン酸ナトリウムの核磁気共鳴スペクトル（Ｄ
２０中、６０ＭＨｚ）を、それぞれ示す。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 気菌糸が灰青色ないし灰緑色（イースト麦芽寒天ま
   たはスターチ無機塩寒天上）で、胞子鎖がオープンスパ
   イラル状で胞子表面が平滑であり、ゼラチンは液化する
   力＝’６Ｍ塩を還元せず、メラニン様色素を産生せず、
   プリドハム・ゴツトリープ寒天培地上でＤ−マンニトー
   ル、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトー
   スおよびラフィノースのいずれをも単一炭素源として利
   用せず、かつクラバラン酸生産能を有する新菌種ストレ
   プトミセス・カツラハマヌス。