JPS6247519B2

JPS6247519B2 -

Info

Publication number: JPS6247519B2
Application number: JP11204478A
Authority: JP
Inventors: Yukio Fujisawa; Masaru Suzuki
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1978-09-11
Filing date: 1978-09-11
Publication date: 1987-10-08
Also published as: JPS5539735A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、セフアロスポリンＣ（以下、
「CPC」と略称する。）の３位の側鎖であるアセ
チル基を放線菌の培養物あるいはその処理物のエ
ステラーゼ様活性を利用して離脱させ、有用なデ
アセチルセフアロスポリンＣ（以下、「DCPC」
と略称する。）を製造する方法に関するものであ
る。

DCPCはバイオケミカル・ジヤーナル
（Biochem.J.）75巻 216〜233頁（1960年）；同
81巻 591〜596頁（1961年）およびアプライド・
マイクロビオロジー（Appl.Microbiol.）16巻
1011〜1014頁（1968年）などに報告されているよ
うにCPCの化学的分解物として、またCPCから
果実やリゾビウム属菌やアブシデイア属菌などの
微生物のアセチルエステラーゼによる酵素的分解
によつても得られることが知られている。

DCPCは下記の式〔〕に示す構造を有し、抗生物質であると同時に新規
な合成セフアロスポリンの製造上きわめて重要な
中間体として用いることもできる。

本発明者らは微生物変換法によりCPCから高
収率で容易にDCPCを製造する方法について検討
を重ねたところ、ある種の放線菌の培養物中に
CPCの３位の側鎖のアセチル基を特異的に離脱
してDCPCを生成するエステラーゼ様酵素が存在
するという新知見を見出し、これに基づいてさら
に研究した結果本発明を完成するに至つた。

本発明は、セフアロスポリンＣに、CPCを
DCPCに変換する能力を有するストレプトミセ
ス・ビリドクロモゲネス、ストレプトミセス・オ
リバセウス、ストレプトミセス・グリセオラスあ
るいはストレプトミセス・フラジエの培養物また
はその処理物を接触せしめることを特徴とするデ
アセチルセフアロスポリンＣの製造法である。

本発明においては、ストレプトミセス・ビリド
クロモゲネス（Streptomyces
viridchromogenes）、ストレプトミセス・オリバ
セウス（Streptomyces olivaceus）、ストレプト
ミセス・グリセオラス（Streptomyces
griseolus）もしくはストレプトミセス・フラジ
エ（Streptomyces fradiae）に属しCPCをDCPC
に変換する能力を有する微生物であればいずれを
も用いることができる。

本発明方法において用いられる微生物の具体例
としては、たとえばストレプトミセス・ビリドク
ロモゲネスIFO 3113、ストレプトミセス・オリ
バセウスIFO 3119、ストレプトミセス・オリバ
セウスIFO 3409、ストレプトミセス・グリセオ
ラスIFO 3403、ストレプトミセス・グリセオラ
スIFO 3415、ストレプトミセス・グリセオラス
IFO 3416、ストレプトミセス・グリセオラス
IFO 3719、ストレプトミセス・フラジエIFO
12178などが挙げられる。

上記のIFO番号の付された微生物は、いずれも
財団法人発酵研究所のリスト・オブ・カルチヤー
ズ（List of Cultures）1972年版第５版に収載さ
れ、発酵研究所から入手可能な微生物である。

一般に、ストレプトミセス属菌は、その性状が
変化しやすく、たとえばＸ線照射、紫外線照射、
放射線照射、人工変異剤（例、ニトロソグアニジ
ン、エチレンイミンなど）を用いる人工変異手段
などで容易に変異しうる。このような変異株であ
つても、ストレプトミセス・ビリドクロモゲネ
ス、ストレプトミセス・オリバセウス、ストレプ
トミセス・グリセオラスもしくはストレプトミセ
ス・フラジエに属しCPCをDCPCに変換する能力
を有する変異株は本発明方法に使用し得る。

本発明において、培養物とは、放線菌を生育可
能な培地で培養した後の全培養液そのものをい
う。また、処理物とは上記微生物の培養物に例え
ば磨砕、超音波処理、遠心分離、ろ過、無細胞抽
出、溶媒沈殿、塩析、吸着クロマトグラフイー、
イオン交換クロマトグラフイー、ゲルろ過、電気
泳動、等電点分画などの精製手段を施すことによ
り前記のごときエステラーゼ様活性を有するもの
をいう。

上記放線菌の培養物またはその処理物を使用す
る場合、その培養は液状培地でも固状培地でも行
いうるが、通常は液状の培地を使用して行うのが
工業的に便利である。液状の培地を用いるときは
静置培養法によつてもよいが、通常振盪または通
気撹拌などの深部培養法がより有利に用いられ
る。培地は培養手段に応じて適当に選択される
が、いずれにおいても同化できる炭素源、消化で
きる窒素源およびその他菌の生育に必要な諸成分
が含有される。炭素源としては、例えばデキスト
リン、澱粉、庶糖、ブドウ糖、グリセリン、ｎ―
パラフイン、有機酸（例、酢酸）、アルコール類
（例、エタノール）、動植物油（例、大豆油）な
ど、窒素源として例えばポリペプトン、酵母エキ
ス、肉エキス、生大豆粉、脱脂大豆粉、コーン・
スチープ・リカー、綿実粉、麦芽エキス、廃糖蜜
などが用いられる。その他必要に応じて無機塩類
例えばカルシウム塩類（例、塩化カルシウム）、
マグネシウム塩類（例、硫酸マグネシウム）、ナ
トリウム塩類（例、塩化ナトリウム）、カリウム
塩類（例、塩化カリウム）、リン酸塩類（例、リ
ン酸二カリウム）などやビタミン類（例、ビタミ
ンB₁）、その他の添加物（例、界面活性剤）を組
合せて使用できる。また、培養の条件は当該エス
テラーゼ様活性が最大になるように決定されるの
が望ましい。培養の条件は菌株、培地組成その他
の条件に応じて変動があるが、多くの場合、生育
に可能な温度であつて、通常約24〜40℃付近がよ
く、PHは約４〜10、培養時間は約30〜120時間が
適当である。

本発明方法であるCPCのアセチル基離脱反応
は、原料物質CPCと前記の放線菌の培養物また
はその処理物とを接触させて行われるが、反応液
中のCPC濃度はおよそ0.1〜100mg／ml程度が適当
である。なお目的物質DCPCを少量でも純粋な状
態で採取したい場合は原料のCPCの反応液への
添加は比較的低濃度が好ましく、多少原料が残存
していても多量の目的物質を採取したい場合は原
料のCPCの反応液への添加は比較的高濃度で使
用するのが有利である。本発明方法の反応温度は
約20〜50℃、PH約６〜8.5が適当であるが、特に
温度約30〜40℃、PH約７〜８が好適である。また
反応は静止下でも振盪条件下でも良いが、振盪す
るのが一般に良好である。反応は通常24時間以内
に終了するが、条件を最良に選べば約１〜10時間
程度で終了する。

本発明方法においては、微生物の培養と同時に
CPCからDCPCへの変換を行なわしめてもよい。

すなわち、本発明に使用する微生物を培養する
際に、培養の途中に適宜CPCを添加しながら培
養をつづけることにより効率よくDCPCを生成せ
しめることも可能である。

反応終了後、生成物であるDCPCを分別採取す
るには、弱酸性有機化合物の一般的な分別採取法
が準用できる。すなわちイオン交換樹脂（例、ア
ンバーライトIRA―900）、活性炭、セルロース、
シリカゲル、XAD（ローム・アンド・ハース社
製）などを用いるクロマトグラフイーあるいはゲ
ルろ過法などを組合せることにより有利にDCPC
を採取することができる。なお、反応液中の
CPCおよびDCPCの定量は、一定量の反応液を薄
層クロマトグラフイーにかけCPCとDCPCとを分
離したのち、それらの相当画分を水で抽出し、ネ
イチヤー・ニユー・ビオロジー（Nature New
Biol.）第246巻 154〜155頁（1973年）に記載さ
れているセフアロスポリナーゼを用いる方法に準
じて行われる。またDCPCの同定には元素分析、
核磁気共鳴スペクトル、ろ紙電気泳動、薄層クロ
マトグラフイーなどが用いられる。

本発明は、高濃度のCPCを非常に良好な収率
でDCPCに転換させるもので、純然たる化学的な
手法でDCPCを得る場合の収量とは比較にならな
い程の有利性がある。また、本発明によれば標準
的な発酵技術を用いて大規模に微生物を培養して
十分な量のCPCエステラーゼ含有物を容易に得
ることができ、実際上極めて有利である。

以下に実施例をもつてさらに詳細に本発明の内
容を説明するが、これによつて本発明が限定され
るものではない。なお、以下においてパーセント
（％）は、とくにことわりのないかぎり、重量／
容量パーセント（Ｗ／Ｖ％）を表わす。

実施例１ストレプトミセス・フラジエIFO 12178をグリ
コース３％、コーン・スチープ・リカー0.5％、
脱脂大豆粉１％、CaCO₃0.3％、MgSO₄・
7H₂O0.05％、NaCl0.5％、PH7.0の培地30を含
む50容タンクを用いて28℃で48時間培養し、こ
れにCPCを終末濃度10mg／mlになるように加
え、NaOHでPH8.0に調整しながら37℃で24時
間、接触反応させると、CPCの３位側鎖のアセ
チル基は定量的に加水分解される。反応液30を
HClでPH5.0に補正したのち、活性炭カラムに
CPCを吸着させた。カラムを十分水洗したのち
0.01NNaOHを含む５％ｎ―ブタノール水溶液で
溶出し、DCPCの画分を得る。次いでこの画分を
濃縮しNaOHでPH7.0に中和後、50％（Ｖ／Ｖ）
になるようにエタノールを添加したところ179.5
ｇのDCPCナトリウム塩の粗結晶が得られた。

その物理化学的性状を以下に示す。

IR（KBr）cm^-1、1745cm^-1、（β―ラクタ
ム）；UV λ^Ｈ２Ｏ _ｎａｘnm（Ｅ^１cm_１％）、261（196
）；
〔α〕^２０ _Ｄ、＋125゜（ｃ＝0.5、H₂O）実施例２ストレプトミセス・ビリドクロモゲネスIFO
3113を実施例１と同様の培地を用いて28℃で72時
間培養し、これにCPCを終末濃度10mg／mlにな
るように加え、NaOHでPH8.0に調整しながら反
応させる。反応液を実施例１と同様の操作を行な
うと、119.3ｇのDCPCナトリウム塩の粗結晶が
得られた。

その物理化学的性状を以下に示す。

IR（KBr）cm^-1、1745cm^-1、（β―ラクタ
ム）；UV λ^Ｈ２Ｏ _ｎａｘnm（Ｅ^１cm_１％）、261（196
）；
〔α〕^２０ _Ｄ、＋125゜（ｃ＝0.5、H₂O）実施例３ストレプトミセス・フラジエIFO 12178を実施
例１と同様の培地30を含む50容タンクに接種
し、28℃、48時間培養後、得られた培養液を遠心
分離して集菌し、菌体を0.05Mトリスー塩酸緩衝
液（PH8.0）で洗浄したのち１／６容の同緩衝液
に懸濁させる。これにCPCを終末濃度100mg／ml
になるように約500ｇ添加し、NaOHでPH8.0に調
整しながら37℃で８時間反応させる。次いで、反
応液をろ過して得られたろ液をHClでPH5.0に修
正したのち活性炭カラムにDCPCを吸着させる。
カラムを十分水洗したのち0.01N NaOHを含む５
％ｎ―ブタノール水溶液で溶出しDCPCの画分を
得る。この画分を濃縮しNaOHでPH7.0に中和
後、50％（Ｖ／Ｖ）になるようにエタノールを添
加したところ255ｇのDCPCナトリウム塩の粗結
晶が得られた。

実施例４ストレプトミセス・ビリドクロモゲネスIFO
3113を実施例１と同様の培地30を含む50容タ
ンクに接種し、28℃、72時間培養した。実施例３
と同様の方法によつて、菌体懸濁液を調製し約
500ｇのCPCを添加して反応させたところ、198.9
ｇのDCPCナトリウム塩の粗結晶が得られた。

実施例５ストレプトミセス・フラジエIFO 12178を実施
例３と同様の培地で培養し実施例３と同様の操作
を行なつて得られた菌体を0.05Mトリスー塩酸緩
衝液で洗浄したのち、培養液の１／10容の同緩衝
液に懸濁させ超音波により細胞を破砕する。破砕
液を遠心分離して得られた上清を無細胞抽出液と
した。次に、抽出液65mlに0.5Mの上記緩衝液
35mlとCPC10ｇを加え、NaOHでPH8.0に調整し
ながら37℃で10〜12時間反応させる。反応液か
ら、実施例１と同様の方法でDCPCナトリウム塩
の粗結晶5.98ｇが得られた。

実施例６ストレプトミセス・ビリドクロモゲネスIFO
3113を実施例４と同様の方法で培養し実施例３と
同様の操作を行なつて得られた菌体を実施例５と
同様に処理して無細胞抽出液を得る。実施例５と
同様の方法で抽出液にCPCを加え反応させ、実
施例１の方法で精製したところ、DCPCナトリウ
ム塩の粗結晶が3.98ｇ得られた。

実施例７ストレプトミセス・オリバセウスIFO 3409を
実施例１と同様の方法で培養し、実施例１と同様
の方法で培養液にCPCを加え反応させた。反応
液から、実施例１と同様の方法でDCPCナトリウ
ム塩105.5ｇの粗結晶が得られた。

その物理化学的性状を以下に示す。

IR（KBr）cm^-1、1745cm^-1、（β―ラクタ
ム）；UV λ^Ｈ２Ｏ _ｎａｘnm（Ｅ^１cm_１％）、261（196
）；
〔α〕^２０ _Ｄ、＋125゜（ｃ＝0.5、H₂O）実施例８ストレプトミセス・オリバセウスIFO 3409を
実施例１と同様の方法で培養し、実施例３と同様
の方法によつて、菌体懸濁液に約500ｇのCPCを
添加、反応させたところ、160.5ｇのDCPCナト
リウム塩の粗結晶が得られた。

実施例９ストレプトミセス・オリバセウスIFO 3409を
実施例１と同様の方法で培養し、実施例３と同様
の操作を行なつて得られた菌体を実施例５と同様
に処理して無細胞抽出液を得る。実施例５と同様
の方法で抽出液にCPCを加え反応させ、実施例
１の方法で精製したところ、DCPCナトリウム塩
の粗結晶が3.55ｇ得られた。

実施例 10 ストレプトミセス・グリセオラスIFO 3403を
実施例２と同様の方法で培養し、実施例１と同様
の方法で培養液にCPCを加え反応させた。反応
液から、実施例１と同様の方法でDCPCナトリウ
ム塩100.5ｇの粗結晶が得られた。

その物理化学的性状を以下に示す。

IR（KBr）cm^-1、1745cm^-1、（β―ラクタ
ム）；UV λ^Ｈ２Ｏ _ｎａｘnm（Ｅ^１cm_１％）、261（196
）；
〔α〕^２０ _Ｄ、＋125゜（ｃ＝0.5、H₂O）実施例 11 ストレプトミセス・グリセオラスIFO 3403を
実施例２と同様の方法で培養し、実施例３と同様
の方法で集菌し、実施例３と同様の方法によつ
て、菌体懸濁液に約500ｇのCPCを添加、反応さ
せたところ、155.3ｇのDCPCナトリウム塩の粗
結晶が得られた。

実施例 12 ストレプトミセス・グリセオラスIFO 3403を
実施例２と同様の方法で培養し、実施例３と同様
の操作を行なつて得られた菌体を実施例５と同様
に処理して無細胞抽出液を得る。実施例５と同様
の方法で抽出液にCPCを加え反応させ、実施例
１の方法で精製したところ、DCPCナトリウム塩
の粗結晶が3.31ｇ得られた。

Claims

【特許請求の範囲】

１セフアロスポリンＣに、セフアロスポリンＣ
をデアセチルセフアロスポリンＣに変換する能力
を有するストレプトミセス・ビリドクロモゲネ
ス、ストレプトミセス・オリバセウス、ストレプ
トミセス・グリセオラスあるいはストレプトミセ
ス・フラジエの培養物またはその処理物を接触せ
しめることを特徴とするデアセチルセフアロスポ
リンＣの製造法。