JP6758499B2 - カイスティア属微生物を用いたｄ−プシコースの製造方法 - Google Patents
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Description
本出願は、カイスティア属微生物を用いてＤ−プシコースを製造する方法に関する。
Ｄ−プシコース（D-psicose、以下「プシコース」と記載する）は、自然界に極少量存在する希少糖（rare sugar）として知られている単糖類である。砂糖の約７０％の甘みを有しながらも、ほぼゼロカロリーに近く、血糖値の抑制及び脂肪合成の抑制などの機能性により新たな食品原料として多くの関心を受けている。
このような特徴により、プシコースは、砂糖を代替しうる甘味料として様々な食品への使用が考慮されているが、自然界に極少量存在するため、プシコースを効率的に生産しうる方法の必要性が高まっている。
従来知られているプシコースの生産方法は、モリブデン酸イオンの触媒作用を用いたり（非特許文献１）、エタノールとトリエチルアミン（triethylamine）とを一緒に加熱してＤ−フルクトースからプシコースを生産する化学的方法（非特許文献２）とＤ−プシコース３−エピマー化酵素を生産する微生物を用いて、Ｄ−フルクトースからプシコースを生産する生物学的方法（特許文献１）がある。化学的方法によるプシコースの生産は副産物が多く生成されて、複雑な精製過程が必要となり、生物学的な方法も熱安定性が高くなくて生産コストが高いという問題があるところ、Ｄ−フルクトースからプシコースを生産しうる新規な微生物の発掘が必要な実情である。
このような背景下で、本発明者らはプシコースの生産可能な新規微生物を発掘するために鋭意研究努力した結果、カイスティア属微生物がＤ−フルクトースからプシコースを生産しうることを確認し、本出願を完成した。
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本出願の一目的は、カイスティア（kaistia）属微生物を含むプシコース生産用組成物を提供することにある。
本出願の他の目的は、カイスティア属微生物または前記微生物を含むプシコース生産用組成物をＤ−フルクトースと接触させる段階を含むプシコースの製造方法を提供することにある。
本出願のまた別の目的は、プシコース生産に有用な新規カイスティア（kaistia）属微生物を提供することにある。
本出願の目的を達成するために、本出願は一様態としてカイスティア（kaistia）属微生物を含むプシコース生産用組成物を提供する。
本出願のカイスティア属微生物は、Ｄ−フルクトースをＤ−プシコースに転換しうる能力を有するカイスティア属微生物であれば、制限なく含んでもよい。本出願の一具現例によると、本出願のカイスティア属微生物は、カイスティア・グラニュリ（Kaistia granuli）、 カイスティア・デフルビイ（Kaistia defluvii）、カイスティア・アディパタ（Kaistia adipata）、カイスティア・ゲウムホネシス（Kaistia geumhonensis）、 カイスティア・ダルセオネシス（Kaistia dalseonensis）、 カイスティア・ヒルジニス（Kaistia hirudinis）、カイスティア・ソライ（Kaistia soli）及びカイスティア・テラエ（Kaistia terrae）からなる群から選択される１種以上のカイスティア属微生物であってもよい。具体的には、本出願のカイスティア属微生物は、カイスティア・グラニュリＬＩＳ１（寄託番号ＫＣＣＭ１１９１６Ｐ）、 カイスティア・デフルビイＬＩＳ２（寄託番号ＫＣＣＭ１２０２０Ｐ）、カイスティア・グラニュリＫＣＴＣ１２５７５、カイスティア・デフルビイＫＣＴＣ２３７６６、カイスティア・アディパタＫＣＴＣ１２０９５、カイスティア・ゲウムホネシスＫＣＴＣ１２８４９、カイスティア・ダルセオネシスＫＣＴＣ１２８５０、カイスティア・ヒルジニスＤＳＭ２５９６６、カイスティア・ソライＤＳＭ１９４３６及び カイスティア・テラエＤＳＭ２１３４１からなる群から選択される１種以上のカイスティア属微生物であってもよい。
本出願のカイスティア属微生物は、菌株自体、その培養物または前記微生物の破砕物であってもよい。本出願のカイスティア属微生物の培養物または破砕物は、カイスティア属微生物から生産されたＤ−プシコース３−エピマー化酵素を含んでもよい。また、本出願のカイスティア微生物の培養物は、前記微生物を含んでも、含まなくてもよい。加えて、本出願のカイスティア微生物の破砕物は、カイスティア微生物またはその培養物を破砕した破砕物、または前記破砕物を遠心分離して得られた上澄み液であってもよい。
本出願の他の具現例によると、本出願のプシコース生産用組成物は、Ｄ−フルクトースをさらに含んでもよい。
本出願の他の具現例によると、本出願のカイスティア微生物は、担体に固定化させて用いてもよい。本出願で用いられる担体の例としては、アガー（agar）、アガロース（agarose）、ｋ−カラギーナン、アルギン酸またはキトサンがあり、これに限定されるものではない。
本出願のプシコース生産用組成物は金属をさらに含んでもよい。具体的には、本出願の金属は、マンガン、カルシウム、マグネシウム、鉄、リチウム及びナトリウムからなる群から選択される１つ以上の金属であってもよい。より具体的には、前記金属は、金属イオンまたは金属塩であってもよく、さらに具体的には、前記金属塩は、ＬｉＣｌ、Ｎａ２ＳＯ４、ＭｇＣｌ２、ＮａＣｌ、ＦｅＳＯ４、ＭｇＳＯ４、ＭｎＣｌ２、ＭｎＳＯ４及びＣａＣｌ２からなる群から選択される１種以上の金属塩であってもよい。前記金属イオンまたは金属塩は、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ、０．１ｍＭ〜７ｍＭ、０．１ｍＭ〜４ｍＭ、０．５ｍＭ〜１０ｍＭ、０．５ｍＭ〜７ｍＭ、０．５ｍＭ〜４ｍＭ、１ｍＭ〜１０ｍＭ、１ｍＭ〜７ｍＭ、１ｍＭ〜４ｍＭ、２ｍＭ〜１０ｍＭ、２ｍＭ〜７ｍＭまたは２ｍＭ〜４ｍＭで含んでもよい。
本出願は他の様態として、カイスティア（kaistia）属微生物または本出願に記載されたプシコース生産用組成物をＤ−フルクトースと接触させる段階を含む、プシコースの製造方法を提供する。
本出願の一具現例によると、本出願の接触は、ｐＨ５．０〜９．０の条件で、４０℃〜９０℃の条件で、及び/または０．５時間〜４８時間行ってもよい。
具体的には、ｐＨ６．０〜９．０、ｐＨ７．０〜９．０、ｐＨ７．５〜９．０、ｐＨ６．０〜８．５、ｐＨ７．０〜８．５またはｐＨ７．５〜８．５で行ってもよい。
また、本出願の接触は、４０℃〜８０℃、４０℃〜７５℃、４０℃〜６５℃、５０℃〜９０℃、５０℃〜８０℃、５０℃〜７５℃、５０℃〜６５℃、５５℃〜９０℃、５５℃〜８０℃、５５℃〜７５℃、５５℃〜６５℃、６０℃〜９０℃、６０℃〜８０℃、６０℃〜７５℃、６０℃〜６５℃、 ６５℃〜９０℃、６５℃〜８０℃または６５℃〜７５℃の温度で行ってもよい。
また、本出願の接触は、０．５時間以上、１時間以上、３時間以上、４時間以上、５時間以上または６時間以上、及び/または４８時間以下、３６時間以下、２４時間以下、１８時間以下、１２時間以下、９時間以下行ってもよい。
本出願の他の具現例によると、本出願のカイスティア（kaistia）属微生物とＤ−フルクトースは重量比が１：１〜1：５であってもよい。具体的には、前記重量比は１：１〜１：４、１：１〜１：３、１：２〜１：５、１：２〜１：４．１：２〜１：３または１：２．５であってもよい。
本出願の他の具現例によると、本出願の製造方法は、本出願のＤ−フルクトースと接触させる段階の以前、以後または同時に金属を添加する段階をさらに含んでもよい。
本出願の他の具現例によると、本出願の製造方法は、本出願のＤ−フルクトースと接触させる段階、または本出願の金属を添加する段階の後に、プシコースを分離及び/または精製する段階をさらに含んでもよい。本出願の分離及び/または精製は、特に制限されず、本出願の技術分野で通常用いられる方法を用いてもよい。例えば、前記分離及び／または精製は、透析、沈殿、吸着、電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー及び分別結晶などの公知の方法のいずれか一つ以上の方法を選択して利用してもよいが、これに制限されない。
また、本出願の方法は、それぞれ、本出願の分離及び/または精製する段階の以前または以後に脱色及び/または脱塩を行う段階をさらに含んでもよい。前記脱色及び/または脱塩を行うことにより、不純物を含まない、より精製されたプシコースを得ることができる。
本出願の他の具現例によると、本出願の製造方法は、本出願のＤ−フルクトースと接触させる段階、金属を添加する段階、分離及び/または精製する段階、または脱色及び/または脱塩段階の後に、Ｄ−プシコースを結晶化する段階をさらに含んでもよい。前記結晶化は、通常使用する結晶化方法を用いて行ってもよい。例えば、冷却結晶化方法を用いて結晶化を行ってもよい。
本出願の他の具現例によると、本出願の製造方法は、本出願の結晶化する段階の以前にプシコースを濃縮させる段階をさらに含んでもよい。前記濃縮は結晶化の効率を高めることができる。
本出願の他の具現例によると、本出願の製造方法は、本出願の分離及び／または精製する段階の後に、未反応されたＤ−フルクトースをカイスティア属微生物と接触させる段階、本出願の結晶化する段階の後に結晶が分離された母液を前記分離及び／または精製段階で再使用する段階、またはその組み合わせをさらに含んでもよい。前記追加の段階を介してプシコースをさらに高収率で収得することができ、捨てられるＤ−フルクトースの量を削減することができて経済的利点がある。
本出願の製造方法によるＤ−フルクトースからプシコースへの転換率は重量を基準に、５％〜５０％、１０％〜５０％、２０％〜５０％、２５％〜５０％、３０％〜５０％、５％〜４０％、１０％〜４０％、２０％〜４０％、２５％〜４０％、３０％〜４０％、５％〜３５％、１０％〜３５％、２０％〜３５％、２５％〜３５％または３０％〜３５％であってもよい。
本出願のプシコースの製造方法に記載されたカイスティア属微生物、Ｄ−フルクトース、プシコース、金属及び担体は、前述した様態で記載した通りである。
本出願はまた別の様態として、寄託番号ＫＣＣＭ１１９１６Ｐとして寄託された、カイスティア・グラニュリＬＩＳ１（Kaistia granuli LIS1）菌株を提供する。
本出願はまた別の様態として、寄託番号ＫＣＣＭ１２０２０Ｐとして寄託された、カイスティア・デフルビイＬＩＳ２（Kaistia defluvii LIS2）菌株を提供する。
本出願に係るカイスティア（kaistia）属微生物は、Ｄ−フルクトースをプシコースに転換することができ、同時に５０℃以上の高い温度でも安定性を有して、プシコースを産業的に生産するのに適用可能である。したがって、前記微生物をプシコースの生産に用いる場合、Ｄ−フルクトースからプシコースを経済的に生産できる効果がある。
以下、本出願の具体的な実施例によって、より詳細に説明する。しかし、本出願が下記の実施例に限定されるものではなく、本出願の趣旨及び内容の範囲内で当業者によって多様な変形または修正が可能であることが認識されるべきである。
本出願の明細書全体にわたり、特定物質の濃度を示すために使用する「％」は、別の記載がない場合、固体／固体は（重量／重量）％、固体／液体は（重量／体積）％、そして液体／液体は（体積／体積）％である。
実施例１．Ｄ−フルクトースをプシコースに転換する土壌由来微生物の分離
Ｄ−フルクトースをプシコースに転換させる微生物を分離するために、１％（ｗ／ｖ）プシコースが添加された最小培地（ＫＨ２ＰＯ４ ２．４ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４ ５．６ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ２．６ｇ／Ｌ 、３ｍＭ ＭｎＳＯ４、７Ｈ２Ｏ ０．１ｇ／Ｌ、酵母抽出物１ｇ／Ｌ）を用いた。根圏土壌（rhizosphere soil）１ｇを０．８５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、１０ｍＬに懸濁し、１００μlを取って寒天培地に塗抹した後、３０℃で培養した。前記寒天培地で形成されたコロニーのうちの形状や大きさが異なるコロニーを選別した後、最小培地（ＫＨ２ＰＯ４ ２．４ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４ ５．６ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ２．６ｇ／Ｌ 、３ｍＭ ＭｎＳＯ４、７Ｈ２Ｏ ０．１ｇ／Ｌ、酵母抽出物１ｇ／Ｌ）に各コロニーを接種し、３０℃で２４時間振とう培養し、遠心分離して菌体のみを回収した。回収した菌体は、０．８５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌで洗浄した後、菌体濃度２０％（ｗ／ｗ）に５０％（ｗ／ｗ）Ｄ−フルクトース、３ｍＭ ＭｎＳＯ４を添加した５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を入れて浮遊させ、５５℃で２時間菌体と反応させた。前記反応結果物は遠心分離して反応液から菌体を除去し、上澄み液をＨＰＬＣを介してプシコースの生産を確認した。前記ＨＰＬＣ分析は、Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｃカラム（BI0-RAD）が装着されたＨＰＬＣ（Agi lent、USA）のＲｅｆｒａｃｔｉｖｅ Ｉｎｄｅｘ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Agilent 1260 RID）を利用し、移動相溶媒は水を用いており、温度は８０℃、流速は０．６ｍｌ／分で行った。ＨＰＬＣ分析により、Ｄ−フルクトースからプシコースを最も多く生産した菌株２種（ＬＩＳ１及びＬＩＳ２）を選定した（図１及び２）。
Ｄ−フルクトースをプシコースに転換させる微生物を分離するために、１％（ｗ／ｖ）プシコースが添加された最小培地（ＫＨ２ＰＯ４ ２．４ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４ ５．６ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ２．６ｇ／Ｌ 、３ｍＭ ＭｎＳＯ４、７Ｈ２Ｏ ０．１ｇ／Ｌ、酵母抽出物１ｇ／Ｌ）を用いた。根圏土壌（rhizosphere soil）１ｇを０．８５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、１０ｍＬに懸濁し、１００μlを取って寒天培地に塗抹した後、３０℃で培養した。前記寒天培地で形成されたコロニーのうちの形状や大きさが異なるコロニーを選別した後、最小培地（ＫＨ２ＰＯ４ ２．４ｇ／Ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４ ５．６ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ２．６ｇ／Ｌ 、３ｍＭ ＭｎＳＯ４、７Ｈ２Ｏ ０．１ｇ／Ｌ、酵母抽出物１ｇ／Ｌ）に各コロニーを接種し、３０℃で２４時間振とう培養し、遠心分離して菌体のみを回収した。回収した菌体は、０．８５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌで洗浄した後、菌体濃度２０％（ｗ／ｗ）に５０％（ｗ／ｗ）Ｄ−フルクトース、３ｍＭ ＭｎＳＯ４を添加した５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を入れて浮遊させ、５５℃で２時間菌体と反応させた。前記反応結果物は遠心分離して反応液から菌体を除去し、上澄み液をＨＰＬＣを介してプシコースの生産を確認した。前記ＨＰＬＣ分析は、Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｃカラム（BI0-RAD）が装着されたＨＰＬＣ（Agi lent、USA）のＲｅｆｒａｃｔｉｖｅ Ｉｎｄｅｘ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Agilent 1260 RID）を利用し、移動相溶媒は水を用いており、温度は８０℃、流速は０．６ｍｌ／分で行った。ＨＰＬＣ分析により、Ｄ−フルクトースからプシコースを最も多く生産した菌株２種（ＬＩＳ１及びＬＩＳ２）を選定した（図１及び２）。
選別したＬＩＳ１菌株及びＬＩＳ２菌株の１６ｓリボソームＤＮＡの塩基配列（５’→３’）は、それぞれ配列番号１及び２と同じで、配列相同性の分析結果、配列番号１は、カイスティア・グラニュリ（Kaistia granuli）Ｋｏ０４の１６ｓリボソームＤＮＡ配列（配列番号３）と約９９％の相同性を示し、配列番号２は、カイスティア・デフルビイ（Kaistia defluvii）Ｂ６−１２の１６ｓリボソームＤＮＡ配列（配列番号４）と約９９％の相同性を示すことを確認した。したがって、ＬＩＳ１菌株はカイスティア・グラニュリ、ＬＩＳ２菌株はカイスティア・デフルビイと同定し、それぞれカイスティア・グラニュリＬＩＳ１及びカイスティア・デフルビイＬＩＳ２と命名した。前記二つの菌株は、ブダペスト条約下の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（Korean Culture of Microorganisms、KCCM）に寄託し、前記カイスティア・グラニュリＬＩＳ１は２０１６年１０月２０日付で寄託し、受託番号ＫＣＣＭ１１９１６Ｐを与えられ、前記カイスティア・デフルビイＬＩＳ２菌株は２０１７年４月２４日付で寄託し、受託番号ＫＣＣＭ１２０２０Ｐを与えられた。
実施例２．カイスティア属微生物によるプシコース生産の確認
カイスティア・グラニュリＬＩＳ１及びカイスティア・デフルビイＬＩＳ２と同種の他の菌株及び異種のカイスティア属菌株もプシコースの生産が可能であるかを確認した。
カイスティア・グラニュリＬＩＳ１及びカイスティア・デフルビイＬＩＳ２と同種の他の菌株及び異種のカイスティア属菌株もプシコースの生産が可能であるかを確認した。
具体的には、追加８種の微生物「同種：カイスティア・グラニュリ（K. granuli）ＫＣＴＣ１２５７５及びカイスティア・デフルビイ（K. defluvii）ＫＣＴＣ２３７６６；異種：カイスティア・ゲウムホネシス（K. geumhonensis）ＫＣＴＣ１２８４９、カイスティア・ダルセオネシス（K. dalseonensis）ＫＣＴＣ１２８５０、カイスティア・ヒルジニス（K. hirudinis）ＤＳＭ２５９６６、カイスティア・ソライ（K. soli）ＤＳＭ１９４３６及び カイスティア・テラエ（K. terrae）ＤＳＭ２１３４１」を生物資源センター（Korean Collection for Type Cultures、KTCT）とドイツ生物資源センター（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen）から購入し、通常培地（Nutrient broth；ブドウ糖１ｇ／Ｌ、ペプトン１５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ６ｇ／Ｌ、酵母抽出物３ｇ／Ｌ）に接種し、３０℃で２４時間振とう培養し、遠心分離した後、菌体のみ回収した。回収した菌体は、０．８５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌで洗浄した後、菌体濃度２０％（ｗ／ｗ）で、前記実施例１の反応条件と同様に５０％（ｗ／ｗ）Ｄ−フルクトースと反応させた。反応終了後、反応上澄み液をＨＰＬＣで分析し、プシコースの生産や転換率を確認した。前記ＨＰＬＣ分析は、実施例１と同様に行った。プシコース転換率は、反応前の基質（Ｄ−フルクトース）の重量比反応後に生成されたプシコースの重量の比で計算した。
その結果、前記８種のカイスティア属菌株のすべてＤ−フルクトースからプシコースを生産することを確認したところ、カイスティア属と知られているすべての種の微生物が高温でＤ−フルクトースからプシコースを生産しうることを確認した（表１、図３〜１０）。
以上の説明から、本出願が属する技術分野の当業者は、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形態で実施されうることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はすべての面で例示的なものであり、限定的なものではないものと理解しなければならない。本出願の範囲は、前記詳細な説明より、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導き出されるすべての変更または変形された形態が本出願の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
Claims (6)
- カイスティア（kaistia）属微生物を含む、Ｄ−プシコース生産用組成物。
- 前記カイスティア属微生物が、カイスティア・グラニュリ（Kaistia granuli）、カイスティア・デフルビイ（Kaistia defluvii）カイスティア・ゲウムホネシス（Kaistia geumhonensis）、カイスティア・アディパタ（Kaistia adipata）、カイスティア・ダルセオネシス（Kaistia dalseonensis）、カイスティア・ヒルジニス（Kaistia hirudinis）、カイスティア・ソライ（Kaistia soli）及びカイスティア・テラエ（Kaistia terrae）からなる群から選択される１種以上のカイスティア属微生物である、請求項１に記載のＤ−プシコース生産用組成物。
- 前記プシコース生産用組成物が、Ｄ−フルクトース（D-fructose）をさらに含む、請求項１または２に記載のＤ−プシコース生産用組成物。
- カイスティア（kaistia）属微生物をＤ−フルクトースと接触させる段階を含む、Ｄ−プシコースの製造方法。
- 前記接触が、ｐＨ５．０〜９．０の条件で、４０℃〜９０℃の温度条件で、または０．５時間〜４８時間行うことである、請求項４に記載のＤ−プシコースの製造方法。
- 寄託番号ＫＣＣＭ１１９１６Ｐとして寄託された、カイスティア・グラニュリ（Kaistia granuli）ＬＩＳ１菌株。
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