JP7145922B2

JP7145922B2 - マイクロバクテリウム属菌株およびこれを用いたプシコース生産方法

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Publication number: JP7145922B2
Application number: JP2020188203A
Authority: JP
Inventors: ハン・ユンジン; イ・サンヒ; クォン・スンギュ; パク・プス; アン・シネ; パク・チョンジン; イ・カンピョ
Original assignee: サムヤンコーポレイション
Priority date: 2015-12-07
Filing date: 2020-11-11
Publication date: 2022-10-03
Anticipated expiration: 2036-12-01
Also published as: US20200399721A1; EP3388526A1; US11066640B2; KR20170067070A; WO2017099418A1; JP2018536417A; KR101944103B1; JP6846425B2; IL259665A; EP3388526A4; IL259665B; AU2016368075A1; AU2016368075B2; JP2021045137A; CN108603209B; CN108603209A

Description

本発明は、新規に分離されたマイクロバクテリウム属菌株、前記菌株を含むプシコース生産用組成物およびこれを用いたプシコース生産方法に関する。

一般に、プシコース（ｐｓｉｃｏｓｅ）は、果糖（Ｄ－ｆｒｕｃｔｏｓｅ）の３番炭素のエピマー（ｅｐｉｍｅｒ）である。果糖と比較する時、果糖の７０％に該当する甘味度を有しているが、果糖と異なり体内吸収時にほとんど代謝されず、グルコースの吸収を抑制して血糖抑制作用を行う機能がある。したがって、糖尿病患者用食品または水腎用食品などに用いることができ、肝臓での脂質合成に関与する酵素活性を抑制する機能があって腹部脂肪蓄積抑制ができるなど血糖調節、虫歯予防および肝臓での脂肪合成を阻害する機能を有しているので、健康食品など様々な機能性食品などに使用することができる。

砂糖代替甘味料として多く使用されている糖アルコール類は、一定量以上摂取時、下痢を誘発するなどの副作用があるが、プシコースは知られている副作用がない。よって、プシコースはダイエット甘味料として関心が高まっているが、自然界に極めてめずらしく存在する単糖類の希少糖に属するため、食品産業に適用するためにはプシコースを効率的に製造する技術の開発が必要である。

従来のプシコース製造方法は、モリブデン酸イオンの触媒作用を用いて果糖からプシコースを生産する化学的方法のような主に化学的合成過程を経て製造することであった。しかし、化学的合成による場合、糖蜜処理過程またはグルコース異性化反応過程中にプシコースが非常に少量存在し、費用が多く消耗され、副産物が発生する短所がある。

このような問題点を解決するために、アグロバクテリウムツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）由来のプシコースエピマー化酵素によって果糖からプシコースを生産することのような、果糖を基質にして酵素反応によってプシコースを製造する生物学的方法が研究されている。

しかし、既存の機能が明らかになった酵素的方法によれば、プシコースを生産する酵素がアルカリ条件のｐＨ下で最適を示す場合が多く、アルカリ条件下での反応は非特異的反応と糖の褐変化を誘導するため産業化に適当でない。また、既存の酵素は高い温度で安定性が劣るか、遅い反応速度によって産業化に適用されるプシコース生産の収率が低く製造原価が上昇する問題があった。したがって、副産物を生成せず、産業化に適した温度およびｐＨ条件下で高い収率でプシコースを生産することができる方法が要求されている。

本発明の一例は、果糖からプシコースを生産するプシコース転換活性を有する新規なマイクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌株を提供する。

本発明のまた他の例は、前記マイクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌株、前記菌株の培養物、菌株の培養物の上清、菌株の培養物の抽出物、および／または前記菌株の破砕物を含むプシコース生産用組成物を提供する。

本発明のまた他の例は、前記マイクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌株を用いて果糖からプシコースを生産する方法を提供する。

本発明のまた他の例は、果糖をプシコースに転換する酵素を生産するマイクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌株を食品から分離する方法を提供する。

果糖をプシコースに転換する活性に優れた新規マイクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌株（例えば、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｏｌｉｏｒｕｍ）を食品から分離および同定し、前記菌株の菌体を用いて果糖からプシコースへの転換能を確認し、高いプシコース転換能を得るための菌体反応の最適温度、最適ｐＨおよび金属イオン要求性有無を確認し、プシコースを効率的に大量生産するための条件を確立して本発明を完成した。

本発明の一例は、果糖をプシコースに転換する新規マイクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌株を提供する。

他の例は、前記マイクロバクテリウム属菌株を用いて果糖からプシコースを生産する方法を提供する。前記製造方法において、高いプシコース転換能を得るための菌体の最適反応条件およびプシコースの大量生産のための条件を提案する。

以下、本発明をさらに詳しく説明する。

まず、新規なマイクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属菌株が提供される。前記マイクロバクテリウム属菌株は果糖をプシコースに転換する活性に優れた菌株であって、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｏｌｉｏｒｕｍ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｏｘｙｄａｎｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｍａｒｉｔｙｐｉｃｕｍ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｕｔｅｏｌｕｍ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｉｎｓｅｎｇｉｔｅｒｒａｅ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｋｅｒａｔａｎｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｎａｔｏｒｉｅｎｓｅ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌａｃｔｉｃｕｍ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｘｙｌａｎｉｌｙｔｉｃｕｍ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｋｏｒｅｅｎｓｅ、ＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｍｐｅｒｉａｌまたはＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｐｈｙｌｌｏｓｐｈａｅｒａｅであってもよく、好ましくはＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｏｌｉｏｒｕｍ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｏｘｙｄａｎｓ、およびＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｐｈｙｌｌｏｓｐｈａｅｒａｅからなる群より選択された１種以上であってもよく、例えば、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｏｌｉｏｒｕｍ菌株であってもよい。

一実施形態で、前記マイクロバクテリウム属菌株は、寄託番号ＫＣＣＭ１１７７４ＰのＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｏｌｉｏｒｕｍＳＹＧ２７Ｂ菌株であってもよい。

前記マイクロバクテリウム属菌株は、果糖をプシコースに転換させるプシコース転換能に優れることを特徴とする。

前記プシコース転換能は前記マイクロバクテリウム属菌株が果糖をプシコースに転換させる酵素を生産することによって得られるものであって、前記マイクロバクテリウム属菌株はプシコース転換能の高い酵素を生産するか、プシコース転換酵素を大量で生産して優れたプシコース転換能を示すことができる。したがって、前記マイクロバクテリウム属菌株はプシコース製造に有用に適用され、プシコース生産収率をより増進させることができる。

前記プシコース転換能は４０℃以上の温度条件下で活性を有するものであってもよく、４０～８０℃、例えば、５０～８０℃、６０～８０℃、または７０～８０℃、例えば、７５℃の温度条件で最大活性を示すものであってもよい。

また、前記プシコース転換能はｐＨ６．５～９．０、例えば、ｐＨ７．０～９．０、ｐＨ７．５～９．０、ｐＨ８．０～９．０または８．５～９．０の条件下で高い活性を有し得る。特に、ｐＨ７．０～８．０の中性ｐＨ範囲でもプシコースの効率的な生産が可能である。

したがって、前記マイクロバクテリウム属菌株の菌体、前記菌株の培養物、菌株の培養物の上清、菌株の培養物の抽出物および前記菌株の破砕物からなる群より選択された１種以上を含むプシコース生産用組成物が提供される。

前記培養物は前記マイクロバクテリウム属菌株から生産された酵素を含むものであって、前記菌株を含むか、菌株を含まない無細胞（ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ）形態であってもよい。

前記破砕物は前記マイクロバクテリウム属菌株を破砕した破砕物または前記破砕物を遠心分離して得られた上清を意味するものであって、前記マイクロバクテリウム属菌株から生産された酵素を含む。

本明細書において、別途の言及がない限り、プシコースの製造に使用されるマイクロバクテリウム属菌株は前記菌株の菌体、前記菌株の培養物および前記菌株の破砕物からなる群より選択された１種以上を意味するものとして使用される。

また、前記マイクロバクテリウム属菌株を使用するプシコース生産方法が提供される。前記プシコース生産方法は、前記マイクロバクテリウム属菌株を果糖と反応させる段階を含む。

一実施形態で、前記マイクロバクテリウム属菌株を果糖と反応させる段階は、前記マイクロバクテリウム属菌株の菌体を果糖が含まれている培養培地で培養する段階によって遂行されてもよい。

他の実施形態で、前記マイクロバクテリウム属菌株を果糖と反応させる段階は、前記菌株（菌体、菌株の培養物、および／または菌株の破砕物）を果糖と接触させる段階、例えば、前記菌株を果糖と混合する段階または前記菌株が固定化された担体に果糖を接触させる段階によって遂行されてもよい。このようにマイクロバクテリウム属菌株を果糖と反応させることによって果糖をプシコースに転換して果糖からプシコースを生産することができる。

前記プシコース生産方法において、効率的なプシコース生産のために、基質として使用される果糖の濃度は全体反応物基準に４０～７５％（ｗ／ｖ）、４５～７５％（ｗ／ｖ）、例えば、５０～７５％（ｗ／ｖ）であってもよい。果糖の濃度が前記範囲より低ければ経済性が低くなり、前記範囲より高ければ果糖がよく溶解されないので、果糖の濃度は上記範囲にすることがよい。前記果糖は緩衝溶液または水（例えば、蒸留水）に溶解された溶液状態で使用されてもよい。

前記プシコース生産方法において、前記反応は３０℃以上、例えば４０℃以上の温度条件下で遂行されてもよい。温度が８０℃以上になれば基質の果糖の褐変現象が起こることがあるので、前記反応は４０～８０℃、例えば、５０～８０℃、６０～８０℃、または７０～８０℃、例えば、７５℃の条件下で遂行されてもよい。

また、前記反応はｐＨ６．５～９．０、例えば、ｐＨ７．０～９．０、ｐＨ７．５～９．０、ｐＨ８．０～９．０または８．５～９．０の条件下で遂行されてもよい。特に、ｐＨ７．０～８．０の中性ｐＨ範囲でもプシコースの効率的な生産が可能である。

また、前記プシコース生産方法において、前記反応時間は長いほどプシコース転換率が高まる。例えば、前記反応時間は１時間以上、例えば２時間以上、３時間以上、４時間以上、５時間以上または６時間以上にすることがよい。また、反応時間が４８時間を超せばプシコース転換率の増加率が微小であるか、むしろ減少するので、反応時間は４８時間を超さないことが良い。したがって前記反応時間は１～４８時間、２～４８時間、３～４８時間、４～４８時間、５～４８時間、または６～４８時間にしてもよく、産業的および経済的側面を考慮して、１～４８時間、２～３６時間、３～２４時間、３～１２時間、または３～６時間程度にしてもよいが、これに制限されるものではない。

前記条件は、果糖からプシコースへの転換効率が最大化される条件として選定される。

また、前記プシコース生産方法において、使用されるマイクロバクテリウム属菌株の菌体濃度は全体反応物基準に、５ｍｇ（ｄｃｗ：乾燥細胞重量）／ｍｌ以上、例えば、５～１００ｍｇ（ｄｃｗ）／ｍｌ、１０～９０ｍｇ（ｄｃｗ）／ｍｌ、２０～８０ｍｇ（ｄｃｗ）／ｍｌ、３０～７０ｍｇ（ｄｃｗ）／ｍｌ、４０～６０ｍｇ（ｄｃｗ）／ｍｌ、または４５～５５ｍｇ（ｄｃｗ）／ｍｌであってもよい。菌体濃度が前記範囲未満である場合にはプシコース転換活性が低いか殆どなく、前記範囲を超過すれば菌体が過度に多くなってプシコース転換反応の全体的な効率が低くなるので、菌体濃度は上記範囲にすることがよい。

前記マイクロバクテリウム属菌株が生産する果糖をプシコースに転換させる酵素（例えば、エピメラーゼ）は金属イオンによって活性化が調節され得るので、前記マイクロバクテリウム属菌株を用いたプシコース生産において、金属イオンを添加すれば果糖からプシコースへの転換効率、即ち、プシコース生産率が増加され得る。

したがって、前記マイクロバクテリウム属菌株を含むプシコース生産用組成物は、金属イオンを追加的に含むものであってもよい。また、前記マイクロバクテリウム属菌株を用いたプシコース生産方法は、金属イオンを添加する段階を追加的に含んでもよい。

一実施形態で、前記金属イオンは前記培養段階の培養培地に添加されるか、前記培養段階が前記金属イオンが添加された培養培地で行われるものであってもよい。他の実施形態で、前記金属イオンは果糖に添加されるか、前記マイクロバクテリウム属菌株と果糖との混合物に添加されてもよい。また他の実施形態で、前記マイクロバクテリウム属菌株が固定化された担体に添加されるか（果糖添加前）、前記マイクロバクテリウム属菌株が固定化された担体と果糖との混合物に添加されるか（果糖添加後）、または果糖添加時に果糖と混合物の形態に、またはそれぞれ添加されてもよい。

前記金属イオンは、銅イオン、マンガンイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、ニッケルイオン、コバルトイオン、鉄イオン、アルミニウムイオンなどからなる群より選択された１種以上であってもよい。例えば、前記金属イオンはマンガンイオン、マグネシウムイオン、ニッケルイオン、コバルトイオンなどからなる群より選択された１種以上であってもよく、一例で前記金属イオンはマンガンイオン、コバルトイオン、またはこれらの混合物であってもよい。

金属イオンとしてマンガンイオン、コバルトイオン、またはこれらの混合物が存在する場合にはプシコース転換活性が、金属イオンがない場合に比べて１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２．０倍、２．１倍、２．２倍、または２．３倍以上増加し、例えば、１．２～２．３倍増加し得る。

また、前記金属イオンの添加量が０．５ｍＭ未満である場合にはプシコース生産収率増進効果が微小であるので、前記金属イオンの添加量は０．５ｍＭ以上にしてもよい。一方、前記金属イオンの添加量が５ｍＭを超過すればその超過量に比べて効果が微小であるので、前記金属イオンの添加量は５ｍＭ以下にしてもよい。例えば、前記金属イオンの添加量は０．５ｍＭ～５ｍＭ、０．５ｍＭ～４ｍＭ、０．５ｍＭ～３ｍＭ、例えば、０．５ｍＭ～２ｍＭ範囲にしてもよい。

前記担体は固定された菌株、または前記菌株から生産される酵素の活性が長期間維持され得る環境を造成することができるものであって、酵素固定化用途に使用できる公知の全ての担体であってもよい。

例えば、前記担体としてアルギン酸ナトリウム（ｓｏｄｕｉｍａｌｇｉｎａｔｅ）を使用してもよい。アルギン酸ナトリウムは海藻類の細胞壁に豊富に存在する天然コロイド性多糖類であって、マンヌロン酸（β－Ｄ－ｍａｎｎｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ）とグルロン酸（α－Ｌ－ｇｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ）が組成されており、含量面では無作為にベータ－１，４結合を成して形成され、菌株または酵素が安定的に固定されて優れたプシコース収率を示すのに有利であり得る。

一実施形態で、プシコースの収率をより増進させるために、１．５～４．０％（ｗ／ｖ）濃度のアルギン酸ナトリウム溶液（例えば、アルギン酸ナトリウム水溶液）、例えば、約２．５％の（ｗ／ｖ）濃度のアルギン酸ナトリウム溶液を菌株の固定化に使用してもよい。例えば、菌株の菌体、前記菌株が生産した酵素を含む培養液、または前記菌株の破砕物の１～２体積倍のアルギン酸ナトリウム水溶液に前記菌株の菌体、前記菌株が生産した酵素を含む培養物、または前記菌株の破砕物を添加して混合した後、前記得られた混合液をシリンジポンプと真空ポンプを用いて約０．２Ｍカルシウムイオン溶液に落としてビードが生成されるようにすることによって、アルギン酸ナトリウム担体に菌株の菌体、前記菌株が生産した酵素を含む培養物、または前記菌株の破砕物を固定化させることができる。前記酵素は、前記菌株、菌株培養物または前記菌株の破砕物から通常の方法、例えば透析、沈殿、吸着、電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどの方法によって精製されたものであってもよい。

本発明で提案されるプシコースを生産する方法は緩衝溶液を使用せず菌体を用いて果糖をプシコースに転換することが可能であるので、より簡便な方法でプシコースを高い収率で生産することができるという長所がある。

本発明は新規に分離されたマイクロバクテリウム属菌株、前記菌株を含むプシコース生産用組成物およびこれを用いたプシコース生産方法に関するものであって、本発明のマイクロバクテリウム属菌株は産業的に有用な範囲のｐＨ、温度で安定性を有し、果糖から高い収率でプシコースを生産する活性を有するので、機能性糖関連健康食品および医薬産業で幅広く使用されると期待される。

本発明の一実施例で高濃度果糖からプシコースが生産されたことを高性能液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ－ＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＨＰＬＣ）で確認したクロマトグラムを示すグラフである。本発明の一実施例で分離されたＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｏｌｉｏｒｕｍ菌株の温度によるプシコース生産相対活性を示すグラフである。本発明の一実施例で分離されたＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｏｌｉｏｒｕｍ菌株のｐＨによるプシコース生産相対活性を示すグラフである。本発明の一実施例で分離されたＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｏｌｉｏｒｕｍ菌株の金属イオン種類によるプシコース生産相対活性を示すグラフである。本発明の一実施例で分離されたＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｏｌｉｏｒｕｍ菌株の５０℃での温度安定性分析結果を示すグラフである。本発明の一実施例で分離されたＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｏｌｉｏｒｕｍ菌株の高濃度基質反応時プシコース生産性を示すグラフである。

以下、本発明を下記の実施例によってさらに詳しく説明する。しかし、これら実施例は本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれら実施例によって限定されるのではない。

実施例
実施例１．果糖をプシコースに転換する食品由来微生物の分離
果糖をプシコースに転換する菌株を分離するために１％（ｗ／ｖ）プシコースが添加された無機塩ブロス（Ｍｉｎｅｒａｌｓａｌｔｂｒｏｔｈ）（ＫＨ_２ＰＯ_４２．４ｇ／Ｌ、Ｋ_２ＨＰＯ_４５．６ｇ／Ｌ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４２．６ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ_４７Ｈ_２Ｏ０．１ｇ／Ｌ、酵母エキス（ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ）１ｇ／Ｌ）を使用した。

食品（例えば、ブロッコリー、人参、食用花など）を選定して、それぞれの食品を１ｇを採取してＭＳＰブロス（ＭＳＰｂｒｏｔｈ）に添加した後、３０℃で２４時間培養して増菌を実施した。その後、培養液１００μＬ（ｍｉｃｒｏｌｉｔｅｒ）を取って寒天培地に塗抹した後、３０℃でコロニーが確認されるまで培養した。前記寒天培地で形成されたコロニーのうちの形態と大きさが異なるコロニーを選別してＭＳＰブロスに接種した後、３０℃で２４時間振盪培養し遠心分離して菌体のみ回収した。回収した菌体は５０ｍＭＰＩＰＥＳ（ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ－Ｎ，Ｎ’－ｂｉｓ（２－ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ））緩衝溶液（ｐＨ７．０）１００μＬに入れて浮遊させ、音波振動機（Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｐｒｏｃｅｓｓｏｒ．ＣｏｌｅｐＰａｒｍｅｒ）を用いて破砕して破砕液を収得した。前記破砕液を１２，０００ｒｐｍで４℃で１０分間遠心分離した後、上清を回収して酵素液（粗酵素）として使用し、前記酵素液を１０ｍＭ果糖およびプシコースを基質にして３０℃で１２時間反応させた。

薄層クロマトグラフィー（ＴｈｉｎＬａｙｅｒＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＴＬＣ）分析を通じて前記反応液でプシコースが果糖に転換されたか確認した。前記薄層クロマトグラフィー分析は、横２０ｃｍ、縦１０ｃｍのシリカゲル（Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ６０Ｆ２５４（Ｍｅｒｃｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ））固定相とアセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）と水を８５：１５体積比で混合した移動相展開溶媒を用いて１０分間３回ずつ展開して行った。

前記ＴＬＣ分析を通じてプシコースから果糖への転換が確認された菌株を選別して、０．１％（ｗ／ｖ）プシコースが添加されたＭＳブロス（ＭＳｂｒｏｔｈ）に接種して３０℃で２４時間振盪培養し、遠心分離後に菌体のみ回収した。回収した菌体は０．８５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌで洗浄した後、４００ｇ／Ｌ果糖と１ｍＭマンガンイオンを添加した５０ｍＭＰＩＰＥＳ緩衝溶液（ｐＨ７．０）を入れて浮遊させ、７０℃で１時間反応した。

その後、前記反応結果物を遠心分離して上清を回収した後、高性能液体クロマトグラフィー（Ｈｉｇｈ－ＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＨＰＬＣ）分析を実施した。前記液体クロマトグラフィー分析は、ＡｍｉｎｅｘＨＰＸ－８７Ｃカラム（ＢＩＯ－ＲＡＤ）が装着されたＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ、ＵＳＡ）のＲＩＤ（ＲｅｆｒａｃｔｉｖｅＩｎｄｅｘＤｅｔｅｃｔｏｒ、Ａｇｉｌｅｎｔ１２６０ＲＩＤ）を用いて行った。移動相溶媒は水を使用し、温度は８０℃、流速は０．６ｍＬ／ｍｉｎにした。前記得られた結果を図１に示し、１５００種の菌株の中でプシコースを最も多く生産した菌株１種を最終選定した。

実施例２．プシコース転換菌株の同定
２－１．菌株同定
実施例１で分離された菌株を同定するために１６ＳリボソームＲＮＡの塩基配列を確認した。分離菌株の１６ＳリボソームＲＮＡの塩基配列（５’→３’）は配列番号１と同一であり、ＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｏｌｉｏｒｕｍＤＳＭ１２９６６と９９．５％同一であるのを確認し、ＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｏｌｉｏｒｕｍＳＹＧ２７Ｂと命名した。前記菌株は２０１５年９月２４日付で韓国微生物保存センターに寄託して受託番号ＫＣＣＭ１１７７４Ｐを付与された。

２－２．同一属菌株のプシコース転換活性
実施例１でプシコース転換活性を示す分離菌株のうち、１６ＳリボソームＲＮＡの塩基配列を通じてマイクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に同定された菌株は３種（Ｍ．ｆｏｌｉｏｒｕｍ、Ｍ．ｏｘｙｄａｎｓ、Ｍ．ｐｈｙｌｌｏｓｐｈａｅｒａｅ）であった。この中でブロッコリーと人参から分離されると知られていて安定性面で優れていると思われるマイクロバクテリウムフォリオラム（Ｍ．ｆｏｌｉｏｒｕｍ）を選定して以下の実験を実施した。

実施例３．前記菌株の菌体反応を用いた最適条件確立
前記で分離された菌株を多様なｐＨ、温度および金属イオン条件下で菌体と基質を反応させ、それによるプシコース転換活性を比較した。

３－１．温度による活性分析
プシコース生産最適温度を確認するために、４００ｇ／Ｌ果糖と１ｍＭマンガン金属イオンを添加した５０ｍＭＰＩＰＥＳ緩衝溶液（ｐＨ７．０）に前記実施例１で分離された菌株の菌体濃度を５ｍｇ（ｄｃｗ）／ｍＬにして、５５～８０℃範囲で温度を変化させながら１時間反応させ、反応終了後に前記実施例１と同様な方法でＨＰＬＣ分析を通じてプシコース生産量を測定し、得られた結果を図２および表１に示した。

図２および表１に示されているように、ＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｏｌｉｏｒｕｍＳＹＧ２７Ｂは、７５℃まで反応温度が高まるほど相対的活性が増加し、８０℃で減少するのを確認した。また、前記分離菌株は７５℃温度で最大活性を示すことが分かった。

３－２．ｐＨによる活性分析
転換反応でｐＨ効果を調査するために、前記実施例１で分離された菌株の菌体濃度５ｍｇ／ｍＬおよび果糖濃度４００ｇ／Ｌの１ｍＭマンガンイオンを添加した緩衝溶液ＭｃＩｌｖａｉｎｅ（０．１Ｍクエン酸と０．２Ｍリン酸水素二にトリウム溶液をｐＨ別に量を異にして添加して製造する緩衝溶液）ｐＨ５．０～９．０範囲をそれぞれ使用し、各ｐＨ条件で７０℃で１時間反応させ、反応終了後に前記実施例１と同様な方法でＨＰＬＣ分析を通じてプシコース生産量を測定し、得られた結果を図３および表２に示した。

図３および表２に示されているように、実施例１で得られた分離菌株のＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｏｌｉｏｒｕｍＳＹＧ２７Ｂは、ｐＨ６．５～９．０範囲で高い活性を示し、特に、ｐＨ７．０～８．０の中性ｐＨ範囲でもプシコースの効率的な生産が可能であるのを確認した。

３－３．金属イオンによる活性分析
金属イオン要求性を確認するために、４００ｇ／Ｌ果糖を基質として使用し、前記実施例１で分離された菌株の菌体濃度５ｍｇ／ｍＬ、７０℃、および５０ｍＭＰＩＰＥＳ緩衝溶液（ｐＨ７．０）に溶かした１ｍＭ金属イオン（ＣａＣｌ_２、ＣｏＣｌ_２、ＣｕＣｌ_２、ＦｅＳＯ_４、ＭｎＣｌ_２、ＮｉＳＯ_４、ＺｎＳＯ_４）溶液をそれぞれ使用して１時間反応させ、反応終了後、前記実施例１と同様な方法でＨＰＬＣ分析を通じてプシコース生産量を測定し、得られた結果を図４および表３に示した。

図４および表３に示したように、金属イオンは添加しない対照群（Ｎｏｎ）と比較した時、実施例１で得られたＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｏｌｉｏｒｕｍＳＹＧ２７Ｂは、マンガン（Ｍｎ）イオンとコバルト（Ｃｏ）イオンを添加した場合に対照群に比べてさらに高いプシコース転換活性を示した。

実施例４．プシコース大量生産のための条件
４－１．菌体の温度安定性分析
前記分離された菌株の温度安定性を確認するために、前記実施例１で分離された菌体を１ｍＭマンガンイオンを添加した５０ｍＭＰＩＰＥＳ緩衝溶液（ｐＨ７．０）で浮遊させ、３６時間５０℃の熱衝撃を加えた。その後、最終果糖濃度４００ｇ／Ｌ、菌体濃度５ｍｇ／ｍＬにして、７０℃で１時間反応させた後、熱衝撃が加えられた時間別プシコース生産量をＨＰＬＣ分析を通じて測定して得られた結果を図５および表４に示した。

図５および表４に示されているように、実施例１で得られたＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｏｌｉｏｒｕｍＳＹＧ２７Ｂに対して５０℃で熱衝撃を加えた場合、熱衝撃を加えない場合のプシコース転換活性を比較した時、半減期（ｈａｌｆ－ｌｉｆｅ）は約２８時間であった。

４－２．プシコース生産性
前記で確立されたプシコース大量生産条件下で、反応時間による最大生産性を確認した。前記実施例１で分離された菌株の菌体濃度２０ｍｇ／ｍＬ、果糖濃度４００ｇ／Ｌ、温度７０℃およびｐＨ７．０条件下で反応時間別活性を確認した。前記反応は１２時間行い、２時間間隔でプシコース生産性をＨＰＬＣ分析を通じて確認した。その結果を図６および表５に示した。

図６および表５に示されているように、ＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｏｌｉｏｒｕｍＳＹＧ２７Ｂは反応時間が経つほどプシコース転換率が増加し、特に７０℃で１２時間反応後にプシコース転換率が約２７％であって最大であり、この時、プシコース生産量は約７５ｇ／Ｌと確認された。

Claims

果糖からプシコースを生産するプシコース転換活性を有するマイクロバクテリウムフォリオラム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｏｌｉｏｒｕｍ）の菌体、マイクロバクテリウムフォリオラム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｏｌｉｏｒｕｍ）の培養物および破砕物からなる群より選択される少なくとも１つを用いて果糖－含有基質からプシコースを生産する方法であって、ここで、マイクロバクテリウムフォリオラム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｏｌｉｏｒｕｍ）が金属イオンがない場合に比べて、マンガンイオン（Ｍｎ^２＋）の存在下で増加したプシコース転換活性を有し、かつ配列番号１により表される核酸を含み、
ここで、マイクロバクテリウムフォリオラムのプシコース転換活性がｐＨ６．５～９．０および６０～８０℃で安定である、方法。
マイクロバクテリウムフォリオラム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｏｌｉｏｒｕｍ）を果糖が含まれている培地で培養する段階を含む、請求項１に記載のプシコースを生産する方法。
マイクロバクテリウムフォリオラム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｏｌｉｏｒｕｍ）を果糖と反応させる段階は、前記マイクロバクテリウムフォリオラム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｏｌｉｏｒｕｍ）の菌体、前記マイクロバクテリウムフォリオラム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｏｌｉｏｒｕｍ）の培養物および前記マイクロバクテリウムフォリオラム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｏｌｉｏｒｕｍ）の破砕物からなる群より選択された１種以上を果糖と混合して行われる、請求項１に記載のプシコースを生産する方法。
マイクロバクテリウムフォリオラム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｏｌｉｏｒｕｍ）を果糖と反応させる段階は、前記マイクロバクテリウムフォリオラム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｏｌｉｏｒｕｍ）の菌体、前記マイクロバクテリウムフォリオラム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｏｌｉｏｒｕｍ）の培養物および前記マイクロバクテリウムフォリオラム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｏｌｉｏｒｕｍ）の破砕物からなる群より選択された１種以上が固定化された担体に果糖を接触させることにより行われる、請求項３に記載のプシコースを生産する方法。
前記方法は、マンガンおよびコバルトからなる群より選択された１種以上の金属イオンを添加する段階を追加的に含む、請求項３に記載のプシコースを生産する方法。
前記方法は、緩衝溶液を使用しないことを特徴とする、請求項１－５のうちのいずれか一項に記載のプシコースを生産する方法。
前記果糖－含有基質は、４０～７５％（ｗ／ｗ）の濃度の果糖を含有する、請求項１－５のうちのいずれか一項に記載のプシコースを生産する方法。
前記方法は、ｐＨ６．５～９．０および４０～８０℃の条件下で行われる、請求項１－５のうちのいずれか一項に記載のプシコースを生産する方法。
果糖からプシコースを生産するプシコース転換活性を有するマイクロバクテリウムフォリオラム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｏｌｉｏｒｕｍ）の菌体、マイクロバクテリウムフォリオラム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｏｌｉｏｒｕｍ）の培養物および破砕物からなる群より選択される少なくとも１つを含む、果糖からプシコースを生産するプシコース生産用組成物であって、ここで、マイクロバクテリウムフォリオラム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｏｌｉｏｒｕｍ）が金属イオンがない場合に比べて、マンガンイオン（Ｍｎ^２＋）の存在下で増加したプシコース転換活性を有し、かつ配列番号１により表される核酸を含み、
ここで、マイクロバクテリウムフォリオラムのプシコース転換活性がｐＨ６．５～９．０および６０～８０℃で安定である、組成物。
マイクロバクテリウムフォリオラム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｏｌｉｏｒｕｍ）は、４０～８０℃でプシコース転換能を有する、請求項９に記載の組成物。
マイクロバクテリウムフォリオラム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｏｌｉｏｒｕｍ）は、ｐＨ６．５～９．０でプシコース転換能を有する、請求項９に記載の組成物。
マイクロバクテリウムフォリオラム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｏｌｉｏｒｕｍ）は、マンガンおよびコバルトからなる群より選択された１種以上の金属イオンが存在時にプシコース転換活性が金属イオンがない場合に比べて１．２～２．３倍増加する、請求項９に記載のプシコース生産用組成物。