KR102054961B1

KR102054961B1 - 마이크로박테리움 속 균주 및 이를 이용한 사이코스 생산방법

Info

Publication number: KR102054961B1
Application number: KR1020190009492A
Authority: KR
Inventors: 한은진; 이상희; 권순규; 박부수; 안신혜; 박종진; 이강표
Original assignee: 주식회사 삼양사
Priority date: 2019-01-24
Filing date: 2019-01-24
Publication date: 2019-12-12
Also published as: KR20190012243A

Abstract

본 발명은 신규하게 분리된 마이크로박테리움 속 균주, 상기 균주를 포함하는 사이코스 생산용 조성물 및 이를 이용한 사이코스 생산방법에 관한 것이다.

Description

마이크로박테리움 속 균주 및 이를 이용한 사이코스 생산방법 {Strain of microbacterium genus and method for producing psicose using the same}

일반적으로 사이코스(psicose)는 과당(D-fructose)의 3번 탄소의 에피머(epimer)이다. 과당과 비교할 때 과당의 70%에 해당하는 감미도를 가지고 있으나, 과당과 달리 체내 흡수 시 거의 대사되지 않으며, 포도당의 흡수를 억제하여 혈당 억제 작용을 하는 기능이 있다. 따라서, 당뇨병 환자용 음식품 또는 수신용 음식품 등에 사용할 수 있으며, 간에서의 지질합성에 관여하는 효소 활성을 억제는 기능이 있어 복부 지방 축적 억제를 할 수 있는 등 혈당 조절, 충치예방 및 간에서 지방합성을 저해하는 기능을 가지고 있으므로, 건강식품 등 여러 기능성 식품 등에 사용할 수 있다.

설탕 대체 감미료로 많이 사용되고 있는 당 알코올류는 일정량 이상 섭취 시 설사를 유발하는 등의 부작용이 있으나 사이코스는 알려진 부작용이 없다. 이에 사이코스는 다이어트 감미료로서 관심이 높아지고 있지만, 자연계에 극히 드물게 존재하는 단당류인 희소당에 속하기 때문에, 식품 산업에 적용하기 위해서는 사이코스를 효율적으로 제조하는 기술의 개발이 필요하다.

종래의 사이코스 제조 방법은 몰리브덴산 이온의 촉매작용을 이용하여 과당으로부터 사이코스를 생산하는 화학적 방법과 같은 주로 화학적 합성 과정을 거쳐 제조하는 것이었다. 그러나 화학적 합성에 의할 경우, 당밀 처리과정 또는 포도당 이성화 반응 과정 중에 사이코스가 매우 소량 존재하고, 비용이 많이 소모되며, 부산물이 발생하는 단점이 있다.

이와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 아그로박테리움 투메패시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 유래의 사이코스 에피머화 효소에 의하여 과당으로부터 사이코스를 생산하는 것과 같은, 과당을 기질로 하여 효소 반응에 의하여 사이코스를 제조하는 생물학적 방법이 연구되고 있다.

그러나 기존의 기능이 밝혀진 효소적 방법에 의하면 사이코스를 생산하는 효소들이 알칼리 조건의 pH 하에서 최적을 나타내는 경우가 많은데, 알칼리 조건 하에서의 반응은 비특이적 반응과 당의 갈변화를 유도하기 때문에 산업화에 적당하지 않다. 또한, 기존의 효소들은 높은 온도에서 안정성이 떨어지거나 느린 반응 속도로 인해 산업화에 적용되는 사이코스 생산의 수율이 낮고 제조원가가 상승하는 문제가 있었다. 따라서 부산물을 생성하지 않으면서, 산업화에 적합한 온도 및 pH 조건 하에서 높은 수율로 사이코스를 생산할 수 있는 방법이 요구되고 있다.

특허공보 제10-0832339호 (2008. 05. 26.) 특허공개공 제10-2011-0035805호 (2011. 04. 06)

Zhang et al., Biotechnol Lett, Vol31., pp.857-862

본 발명의 일 예는 과당으로부터 사이코스를 생산하는 사이코스 전환활성을 갖는 신규한 마이크로박테리움 (Microbacterium) 속 균주를 제공한다.

본 발명의 또 다른 예는 상기 마이크로박테리움(Microbacterium) 속 균주, 상기 균주의 배양물, 및/또는 상기 균주의 파쇄물을 포함하는 사이코스 생산용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 예는 상기 마이크로박테리움(Microbacterium) 속 균주를 이용하여 과당으로부터 사이코스를 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 예는 과당을 사이코스로 전환하는 효소를 생산하는 마이크로박테리움(Microbacterium) 속 균주를 식품으로부터 분리하는 방법을 제공한다.

과당을 사이코스로 전환하는 활성이 우수한 신규 마이크로박테리움(Microbacterium) 속 균주 (예컨대, Microbacterium foliorum)를 식품으로부터 분리 및 동정하였으며, 상기 균주의 균체를 사용하여 과당에서 사이코스로의 전환능을 확인하고, 높은 사이코스 전환능을 얻기 위한 균체 반응의 최적 온도, 최적 pH 및 금속이온 요구성 여부를 확인하여 사이코스를 효율적으로 대량 생산하기 위한 조건을 확립하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 일 예는 과당을 사이코스로 전환하는 신규 마이크로박테리움 (Microbacterium) 속 균주를 제공한다.

다른 예는 상기 마이크로박테리움 속 균주를 이용하여 과당으로부터 사이코스를 생산하는 방법을 제공한다. 상기 제조 방법에 있어서, 높은 사이코스 전환능을 얻기 위한 균체의 최적 반응 조건 및 사이코스의 대량 생산을 위한 조건을 제안한다.

이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

우선, 신규한 마이크로박테리움(Microbacterium) 속 균주가 제공된다. 상기 마이크로박테리움 속 균주는 과당을 사이코스로 전환하는 활성이 우수한 균주로, Microbacterium foliorum, Microbacterium oxydans, Microbacterium maritypicum, Microbacterium liquefaciens, Microbacterium luteolum, Microbacterium ginsengiterrae, Microbacterium keratanolyticum, Microbacterium natoriense, Microbacterium lacticum, Microbacterium xylanilyticum, Microbacterium koreense, Microbacterium imperial 또는 Microbacterium phyllosphaerae일 수 있으며, 바람직하게는 Microbacterium foliorum, Microbacterium oxydans, 및 Microbacterium phyllosphaerae로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있고, 예를 들어, Microbacterium foliorum 균주일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 마이크로박테리움 속 균주는 기탁번호 KCCM11774P인 Microbacterium foliorum SYG27B 균주일 수 있다.

상기 마이크로박테리움 속 균주는 과당을 사이코스로 전환시키는 사이코스 전환능이 우수한 것을 특징으로 한다.

상기 사이코스 전환능은 상기 마이크로박테리움 속 균주가 과당을 사이코스로 전환시키는 효소를 생산함으로써 얻어지는 것으로, 상기 마이크로박테리움 속 균주는 사이코스 전환능이 높은 효소를 생산하거나, 사이코스 전환 효소를 대량으로 생산하여 우수한 사이코스 전환능을 나타낼 수 있다. 따라서, 상기 마이크로박테리움 속 균주는 사이코스 제조에 유용하게 적용될 수 있으며, 사이코스 생산 수율을 보다 증진시킬 수 있다.

상기 사이코스 전환능은 40℃ 이상의 온도 조건하에서 활성을 갖는 것일 수 있으며, 40 내지 80℃, 예컨대, 50 내지 80℃, 60 내지 80℃, 또는 70 내지 80℃, 예를 들어, 75℃의 온도 조건에서 최대 활성을 나타내는 것일 수 있다.

또한, 상기 사이코스 전환능은 pH 6.5 내지 9.0, 예컨대, pH 7.0 내지 9.0, pH 7.5 내지 9.0, pH 8.0 내지 9.0 또는 8.5 내지 9.0의 조건하에서 높은 활성을 가질 수 있다. 특히, pH 7.0 내지 8.0의 중성 pH 범위에서도 사이코스의 효율적인 생산이 가능하다.

따라서, 상기 마이크로박테리움 속 균주의 균체, 상기 균주의 배양물, 및 상기 균주의 파쇄물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 사이코스 생산용 조성물이 제공된다.

상기 배양물은 상기 마이크로박테리움 속 균주로부터 생산된 효소를 포함하는 것으로, 상기 균주의 상기 균주를 포함하거나, 균주를 포함하지 않는 cell-free 형태일 수 있다.

상기 파쇄물은 상기 마이크로박테리움 속 균주를 파쇄한 파쇄물 또는 상기 파쇄물을 원심분리하여 얻어진 상등액을 의미하는 것으로, 상기 마이크로박테리움 속 균주로부터 생산된 효소를 포함하는 것이다.

본 명세서에 있어서, 별도의 언급이 없는 한, 사이코스의 제조에 사용되는 마이크로박테리움 속 균주는 상기 균주의 균체, 상기 균주의 배양물 및 상기 균주의 파쇄물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 의미하는 것으로 사용된다.

또한, 상기 마이크로박테리움 속 균주를 사용하는 사이코스 생산 방법이 제공된다. 상기 사이코스 생산 방법은 상기 마이크로박테리움 속 균주를 과당과 반응시키는 단계를 포함한다.

일 구체예에서, 상기 마이크로박테리움 속 균주를 과당과 반응시키는 단계는 상기 마이크로박테리움 속 균주의 균체를 과당이 포함된 배양 배지에서 배양하는 단계에 의하여 수행될 수 있다.

다른 구체예에서, 상기 마이크로박테리움 속 균주를 과당과 반응시키는 단계는 상기 균주(균체, 균주의 배양물, 및/또는 균주의 파쇄물)를 과당과 접촉시키는 단계, 예컨대, 상기 균주를 과당과 혼합하는 단계 또는 상기 균주가 고정화된 담체에 과당을 접촉시키는 단계에 의하여 수행될 수 있다. 이와 같이 마이크로박테리움 속 균주를 과당과 반응시킴으로써 과당을 사이코스로 전환하여 과당으로부터 사이코스를 생산할 수 있다.

상기 사이코스 생산 방법에 있어서, 효율적인 사이코스 생산을 위하여, 기질로서 사용되는 과당의 농도는 전체 반응물 기준으로 40 내지 75%(w/v), 45 내지 75%(w/v), 예컨대, 50 내지 75%(w/v)일 수 있다. 과당의 농도가 상기 범위보다 낮으면 경제성이 낮아지고, 상기 범위보다 높으면 과당이 잘 용해되지 않으므로, 과당의 농도는 상기 범위로 하는 것이 좋다. 상기 과당은 완충 용액 또는 물(예컨대 증류수)에 용해된 용액 상태로 사용될 수 있다.

상기 사이코스 생산방법에 있어서, 상기 반응은 30℃ 이상, 예컨대 40℃ 이상의 온도 조건하에서 수행될 수 있다. 온도가 80℃ 이상이 되면 기질인 과당의 갈변 현상이 일어날 수 있으므로, 상기 반응은 40 내지 80℃, 예컨대, 50 내지 80℃, 60 내지 80℃, 또는 70 내지 80℃, 예를 들어, 75℃의 조건하에서 수행될 수 있다.

또한, 상기 반응은 pH 6.5 내지 9.0, 예컨대, pH 7.0 내지 9.0, pH 7.5 내지 9.0, pH 8.0 내지 9.0 또는 8.5 내지 9.0의 조건하에서 수행될 수 있다. 특히, pH 7.0 내지 8.0의 중성 pH 범위에서도 사이코스의 효율적인 생산이 가능하다.

또한, 상기 사이코스 생산방법에 있어서, 상기 반응 시간은 길수록 사이코스 전환률이 높아진다. 예컨대, 상기 반응 시간은 1시간 이상, 예컨대 2시간 이상, 3시간 이상, 4시간 이상, 5시간 이상 또는 6시간 이상으로 하는 것이 좋다. 또한, 반응 시간이 48시간을 넘어가면 사이코스 전환률의 증가율이 미미하거나 오히려 감소하므로, 반응시간은 48시간을 넘기지 않는 것이 좋다. 따라서 상기 반응 시간은 1 내지 48시간, 2 내지 48시간, 3 내지 48시간, 4 내지 48시간, 5 내지 48시간, 또는 6 내지 48시간으로 할 수 있으며, 산업적 및 경제적 측면을 고려하여, 1 내지 48시간, 2 내지 36시간, 3 내지 24시간, 3 내지 12시간, 또는 3 내지 6시간 정도로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 조건은 과당에서 사이코스로의 전환 효율이 최대화되는 조건으로서 선정된 것이다.

또한, 상기 사이코스 생산 방법에 있어서, 사용되는 마이크로박테리움 속 균주의 균체 농도는 전체 반응물 기준으로 5mg(dcw: 건조세포중량)/ml 이상, 예컨대, 5 내지 100mg(dcw)/ml, 10 내지 90mg(dcw)/ml, 20 내지 80mg(dcw)/ml, 30 내지 70mg(dcw)/ml, 40 내지 60mg(dcw)/ml, 또는 45 내지 55mg(dcw)/ml일 수 있다. 균체 농도가 상기 범위 미만인 경우에는 사이코스 전환 활성이 낮거나 거의 없고, 상기 범위를 초과하면 균체가 너무 많아져서 사이코스 전환 반응의 전체적인 효율이 낮아지므로, 균체 농도는 상기 범위로 하는 것이 좋다.

상기 마이크로박테리움 속 균주가 생산하는 과당을 사이코스로 전환시키는 효소(예컨대, 에피머레이즈)는 금속 이온에 의하여 활성화가 조절될 수 있으므로, 상기 마이크로박테리움 속 균주를 이용한 사이코스 생산에 있어서, 금속 이온을 첨가하면 과당에서 사이코스로의 전환 효율, 즉 사이코스 생산율이 증가될 수 있다.

따라서, 상기 마이크로박테리움 속 균주를 포함하는 사이코스 생산용 조성물은 금속 이온을 추가로 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 마이크로박테리움 속 균주를 이용한 사이코스 생산 방법은 금속 이온을 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 금속 이온은 상기 배양 단계의 배양 배지에 첨가되거나, 상기 배양 단계가 상기 금속 이온이 첨가된 배양 배지에서 수행되는 것일 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 금속 이온은 과당에 첨가되거나, 상기 마이크로박테리움 속 균주와 과당과의 혼합물에 첨가될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 마이크로박테리움 속 균주가 고정화된 담체에 첨가되거나(과당 첨가 전), 상기 마이크로박테리움 속 균주가 고정화된 담체와 과당과의 혼합물에 첨가되거나(과당 첨가 후), 또는 과당 첨가 시에 과당과 혼합물의 형태로 또는 각각 첨가될 수 있다.

상기 금속 이온은 구리 이온, 망간 이온, 칼슘 이온, 마그네슘 이온, 아연 이온, 니켈 이온, 코발트 이온, 철 이온, 알루미늄 이온 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 예컨대, 상기 금속 이온은 망간 이온, 마그네슘 이온, 니켈 이온, 코발트 이온 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 일 예에서 상기 금속 이온은 망간 이온, 코발트 이온, 또는 이들의 혼합물일 수 있다.

금속 이온으로 망간 이온, 코발트 이온, 또는 이들의 혼합물이 존재하는 경우에는 사이코스 전환 활성이 금속 이온이 없는 경우에 비해 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2.0배, 2.1배, 2.2배, 또는 2.3배 이상 증가하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 1.2 내지 2.3배 증가하는 것일 수 있다.

또한, 상기 금속 이온의 첨가량이 0.5mM 미만인 경우에는 사이코스 생산 수율 증진 효과가 미미하므로, 상기 금속 이온의 첨가량은 0.5mM 이상으로 할 수 있다. 한편, 상기 금속 이온의 첨가량이 5mM을 초과하면 그 초과량에 비하여 효과가 미미하기 때문에, 상기 금속 이온의 첨가량은 5mM 이하로 할 수 있다. 예컨대, 상기 금속 이온의 첨가량은 0.5mM 내지 5mM, 0.5mM 내지 4mM, 0.5mM 내지 3mM, 예컨대, 0.5 mM 내지 2mM 범위로 할 수 있다.

상기 담체는 고정된 균주, 또는 상기 균주로부터 생산되는 효소의 활성이 장기간 유지될 수 있는 환경을 조성할 수 있는 것으로, 효소 고정화 용도로 사용할 수 있는 공지된 모든 담체일 수 있다.

예컨대, 상기 담체로서 알긴산나트륨(soduim alginate)을 사용할 수 있다. 알긴산나트륨은 해조류의 세포벽에 풍부하게 존재하는 천연 콜로이드성 다당류로, 만누로닉산(β-D-mannuronic acid)과 글루로닉산(α-L-gluronic acid)이 조성되어 있고, 함량 면에서는 무작위로 베타-1,4 결합을 이루어 형성되어, 균주 또는 효소가 안정적으로 고정되어 우수한 사이코스 수율을 나타내는 데 유리할 수 있다.

일 구체예에서, 사이코스의 수율을 보다 증진시키기 위하여 1.5 내지 4.0%(w/v) 농도의 알긴산나트륨 용액(예컨대, 알긴산나트륨 수용액), 예컨대, 약 2.5%의 (w/v) 농도의 알긴산나트륨 용액을 균주의 고정화에 사용할 수 있다. 예컨대, 균주의 균체, 상기 균주가 생산한 효소를 포함하는 배양액, 또는 상기 균주의 파쇄물의 1 내지 2 부피 배의 알긴산나트륨 수용액에 상기 균주의 균체, 상기 균주가 생산한 효소를 포함하는 배양물, 또는 상기 균주의 파쇄물을 첨가하여 혼합한 후, 상기 얻어진 혼합액을 주사기 펌프와 진공 펌프를 사용하여 약 0.2M 칼슘 이온 용액에 떨어뜨려 비드가 생성되도록 함으로써, 알긴산나트륨 담체에 균주의 균체, 상기 균주가 생산한 효소를 포함하는 배양물, 또는 상기 균주의 파쇄물이 고정화시킬 수 있다. 상기 효소는 상기 균주, 균주 배양물 또는 상기 균주의 파쇄물로부터 통상의 방법, 예컨대 투석, 침전, 흡착, 전기영동, 친화 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피 등의 방법에 의하여 정제된 것일 수 있다.

본 발명에서 제안되는 사이코스를 생산하는 방법은 완충 용액을 사용하지 않고 균체를 이용하여 과당을 사이코스로 전환하는 것이 가능하므로, 보다 간편한 방법으로 사이코스를 높은 수율로 생산할 수 있다는 장점이 있다.

본 발명은 신규 하게 분리된 마이크로박테리움 속 균주, 상기 균주를 포함하는 사이코스 생산용 조성물 및 이를 이용한 사이코스 생산방법에 관한 것으로, 본 발명의 마이크로박테리움 속 균주는 산업적으로 유용한 범위의 pH, 온도에서 안정성을 가지며, 과당으로부터 높은 수율로 사이코스를 생산하는 활성을 가지므로, 기능성 당 관련 건강식품 및 의약 산업에서 폭넓게 사용될 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에서 고농도 과당으로부터 사이코스가 생산된 것을 고성능 액체 크로마토그래피(High-Performance Liquid Chromatography, HPLC)으로 확인한 크로마토그램을 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에서 분리된 Microbacterium foliorum 균주의 온도에 따른 사이코스 생산 상대활성을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에서 분리된 Microbacterium foliorum 균주의 pH에 따른 사이코스 생산 상대활성을 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에서 분리된 Microbacterium foliorum 균주의 금속 이온 종류에 따른 사이코스 생산 상대활성을 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에서 분리된 Microbacterium foliorum 균주의 50 에서의 온도 안정성 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에서 분리된 Microbacterium foliorum 균주의 고농도 기질반응 시 사이코스 생산성을 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 과당을 사이코스로 전환하는 식품 유래 미생물의 분리

과당을 사이코스로 전환하는 균주를 분리하기 위해 1% (w/v) 사이코스가 첨가된 Mineral salt broth (KH₂PO₄ 2.4 g/L, K₂HPO₄ 5.6 g/L, (NH₄)₂SO₄ 2.6 g/L, MgSO₄7H₂O 0.1 g/L, yeast extract 1 g/L)를 사용하였다.

식품 (예를 들어, 브로콜리, 인삼, 식용꽃 등)을 선정하여, 각각의 식품을 1g을 채취하고 MSP broth에 첨가 후 30℃에서 24시간 배양하여 증균을 실시하였다. 그 다음, 배양액 100 μL(microliter)를 취해 한천 배지에 도말한 후 30℃에서 콜로니가 확인될 때까지 배양하였다. 상기 한천 배지에서 형성된 콜로니 중 모양과 크기가 다른 콜로니를 선별하여 MSP broth에 접종 후, 30℃에서 24시간 진탕배양하고 원심분리하여 균체만 회수하였다. 회수한 균체는 50 mM PIPES(piperazine-N, N'-bis(2-ethanesulfonic acid)) 완충용액(pH 7.0) 100 μL에 넣어 부유시키고, 음파진동기(Ultrasonic processor. ColepParmer)를 사용하여 파쇄하여 파쇄액을 수득하였다. 상기 파쇄액을 12,000rpm으로 4℃에서 10분 동안 원심분리 후, 상등액을 회수하여 효소액(crude enzyme)으로 사용하였으며, 상기 효소액을 10 mM 과당 및 사이코스를 기질로 하여 30℃에서 12시간 동안 반응시켰다.

박층 크로마토그래피(Thin Layer Chromatography, TLC) 분석을 통해 상기 반응액에서 사이코스가 과당으로 전환되었는지 확인하였다. 상기 박층 크로마토그래피 분석은 가로 20cm, 세로 10cm의 실리카겔(Silica gel 60F254(Merck, Germany)) 고정상과 아세토나이트릴(acetonitrile)과 물을 85:15 부비피로 혼합한 이동상 전개용매를 사용하여 10분간 3번씩 전개하여 수행하였다.

상기 TLC 분석을 통해 사이코스에서 과당으로 전환이 확인된 균주를 선별하여 0.1%(w/v) 사이코스가 첨가된 MS broth에 접종하여 30℃에서 24시간 진탕배양 하였으며, 원심분리 후 균체만 회수하였다. 회수한 균체는 0.85%(w/v) NaCl로 세척한 후, 400g/L 과당과 1mM 망간 이온을 첨가한 50mM PIPES 완충용액(pH 7.0)을 넣어 부유시키고, 70℃에서 1시간 동안 반응하였다.

그 다음, 상기 반응 결과물을 원심분리하여 상등액을 회수한 후 고성능 액체 크로마토그래피(High-Performance Liquid Chromatography, HPLC) 분석을 실시하였다. 상기 액체 크로마토그래피 분석은 Aminex HPX-87C 컬럼(BIO-RAD)이 장착된 HPLC(Agilent, USA)의 RID(Refractive Index Detector, Agilent 1260 RID)를 이용하여 수행하였다. 이동상 용매는 물을 사용하였고 온도는 80℃, 유속은 0.6 mL/min로 하였다. 상기 얻어진 결과를 도 1에 나타내었고, 1500종의 균주 중에서 사이코스를 가장 많이 생산한 균주 1종을 최종 선정하였다.

실시예 2. 사이코스 전환균주의 동정

2-1. 균주 동정

실시예 1에서 분리된 균주를 동정하기 위하여 16S 리보좀 RNA의 염기서열을 확인하였다. 분리 균주의 16S 리보좀 RNA의 염기서열(5'→3')은 서열번호 1과 같으며 Microbacterium foliorum DSM12966과 99.5% 동일함을 확인하였고, Microbacterium foliorum SYG27B로 명명하였다. 상기 균주는 2015년 9월 24일자로 한국미생물보존센터에 기탁하여 수탁번호 KCCM11774P를 부여받았다.

2-2. 동일 속 균주의 사이코스 전환 활성

실시예 1에서 사이코스 전환 활성을 나타내는 분리 균주 중, 16S 리보좀 RNA의 염기서열을 통해 Microbacterium 속으로 동정된 균주는 3종(M. foliorum, M. oxydans, M. phyllosphaerae)으로 나타났다. 이 중에서 브로콜리와 인삼에서 분리되는 것으로 알려져있어 안정성 면에서 우수할 것으로 생각되는 M. foliorum을 선정하여 이하의 실험을 실시하였다.

실시예 3. 상기 균주의 균체반응을 이용한 최적조건 확립

상기에서 분리된 균주를 다양한 pH, 온도 및 금속이온 조건하에서 균체와 기질을 반응시키고 그에 따른 사이코스 전환 활성을 비교하였다.

3-1. 온도에 따른 활성 분석

사이코스 생산 최적 온도를 확인하기 위하여, 400g/L 과당과 1mM 망간 금속이온을 첨가한 50 mM PIPES 완충용액(pH7.0)에 상기 실시예 1에서 분리된 균주의 균체 농도를 5mg(dcw)/mL로 하여, 55 내지 80℃ 범위에서 온도를 변화시키면서 1시간 동안 반응시키고, 반응 종료 후 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 HPLC 분석을 통하여 사이코스 생산량을 측정하였으며, 얻어진 결과를 도 2 및 표 1에 나타내었다.

반응온도 (℃)	Relative activity (%)
55	54.2
60	66.1
65	85.8
70	96.7
75	100.0
80	87.7

도 2 및 표 1에 나타난 바와 같이, Microbacterium foliorum SYG27B는, 75℃까지 반응 온도가 높아질수록 상대적 활성이 증가하였고, 80℃에서 감소함을 확인하였다. 또한, 상기 분리균주는 75 온도에서 최대 활성을 나타내는 것으로 나타났다.

3-2. pH에 따른 활성 분석

전환반응에서 pH 효과를 조사하기 위하여, 상기 실시예 1에서 분리된 균주의 균체 농도 5 mg/mL 및 과당 농도 400 g/L의 1mM 망간 이온을 첨가한 완충용액 McIlvaine(0.1 M citric acid와 0.2 M disodium hydrogen phosphate 용액을 pH별로 양을 다르게 첨가하여 제조하는 완충용액) pH 5.0 내지 9.0 범위를 각각 사용하여, 각 pH 조건에서 70℃에서 1시간 반응시키고, 반응 종료 후 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 HPLC 분석을 통하여 사이코스 생산량을 측정하고, 얻어진 결과를 도 3 및 표 2에 나타내었다.

pH	Relative activity (%)
5.0	24.6
5.5	36.0
6.0	39.6
6.5	60.8
7.0	75.9
7.5	81.2
8.0	91.8
8.5	93.9
9.0	100.0

도 3 및 표 2에 나타난 바와 같이, 실시예 1에서 얻어진 분리 균주인 Microbacterium foliorum SYG27B는, pH 6.5 내지 9.0 범위에서 높은 활성을 나타내었으며, 특히, pH 7.0 내지 8.0의 중성 pH 범위에서도 사이코스의 효율적인 생산이 가능함을 확인하였다.

3-3. 금속이온에 따른 활성 분석

금속이온 요구성을 확인하기 위하여, 400g/L 과당을 기질로 사용하고, 상기 실시예 1에서 분리된 균주의 균체 농도 5mg/mL, 70℃, 및 50mM PIPES 완충용액(pH 7.0)에 녹인 1mM 금속이온(CaCl₂, CoCl₂, CuCl₂, FeSO₄, MnCl₂, NiSO₄, ZnSO₄) 용액을 각각 사용하여 1시간 동안 반응시키고 반응 종료 후, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 HPLC 분석을 통하여 사이코스 생산량을 측정하고, 얻어진 결과를 도 4 및 표 3에 나타내었다.

금속 이온	Relative activity (%)
Non (대조군)	100.0
Ca	90.1
Co	222.6
Cu	24.8
Fe	77.1
Mn	121.5
Ni	95.8
Zn	31.7

도 4 및 표 3에 나타낸 바와 같이, 금속이온은 첨가하지 않은 대조군(Non)과 비교하였을 때, 실시예 1에서 얻어진 Microbacterium foliorum SYG27B는, 망간(Mn) 이온과 코발트(Co) 이온을 첨가한 경우에 대조군에 비해서 더 높은 사이코스 전환 활성을 나타내었다.

실시예 4. 사이코스 대량생산을 위한 조건

4-1. 균체의 온도 안정성 분석

상기 분리된 균주의 온도 안정성을 확인하기 위해, 상기 실시예 1에서 분리된 균체를 1 mM 망간 이온을 첨가한 50 mM PIPES 완충용액(pH 7.0)으로 부유시키고, 36시간 동안 50℃의 열충격을 가하였다. 그 다음, 최종 과당 농도 400g/L, 균체 농도 5 mg/mL로 하고, 70℃에서 1시간 반응시킨 후 열충격이 가해진 시간별 사이코스 생산량을 HPLC 분석을 통하여 측정하여 얻어진 결과를 도 5 및 표 4에 나타내었다.

시간 (hr)	Relative activity (%)
0	100
2	93.4
4	77.8
8	65.1
12	59.7
24	53.1
36	46.1

도 5 및 표 4에 나타난 바와 같이, 실시예 1에서 얻어진 Microbacterium foliorum SYG27B에 대해 50℃에서 열충격을 가한 경우, 열충격을 가하지 않은 경우의 사이코스 전환 활성을 비교하였을 때, 반감기(half-life)는 약 28시간으로 나타났다.

4-2. 사이코스 생산성

상기에서 확립된 사이코스 대량생산 조건하에서, 반응 시간에 따른 최대 생산성을 확인하였다. 상기 실시예 1에서 분리된 균주의 균체 농도 20mg/mL, 과당 농도 400g/L 온도 70℃ 및 pH 7.0 조건하에서 반응 시간별 활성을 확인하였다. 상기 반응은 12시간 동안 진행하였으며, 2시간 간격으로 사이코스 생산성을 HPLC 분석을 통하여 확인하였다. 그 결과를 도 6 및 표 5에 나타내었다.

반응시간 (hr)	Relative activity (%)
1	8.4
2	13.9
4	18.5
6	20.2
8	24.8
10	26.4
12	27.1
14	27.1

도 6 및 표 5에 나타난 바와 같이, Microbacterium foliorum SYG27B는 반응 시간이 지날수록 사이코스 전환율이 증가하였으며, 특히 70℃에서 12시간 반응 후 사이코스 전환율이 약 27%로 최대로 나타내었으며, 이때 사이코스 생산량은 약 75g/L로 확인되었다.

기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)

수탁번호 : KCCM11774P

수탁일자 : 20150924

<110> SAMYANG CORPORATION <120> Strain of microbacterium genus and method for producing psicose using the same <130> DPP20190125KR <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1466 <212> DNA <213> Microbacterium foliorum <400> 1 gatgaacgct ggcggcgtgc ttaacacatg caagtcgaac ggtgaacacg gagcttgctc 60 tgtgggatca gtggcgaacg ggtgagtaac acgtgagcaa cctacccctg actctgggat 120 aagcgctgga aacggcgtct aatactggat acgagtggcg accgcatggt cagctactgg 180 aaagatttat tggttgggga tgggctcgcg gcctatcagc ttgttggtga ggtaatggct 240 caccaaggcg tcgacgggta gccggcctga gagggtgacc ggccacactg ggactgagac 300 acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt ggggaatatt gcacaatggg cgcaagcctg 360 atgcagcaac gccgcgtgag ggatgacggc cttcgggttg taaacctctt ttagcaggga 420 agaagcgaaa gtgacggtac ctgcagaaaa agcgccggct aactacgtgc cagcagccgc 480 ggtaatacgt agggcgcaag cgttatccgg aattattggg cgtaaagagc tcgtaggcgg 540 tttgtcgcgt ctgctgtgaa atccggaggc tcaacctccg gcctgcagtg ggtacgggca 600 gactagagtg cggtagggga gattggaatt cctggtgtag cggtggaatg cgcagatatc 660 aggaggaaca ccgatggcga aggcagatct ctgggccgta actgacgctg aggagcgaaa 720 gggtggggag caaacaggct tagataccct ggtagtccac cccgtaaacg ttgggaacta 780 gttgtggggt ccattccacg gattccgtga cgcagctaac gcattaagtt ccccgcctgg 840 ggagtacggc cgcaaggcta aaactcaaag gaattgacgg ggacccgcac aagcggcgga 900 gcatgcggat taattcgatg caacgcgaag aaccttacca aggcttgaca tatacgagaa 960 cgggccagaa atggtcaact ctttggacac tcgtaaacag gtggtgcatg gttgtcgtca 1020 gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctcg ttctatgttg 1080 ccagcacgta atggtgggaa ctcatgggat actgccgggg tcaactcgga ggaaggtggg 1140 gatgacgtca aatcatcatg ccccttatgt cttgggcttc acgcatgcta caatggccgg 1200 tacaaagggc tgcaataccg cgaggtggag cgaatcccaa aaagccggtc ccagttcgga 1260 ttgaggtctg caactcgacc tcatgaagtc ggagtcgcta gtaatcgcag atcagcaacg 1320 ctgcggtgaa tacgttcccg ggtcttgtac acaccgcccg tcaagtcatg aaagtcggta 1380 acacctgaag ccggtggcct aacccttgtg gagggagccg tcgaaggtgg gatcggtaat 1440 taggactaag tcgtaacaag gtaacc 1466

Claims

기탁번호 KCCM11774P을 가지며, 과당을 사이스코로 전환하는 활성을 가지는 마이크로박테리움 폴리오룸 (Microbacterium foliorum)균주로서,
상기 균주는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 16s rDNA 서열을 가지며,
상기 균주의 과당을 사이코스로 전환하는 활성은 망간 및 코발트에 의해 증가하며, 60℃ 내지 80℃의 온도범위 및 pH 6.5 내지 9.0의 pH 범위에서 안정한 것인, 마이크로박테리움 폴리오룸 (Microbacterium foliorum)균주.
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제1항에 있어서, 상기 균주의 사이코스 전환활성은 pH 7.0 내지 8.0의 pH 범위에서 안정한 것인 균주.
제1항에 있어서, 상기 균주는 코발트 이온 및 망간 이온에 의해 사이코스 전환활성이, 금속 이온이 없는 경우에 비해 1.2배 이상 증가하는 것인, 균주.
제1항에 있어서, 상기 균주는, 코발트 이온 및 망간 이온에 의해 사이코스 전환활성이, 금속 이온이 없는 경우에 비해 1.7배 이상 증가하는 것인 균주.
제1항에 있어서, 상기 균주는 코발트 이온 및 망간 이온에 의해 사이코스 전환활성이, 금속 이온이 없는 경우에 비해 1.2배 내지 2.3배 증가하는 것인 균주.
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