KR101647129B1

KR101647129B1 - 엔시퍼 속 균주 및 이를 이용한 사이코스 생산방법

Info

Publication number: KR101647129B1
Application number: KR1020130038593A
Authority: KR
Inventors: 안신혜; 김혜정; 한은진; 전세희; 박종진; 이강표
Original assignee: 주식회사 삼양사
Priority date: 2013-04-09
Filing date: 2013-04-09
Publication date: 2016-08-09
Also published as: KR20140122043A

Abstract

토양으로부터 신규하게 분리된 균주 Ensifer adhaerens 및 이를 이용한 사이코스 제조방법이 제공된다.

Description

엔시퍼 속 균주 및 이를 이용한 사이코스 생산방법{Strain of Ensifer genus and method for producing psicose using the same}

사이코스(psicose)는 과당의 3번 탄소의 에피머로서, 과당의 70%에 해당하는 감미도를 가지고 있으며, 혈당 조절, 충치예방 및 간에서 지방합성을 저해하는 기능성 당이다.

설탕 대체 감미료로 많이 사용되고 있는 당알코올류는 일정량 이상 섭취 시 설사를 유발하는 등의 부작용이 있으나 사이코스는 알려진 부작용이 없다. 따라서 사이코스의 감미료로서의 관심이 높아지고 있으며 효율적인 사이코스 생산방법에 대한 개발 필요성이 높아지고 있다.

기존의 사이코스 생산은 몰리브덴산 이온의 촉매작용을 이용하여 과당으로부터 사이코스를 생산하는 화학적 방법에 의한 생산과, 아그로박테리움 투메패시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 유래의 사이코스 에피머화 효소에 의하여 과당으로부터 사이코스를 생산하는 것과 같은 생물학적 방법에 의한 생산으로 나누어진다. 화학적 방법에 의한 사이코스 생산은 효율이 낮고 부산물이 발생하는 것이 문제가 되고 있으며, 생물학적인 방법 역시 수율이 낮고 생산 비용이 높다는 문제점이 있다.

따라서 부산물을 생성하지 않으면서, 산업화에 적합한 온도 및 pH 조건 하에서 높은 수율로 사이코스를 생산할 수 있는 방법이 요구되고 있다.

본 발명의 일 예는 과당을 사이코스로 전환하는 효소를 생산하는 균주를 근권 토양으로부터 분리하는 방법을 제공한다.

다른 예는 사이코스로 전환하는 신규한 엔시퍼 (Ensifer) 속 균주를 제공한다.

다른 예는 상기 Ensifer 속 균주, 상기 균주의 배양물, 및/또는 상기 균주의을 파쇄물을 포함하는 사이코스 생산용 조성물을 제공한다.

다른 예는 상기 균주를 이용하여 과당으로부터 사이코스를 생산하는 방법을 제공한다.

과당을 사이코스로 전환하는 활성이 우수한 신규 Ensifer 속 균주(예컨대, Ensifer adhaerens)를 토양으로부터 분리 및 동정 하였으며, 상기 균주의 균체를 사용하여 과당에서 사이코스로의 전환능을 확인하고, 높은 사이코스 전환능을 얻기 위한 균체 반응의 최적 온도, 최적 pH 및 금속 이온 요구성 여부를 확인하여 사이코스를 효율적으로 대량 생산하기 위한 조건을 확립하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 일 예는 과당을 사이코스로 전환하는 신규 Ensifer 속 균주를 제공한다. 상기 Ensifer 속 균주는, 예컨대, Ensifer adhaerens일 수 있다.

다른 예는 상기 균주를 이용하여 과당으로부터 사이코스를 생산하는 방법을 제공한다. 상기 제조 방법에 있어서, 높은 사이코스 전환능을 얻기 위한 균체의 최적 반응 조건 및 사이코스의 대량 생산을 위한 조건을 제안한다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다.

우선, 신규한 Ensifer 속 균주가 제공된다. 상기 Ensifer 속 균주는 과당을 사이코스로 전환하는 활성이 우수한 균주로, Ensifer adhaerens, Ensifer garamanticus, Ensifer sojae , Ensifer mexicanus , Ensifer numidicus 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 예컨대, Ensifer adhaerens 균주일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 Ensifer 속 균주는 기탁번호 KCCM11405P인 Ensifer adhaerens 균주일 수 있다. 상기 Ensifer adhaerens 균주는 16S 리보좀 RNA 서열이 서열번호 1과 같고, 질산염환원능, 유레이즈(Urease) 활성, 베타-글루코시데이즈 활성, 및 베타-갈락토시데이즈 활성을 가지며, 대사 기질로서 D-글루코스, L-아라비노스, D-만노스, D-만니톨, N-아세틸 글루코사민, D-말토스, 및 말산(Malic acid)을 이용할 수 있다. 또한 상기 Ensifer adhaerens 균주는 L-트립토판 분해능, D-글루코스 발효능, 아르기닌 다이하이드로레이즈(Arginine dihydrolase) 활성, 젤라틴 가수분해능, 포타슘 글루코네이트(Potassium gluconate) 이용능, 카프르산(Capric acid) 이용능, 아디프산(Adipic acid) 이용능, 트리소듐 시트레이트(Trisodium citrate)이용능, 및 페닐아세트산(Phenylacetic acid) 이용능은 갖지 않는다.

상기 Ensifer 속 균주는 과당을 사이코스로 전환시키는 사이코스 전환능이 우수한 것을 특징으로 한다. 상기 사이코스 전환능은 상기 Ensifer 속 균주가 과당을 사이코스로 전환시키는 효소를 생산함으로써 얻어지는 것으로, 상기 Ensifer 속 균주는 사이코스 전환능이 높은 효소를 생산하거나 사이코스 전환 효소를 대량으로 생산하여 우수한 사이코스 전환능을 나타낼 수 있다. 따라서, 상기 Ensifer 속 균주는 사이코스 제조에 유용하게 적용될 수 있으며, 사이코스 생산 수율을 보다 증진시킬 수 있다.

따라서, 상기 Ensifer 속 균주의 균체, 상기 균주의 배양물, 및 상기 균주의 파쇄물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 사이코스 생산용 조성물이 제공된다. 상기 배양물은 상기 Ensifer 속 균주로부터 생산된 효소를 포함하는 것으로, 상기 균주의 상기 균주를 포함하거나, 균주를 포함하지 않는 cell-free 형태일 수 있다. 상기 파쇄물은 상기 Ensifer 속 균주를 파쇄한 파쇄물 또는 상기 파쇄물을 원심분리하여 얻어진 상등액을 의미하는 것으로, 상기 Ensifer 속 균주로부터 생산된 효소를 포함하는 것이다. 본 명세서에 있어서, 별도의 언급이 없는 한, 사이코스의 제조에 사용되는 Ensifer 속 균주는 상기 균주의 균체, 상기 균주의 배양물 및 상기 균주의 파쇄물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 의미하는 것으로 사용된다.

또한, 상기 Ensifer 속 균주를 사용하는 사이코스 생산 방법이 제공된다. 상기 사이코스 생산 방법은 상기 Ensifer 속 균주를 과당과 반응시키는 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 Ensifer 속 균주를 과당과 반응시키는 단계는 상기 Ensifer 속 균주의 균체를 과당이 포함된 배양 배지에서 배양하는 단계에 의하여 수행될 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 Ensifer 속 균주를 과당과 반응시키는 단계는 상기 균주(균체, 균주의 배양물, 및/또는 균주의 파쇄물)를 과당과 접촉시키는 단계, 예컨대, 상기 균주를 과당과 혼합하는 단계 또는 상기 균주가 고정화된 담체에 과당을 접촉시키는 단계에 의하여 수행될 수 있다. 이와 같이 Ensifer 속 균주를 과당과 반응시킴으로써 과당을 사이코스로 전환하여 과당으로부터 사이코스를 생산할 수 있다.

상기 사이코스 생산 방법에 있어서, 효율적인 사이코스 생산을 위하여, 기질로서 사용되는 과당의 농도는 전체 반응물 기준으로 40 내지 75%(w/v), 예컨대, 50 내지 75%(w/v)일 수 있다. 과당의 농도가 상기 범위보다 낮으면 경제성이 낮아지고, 상기 범위보다 높으면 과당이 잘 용해되지 않으므로, 과당의 농도는 상기 범위로 하는 것이 좋다. 상기 과당은 완충용액 또는 물(예컨대 증류수)에 용해된 용액 상태로 사용될 수 있다.

상기 사이코스 생산방법에 있어서, 상기 반응은 pH 6 내지 9.5, 예컨대, pH 7 내지 9, pH 7 내지 8 또는 pH 8 내지 9의 조건 하에서 수행될 수 있다. 또한, 상기 반응은 30℃ 이상, 예컨대 40℃ 이상의 온도 조건 하에서 수행될 수 있다. 온도가 80℃ 이상이 되면 기질인 과당의 갈변 현상이 일어날 수 있으므로, 상기 반응은 40 내지 80℃, 예컨대, 50 내지 75℃, 60 내지 75℃, 또는 68 내지 75℃의 조건 하에서 수행될 수 있다. 또한 상기 반응 시간이 길수록 사이코스 전환률이 높아진다. 예컨대, 상기 반응 시간은 1시간 이상, 예컨대 2시간 이상, 3시간 이상, 4시간 이상, 5시간 이상 또는 6시간 이상으로 하는 것이 좋다. 반응시간이 48 시간을 넘어가면 사이코스 전환률의 증가율이 미미하거나 오히려 감소하므로, 반응시간은 48 시간을 넘기지 않는 것이 좋다. 따라서 상기 반응 시간은 1 내지 48시간, 2 내지 48시간, 3 내지 48시간, 4 내지 48시간, 5 내지 48시간, 또는 6 내지 48시간으로 할 수 있으며, 산업적 및 경제적 측면을 고려하여, 1 내지 48시간, 2 내지 36 시간, 3 내지 24 시간, 3 내지 12시간, 또는 3 내지 6시간 정도로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 조건은 과당에서 사이코스로의 전환 효율이 최대화되는 조건으로서 선정된 것이다.

또한, 상기 사이코스 생산 방법에 있어서, 사용되는 균주의 균체 농도는 전체 반응물 기준으로 5 mg(dcw: 건조세포중량)/ml 이상, 예컨대, 5 내지 100mg(dcw)/ml, 10 내지 90mg(dcw)/ml, 20 내지 80mg(dcw)/ml, 30 내지 70 mg(dcw)/ml, 40 내지 60 mg(dcw)/ml, 또는 45 내지 55 mg(dcw)/ml일 수 있다. 균체 농도가 상기 범위 미만인 경우에는 사이코스 전환 활성이 낮거나 거의 없고, 상기 범위를 초과하면 균체가 너무 많아져서 사이코스 전환 반응의 전체적인 효율이 낮아지므로, 균체 농도는 상기 범위로 하는 것이 좋다.

상기 Ensifer 속 균주가 생산하는 과당을 사이코스로 전환시키는 효소(예컨대, 에피머레이즈)는 금속 이온에 의하여 활성화가 조절될 수 있으므로, 상기 Ensifer 속 균주를 이용한 사이코스 생산에 있어서, 금속 이온을 첨가하면 과당에서 사이코스로의 전환 효율, 즉 사이코스 생산률이 증가될 수 있다.

따라서, 상기 Ensifer 속 균주를 포함하는 사이코스 생산용 조성물은 금속 이온을 추가로 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 Ensifer 속 균주를 이용한 사이코스 생산 방법은 금속 이온을 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 금속 이온은 상기 배양 단계의 배양 배지에 첨가되거나, 상기 배양 단계가 상기 금속 이온이 첨가된 배양 배지에서 수행되는 것일 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 금속 이온은 과당에 첨가되거나, 상기 Ensifer 속 균주와 과당과의 혼합물에 첨가될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 Ensifer 속 균주가 고정화된 담체에 첨가되거나(과당 첨가 전), 상기 Ensifer 속 균주가 고정화된 담체와 과당과의 혼합물에 첨가되거나(과당 첨가 후), 또는 과당 첨가시에 과당과 혼합물의 형태로 또는 각각 첨가될 수 있다.

상기 금속 이온은 구리 이온, 망간 이온, 칼슘 이온, 마그네슘 이온, 아연 이온, 니켈 이온, 코발트 이온, 철 이온, 알루미늄 이온 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 예컨대, 상기 금속 이온은 망간 이온, 마그네슘 이온, 니켈 이온, 코발트 이온 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 일 예에서 상기 금속 이온은 망간 이온, 코발트 이온, 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 상기 금속 이온의 첨가량이 0.5mM 미만인 경우에는 사이코스 생산 수율 증진 효과가 미미하므로, 상기 금속 이온의 첨가량은 0.5mM 이상으로 할 수 있다. 한편, 상기 금속 이온의 첨가량이 5mM을 초과하면 그 초과량에 비하여 효과가 미미하기 때문에, 상기 금속 이온의 첨가량은 5mM 이하로 할 수 있다. 예컨대, 상기 금속 이온의 첨가량은 0.5mM 내지 5mM, 예컨대, 0.5 mM 내지 2mM 범위로 할 수 있다.

상기 담체는 고정된 균주, 또는 상기 균주로부터 생산되는 효소의 활성이 장기간 유지될 수 있는 환경을 조성할 수 있는 것으로, 효소 고정화 용도로 사용할 수 있는 공지된 모든 담체일 수 있다. 예컨대, 상기 담체로서 알긴산나트륨(soduim alginate)을 사용할 수 있다. 알긴산나트륨은 해조류의 세포벽에 풍부하게 존재하는 천연 콜로이드성 다당류로, 만누로닉산(β-D-mannuronic acid)과 글루로닉산(α-L-gluronic acid)이 조성되어 있고, 함량면에서는 무작위로 베타-1,4 결합을 이루어 형성되어, 균주 또는 효소가 안정적으로 고정되어 우수한 사이코스 수율을 나타내는 데 유리할 수 있다. 일 구체예에서, 사이코스의 수율을 보다 증진시키기 위하여 1.5 내지 4.0%(w/v) 농도의 알긴산나트륨 용액(예컨대, 알긴산나트륨 수용액), 예컨대 약 2.5%의 (w/v) 농도의 알긴산나트륨 용액을 균주의 고정화에 사용할 수 있다. 예컨대, 균주의 균체, 상기 균주가 생산한 효소를 포함하는 배양액, 또는 상기 균주의 파쇄물의 1 내지 2 부피배의 알긴산나트륨 수용액에 상기 균주의 균체, 상기 균주가 생산한 효소를 포함하는 배양물, 또는 상기 균주의 파쇄물을 첨가하여 혼합한 후, 상기 얻어진 혼합액을 주사기 펌프와 진공 펌프를 사용하여 약 0.2M 칼슘 이온 용액에 떨어뜨려 비드가 생성되도록 함으로써, 알긴산나트륨 담체에 균주의 균체, 상기 균주가 생산한 효소를 포함하는 배양물, 또는 상기 균주의 파쇄물이 고정화시킬 수 있다. 상기 효소는 상기 균주, 균주 배양물 또는 상기 균주의 파쇄물로부터 통상의 방법, 예컨대 투석, 침전, 흡착, 전기영동, 친화 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피 등의 방법에 의하여 정제된 것일 수 있다.

상기 사이코스 생산에 있어서, 비이온성 계면활성제를 추가로 사용함으로써 사이코스 생산 효율을 보다 증진시킬 수 있다. 상기 비이온성 계면활성제는 세포막의 투과성을 높여 세포막 내부에 있는 효소가 유리되도록 하고, 이를 통해 사이코스 생산 효율을 증진시킬 수 있다. 상기 비이온성 계면활성제는 예컨대 옥틸페놀에톡실레이트(트리톤(Triton) X-100; C₁₄H₂₂O(C₂H₄O)_n; n=9 또는 10)일 수 있다(도 8 참조).

따라서, 상기 Ensifer 속 균주를 포함하는 사이코스 생산용 조성물은 비이온성 계면활성제, 예컨대 옥틸페놀에톡실레이트를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 Ensifer 속 균주를 이용한 사이코스 생산 방법은 비이온성 계면활성제를 첨가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 비이온성 계면활성제는 상기 배양 단계의 배양 배지에 첨가되거나, 상기 배양 단계가 상기 비이온성 계면활성제가 첨가된 배양 배지에서 수행되는 것일 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 비이온성 계면활성제는 과당을 포함하는 기질 반응물에 첨가되거나, 상기 Ensifer 속 균주와 기질 반응물의 혼합물에 첨가될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 비이온성 계면활성제는 상기 Ensifer 속 균주가 고정화된 담체에 첨가되거나, 상기 Ensifer 속 균주가 고정화된 담체와 과당의 혼합물에 첨가되거나, 과당 첨가시에 함께 첨가될 수 있다.

사이코스 생산 수율을 고려할 때, 상기 비이온성 계면활성제의 첨가량은 전체 배양물 또는 반응물 부피를 기준으로 0.01 내지 0.5%(v/v), 예컨대 0.05 내지 0.45%(v/v), 0.2 내지 0.45%(v/v), 또는 0.3 내지 0.42%(v/v)일 수 있다.

본 발명에서 제안되는 사이코스 제조 방법은 완충용액을 사용하지 않고 균체를 이용하여 과당을 사이코스로 전환하는 것이 가능하므로, 보다 간편한 방법으로 사이코스를 높은 수율로 생산할 수 있다는 장점이 있다. 도 11에서 보여지는 바와 같이, 완충용액을 사용하지 않고 초기 pH를 앞서 설명한 범위(예컨대, pH 7 내지 9, pH 7 내지 8 또는 pH 8 내지 9)로 하여 반응을 실시하는 경우, 상기한 범위를 벗어나는 경우와 비교하여 사이코스 전환률이 높게 유지될 수 있다.

본 발명은 토양분리 균주 Ensifer adhaerens 균주는 산업적으로 유용한 범위의 pH, 온도에서 안정성을 가지며, 과당으로부터 높은 수율로 사이코스를 생산하는 활성을 가지므로, 기능성 당 관련 건강식품 및 의약 산업에서 폭넓게 사용될 것으로 기대된다.

도 1은 일 실시예에서 분리된 Ensifer adhaerens 균주가 사이코스로부터 과당을 생산한 것을 박층크로마토그래피로 분석 한 결과 나타낸 것이다 (1; 과당과 사이코스 standard, 2-3; Ensifer adhaerens 배양 균체를 파쇄하여 상등액을 사이코스와 반응하여 과당으로 전환된 것을 확인한 결과).
도 2는 고농도 과당으로부터 사이코스가 생산된 것을 HPLC 분석으로 확인한 크로마토 그램을 나타낸 것이다.
도 3은 일 실시예에서 분리된 Ensifer adhaerens 균주의 phylogenetic tree 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4은 균체 농도에 따른 사이코스 생산량을 나타낸 것이다.
도 5는 온도에 따른 사이코스 생산량을 나타낸 것이다.
도 6는 pH에 따른 사이코스 생산량을 나타낸 것이다.
도 7은 금속 이온 종류에 따른 사이코스 생산 상대활성을 나타낸 것이다.
도 8은 Triton X-100 농도에 따른 사이코스 생산량을 나타낸 것이다.
도 9는 일 실시예에서 분리된 Ensifer adhaerens 균주의 온도에 따른 안정성을 나타낸 것이다.
도 10은 반응 6시간 동안 온도별 사이코스 생산성을 나타낸 것이다.
도 11은 완충용액을 사용하지 않고 HCL 및 NaOH를 이용하여 조절한 기질의 초기 pH에 따라 사이코스 생산성을 나타낸 것이다.
도 12는 일 실시예에서 분리된 Ensifer adhaerens 균주의 16s rRNA 서열을 보여준다.

이하 본 발명을 구체적인 실시예에 의해 더 상세히 설명하고자 한다. 하지만 본 발명은 하기 실시예에 한정된 것이 아니며, 본 발명의 사상과 범위 내에서 여러 가지 변형 또는 수정이 가능함은 이 분야에서 당업자에게 명백한 것이다. 따라서, 첨부된 청구항들은 넓게 본 발명의 사상과 범위에 부합되게 해석되어야 한다.

실시예 1. 과당을 사이코스로 전환하는 토양유래 미생물의 분리

과당을 사이코스로 전환하는 균주를 분리하기 위해 1% (w/v)사이코스가 첨가된 최소배지(KH₂PO₄ 2.4g/L, K₂HPO₄ 5.6g/L, (NH₄)₂·SO₄ 2.6g/L, MgSO₄·7H₂O 0.1g/L, yeast extract 1g/L)를 사용하였다.

근권토양 1g을 0.85%(w/v) NaCl 10mL에 현탁하고, 100ul(microliter)를 취해 한천배지에 도말한 후 30℃에서 배양하였다. 상기 한천배지에서 형성된 콜로니 중 모양과 크기가 다른 콜로니를 선별한 후, 상기 최소배지에 접종하여 30℃에서 24시간 진탕배양하고, 원심분리 한 후, 균체만 회수하였다. 회수한 균체는 50mM PIPES(piperazine-N,N'-bis(2-ethanesulfonic acid)) 완충용액 (pH 8.0) 100㎕에 넣어 부유시키고, 음파진동기 (Ultrasonic processor. ColepParmer)를 사용하여 파쇄하였다. 상기 파쇄액을 12,000rpm으로 4℃에서 10분 동안 원심분리하여 상등액을 회수하여 효소액(crude enzyme)으로 사용하였으며, 상기 효소액을 10mM 사이코스를 기질로 하여 30℃에서 8시간 동안 반응시켰다.

박층 크로마토그래피 (TLC) 및 고성능 액체 크로마토 그래피(HPLC) 분석을 통해 상기 반응액에서 사이코스가 과당으로의 전환이 이루어졌는지 확인하였다. 상기 박층 크로마토그래피 분석은 가로 20cm, 세로 5cm의 실리카겔(Silica gel 60 F254(Merck, Germany)) 고정상과 아세토나이트릴(acetonitrile)과 물을 85:15 조건으로 혼합한 이동상 전개용매를 사용하여 3분 30초간 2번씩 전개하여 수행하였다. 상기 액체 크로마토그래피 분석은 Aminex HPX-87C 컬럼(BIO-RAD)이 장착된 HPLC(Agilent, USA)의 Refractive Index Detector를 이용하여 (Agilent 1260 RID) 수행하였다. 이동상 용매는 물을 사용하였고 온도는 80℃, 유속은 0.6ml/min로 하였다.

상기 TLC 분석 결과를 도 1에 나타내었다.

상기 분석을 통해 사이코스에서 과당으로 전환이 확인된 균주를 선별하여 1%(w/v) 과당과 0.05%(w/v) 사이코스가 첨가된 최소배지에 접종하여 30℃에서 24시간 진탕배양 하였으며 원심분리 한 후 균체만 회수하였다. 회수한 균체는 0.85%(w/v) NaCl로 세척한 후, 균체 농도 40mg-dcw/ml 조건에서 400g/L 과당과 1mM 망간 이온을 첨가한 50mM PIPES buffer (pH 8.0)를 넣어 부유시키고, 70℃에서 6시간 동안 균체와 과당과의 반응을 실시하였다. 상기 반응 결과물을 100℃에서 5분간 가열하여 반응을 정지시키고 HPLC를 통하여 사이코스 생산을 확인하였다. 상기 HPLC 분석은 Aminex HPX-87C 컬럼(BIO-RAD)이 장착된 HPLC(Agilent, USA)의 Refractive Index Detector를 이용하여 (Agilent 1260 RID) 앞서 설명한 조건(용매는: 물, 온도:80℃, 유속: 0.6ml/min)으로 수행하였다. 상기 얻어진 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2와 같이 HPLC 분석을 통해 과당에서 사이코스를 가장 많이 생산한 균주 1종을 최종 선정하였다.

실시예 2. 사이코스 전환균주의 동정

상기 실시예 1에서 분리된 균주를 동정하기 위하여 16S 리보좀 RNA의 염기서열 및 생화학적 특성을 확인하였다. 분리 균주의 16S 리보좀 RNA의 염기서열(5'->3')은 서열번호 1 및 도 12와 같으며 도 3에 나타난 바와 같이 염기서열 분석 (phylogenetic tree)을 통해 Ensifer adhaerens와 100% 동일성을 나타냄을 확인하여 Ensifer adhaerens SYG29로 명명하였다. 상기 균주는 2013년 3월 29일자로 한국미생물보존센터에 기탁하여 수탁번호 KCCM11405P를 부여 받았다.

상기 균주의 생화학적 특성을 아래의 표 1에 나타내었다.

구분	반응
질산염 환원능	+
L-트립토판 분해능	-
D-글루코스 발효능	-
Arginine dihydrolase	-
Urease	+
β-glucosidase	+
젤라틴 가수분해능	-
β-galactosidase	+
D-글루코스 이용능	+
L-아라비노스 이용능	+
D-만노스 이용능	+
D-만니톨 이용능	+
N-아세틸 글루코사민 이용능	+
D-말토스 이용능	+
Potassium gluconate 이용능	-
Capric acid 이용능	-
Adipic acid 이용능	-
Malic acid 이용능	+
Trisodium citrate 이용능	-
Phenylacetic acid 이용능	-

실시예 3. 상기 균주의 균체반응을 이용한 사이코스 생산 최적조건 확립

상기에서 분리된 균주의 pH 및 온도 변화에 따른 사이코스 전환률을 조사하기 위하여, 다양한 pH 및 온도 조건 하에서 상기 분리된 균주의 균체와 기질을 반응시키고 사이코스 전환 활성을 비교하였다.

3-1. 균체 농도에 따른 활성 분석

사이코스 생산 최소 균체 농도를 확인하기 위하여, 500g/L 과당과 1mM 망간(Mn) 금속 이온을 첨가한 50mM PIPES buffer (pH 7.0) 용액에, 실시예 1에서 분리된 균주의 균체 농도를 5-50 g(dcw)/L 범위로 변화시키면서, 60℃ 하에서 2시간 동안 반응시키고, 기질 반응 정지를 위해 13,000rpm에서 원심분리 후 상등액을 5분간 가열하여 반응을 종료(정지)시키고 난 후에, HPLC 분석을 통하여 사이코스 생산량을 측정하였다. 상기 HPLC 분석은 Aminex HPX-87C 컬럼(BIO-RAD)이 장착된 HPLC(Agilent, USA)의 Refractive Index Detector를 이용하여 (Agilent 1260 RID) 앞서 설명한 조건(용매는: 물, 온도:80℃, 유속: 0.6ml/min)으로 수행하였다.

상기 얻어진 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타난 바와 같이 균체 농도가 증가할수록 사이코스 생산량도 증가함을 확인하였다. 상기 균체 반응 결과, 균체 농도가 50g(dcw)/L인 경우에 78.2g/L의 사이코스를 생산하여 시험 농도 중에서 최대 활성을 보이는 것으로 나타났고, 최소 5g/L 균체 농도에서도 사이코스 전환 활성이 있음을 확인하였다.

3-2. 온도 따른 활성 분석

사이코스 생산 최적 온도를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1에 서 분리된 균주의 균체 농도가 20mg(dcw)/ml 인 것을 제외하고 실시예 3-1과 동일한 반응 및 분석조건에서, 40 내지 70℃ 범위에서 온도를 변화시키면서, 2시간 동안 반응시키고 반응 종료 후, HPLC 분석을 통하여 사이코스 생산량을 측정하였다.

상기 얻어진 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타난 바와 같이 반응 온도가 높아질수록 활성이 증가하였다. 70℃에서 51.5g/L의 사이코스가 생산되어, 상기 온도에서 최대 활성을 나타내는 것으로 나타났다.

3-3. pH 에 따른 활성 분석

또한 전환반응에서 pH 효과를 조사하기 위하여, 상기 실시예 1에서 분리된 균주의 균체농도 25mg(dcw)/ml 및 과당농도 500 g/L의 1mM 망간 이온을 첨가한 완충용액 McIlvaine(0.1M citric acid 와 0.2M disodium hydrogen phosphate 용액을 pH별로 양을 다르게 첨가하여 제조하는 완충용액) pH 6.0-8.0 및 100mM Glycine pH 8.5-9.5 을 각각 사용하여 각 pH 조건에서 70℃에서 반응시키고 반응 종료 후, 상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 HPLC 분석을 통하여 사이코스 생산량을 측정하였다.

상기 얻어진 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에 나타난 바와 같이 pH 7.0-9.0 범위에서 높은 활성을 나타내었고. 특히, pH7.0-8.0의 중성 pH 범위에서도 사이코스의 효율적인 생산이 가능했다.

3-4. 금속이온에 따른 활성 분석

금속이온 요구성을 확인하기 위하여, 400g/L 과당을 기질로 사용하고, 상기 실시예 1에서 분리된 균주의 균체 농도 20mg(dcw)/ml, 70℃, 및 pH 7.0에서, 50mM PIPES 완충용액에 녹인 1mM 금속이온 (CuCl₂, MnCl₂, CaCl₂, ZnSO₄, MgSO₄, NiSO₄, CoCl₂, 또는 FeSO₄) 용액을 각각 사용하여 2시간 동안 반응시키고 반응 종료 후, 상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 HPLC 분석을 통하여 사이코스 생산량을 측정하였다.

상기 얻어진 결과를 도 7에 나타내었다, 도 7에서 확인되는 바와 같이, 금속이온을 첨가하지 않은 경우와 비교하였을 때, 망간 이온과 코발트 이온을 첨가한 경우에서 비교적 높은 사이코스 전환 활성을 나타내었다.

실시예 4. 사이코스 대량생산을 위한 조건

4-1. 트리톤 ( Triton ) X-100 농도에 따른 생산성

세포막의 투과성을 높여주는 트리톤 X-100을 첨가하면 세포막 내부에 있는 효소가 유리되게 하고 이를 통해 사이코스 생산 시간을 단축할 수 있다.

균체 반응을 통한 사이코스의 효과적인 생산을 위하여, 트리톤 (Triton) X-100의 첨가 농도에 따른 사이코스 생산능력을 확인하였다. 상기 실시예 1에서 분리된 균주의 균체 농도가 20mg(dcw)/ml인 것을 제외하고 실시예 3-1과 동일한 반응(과당 500g/L, 1mM 망간이온 첨가) 및 분석조건(HPLC)에서, 0 내지 0.5%(v/v) 농도의 트리톤 X-100을 첨가하고, 60℃에서 2시간 동안 반응시키고 반응 종료 후, HPLC 분석을 통하여 생산되는 사이코스의 양을 확인하였다.

상기 얻어진 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8에 나타난 바와 같이, 트리톤 첨가에 의하여 트리톤을 첨가하지 않은 경우 (트리톤 농도: 0%(v/v))와 비교하여 사이코스 생산량이 증가한 것을 확인할 수 있으며, 특히 트리톤 농도가 0.4%(v/v)인 경우에 사이코스 생산량이 48.9g/L로 가장 높은 것으로 나타났다.

4-2. 균체의 온도 안정성 분석

상기 분리된 균주의 온도 안정성을 확인하기 위해, 상기 실시예 1에서 분리된 균주의 균체를 1mM 망간 이온을 첨가한 50mM PIPES 완충용액으로 부유시키고 온도를 55℃ 또는 60℃로 22시간 열충격을 가하였다. 실시예 3-1과 동일한 방법으로 최종 과당 농도 400g/L, 균체 농도 20mg(dcw)/ml로 하고, 55℃에서 1시간 더 반응시킨 후 열충격이 가해진 시간 별 사이코스 생산량을 HPLC 분석을 통하여 측정하여 사이코스 전환 활성을 얻었다.

상기 얻어진 결과를 도 9에 나타내었다. 도 9에 나타난 바와 같이, 55℃에서 열충격을 가한 경우, 열충격을 가하지 않은 경우의 사이코스 전환 활성을 비교하였을 때, 22시간 이후 상대활성이 약 52% 유지되는 것을 확인하였다. 60℃에서는 열충격을 가한 경우 22시간 이후 상대활성이 10%까지 감소하였으며 이를 통해 활성의 반감기는 456분(7.6 시간)으로 확인되었다.

4-3. 사이코스 생산성

상기에서 확립된 사이코스 대량생산 조건 하에서 반응 시간에 따른 최대 생산성을 확인하였다. 상기 실시예 1에서 분리된 균주의 균체 농도 40mg-dcw/ml, 500g/L 과당농도 및 pH 7.0 조건 하에서, 온도 조건을 40, 50, 또는 70℃로 하여 상기 실시예 3-1의 방법을 참보하여 반응을 실시하였다. 상기 반응은 6시간 동안 진행하였으며 1시간 간격으로 사이코스 생산성을 HPLC 분석을 통하여 확인하였다. 반응액은 100℃에서 5분간 가열하여 반응을 정지시켰다.

상기 얻어진 결과를 도 10에 나타내었다. 도 10에 나타난 바와 같이, 반응 온도가 증가하고 시간이 지날수록 사이코스 생산성이 증가하였으며, 특히 70℃, 6시간 후 사이코스 최대 생산성을 나타내었다(사이코스 생산량: 130.3g/L; 약 26%의 전환율).

4-4. 초기 pH 에 따른 사이코스 생산성

상기 분리된 균주의 초기 pH에 따른 사이코스 대량생산의 가능성을 확인하기 위하여 완충용액 대신 증류수에 기질을 녹이고 HCl 및 NaOH를 사용해 초기 pH를 조정하였다. 상기 실시예 3-1의 방법을 참조하여, 초기 pH를 6.0, 6.5, 또는 7.0로 하여, 1mM 망간이온, 과당 400g/L, 상기 실시예 1에서 분리된 균주의 균체 농도 40mg-dcw/ml, 및 70℃ 조건에서 0.4%(v/v) 트리톤 X-100을 첨가하여 6시간 동안 반응을 실시하여고 반응 종료 후, HPLC 분석을 통하여 사이코스 생산량을 측정하였다.

상기 얻어진 결과를 도 11에 나타내었다. 도 11에 나타낸 바와 같이, 초기 pH 7.0인 경우 완충용액을 사용하지 않아도 반응 6시간 이후 97.3g/L 사이코스가 생산되어 24.3%의 전환율을 나타냄을 확인하였다.

한국미생물보존센터

KCCM11405P

20130329

<110> SAMYANG GENEX CORPORATION <120> Strain of Ensifer genus and method for producing psicose using the same <130> DPP20131374KR <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1334 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S rRNA of KCCM11405P <400> 1 tgcaagtcga gcgccccgca aggggagcgg cagacgggtg agtaacgcgt gggaatctac 60 ccttttctac ggaataacgc agggaaactt gtgctaatac cgtatacgcc cttcggggga 120 aagatttatc gggaaaggat gagcccgcgt tggattagct agttggtggg gtaaaggcct 180 accaaggcga cgatccatag ctggtctgag aggatgatca gccacattgg gactgagaca 240 cggcccaaac tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg gacaatgggc gcaagcctga 300 tccagccatg ccgcgtgagt gatgaaggcc ctagggttgt aaagctcttt caccggtgaa 360 gataatgacg gtaaccggag aagaagcccc ggctaacttc gtgccagcag ccgcggtaat 420 acgaaggggg ctagcgttgt tcggaattac tgggcgtaaa gcgcacgtag gcggacattt 480 aagtcagggg tgaaatcccg gggctcaacc ccggaactgc ctttgatact gggtgtctag 540 agtatggaag aggtgagtgg aattccgagt gtagaggtga aattcgtaga tattcggagg 600 aacaccagtg gcgaaggcgg ctcactggtc cattactgac gctgaggtgc gaaagcgtgg 660 ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta aacgatgaat gttagccgtc 720 gggcagttta ctgttcggtg gcgcagctaa cgcattaaac attccgcctg gggagtacgg 780 tcgcaagatt aaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt 840 ttaattcgaa gcaacgcgca gaaccttacc agcccttgac atcccgatcg cggattacgg 900 agacgttttc cttcagttcg gctggatcgg agacaggtgc tgcatggctg tcgtcagctc 960 gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa ccctcgccct tagttgccag 1020 catttagttg ggcactctaa ggggactgcc ggtgataagc cgagaggaag gtggggatga 1080 cgtcaagtcc tcatggccct tacgggctgg gctacacacg tgctacaatg gtggtgacag 1140 tgggcagcga gaccgcgagg tcgagctaat ctccaaaagc catctcagtt cggattgcac 1200 tctgcaactc gagtgcatga agttggaatc gctagtaatc gcagatcagc atgctgcggt 1260 gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc atgggagttg gttctacccg 1320 aaggtagtgc gcta 1334

Claims

Ensifer 속 균주를 이용하여 과당으로부터 사이코스를 생산하는 방법으로서, 상기 Ensifer 속 균주는 60 내지 75℃의 온도 조건에서 과당을 사이코스로 전환하는 활성을 가지며, 기탁번호 KCCM11405P을 갖는 Ensifer adhaerens 균주인 사이코스를 생산하는 방법.
제1항에 있어서, 비이온성 계면활성제를 첨가하는 단계를 추가로 포함하는 사이코스를 생산하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 Ensifer 속 균주는 상기 균주의 균체, 상기 균주의 배양물 및 상기 균주의 파쇄물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 사이코스를 생산하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 Ensifer 속 균주를 과당과 반응시키는 단계를 포함하는, 사이코스를 생산하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 Ensifer 속 균주를 과당과 반응시키는 단계는 Ensifer 속 균주를 과당이 포함된 배지에서 배양하는 단계인, 사이코스를 생산하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 Ensifer 속 균주를 과당과 반응시키는 단계는 상기 Ensifer 속 균주의 균체, 상기 균주의 배양물 및 상기 균주의 파쇄물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 과당과 혼합하는 단계인, 사이코스를 생산하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 Ensifer 속 균주를 과당과 반응시키는 단계는 상기 Ensifer 속 균주의 균체, 상기 균주의 배양물 및 상기 균주의 파쇄물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 고정화된 담체에 과당을 접촉시키는 단계인, 사이코스를 생산하는 방법.
제4항에 있어서, 구리, 망간, 칼슘, 마그네슘, 아연, 니켈, 코발트, 철 및 알루미늄으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 금속이온을 첨가하는 단계를 추가로 포함하는, 사이코스를 생산하는 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 완충용액을 사용하지 않는 것을 특징으로 하는, 사이코스를 생산하는 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 과당은 40 내지 75%(w/w)의 농도로 사용되는 것인, 사이코스를 생산하는 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, pH 6 내지 9 및 40 내지 80℃의 조건 하에서 수행되는, 사이코스를 생산하는 방법.
Ensifer 속 균주를 포함하는, 과당으로부터 사이코스를 생산하는 사이코스 생산용 조성물로서, 상기 Ensifer 속 균주는 60 내지 75℃의 온도 조건에서 과당을 사이코스로 전환하는 활성을 가지며, 기탁번호 KCCM11405P을 갖는 Ensifer adhaerens 균주인 사이코스 생산용 조성물.
제12항에 있어서, 상기 조성물은 비이온성 계면활성제를 추가로 포함하는 것인 사이코스 생산용 조성물.
제12항에 있어서, 상기 Ensifer 속 균주는 상기 균주의 균체, 상기 균주의 배양물 및 상기 균주의 파쇄물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 사이코스 생산용 조성물.
삭제
60 내지 75℃의 온도 조건에서 과당을 사이코스로 전환하는 활성을 가지며, 기탁번호 KCCM11405P을 갖는 Ensifer adhaerens 균주.