JP5001016B2

JP5001016B2 - エルロースの製造方法

Info

Publication number: JP5001016B2
Application number: JP2007010137A
Authority: JP
Inventors: 一誠小西
Original assignee: Asahi Kasei Chemicals Corp
Current assignee: Asahi Kasei Chemicals Corp
Priority date: 2007-01-19
Filing date: 2007-01-19
Publication date: 2012-08-15
Anticipated expiration: 2027-01-19
Also published as: JP2008173064A

Description

本発明は、スクロースを含む原料を用い、Geobacillus stearothermophilus由来の微生物触媒を利用して、高選択的にエルロースを製造する方法に関する。

近年、食生活・社会生活が多様化する中で、健康に対する意識向上から消費者の食品や食品素材等への関心が高まっている。その中でエルロースは抗う触性を有することから機能性食品素材として期待されており、さらに、スクロースに近い味質を有することから新しいタイプの甘味料としても注目されている。

これまでに試みられている、実験的あるいは工業的なエルロースの製造方法としては、精製酵素を使用するエルロースの製造方法が挙げられ、蜜蜂由来の精製α−グルコシダーゼを用いたスクロース転移糖の製造方法（非特許文献１）やKluyveromyces marxianus 由来の精製α-グルコシダーゼを用いた転移反応による合成法等(非特許文献２)が報告されている。この他には、エルロース製造触媒として、Bacillus属に属する微生物を培養して得られた菌体を酵素精製等の煩雑な工程を経ることなくそのまま利用するスクロース転移糖（エルロースを含む）の製造方法が挙げられる（特許文献１）。

特開平4-30796号公報 Agric. Biol. Chem., 51(7), 1859-1864, 1987 早稲田大学理工学研究所報告第117輯, 56-61, 1987

精製酵素を用いたエルロースの製造方法は、生成三糖中のエルロース含有率を向上させるという点で有効な方法である。しかしながら、エルロース製造酵素を含有する生物から目的酵素を精製する酵素精製工程が必要となり、プロセスが非常に煩雑なものとなってしまうため、本手法を用いた製法は工業的には実施困難である。さらにその上、蜜蜂由来の精製α−グルコシダーゼを用いたエルロースの製造方法では、エルロース合成反応初期（３時間後）に酵素反応を停止させないと著しくエルロースの分解が進んでしまう上、酵素原料となる蜜蜂を大量に取得することも微生物由来の酵素とは異なり困難である（非特許文献１)。また、Kluyveromyces marxianus 由来の精製α-グルコシダーゼを用いたエルロース合成反応においても蜜蜂由来の精製α−グルコシダーゼと同様の傾向があり、反応初期（３時間後）に酵素反応を停止させないと著しくエルロースの分解が進んでしまう(非特許文献２)。

一方、エルロース製造触媒として、微生物を培養して得られた菌体を酵素精製等の煩雑な工程を経ることなくそのまま利用する方法は、精製酵素を利用する方法と比べてプロセスを簡素化できるため非常に有効な方法である。しかしながら、従来知られている微生物を用いた場合、微生物菌体などを煩雑な酵素精製工程を経ることなくそのまま利用すると、エルロース製造酵素以外の夾雑酵素の影響により、エルロースを主成分として得ることができず、生成三糖中にケスト−ス等のエルロース以外の夾雑三糖が生成してしまい、最終製品からの夾雑三糖の分離が困難になるだけでなく、夾雑酵素による原料の浪費といった問題も生じてしまう。

本発明は、こうした状況のもとに、エルロースの製造において煩雑な酵素精製を必要としない微生物触媒を用い、選択的にエルロースを得ることのできるエルロースの製造方法を提供することを目的とするものである。

これらの課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、本発明者らは、酵素の精製工程を経ることなく微生物そのものを触媒として利用し、エルロース以外の夾雑三糖の生成を抑制したエルロースの製造方法を見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下の（１）〜（８）に示すエルロースの製造方法である。
（１）スクロースを含む原料を用い、Geobacillus stearothermophilus に属する微生物を培養して得た微生物触媒を利用することを特徴とするエルロースの製造方法。
（２）微生物が、Geobacillus stearothermophilus AKC-007株（受託番号ＦＥＲＭＰ−２１１１２）、AKC-008株（受託番号ＦＥＲＭＰ−２１１１３）またはAKC-009株（受託番号ＦＥＲＭＰ−２１１１４）である、（１）に記載のエルロースの製造方法。

（３）生成三糖中のエルロース含有率が５０％以上である、（１）又は（２）に記載のエルロースの製造方法。
（４）生成三糖中のエルロース含有率が７５％以上である、（１）又は（２）に記載のエルロースの製造方法。

（５）反応液中のエルロース濃度が２重量％以上である、（１）から（４）の何れかに記載のエルロースの製造法。
（６）反応液中のエルロース濃度が５重量％以上である、（１）から（4）の何れかに記載のエルロースの製造法。

（７）原料中のスクロース濃度が１５重量％以上である、（１）から（６）の何れかに記載のエルロースの製造法。
（８）原料中のスクロース濃度が５０重量％以上である、（１）から（６）の何れかに記載のエルロースの製造法。

本発明を用いることにより、酵素精製といった煩雑な工程を経ることなく、エルロースを選択的に製造することが可能である。

以下、本発明について具体的に説明する。
本発明を利用した場合、生成三糖中のエルロース含有率を５０％以上に向上することができ、より好ましい条件では７５％以上に、さらに好ましい条件では９０％以上にすることができる。生成三糖中のエルロース含有率が低い場合、生成物からのエルロースの精製が著しく困難となるだけでなく、夾雑三糖生成に伴う原料スクロースの無駄な消費も重大な問題となる。さらに、本発明を利用した場合、反応液中のエルロース濃度は０．３重量％以上にすることができ、より好ましい条件では２重量％以上に、さらに好ましい条件では５重量％以上にすることができ、反応液からの分離が容易となる。

本発明における夾雑三糖とは、エルロース以外の三糖オリゴ糖であって、例えば、マルトトリオース、イソマルトトリオース、メレジトース、パノース、イソパノース、セロトリオース、ケストースなどが挙げられる。

エルロースの製造に用いる微生物触媒としては、通常行われる培養方法によって得られる微生物そのものを利用することができ、エルロースの合成酵素を微生物から精製する必要はない。また、場合によっては、微生物培養液、微生物培養上清を利用することもできる。一方、培養法により得られた微生物は必要に応じて、水や緩衝液等で洗浄した後、利用することもできる。例えば、培養した微生物の培養液、または遠心分離、バッファーによる洗浄等により得た微生物懸濁液、微生物または微生物の処理物(例えば微生物の破砕物等)を懸濁または溶解させた水溶液、あるいは微生物または微生物処理物を包括法、架橋法、又は担体結合法によって固定化したものを用いることができる。固定化する際の固定化担体の例としては、ガラスビーズ、シリカゲル、ポリウレタン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、カラギーナン、アルギン酸等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

本発明に用いる微生物としては、Geobacillus stearothermophilusに属する微生物であればどのようなものを用いてもよく、スクロースからエルロースを合成する活性を有する任意の微生物を用いることができる。好ましくは、Geobacillus stearothermophilus AKC-007株、AKC-008株、AKC-009株が挙げられる。また、本発明における微生物は、Geobacillus stearothermophilusに属する微生物を親株として得られる変異株であってもかまわない。Geobacillus stearothermophilus AKC-007株、AKC-008株、AKC-009株は、それぞれ、平成１８年１１月３０日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東一丁目１番地１中央第６）に寄託されている。受託番号は以下の通りである。
AKC-007株（ＦＥＲＭＰ−２１１１２）
AKC-008株（ＦＥＲＭＰ−２１１１３）
AKC-009株（ＦＥＲＭＰ−２１１１４）

本発明に用いる微生物の培養方法としては、通常の通気攪拌培養あるいは固体培養が用いられ、一般的に行われている微生物の培養方法が適応できる。培地としては、当該微生物が良好に生育し且つ、微生物中のエルロース合成酵素を順調に生産するために必要な炭素源、窒素源、無機塩、必要な栄養源等を含有する合成培地または天然培地が挙げられる。例えば、炭素源としては、グルコース、グリセロール、スクロース、ガラクトース、ラクトース、ラフィノース、セロビオース、エルロース、有機酸、澱粉、オリーブ油、大豆油等を用いることができる。窒素源としては、例えば、硫安、硝安、尿素、アミノ酸、アミン類、アンモニア、各種無機酸や有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素化合物、ペプトン、トリプトン、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、綿実粕、コーンスティープリカー、および大豆粕等があげられる。また、無機塩類としては、第一リン酸カリウム、第二リン酸カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸マンガン、硫酸銅、硫酸鉄、炭酸カルシウム等が用いられる。培養温度は２５〜８０℃が好ましく、より好ましくは４０〜６５℃、さらに好ましくは５０〜６０℃である。また、培地のＰＨは広範囲で選択可能であり、例えば３〜９が好ましい。

本発明において、微生物触媒によるエルロース合成反応直後の反応液中のエルロース濃度を向上させるには、原料糖液のスクロース濃度が高い方が有利である。原料スクロース濃度は１５重量％以上が好ましく、より好ましくは５０重量％以上であり、さらに好ましくは７０重量％以上である。

反応温度は、５〜９０℃、より好ましくは３０〜８０℃であり、さらに好ましくは５０〜７０℃である。反応温度が５℃未満である場合、反応速度が極めて小さく、９０℃を超える温度領域では酵素活性の失活が早く大量の微生物触媒を要するため好ましくない。反応ｐＨは広範囲で調整可能であり、好ましくはｐＨ３〜１０、より好ましくはｐＨ４．５〜８．５である。反応ｐＨが３未満、あるいは１０より大きい場合、触媒の失活が著しく早くなるため好ましくない。本発明においては反応後期にエルロースの分解が著しく進むということは見られないが、工業的利用を考慮すると、反応時間は好ましくは２０分〜２００時間、より好ましくは、１〜１２０時間である。しかしながら、本発明は以上の反応条件や反応形態に限定されるものではなく、適宜選択することができる。

本発明において得られるエルロースは以下の方法により測定される。
［生成三糖中のエルロース含有率の測定方法］
エルロース合成反応終了後、反応液を２５倍希釈して、９９℃で１０分間保持することで反応を停止した。反応停止後、遠心分離により微生物を除去し、得られた反応溶液を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて定量した。測定には、サーモエレクトロン社製Ｈｙｐｅｒｃａｒｂカラム、検出器はＲＩを用いた。生成三糖中のエルロース含有率は、ＨＰＬＣ分析チャートに検出された各々のピーク面積比から（エルロースのピーク面積）／（生成三糖のピーク面積）×１００により算出した。

本発明の方法により製造されるエルロースを精製、分離する方法としては、一般的に用いられている精製処理方法を利用することができる。すなわち、例えば、遠心分離、ＭＦ膜やＵＦ膜等による膜処理、フィルタープレス等により微生物触媒を除き、陽イオン交換クロマトグラフィーや陰イオン交換クロマトグラフィー等のクロマト処理や透析等の脱塩処理により緩衝液や培地等から持ち込まれる塩類等を除去し、さらに、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、活性炭クロマトグラフィー等のクロマト処理や溶解度の差等を利用した結晶化処理、その他の常法に従ってエルロースを分離、精製することができる。クロマト処理はこれらの方法を単独で用いても良いし、組み合わせて用いても良く、移動層方式や擬似移動層方式、多成分分離擬似移動層方式、多成分分離循環方式等を適宜利用することができる。これらの分離、精製方法を利用した場合、エルロースをその他の夾雑オリゴ糖成分から分離することができるだけではなく、様々な結合形態あるいは異なる分子量を有する複数のオリゴ糖から分離することもできる。これらのエルロースの精製、分離処理方法は、バッチ式で行っても良いしカラムを利用するなどして連続的に行っても良い。

以下、実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。

実施例１
Geobacillus stearothermophilus AKC-007株(受託番号ＦＥＲＭＰ−２１１１２：寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター)をTBAB（Tryptose Blood Agar Base）プレート (Difco)で、55℃、1日間培養してコロニーを形成させる。その１白金耳を培地-X (表１、並びに表２〜４参照) 30mLを150mL容三角フラスコに分注したものに接種して、55℃、150rpmで1日間培養した。

本培養1日後、培養菌体10mL分を15mL容チューブに回収した。培養液を回収した15mL容チューブを10000rpmで遠心後、上清を除去した。次に、100mM酢酸Na buffer (pH5)を1mL添加し、再懸濁した後、懸濁液を2mL容エッペンに移した。再度、エッペンを遠心し、上清を除去した後、原料糖液S80（スクロース 80重量%, 100mM酢酸Na buffer (pH5)）を300μL添加し、菌体をボルテックスミキサーでよく懸濁させ、糖合成反応をスタートした。本糖合成反応は反応温度60℃、回転数1200rpmで行った。糖合成反応開始2時間および21時間後に、反応液20μLを回収し、蒸留水480μLとよく混合し、99℃で10分間酵素の熱失活を行った。それぞれの希釈糖液は常温に戻した後、HPLC分析(Hypercarbカラム)した。表５にそれぞれの反応液中のエルロース濃度及び生成三糖中のエルロース含有率を示した。また、反応21時間のHPLCチャートを図.1に示した。図1におけるPeak-2に対応する画分を分取し、13C-NMRで解析した結果、Peak-2はエルロースに対応することを確認した。その他のピークは夾雑オリゴ糖であった。

実施例２
Geobacillus stearothermophilus AKC-008株(受託番号ＦＥＲＭＰ−２１１１３：寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター)をTBAB（Tryptose Blood Agar Base）プレート (Difco)で、55℃、1日間培養してコロニーを形成させる。その１白金耳を培地-X (表.1参照) 30mLを150mL容三角フラスコに分注したものに接種して、55℃、150rpmで1日間培養した。

本培養1日後、培養菌体10mL分を15mL容チューブに回収した。培養液を回収した15mL容チューブを10000rpmで遠心後、上清を除去した。次に、100mM酢酸Na buffer (pH5)を1mL添加し、再懸濁した後、懸濁液を2mL容エッペンに移した。再度、エッペンを遠心し、上清を除去した後、原料糖液S80（スクロース 80重量%, 100mM酢酸Na buffer (pH5)）を300μL添加し、菌体をボルテックスミキサーでよく懸濁させ、糖合成反応をスタートした。本糖合成反応は反応温度60℃、回転数1200rpmで行った。糖合成反応開始2時間および21時間後に、反応液20μLを回収し、蒸留水480μLとよく混合し、99℃で10分間酵素の熱失活を行った。それぞれの希釈糖液は常温に戻した後、HPLC分析(Hypercarbカラム)した。表5にそれぞれの反応液中のエルロース濃度及び生成三糖中のエルロース含有率を示した。

実施例３
Geobacillus stearothermophilus AKC-009株(受託番号ＦＥＲＭＰ−２１１１４：寄託機関；独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター)をTBAB（Tryptose Blood Agar Base）プレート (Difco)で、55℃、1日間培養してコロニーを形成させる。その１白金耳を培地-X (表1参照) 30mLを150mL容三角フラスコに分注したものに接種して、55℃、150rpmで1日間培養した。

実施例４
原料糖液として、原料糖液S80に加えて、原料糖液S62.5（スクロース 62.5重量%, 100mM酢酸Na buffer (pH5)）、原料糖液S40（スクロース 40.0重量%, 100mM酢酸Na buffer (pH5)）、原料糖液S20（スクロース 20.0重量%, 100mM酢酸Na buffer (pH5)）をそれぞれ用いる以外は実施例1と同様の手法を用いて、糖合成反応を実施した。各原料糖液を用いて行った糖合成反応は、それぞれ糖合成反応開始42時間後に、反応液20μLを回収し、蒸留水480μLとよく混合し、99℃で10分間酵素の熱失活を行った。希釈糖液は常温に戻した後、それぞれHPLC分析(Hypercarbカラム)を行った。本結果を表6に示す。

実施例５
原料糖液として、原料糖液S80に加えて、原料糖液S62.5（スクロース 62.5重量%, 100mM酢酸Na buffer (pH5)）、原料糖液S40（スクロース 40.0重量%, 100mM酢酸Na buffer (pH5)）、原料糖液S20（スクロース 20.0重量%, 100mM酢酸Na buffer (pH5)）をそれぞれ用いる以外は実施例2と同様の手法を用いて、糖合成反応を実施した。各原料糖液を用いて行った糖合成反応は、それぞれ糖合成反応開始114時間後に、反応液20μLを回収し、蒸留水480μLとよく混合し、99℃で10分間酵素の熱失活を行った。希釈糖液を常温に戻した後、それぞれHPLC分析(Hypercarbカラム)を行った。本結果を表7に示す。

図１は、AKC-007株によるエルロース合成液HPLCチャート（反応21h）を示す。

Claims

スクロースのみを原料として用い、Geobacillus stearothermophilus に属する微生物を培養して得た微生物触媒を利用することで、生成三糖中のエルロース含有率が５０％以上となることを特徴とするエルロースの製造方法。
微生物が、Geobacillus stearothermophilus AKC-007株（受託番号ＦＥＲＭＰ−２１１１２）、AKC-008株（受託番号ＦＥＲＭＰ−２１１１３）またはAKC-009株（受託番号ＦＥＲＭＰ−２１１１４）である、請求項１に記載のエルロースの製造方法。
生成三糖中のエルロース含有率が７５％以上である、請求項１又は２に記載のエルロースの製造方法。
反応液中のエルロース濃度が２重量％以上である、請求項１から３の何れかに記載のエルロースの製造法。
反応液中のエルロース濃度が５重量％以上である、請求項１から３の何れかに記載のエルロースの製造法。
原料中のスクロース濃度が１５重量％以上である、請求項１から５の何れかに記載のエルロースの製造法。
原料中のスクロース濃度が５０重量％以上である、請求項１から５の何れかに記載のエルロースの製造法。