JP5275640B2 - メリビオースの製造方法 - Google Patents
メリビオースの製造方法Info
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Description
(1) Geobacillus thermocatenulatusに属する菌株由来のα−ガラクトシダーゼを、ガラクトース及びグルコースを含む原料に作用させてメリビオースを製造することを含む、メリビオースの製造方法。
(2) α−ガラクトシダーゼが、Geobacillus thermocatenulatus AKC−011株(受託番号FERM P−21253)、AKC−012株(受託番号FERM P−21254)、AKC−013株(受託番号FERM P−21255)、又はAKC−014株(受託番号FERM P−21256)、あるいはAKC−011株(受託番号FERM P−21253)、AKC−012株(受託番号FERM P−21254)、AKC−013株(受託番号FERM P−21255)、又はAKC−014株(受託番号FERM P−21256)を親株として得られる変異株由来のものである、(1)に記載のメリビオースの製造方法。
(3) 生成物オリゴ糖中のメリビオース含有率が50%以上である、(1)又は(2)に記載のメリビオースの製造方法。
(4) 生成物オリゴ糖中のメリビオース含有率が70%以上である、(1)から(3)の何れかに記載のメリビオースの製造方法。
本発明でいうα−ガラクトシダーゼとは、正反応としてα−ガラクトシダーゼの定義(即ち、糖鎖の非還元末端のα−ガラクトシド結合を切断する活性を有する)どおりの反応を行い、逆反応としてグルコース及びガラクト−スを基質としてメリビオース合成反応を行う酵素のことを言う。
AKC-011株(FERM P−21253)
AKC-012株(FERM P−21254)
AKC-013株(FERM P−21255)
AKC-014株(FERM P−21256)
[生成物オリゴ糖中のメリビオース含有率の測定方法]
グルコースとガラクトースを原料としたα−ガラクトオリゴ糖合成反応終了後、反応液を25倍希釈して、99℃で10分間保持することで反応を停止した。反応停止後、さらに糖合成液を20倍希釈し、イオンクロマト分析により、メリビオース蓄積濃度%(w/v)を算出した。また、反応停止後の糖合成液を2倍希釈して、HPLC分析を行い、全二糖蓄積濃度を算出した。イオンクロマト分析には、Carbpac PA1カラム(ダイオネクス社製)を用い、カラム温度35℃、流量1mL/min.で行った。検出器には、パルスドアンペロメトリ検出器を用いた。溶離液としては、水、100mM水酸化ナトリウム水溶液、500mM酢酸ナトリウム水溶液を利用し、0−20分、20−40分、40−45分の各々の段階で水、100mM水酸化ナトリウム水溶液、500mM酢酸ナトリウム水溶液の比率が49/50/1、30/50/20、0/100/0となるようなグラジエント条件で行った。HPLC分析には、Shodex Sugar SCLGガードカラム(昭和電工社製)、Shodex Sugar SC1011カラム(昭和電工社製)、Shodex Sugar SP0810カラム(昭和電工社製)を連結して使用し、カラム温度80℃、流量0.6mL/min.、RI検出器で行った。溶離液には蒸留水を使用した。生成物オリゴ糖中のメリビオース含有率(%)はメリビオース蓄積濃度/全二糖蓄積濃度×100により算出した。
α−ガラクトシダーゼ活性を測定する方法としては、例えば、2.67mMのp−ニトロフェニル−α−D−ガラクトピラノシドを含むpH5.0の100mM酢酸ナトリウム緩衝液450μLに適宜調整した酵素液150μLを混合し、40℃で10分間程度反応させた後、1Mの炭酸ナトリウム水溶液1mLに添加して酵素を失活させ、反応を停止する。得られた溶液の着色度を波長420nmの吸収を測定し、各濃度のp−ニトロフェノールで作製した検量線を用いて濃度を算出する。また、酵素活性は上記条件下で1分間に1μmolのp−ニトロフェノールを遊離させる酵素量を1Uとして評価する。
α−ガラクトシダーゼの熱安定性は各温度条件下に一定時間さらした後に、α―ガラクトシダーゼ活性を測定することにより評価することができる。
Geobacillus thermocatenulatus AKC−011株(受託番号FERM P−21253:寄託機関;独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター)をTBAB(Tryptose Blood Agar Base)プレート (DIFCO)で、55℃、24時間培養してコロニーを形成させる。その1白金耳を培地−A(表.1参照) 100mLを500mL容三角フラスコに分注したものに接種して、55℃、150rpmで28時間培養した。
Geobacillus thermocatenulatus AKC−011株(受託番号FERM P−21253:寄託機関;独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター)をTBAB(Tryptose Blood Agar Base)プレート (DIFCO)で、55℃、24時間培養してコロニーを形成させる。その1白金耳を培地−A(表1参照) 100mLを500mL容三角フラスコに分注したものに接種して、55℃、150rpmで28時間培養した。
実施例1に記載の方法で得られるGeobacillus thermocatenulatus AKC−011株の菌体を100mM酢酸Na buffer(pH5)に懸濁して、4℃および50℃で2時間インキュベートを行い、それぞれα−ガラクトシダーゼ活性測定を行った。活性測定は、100mM酢酸Na buffer(pH5)に溶解させた2.67mMのp−ニトロフェニル−α−D−ガラクトピラノシド450μLに、各温度でインキュベートした菌液150μLを混合し、40℃で10分間反応させた。反応後、遊離されたp−ニトロフェノールを定量することで活性を測定し、4℃および50℃でインキュベートした菌液の活性を算出した。4℃でインキュベートした菌体活性を100とすると、50℃でインキュベートした菌体の活性は97という高い値を示した。
Green coffee beans由来α−ガラクトシダーゼ(SIGMA−ALDRICH製)を用いて実施例3に記載した方法で、熱安定性試験を行ったと。実施例3と同様に、4℃でインキュベートしたα−ガラクトシダーゼの活性を100とすると、50℃でインキュベートしたα−ガラクトシダーゼの活性は50であった。
Claims (3)
- Geobacillus thermocatenulatus AKC−011株(受託番号FERM P−21253)由来のα−ガラクトシダーゼを、ガラクトース及びグルコースを含む原料に作用させてメリビオースを製造することを含む、メリビオースの製造方法。
- 生成物オリゴ糖中のメリビオース含有率が50%以上である、請求項1に記載のメリビオースの製造方法。
- 生成物オリゴ糖中のメリビオース含有率が70%以上である、請求項1または2に記載のメリビオースの製造方法。
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