CN103243048B

CN103243048B - 用于高密度培养深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp的培养基

Info

Publication number: CN103243048B
Application number: CN201310170443.0A
Authority: CN
Inventors: 周祥山; 蒋涛; 蔡孟浩; 张元兴
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2013-05-09
Filing date: 2013-05-09
Publication date: 2015-05-13
Anticipated expiration: 2033-05-09
Also published as: CN103243048A

Abstract

本发明涉及用于高密度培养深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.的培养基，所述培养基含有可溶性淀粉、酵母粉、蛋白胨、氯化钠、无水硫酸镁、氯化镁、氯化钾、氯化钙、磷酸氢二钾、硫酸亚铁铵、氯化镍。本发明的培养基，适合于深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.的生长，且可大大地提高最终获得的菌体密度。

Description

用于高密度培养深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp的培养基

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及用于高密度培养深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.(更佳地是Geobacillus sp.1j)的培养基及其制备方法。

背景技术

常规海洋环境下微生物资源的开发如今已形成相当的规模。但极端环境下的海洋微生物资源的开发还处在逐步发展的阶段，嗜热海洋微生物就是来源于地热含油地质层、深海火山泥、深海热液口等特殊生境的一类微生物资源。嗜热菌因其对高温独特的适应性而备受人们关注，一般是指最适生长温度大于45℃的一类微生物，目前已有约70个属140种嗜热菌得到了鉴定，而嗜热海洋微生物因来源海洋而往往具有特殊性。目前嗜热菌的研究主要集中在资源研究、耐热机制研究和工业应用研究等方面。

深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.1j，是由是由中国海洋第三研究所分离得到的、来源于深海、最适生长温度在60℃的一类中度嗜热微生物。由于其来源于深海这一极端环境，对溶氧、高盐、高温、高压等环境条件可能会有特殊的生理相应，因此可以进行很多新颖性研究和探索。如在应用方面，可探索用其生产相关嗜热酶，也可以克隆其相关的基因转入其他细菌以生产某种工业产品，或作为宿主菌表达某些特殊工业用酶或活性物质。但随着研究的深入，提高相应菌体密度以满足研究需求就显得必不可少。

然而，对于嗜热菌Geobacillus sp.1j而言，菌体密度成为各项研究的瓶颈，特别在其规模化培养领域，如果不能有效提高其菌体密度，就很难进行相应的研究和工业化生产过程。因此通过优化其培养环境、改善其发酵工艺已成为当务之急。培养基是微生物生长的基质，开发一种用于深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.1j提高菌体密度的新型培养基是目前工作的重要基础。

发明内容

本发明的目的在于提供用于深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.高密度培养的培养基，其制备方法及应用。

在本发明的第一方面，提供一种深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.的培养基，所述培养基包括以下组分：

可溶性淀粉 4-20g/L；

酵母粉 2-10g/L；

蛋白胨 2-10g/L；

氯化钠 5-20g/L；

无水硫酸镁 0.1-5g/L；

氯化镁 2-20g/L；

氯化钾 0.01-2g/L；

氯化钙 0.01-1g/L；

磷酸氢二钾 0.02-2g/L；

硫酸亚铁铵 0.001-0.1g/L；和

氯化镍 0.0001-0.001g/L。

在一个优选例中，所述的深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.是Geobacillussp. 1j。

在另一优选例中，所述培养基包括以下组分：

可溶性淀粉 6-18g/L；

酵母粉 3-8g/L；

蛋白胨 3-8g/L；

氯化钠 6-16g/L；

无水硫酸镁 0.8-4g/L；

氯化镁 5-15g/L；

氯化钾 0.1-1.5g/L；

氯化钙 0.05-0.5g/L；

磷酸氢二钾 0.1-1g/L；

硫酸亚铁铵 0.005-0.05g/L；和

氯化镍 0.0003-0.001g/L。

在另一优选例中，所述培养基包括以下组分：

可溶性淀粉 12g/L；

酵母粉 5g/L；

蛋白胨 5g/L；

氯化钠 10g/L；

无水硫酸镁 1.669g/L；

氯化镁 8.92g/L；

氯化钾 0.33g/L；

氯化钙 0.1g/L；

磷酸氢二钾 0.183g/L；

硫酸亚铁铵 0.01g/L；和

氯化镍 0.0005g/L；

其中，各组分在培养基中的含量可在±10%(更佳地±5%)范围内浮动。

在另一优选例中，所述培养基中，还含有有效量(适于细菌生长的量)的微量元素；较佳地，微量元素含量为：

氨三乙酸 0.0128-0.256g/L；

四水合氯化亚铁 0.001-0.02g/L；

四水合氯化锰 0.0005-0.01g/L；

四水合氯化钴 0.0003-0.006g/L；

二水合氯化铜 0.00005-0.001g/L；

钼酸钠 0.00005-0.001g/L；

硼酸 0.00002-0.0004g/L；和

六水合氯化镍 0.00002-0.0004g/L。

在另一优选例中，所述培养基中，各组分配制于水(较佳地，所述的水是去离子水)中；和/或所述培养基的pH值6.35±0.5。

在本发明的另一方面，提供前面任一所述的培养基的用途，用于培养深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.，获得高密度菌体。

在本发明的另一方面，提供一种制备前面任一所述的深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.的培养基的方法，其特征在于，所述方法包括：

(a)将所述可溶性淀粉进行糊化，冷却；

(b)将所述酵母粉、蛋白胨、氯化钠、无水硫酸镁、氯化镁、氯化钾、氯化钙、磷酸氢二钾、硫酸亚铁铵混合；

(c)将上述两步骤得到的溶液混合均匀，添加氯化镍溶液以及可选的微量元素；

其中，各组分的用量按照前面任一所述。

在另一优选例中，在步骤(a)中，所述糊化为用少量水(较佳地为去离子水)将所述可溶性淀粉制成悬浊液，然后缓慢倒入90-100℃去离子水并不断搅拌，制成半透明状液体。

在另一优选例中，步骤(c)之后，进一步包括：将pH调至6.35±0.5，在121℃灭菌20-30min。

在本发明的另一方面，提供一种培养深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.的方法，所述方法包括：利用前面任一所述的培养基培养深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.，从而获得高密度菌体。

在一个优选例中，将深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.按体积比1-3%的接种量接种入前面任一所述的培养基，60℃、静置于高温恒温摇床中发酵培养72-96h，每隔12h进行一次振荡处理，使菌液混合均匀；培养60-96h。

在另一优选例中，用于接种的种子液的OD₆₀₀为1.8-2.4，菌落数密度约为3.6×10⁶-4.8×10⁶CFU/ml。

在本发明的另一方面，提供一种用于培养深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.的试剂盒，所述试剂盒中包括：前面任一所述的培养基。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

具体实施方式

本发明人经过长期而深入的研究，研究开发了一种新的适合于高密度培养深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.(更佳地是Geobacillus sp.1j)的培养基配方。本发明的培养基，适合于深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.的生长，且可大大地提高最终获得的菌体密度。

如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

术语“本发明的深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.的培养基”指含有可溶性淀粉、酵母粉、蛋白胨、氯化钠、无水硫酸镁、氯化镁、氯化钾、氯化钙、磷酸氢二钾、硫酸亚铁铵、氯化镍和可选的微量元素的组合物；或基本上由可溶性淀粉、酵母粉、蛋白胨、氯化钠、无水硫酸镁、氯化镁、氯化钾、氯化钙、磷酸氢二钾、硫酸亚铁铵、氯化镍和可选的微量元素组成的组合物。在组合物中，所述的可溶性淀粉、酵母粉、蛋白胨、氯化钠、无水硫酸镁、氯化镁、氯化钾、氯化钙、磷酸氢二钾、硫酸亚铁铵、氯化镍和可选的微量元素占培养基总重量的80-100%，较佳地占90-100%，更佳地占95-100%，如98%，99%。

作为本发明的优选方式，用于配制本发明的深海海洋嗜热细菌Geobacillussp.(更佳地是Geobacillus sp.1j)培养基的各组分的用量如表1所示。

表1

作为本发明的优选方式，所述的培养基中还添加微量元素，微量元素的添加量以满足菌体生长和生产所需为宜，本领域技术人员可按照经验添加。作为本发明的优选方式，微量元素各组分的用量如表2所示。

表2

在得知本发明的深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.(更佳地是Geobacillussp.1j)培养基所用的组分及其配方以后，本领域技术人员可方便地进行配制。

本发明的培养基的应用的组分(原料)均为商业化的普通化学产品，价格比较低，制备也非常简单，与现有技术的培养基相比，本发明的新型培养基能显著促进深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.生长和分裂，菌体密度得到显著提高，有利于大规模工业化生产。

作为本发明的优选方式，在配制所述的深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.(更佳地是Geobacillus sp.1j)培养基时，先分别准确称取各组分，将它们混合于水中。所述的水较佳地为去离子水。更优选的，提供一种用于制备上述培养基的方法，包括步骤：

(a)将所述可溶性淀粉进行糊化，冷却；

(c)将上述两步骤得到的溶液混合均匀，添加氯化镍溶液以及可选的微量元素。

所述可溶性淀粉需先进行糊化处理，目的是防止灭菌过程中结块的问题。可溶性淀粉的糊化可以采用本领域人员已知的任何方法。作为本发明的优选方式，所述糊化为用少量水(较佳地为去离子水)将所述可溶性淀粉制成悬浊液，然后缓慢倒入90-100℃去离子水并不断搅拌，制成半透明状液体。

作为本发明的优选方式，步骤(c)之后，进一步包括：将pH调至6±0.5，在121℃灭菌20-30min。

本发明还提供了使用所述培养基培养深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.(更佳地是Geobacillus sp.1j)的方法，包括步骤：利用所述的培养基培养深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.，从而获得高密度菌体。

本发明的培养基成分明确，添加量低，成本低廉，制备操作方便，能显著提高深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.1j在高温环境下生长的菌体密度，使得600nm处光吸收密度OD₆₀₀从原来的5提高到13以上，对应的菌体数目由1×10⁷CFU/ml提高到2.6×10⁷CFU/ml。这对于深海海洋嗜热细菌的高温规模化培养的研究和相应产品的研发具有重要的意义。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

此外，采用不同厂家的高温恒温摇床等设备，可能会造成实验结果的少许差异，诸如此类的差异属于正常现象。

实施例1、培养基1

1)可溶性淀粉糊化

称取5g可溶性淀粉用10ml去离子水制成悬浊液，然后缓慢倒入刚煮沸的去离子水中并不断搅拌，制成半透明状均匀的粘稠状液体，冷却。

2)培养基配制

称取酵母粉5g，蛋白胨5g，氯化钠10g，无水硫酸镁1.669g，氯化镁8.92g，氯化钾0.33g，氯化钙0.1g，磷酸氢二钾0.183g，硫酸亚铁铵0.01g，倒入适量去离子水将上述成分充分溶解，再倒入步骤1)制备的冷却的淀粉糊化液，添加微量元素液I10ml，氯化镍溶液(10g/L)50μL，再用去离子水定容至1000ml，pH调节至6.35。

其中制备微量元素液I如下制备：

氨三乙酸12.8g，四水合氯化亚铁1g，四水合氯化锰0.5g，四水合氯化钴0.3g，二水合氯化铜0.05g，钼酸钠0.05g，硼酸0.02g，六水合氯化镍0.02g，其余为去离子水，定容至1000ml，pH调至6.8，长时间使用需要过滤除菌。

3)发酵培养过程

深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.1j由中国海洋第三研究所提供。从已经活化好的固体平板中挑取单菌落，接种至装有80ml活化种子培养基的250ml摇瓶中，60℃、100rpm摇床发酵培养18h，获得新鲜种子液；新鲜种子液新鲜种子液的OD₆₀₀为2.1(菌落数密度约为4.0×10⁶CFU/ml)，按1%(v/v)的接种量将新鲜种子液接入装有50ml所述新型培养基的250ml摇瓶中，60℃，静置于高温恒温摇床中发酵培养96h，每隔12h进行一次100rpm，15min的振荡处理，使菌液混合均匀。培养60h后，每隔12h测定一次OD₆₀₀，直至96h止，取其中最高的值表征菌体密度。

其中，每升活化培养基包含有酵母粉2.5g，蛋白胨2.5g，氨三乙酸0.1g，二水硫酸钙0.04g，氯化镁0.2g，柠檬酸铁0.01675g，微量元素液I0.5ml，磷酸盐缓冲液100ml，其余为去离子水，pH调至7.35左右，在121℃灭菌20-30min。每升磷酸盐缓冲液中含有磷酸氢二钾5.44g，十二水合磷酸氢二钠43g，其余为去离子水，pH调至7.2左右。

4)菌体密度的测定

以去离子水为空白，采用分光光度计测定600nm处的光吸收密度。测定时将菌液混合均匀并稀释到合适的倍数，以使分光光度计的读数在0.2-1之间。测定菌体密度OD₆₀₀为8.06。

实施例2、培养基2

1)可溶性淀粉糊化

将10g可溶性淀粉用20ml去离子水制成悬浊液，然后缓慢倒入刚煮沸的去离子水中并不断搅拌，制成半透明状均匀的粘稠状液体，冷却。

2)培养基配制

3)发酵培养过程

同实施例1的步骤3)。

4)发酵培养测定

同实施例1的步骤4)，测定菌体密度OD₆₀₀为9.86。

实施例3、培养基3

1)可溶性淀粉糊化

称取20g可溶性淀粉用40ml去离子水制成悬浊液，然后缓慢倒入刚煮沸的去离子水中并不断搅拌，制成半透明状均匀的粘稠状液体，冷却。

2)培养基配制

3)发酵培养过程

同实施例1的步骤3)。

4)发酵培养测定

同实施例1的步骤4)，测定菌体密度OD₆₀₀为10.37。

实施例4、培养基4

1)可溶性淀粉糊化

称取15g可溶性淀粉用30ml去离子水制成悬浊液，然后缓慢倒入刚煮沸的去离子水中并不断搅拌，制成半透明状均匀的粘稠状液体。

2)培养基配制

3)发酵培养过程

为便于比较，同实施例1的步骤3)。

4)菌体密度测定

同实施例1的步骤4)，测定菌体密度OD₆₀₀为11.39。

实施例5、培养基5

1)可溶性淀粉糊化

称取12g可溶性淀粉用25ml去离子水制成悬浊液，然后缓慢倒入刚煮沸的去离子水中并不断搅拌，制成半透明状均匀的粘稠状液体，冷却。

2)培养基配制

3)发酵培养过程

同实施例1的步骤3)。

4)菌体密度测定

同实施例1的步骤4)，测定菌体密度OD₆₀₀为13.7。

实施例6、对照组实例

1)可溶性淀粉糊化

称取30g可溶性淀粉用50ml去离子水制成悬浊液，然后缓慢倒入刚煮沸的去离子水中并不断搅拌，制成半透明状均匀的粘稠状液体，冷却。

2)培养基配制

称取酵母粉5g，蛋白胨5g，氯化钠30g，无水硫酸镁1.669g，氯化镁8.92g，氯化钾0.33g，氯化钙0.1g，磷酸氢二钾0.183g，硫酸亚铁铵0.01g，倒入适量去离子水将上述成分充分溶解，再倒入步骤1)的冷却的淀粉糊化液，添加微量元素液I10ml，氯化镍溶液(10g/L)50μL，再用去离子水定容至1000ml，pH调节至7.35。

3)发酵培养过程

同实施例1的步骤3)。

4)菌体密度测定

同实施例1的步骤4)测定菌体密度OD₆₀₀为5。

从实施例1～6可以发现：利用本发明的新型培养基和制备方法，使得深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp.1j每毫升菌液在600nm处的光吸收密度OD₆₀₀达到13，菌落数密度达到2.6×10⁷CFU/ml，较同等培养方法下的对照组提高2-3倍。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp. 1j的培养基，其特征在于，所述培养基包括以下组分：

可溶性淀粉 4-20 g/L；酵母粉 2-10 g/L；蛋白胨 2-10 g/L；氯化钠 5-20 g/L；无水硫酸镁 0.1-5 g/L；氯化镁 2-20 g/L；氯化钾 0.01-2 g/L；氯化钙 0.01-1 g/L；磷酸氢二钾 0.02-2 g/L；硫酸亚铁铵 0.001-0.1 g/L；和氯化镍 0.0001-0.001 g/L。

2. 如权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基包括以下组分：

可溶性淀粉 6-18 g/L；酵母粉 3-8 g/L；蛋白胨 3-8 g/L；氯化钠 6-16 g/L；无水硫酸镁 0.8-4 g/L；氯化镁 5-15 g/L；氯化钾 0.1-1.5 g/L；氯化钙 0.05-0.5 g/L；磷酸氢二钾 0.1-1 g/L；硫酸亚铁铵 0.005 -0.05 g/L；和氯化镍 0.0003-0.001 g/L。

3. 如权利要求2所述的培养基，其特征在于，所述培养基包括以下组分：

可溶性淀粉 12 g/L；酵母粉 5 g/L；蛋白胨 5 g/L；氯化钠 10 g/L；无水硫酸镁 1.669 g/L；氯化镁 8.92 g/L；氯化钾 0.33 g/L；氯化钙 0.1 g/L；磷酸氢二钾 0.183 g/L；硫酸亚铁铵 0.01 g/L；和氯化镍 0.0005 g/L；

其中，各组分在培养基中的含量可在±10%范围内浮动。

4. 如权利要求1-3任一所述的培养基，其特征在于，所述培养基中，还含有有效量的微量元素；微量元素含量为：

氨三乙酸 0.0128-0.256 g/L；四水合氯化亚铁 0.001-0.02 g/L；四水合氯化锰 0.0005-0.01 g/L；四水合氯化钴 0.0003-0.006 g/L；二水合氯化铜 0.00005-0.001 g/L；钼酸钠 0.00005-0.001 g/L；硼酸 0.00002-0.0004 g/L；和六水合氯化镍 0.00002-0.0004 g/L。

5. 如权利要求1-3任一所述的培养基，其特征在于，所述培养基中，各组分配制于水中；和/或

所述培养基的pH值6.35±0.5。

6. 权利要求1-5任一所述的培养基的用途，用于培养深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp. 1j，获得高密度菌体。

7. 一种制备权利要求1-5任一所述的深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp. 1j的培养基的方法，其特征在于，所述方法包括：

(a) 将所述可溶性淀粉进行糊化，冷却；

(b) 将所述酵母粉、蛋白胨、氯化钠、无水硫酸镁、氯化镁、氯化钾、氯化钙、磷酸氢二钾、硫酸亚铁铵混合；

(c) 将上述两步骤得到的溶液混合均匀，添加氯化镍溶液以及可选的微量元素；

其中，各组分的用量按照权利要求1-5任一所述。

8. 一种培养深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp. 1j的方法，其特征在于，所述方法包括：利用权利要求1-5任一所述的培养基培养深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp. 1j，从而获得高密度菌体。

9. 如权利要求8所述的方法，其特征在于，将深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp. 1j按体积比1-3%的接种量接种入权利要求1-5任一所述的培养基，60℃、静置于高温恒温摇床中发酵培养72-96 h，每隔12 h进行一次振荡处理，使菌液混合均匀；培养60-96 h。

10. 一种用于培养深海海洋嗜热细菌Geobacillus sp. 1j的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：权利要求1-5任一所述的培养基。