CN102586216A

CN102586216A - 一种利用海洋弧菌生产褐藻胶裂解酶的方法

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Publication number: CN102586216A
Application number: CN2012100688510A
Authority: CN
Inventors: 蔡孟浩; 周久顺; 周祥山; 张元兴
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2012-03-15
Filing date: 2012-03-15
Publication date: 2012-07-18
Anticipated expiration: 2032-03-15
Also published as: CN102586216B

Abstract

本发明涉及一种利用海洋弧菌生产褐藻胶裂解酶的方法。提供了针对褐藻胶裂解酶生产菌株设计的适合发酵以及高产褐藻胶裂解酶的新型培养基，并提供了利用海洋弧菌高产褐藻胶裂解酶的新方法。

Description

一种利用海洋弧菌生产褐藻胶裂解酶的方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及微生物培养基和微生物发酵工艺；更具体的，本发明涉及一种利用海洋弧菌生产褐藻胶裂解酶的方法。

背景技术

近年来随着海洋药物的蓬勃发展，海藻多糖的研究日益受到重视，褐藻胶便是其中之一。褐藻胶又称褐藻酸钠，是从海带、马尾藻、巨藻中提取的天然高分子多糖聚合物，主要由两种糖醛酸单体聚合而成。褐藻胶具有广泛的应用价值，褐藻胶降解物具有很强的生物活性，以酶法降解褐藻胶为代表的生物降解取代传统的化学降解已成为趋势。褐藻胶裂解酶通过β-消去机制催化褐藻胶的降解在非还原端C4，5间形成不饱和双键，根据作用底物的不同可分为甘露糖醛酸裂解酶(EC4.2.2.3)和古罗糖醛酸裂解酶(EC4.2.2.11)。褐藻胶裂解酶可降解藻类细胞壁制备原生质体，用于藻类基础研究，也可用于研究Fucus细胞壁的发育，甚至作为解聚酶系统的一部分用来研究固氮菌的动力学。另外，褐藻胶裂解酶本身具有一定的药用价值，褐藻胶裂解酶能降解绿脓杆菌的细胞膜，恢复病原菌对抗生素的敏感性，用于辅助治疗绿脓杆菌引起的慢性感染，用其治疗肺部囊性纤维化一直是研究褐藻胶裂解酶的重要目标之一。因此褐藻胶裂解酶的研究生产有着深远的理论意义和应用价值。

近年来，随着褐藻胶裂解酶越来越多的应用于医药、食品、化工、农业、分子生物学、海洋生物学等领域，褐藻胶裂解酶日益成为海洋生物资源研究开发的竞争热点。目前国内外对褐藻胶低聚糖的研究工作主要集中在：1、褐藻胶酵解工艺的研究；2、特定褐藻胶低聚糖分子片段的提取和纯化；3、褐藻胶低聚糖的生理活性的开发和应用等方面。迄今为止，国内外市场均未见有褐藻胶裂解酶制剂的产品，也没有生产性的酶解褐藻胶产物的产品。

中国海洋大学从马尾藻表面分离得到一株产生高效胞外褐藻胶裂解酶的海洋弧菌Vibrio sp.QY102，其产生的褐藻胶裂解酶活性高、pH稳定范围广，甘露糖醛酸活性高于古罗糖醛酸活性，具有重要的开发应用价值。然而原始菌株在现有培养条件下的产酶量较低，且国内外鲜有关于原始菌株产褐藻胶裂解酶的发酵研究的报告。建立褐藻胶裂解酶的发酵工艺对于大规模生产褐藻胶裂解酶并促进其在工农医等领域的应用十分重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用海洋弧菌生产褐藻胶裂解酶的方法。

在本发明的第一方面，提供一种利用海洋弧菌生产褐藻胶裂解酶的方法，该方法包括：

将海洋弧菌接种到以淀粉为碳源的培养基中培养，待海洋弧菌生长到对数生长期末期时，每1-6小时添加褐藻胶0.2-6g/L，诱导海洋弧菌生产褐藻胶裂解酶，至发酵结束。

在一个优选例中，所述的海洋弧菌是能以褐藻胶为碳源，在褐藻胶诱导的情况下产生褐藻胶裂解酶的菌。

在另一优选例中，所述的海洋弧菌选自：海洋弧菌Vibrio sp.QY102，海洋弧菌Vibrio sp.QY101，海洋弧菌Vibrio sp.QY103。

在另一优选例中，每2-5小时添加褐藻胶0.3-4g/L，诱导海洋弧菌生产褐藻胶裂解酶。

在另一优选例中，每3-4小时添加褐藻胶0.5-3g/L(较佳地，为1g/L)。

在另一优选例中，所述的以淀粉为碳源的培养基含有：可溶性淀粉3-7g/L，蛋白胨2-6g/L，酵母提取物1-6g/L，磷酸二氢钾1-3g/L，七水硫酸镁0.06-0.20g/L，氯化钠20-50g/L，混合于水(较佳地，为去离子水)中。

在另一优选例中，所述的以淀粉为碳源的培养基含有：可溶性淀粉4-6g/L，蛋白胨3-5.5g/L，酵母提取物1.5-4g/L，磷酸二氢钾1.5-2.5g/L，七水硫酸镁0.08-0.15g/L，氯化钠30-50g/L，混合于水中。

在另一优选例中，所述的以淀粉为碳源的培养基含有：可溶性淀粉4.5-5.5g/L，蛋白胨4-5g/L，酵母提取物1.8-3g/L，磷酸二氢钾1.5-2g/L，七水硫酸镁0.08-0.12g/L，氯化钠40-45/L，混合于水中。

在另一优选例中，先将可溶性淀粉进行糊化处理，再与其它组分混合。

在另一优选例中，所述的海洋弧菌生长到对数生长期末期为：菌体生长到OD₆₀₀值3.5-4.5(较佳地为4.0)的时期。

在另一优选例中，初始培养时，培养基的pH值是5±1(较佳地5±0.5；较佳地5±0.2)。

在另一优选例中，初始培养之后的整个培养过程不再调节pH值。

在另一优选例中，将海洋弧菌接种到以淀粉为碳源的培养基中的接种量为3～10％(v/v)，如5％(v/v)。

在另一优选例中，将按照OD₆₀₀为2±0.2的海洋弧菌种子液接种到以淀粉为碳源的培养基中。

在另一优选例中，种子培养是在30℃，175r/min摇床培养10～12h；按照菌体浓度OD₆₀₀约为2.0的所述种子液接种到发酵罐中，接种量为3～10％(v/v)。

在另一优选例中，培养条件为：30±2℃，350±100r/min，通气0.2-2vvm(较佳地，1±0.3vvm)，罐压0.02±0.01MPa。

在另一优选例中，在发酵结束后，还包括步骤：从发酵培养基中分离或纯化褐藻胶裂解酶。

在本发明的另一方面，提供一种培养海洋弧菌的培养基，含有：可溶性淀粉3-7g/L，蛋白胨2-6g/L，酵母提取物1-6g/L，磷酸二氢钾1-3g/L，七水硫酸镁0.06-0.20g/L，氯化钠20-50g/L。

在另一优选例中，所述的培养基中，各组分混合于水(较佳地，为去离子水)中。较佳地，先将可溶性淀粉进行糊化处理，再与其它组分混合。

在另一优选例中，所述的培养基中，含有：可溶性淀粉4-6g/L，蛋白胨3-5.5g/L，酵母提取物1.5-4g/L，磷酸二氢钾1.5-2.5g/L，七水硫酸镁0.08-0.15g/L，氯化钠30-50g/L。

在本发明的另一方面，提供所述的培养基的用途，用于培养海洋弧菌生产褐藻胶裂解酶。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、发酵过程每3h添加3g固体褐藻胶的分批发酵的过程曲线，褐藻胶添加总量见实施例1。

图2、发酵过程每3h添加1g固体褐藻胶的分批发酵的过程曲线，褐藻胶添加总量与实施例1相同。

图3、发酵过程每3h添加3g固体褐藻胶至发酵结束的分批发酵的过程曲线。

图4、普通分批发酵过程曲线，褐藻胶在培养基配制时一次性加入。

具体实施方式

针对现有技术中难以大规模获得褐藻胶裂解酶的技术缺陷，本发明人经过深入的研究，第一次针对褐藻胶裂解酶生产菌株设计了适合大规模发酵的新型培养基，并基于代谢研究开发了新型的发酵工艺。

如本文所用，术语“含有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成(制成)”、“基本上由……构成”、和“由……构成”。

如本文所用，所述的“海洋弧菌”是能以褐藻胶为碳源，在褐藻胶诱导的情况下产生褐藻胶裂解酶的菌；例如选自：海洋弧菌Vibrio sp.QY102，海洋弧菌Vibrio sp.QY101，海洋弧菌Vibrio sp.QY103。所述的海洋弧菌产的褐藻胶裂解酶AlyVIII是一种诱导酶。褐藻胶既可以作为其生长的底物也可以作为其产酶的诱导物。本发明人在深入研究后发现，对于这类海洋弧菌来说，褐藻胶作为碳源相对淀粉来说更易被利用，淀粉也不会阻遏酶表达，在培养基中预加淀粉可以延迟菌体进入衰亡期从而延长菌体的产酶期，并且由于其代谢缓慢而延缓发酵液pH的上升，更有利于菌体生长。因此，本发明人采用以下策略来优化菌体产酶：以淀粉为基础碳源支持菌体的生长，待菌体进入对数生长期末期时，菌体浓度已达到一个较高水平(OD₆₀₀约为4.0)，且菌体活性未出现明显下降，于此开始添加褐藻胶诱导菌体产酶。结果发现，与普通分批发酵相比，酶产量有很大提高。

培养基

本发明人优化了用于海洋弧菌发酵的培养基，所述的培养基中包含可溶性淀粉、蛋白胨、酵母提取物、磷酸二氢钾、七水硫酸镁和氯化钠。

作为本发明的优选方式，用于配制本发明的培养基的各组分的用量如表1所示。

表1

	含量	优选量	更优选量	最优选量
					可溶性淀粉	3-7g/L	4-6g/L	4.5-5.5g/L	5g/L
蛋白胨	2-6g/L	3-5.5g/L	4-5g/L	4.7g/L
					酵母提取物	1-6g/L	1.5-4g/L	1.8-3g/L	2g/L
磷酸二氢钾	1-3g/L	1.5-2.5g/L	1.5-2g/L	1.7g/L
					七水硫酸镁	0.06-0.20g/L	0.08-0.15g/L	0.08-0.12g/L	0.1g/L
氯化钠	20-50g/L	30-50g/L	40-45/L	42g/L

上述配方的营养成分溶于水，较佳地为去离子水中，从而为海洋弧菌提供适宜的生长环境。较佳地，先将可溶性淀粉用水进行糊化处理，再与其它组分混合于水中。

当水温高于53℃时，淀粉的物理性能发生明显变化。淀粉在高温下溶胀、分裂形成均匀糊状溶液的特性，称为淀粉的糊化。淀粉的糊化处理是本领域公知的技术。

经本发明人优化后的培养基配方，它含有足够且合理的营养成份，有利于海洋弧菌的生长及大量生产褐藻胶裂解酶。

本发明的培养基还具有原料易得、成本低、制备方法简单的优点。

培养方法

为了克服现有褐藻胶裂解酶发酵产量低的缺点，提供一种适合大规模发酵的新型发酵工艺，为褐藻胶裂解酶的大规模制备及应用奠定基础。本发明的方法是建立在碳源代谢研究的基础上开发出的简单实用高效的工艺。

本发明提供了一种用于海洋弧菌生产褐藻胶裂解酶的新型发酵工艺，其工艺包括步骤：将海洋弧菌接种到以淀粉为碳源的培养基中培养，待海洋弧菌生长到对数生长期末期时，每1-6小时添加褐藻胶0.2-6g/L，诱导海洋弧菌生产褐藻胶裂解酶，至发酵结束。

用于接种的海洋弧菌的种子液可以采用现有技术的种子液，或可根据现有技术进行制备。作为本发明的优选方式，用于接种的海洋弧菌的种子液如下制备：挑取单菌落接种于所述培养基培养10～20h获得适当浓度为OD₆₀₀为1.5～2.5的种子液，取所述种子液按照3～10％的接种量接入发酵罐中进行发酵培养。更佳地，从平板中挑取单菌落接种于所述培养基中，在30℃，175r/min下摇床培养12h，得到菌体浓度OD₆₀₀约为2.0的种子液，按照5％的接种量接入发酵罐中。

本发明的方法中，采用可溶性淀粉为基础碳源，其好处在于能延长菌体的产酶期，抑制发酵过程pH过快上升而带来的不利。因此，在初始pH控制为4～6，之后的整个发酵过程无需再控制pH值，这大大简化了发酵操作流程。更佳地，发酵初始用盐酸调节发酵液pH为5.0，发酵过程不控制pH；所述分批发酵培养是在30℃，350rpm，通气1vvm下。

作为本发明的优选方式，分批添加褐藻胶的发酵过程中，菌体生长至对数生长期末期这一阶段，第一次添加所述褐藻胶，每次添加量为1g/L，之后每3h添加相同量所述褐藻胶。

作为本发明的优选实施例，提供了一种用于海洋弧菌Vibrio sp.QY102生产褐藻胶裂解酶的新型发酵工艺，主要包括：培养基以淀粉为基础碳源，于菌体生长进入对数生长期末期第一次添加褐藻胶，每3h添加1次褐藻胶，添加量为每次1g/L，至发酵结束；发酵过程控制初始pH，发酵过程不再控制pH。本发明中的新型发酵工艺能显著提高酶产量，从原始的6.9U/ml提高到52.7U/ml。本发明的新型发酵工艺适用于大规模生产褐藻胶裂解酶，对褐藻胶裂解酶的发酵研究及褐藻胶裂解酶的推广应用具有重大意义。

本发明的方法制备获得的褐藻胶裂解酶，可以采用现有已知的酶活测定方法来确定酶活性。作为本发明的优选方式，提供了一种对培养液(发酵液)上清粗酶液进行酶活检测的方法，包括步骤：所述发酵液12000rpm离心3min，取上清液粗酶液；向试管中加入2700μl底物，40℃下预热10min，加入300μl所述粗酶液，在40℃反应5min，立即用紫外分光光度计测定反应体系在235nm的吸光值；空白对照是底物加入酶液后立刻测定得到。所述底物的配制步骤包括：0.2mol/L NaH₂PO₄·2H₂O 33ml与0.2mol/L Na₂HPO₄·12H₂O 67ml混合，稀释四倍得到50mmol/L pH 7.1磷酸盐缓冲液。按照0.3％称取褐藻胶加入缓冲液，搅拌溶解。

在发酵结束后，还可以包括步骤：从发酵培养基中分离或纯化褐藻胶裂解酶。从培养产物中分离或纯化褐藻胶裂解酶可采用本领域技术人员熟知的蛋白分离纯化技术。例如，可采用硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose离子交换、凝胶过滤法纯化和亲和层析法纯化。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明的所述新型培养基成分主要是淀粉、褐藻胶、蛋白胨、酵母提取物、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、氯化钠等常见物质，原料易得，成本低，制备简单；

(2)本发明采用可溶性淀粉为基础碳源，通过间断性添加固体褐藻胶使残褐藻胶浓度控制在适当水平，使整个发酵过程不因褐藻胶代谢过快而引起发酵液pH迅速上升，同时由于淀粉的存在也避免了因残糖迅速耗尽导致菌体过早衰亡，使菌种生产能力不能充分发挥。褐藻胶多次添加进一步延长了产酶期。并且，本发明的方法，在褐藻胶诱导的情况下产生分泌到胞外的褐藻胶裂解酶，基础碳源不对酶表达产生阻遏。

(3)本发明的所述发酵工艺控制简单，易于操作，效果明显，主要体现在初始pH控制、固体褐藻胶添加策略及淀粉的选择上，在此发酵工艺下能大幅度提高酶产量。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1、发酵过程每3h添加3g固体褐藻胶的补料分批发酵

1、生物反应器

以下实施例使用的发酵罐为上海国强生化工程装备有限公司生产的FMG-5L发酵罐。

2、培养基配制

称取可溶性淀粉15g，用部分去离子水进行糊化；称取蛋白胨14.1g，酵母提取物6g，磷酸二氢钾5.1g，七水硫酸镁0.3g，氯化钠126g，用部分去离子水溶解；将两者混合定容至3L；装罐后用盐酸调节发酵液pH为5.0。

称量18g固体褐藻胶平分为6份，每份3g装入50ml离心管中；灭菌。

3、发酵培养

海洋弧菌Vibrio sp.QY102由中国海洋大学提供。

从种子平板中挑取单菌落接种于摇瓶中，在30℃，175r/min下摇床培养12h，菌体浓度OD₆₀₀约为2.0，按照5％(v/v)的接种量接入发酵罐中。控制温度30℃，350rpm，通气1vvm，罐压0.02MPa。

发酵7h左右，溶氧开始回升至70％以上，菌体浓度OD₆₀₀约为4.0，菌浓增长减缓，表明生长进入对数生长期末期。此时开始第一次添加固体褐藻胶，每3h添加一次，每次添加3g，添加6次总共18g褐藻胶。通过调节搅拌转速和通气量控制发酵过程溶氧不低于30％。此工艺下发酵61h结束，发酵过程中于49h达到最高酶活43.2U/ml。发酵过程曲线见图1。

实施例2、发酵过程每3h添加1g固体褐藻胶的补料分批发酵

1、生物反应器

同实施例1中“1”。

2、培养基配制

培养基配制同实施例1中“2”。

称量18g固体褐藻胶平分为18份，每份1g装入50ml离心管中；灭菌。

3、发酵培养

同实施例1中“3”。不同点在于：自第一次添加固体褐藻胶开始，每3h添加一次，每次添加1g，添加18次总共18g褐藻胶。

此工艺下发酵61h结束，发酵过程中于49h达到最高酶活36.74U/ml。发酵过程曲线见图2。

实施例3、发酵过程每3h添加3g固体褐藻胶至发酵结束的补料分批发酵

1、生物反应器

同实施例1中“1”。

2、培养基配制

培养基配制同实施例1中“2”。

称量若干份固体褐藻胶，每份3g装入离心管中；灭菌。

3、发酵培养

同实施例1中“3”。

自第一次添加固体褐藻胶开始，每3h添加一次，每次添加3g，至发酵结束。此工艺下发酵61h结束，发酵过程中于33h达到最高酶活52.76U/ml。发酵过程曲线见图3。

对比例1、普通分批发酵

1、生物反应器

同实施例1中“1”。

2、培养基配制

称取可溶性淀粉15g，用部分去离子水进行糊化；称取蛋白胨14.1g，酵母提取物6g，磷酸二氢钾5.1g，七水硫酸镁0.3g，氯化钠126g，用部分去离子水溶解；将两者混合定容至3L；向其中加入18g褐藻胶；装罐后用盐酸调节发酵液pH为5.0，灭菌。

3、发酵培养

从种子平板中挑取海洋弧菌Vibriosp.QY102单菌落接种于摇瓶中，在30℃，175r/min下摇床培养12h，菌体浓度OD₆₀₀约为2.0，按照5％(v/v)的接种量接入发酵培养基中。控制温度30℃，350rpm，通气1vvm，罐压0.02MPa。

此工艺下发酵24h结束，发酵过程中生物量在发酵11h达到最大，OD₆₀₀达到5.6左右，于15h达到最高酶活12.3U/ml。发酵过程曲线见图4。

对比例2、中国海洋大学所给的培养基配方的5L罐分批发酵

除培养基采用常用培养基(褐藻胶5％(w/v)，蛋白胨0.4％(w/v)，磷酸二氢钾0.3％(w/v)，三水磷酸氢二钾0.7％(w/v)，氯化钠2％(w/v)，七水硫酸镁0.01％(w/v)，初始pH6.0)(参考文献：傅晓妍，李京宝，韩峰，路新枝，于文功；褐藻胶裂解酶产生菌Vibrio sp.QY102的发酵条件优化；中国海洋大学学报；2007，37(3)：432-436)外，其余发酵生产褐藻胶裂解酶及酶活测定条件方法同实施例1-4相同。

最终，测得发酵过程中最高酶活为6.9U/ml。

综上所述，本发明中的优化的培养基原料易得、成本低、制备方法简单。与对比例相比，本发明的新型培养基在提供的发酵工艺下能显著促进海洋弧菌Vibrio sp.QY102发酵生产褐藻胶裂解酶，有利于工业规模扩大生产，为褐藻胶裂解酶的大规模制备及应用奠定了基础，也为临床新药的开发应用及功能性褐藻胶寡糖产品的研制提供了技术支持。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种利用海洋弧菌生产褐藻胶裂解酶的方法，其特征在于，该方法包括：

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的海洋弧菌是能以褐藻胶为碳源，在褐藻胶诱导的情况下产生褐藻胶裂解酶的菌。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，每2-5小时添加褐藻胶0.3-4g/L，诱导海洋弧菌生产褐藻胶裂解酶。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的以淀粉为碳源的培养基含有：可溶性淀粉3-7g/L，蛋白胨2-6g/L，酵母提取物1-6g/L，磷酸二氢钾1-3g/L，七水硫酸镁0.06-0.20g/L，氯化钠20-50g/L，混合于水中。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，先将可溶性淀粉进行糊化处理，再与其它组分混合。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的海洋弧菌生长到对数生长期末期为：菌体生长到OD₆₀₀值3.5-4.5的时期。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，初始培养时，培养基的pH值是5±1。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，培养条件为：30±2℃，350±100r/min，通气0.2-2vvm，罐压0.02±0.01MPa。

9.一种培养海洋弧菌的培养基，其特征在于，含有：可溶性淀粉3-7g/L，蛋白胨2-6g/L，酵母提取物1-6g/L，磷酸二氢钾1-3g/L，七水硫酸镁0.06-0.20g/L，氯化钠20-50g/L。

10.权利要求9所述的培养基的用途，用于培养海洋弧菌生产褐藻胶裂解酶。