CN105296454A

CN105296454A - 一种褐藻胶裂解酶基因algp及其制备方法与表达

Info

Publication number: CN105296454A
Application number: CN201410353590.6A
Authority: CN
Inventors: 周祥山; 沈伟; 蔡孟浩; 张元兴
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2014-07-23
Filing date: 2014-07-23
Publication date: 2016-02-03
Anticipated expiration: 2034-07-23
Also published as: CN105296454B

Abstract

本发明涉及一种褐藻胶裂解酶基因algp及其制备方法与表达。揭示了一种海洋弧菌来源的褐藻胶裂解酶，其蛋白稳定性好，生物活性高。本发明还公开了褐藻胶裂解酶基因algp、含有褐藻胶裂解酶基因algp的载体和宿主细胞，以及重组表达褐藻胶裂解酶的方法。本发明的技术方案可以实现以较低的成本大量生产重组褐藻胶裂解酶。

Description

一种褐藻胶裂解酶基因algp及其制备方法与表达

技术领域

本发明涉及生物工程领域，更具体地，本发明涉及一种褐藻胶裂解酶基因algp及其制备方法与表达。

背景技术

广袤无垠的海洋占据着地球71％的面积，是一个巨大的宝库，蕴藏的巨量的生物资源。海藻是其中一种重要的海洋植物，它是无机物的天然富集器，也是许多海洋活性物质的制造者。海藻多糖就是海藻中的一大类重要活性物质，目前国际上应用最广泛最多的海藻多糖是褐藻胶，卡拉胶和琼胶。

褐藻胶是源自于褐藻植物的细胞壁的水溶性酸性多糖，其主要由α-L-古罗糖醛酸和β-D-甘露糖醛酸组成。随着研究的发现，褐藻胶的降解产物具有特别的化学活性与生物活性，在医药卫生、食品工业及化妆品行业等均存在巨大的应用价值。制备褐藻胶降解产物有多种方法，如酸法降解、超声降解、氧化降解、酶降解法等。其中酶法降解相较于化学法制备反应温和、易于控制，耗能低，产物回收率较高以及不会产生严重的污染等优点，更多的研究聚焦于酶法降法制备褐藻胶低聚糖。

但是，目前由于大多数产褐藻胶裂解酶的菌株的活性较低，产量较低，阻碍了褐藻胶低聚糖的制备，进一步阻碍了研究与应用的深入进展。

因此，开发活性高、产量高的褐藻胶裂解酶、提高产褐藻胶裂解酶的菌株的活性成为了本技术领域的当务之急。

发明内容

本发明的目的在于提供一种褐藻胶裂解酶基因algp及其制备方法与表达。

在本发明的第一方面，提供一种褐藻胶裂解酶，其是：

(a)SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的多肽；或

(b)将SEQIDNO:2所示氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-10个；更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽活性的由(a)衍生的多肽；

(c)氨基酸序列与(a)限定的多肽的氨基酸序列有90％以上(较佳地95％以上；更佳地98％以上；更佳地99％以上)相同性且具有(a)多肽活性的多肽；或

(d)具有(a)多肽功能的SEQIDNO:2的蛋白片段。

在一个优选例中，所述的褐藻胶裂解酶来源于海洋弧菌(Vibriosp.)QY102。

在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，该多核苷酸编码所述的褐藻胶裂解酶的多核苷酸。

在一个优选例中，所述的多核苷酸的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。

在本发明的另一方面，提供一种表达载体，它含有所述的多核苷酸。

在一个优选例中，所述的表达载体来源于pet28。

在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体，或基因组中整合有所述的多核苷酸。

在一个优选例中，所述的宿主细胞是原核细胞，较佳地为大肠杆菌细胞，更佳地为HMS174(DE3)。

在本发明的另一方面，提供所述的褐藻胶裂解酶的用途，用于酶解褐藻胶。

在本发明的另一方面，提供一种生产褐藻胶裂解酶的方法，包括步骤：

(1)培养所述的宿主细胞，获得培养物；和

(2)从培养物中分离褐藻胶裂解酶。

在一个优选例中，所述的宿主细胞是大肠杆菌细胞，所述的方法包括：

使所述宿主细胞在5L发酵罐中采用发酵培养基生长，生长到OD₆₀₀＝3±0.5时，开始补稀料，根据溶氧反馈缓慢提升补料速率，待1±0.2L稀料补完换成浓料进行补料；整个发酵过程控制溶氧在30±10％(较佳地30±5％)；菌体生长到OD₆₀₀＝40±3时暂停补料，此时溶氧迅速回升，待停补料约10min后进行IPTG诱导，添加IPTG后维持30±5min后再进行补料，待菌体生长缓慢、酶活不再增长后停止发酵。

在另一优选例中，所述的发酵培养基的组分为：酵母粉2g/L，甘油5g/L，泡敌60μl/L，Na₂HPO₄6g/L，KH₂PO₄3g/L，NH₄Cl1g/L，NaCl0.5g/L，MgSO₄0.5g/L，CaCl₂溶液2ml/L，微量元素2ml/L；

所述的稀料的组分为：蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，甘油60g/L，MgSO₄1.25g/L；

所述的浓料的组分为：蛋白胨80g/L，酵母粉40g/L，甘油240g/L，MgSO₄5g/L；

所述各组分的用量在所指定数值基础上可浮动±20％(较佳地，浮动±10％；更佳地，浮动±5％)。

在本发明的另一方面，提供一种用于酶解褐藻胶的试剂盒，所述的试剂盒中包含所述的褐藻胶裂解酶。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、褐藻胶裂解酶基因algp的核苷酸序列。

图2、根据褐藻胶裂解酶基因algp的核苷酸序列推测的氨基酸序列。

具体实施方式

本发明人经过长期的研究，首次揭示了一种海洋弧菌(Vibriosp.)QY102来源的褐藻胶裂解酶，其编码基因命名为algp。本发明的褐藻胶裂解酶蛋白稳定性好，生物活性高。本发明还公开了含有algp基因的表达载体和宿主细胞，以及表达该褐藻胶裂解酶的方法。根据本发明的技术方案，可以实现以较低的成本大量生产重组褐藻胶裂解酶。

如本文所用，所述的“褐藻胶裂解酶活性”是以酶的活力单位来定义的。酶活力单位(U)定义为：在实验条件下，每分钟催化底物产生lμg还原糖所需的酶量。发酵液酶活力单位定义为：每毫升发酵液含酶活单位(U/m1)。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的褐藻胶裂解酶或多肽(蛋白)”是指褐藻胶裂解酶基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化褐藻胶裂解酶。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。

本发明的褐藻胶裂解酶多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。

本发明还包括褐藻胶裂解酶的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然褐藻胶裂解酶相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“褐藻胶裂解酶”指具有裂解褐藻胶的活性的SEQIDNO:2序列的多肽。该术语还包括具有与褐藻胶裂解酶相同功能的、SEQIDNO:2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-20个，更佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个、1-3个、或1-2个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括褐藻胶裂解酶的活性片段和活性衍生物。

多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与褐藻胶裂解酶DNA杂交的DNA所编码的蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含褐藻胶裂解酶或其片段的融合蛋白。

发明还提供褐藻胶裂解酶或多肽的类似物。这些类似物与天然褐藻胶裂解酶的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

在本发明中，“褐藻胶裂解酶保守性变异多肽”指与SEQIDNO:2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个(如1个、2个或3个)氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser

Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明还提供了编码本发明褐藻胶裂解酶或其保守性变异多肽的多核苷酸序列。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQIDNO:1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQIDNO:2的蛋白质，但与SEQIDNO:1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQIDNO:2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少80％(如85％，90％，95％，99％)相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指:(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQIDNO:2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码褐藻胶裂解酶的多聚核苷酸。

本发明的褐藻胶裂解酶核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或褐藻胶裂解酶编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的褐藻胶裂解酶。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码褐藻胶裂解酶的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，褐藻胶裂解酶多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含褐藻胶裂解酶编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的卡那霉素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。

在本发明的优选实施例中，将本发明的褐藻胶裂解酶基因algp用于制备大肠杆菌表达载体pet28-algp，进而制备获得大肠杆菌重组株SW(DE3)。本发明制备的大肠杆菌重组表达菌株SW(DE3)表达水平高，能稳定分泌至胞外上清中，更利于纯化。且多次传代后表达量未有降低。因此，这是一株较为理想的高产菌株。

如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明提供的来源于海洋弧菌(Vibriosp.)QY102的褐藻胶裂解酶是首次被揭示的。本发明基于新发现的褐藻胶裂解酶提供的表达系统和表达方法，用其生产的褐藻胶裂解酶稳定性好，活性高。

本发明的大肠杆菌重组菌株SW(DE3)所表达的重组褐藻胶裂解酶表达水平高，能稳定分泌至胞外上清中，更利于纯化。且多次传代后表达量未有降低，所以通过本发明可以以较低的成本大量生产重组褐藻胶裂解酶。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施列1、褐藻胶裂解酶基因algp部分序列的克隆

使用简并引物以海洋弧菌(Vibriosp.)QY102的基因组为模板进行聚合酶链反应(PCR)克隆褐藻胶裂解酶基因algp，具体操作为：在LB培养基中过夜培养Vibriosp.QY102，使用细菌基因组提取试剂盒提取基因组DNA。使用如下简并引物(其中，N＝A或C或G或T，R＝A或G，Y＝C或T，B＝C或G或T)：

p1：5’-CGNTCNGARCTNCGNGARATG-3’(SEQIDNO:3)，

p2：5’-YTGRTTRTABACBCCBGCYTT-3’(SEQIDNO:4)；

进行梯度PCR反应，条件为：95℃预变性5min，随后95℃30s、45℃-65℃30s、72℃1min进行30个循环，最后在72℃延伸10min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后在550bp左右有一明亮的特异性条带。将该条带切下，经琼脂糖凝胶电泳回收后连接pMD19-T载体(Takara)中后采用标准的氯化钙法转入大肠杆菌top10菌株中，涂布于含有硫酸卡那霉素抗性的LB平板上，过夜培养后挑取单克隆在LB液体培养基(含硫酸卡那霉素)中培养，使用通用引物M13进行PCR验证，正确后将阳性转化子送去测序。通过生物信息学分析该质粒所含的片段确为褐藻胶裂解酶基因的部分序列。

将该阳性转化子命名为pMD19-T-algpp/Top10，将其含有的质粒命名为pMD19-T-algpp。

实施列2、褐藻胶裂解酶基因algp全长的克隆

根据得到的褐藻胶裂解酶algp的部分序列设计染色体步移引物，获取下游片段的引物分别为：

ald1：5’-AGGTCGTTTCATTATCGGTCAG-3’(SEQIDNO:5)，

ald2：5’-AGATCCATGACCAAGATGATGAG-3’(SEQIDNO:6)，

ald3：5’-AGCCAATTCGTTTGTACTACCG-3’(SEQIDNO:7)。

获取上游片段的引物分别为：

alu1：5’-CGGTAGTACAAACGAATTGGCTC-3’(SEQIDNO:8)，

alu2：5’-TCATCATCTTGGTCATGGATCTG-3’(SEQIDNO:9)，

alu3：5’-TGACCGATAATGAAACGACCTAC-3’(SEQIDNO:10)。

根据Takara公司的染色体步移试剂盒说明书对获取上下游片段分别进行3轮PCR反应，经凝胶电泳后获得褐藻胶裂解酶基因algp的部分序列的上游片段约1800bp，下游片段约2500bp。将2个片段分别连接pMD19-T载体后采用标准的氯化钙法转入大肠杆菌Top10菌株中，涂布于含有硫酸卡那霉素抗性的LB平板上，过夜培养后挑取单克隆在LB液体培养基(含硫酸卡那霉素)中培养，使用通用引物M13进行PCR验证，正确后将阳性转化子送去测序。

将测序结果与已获得的褐藻胶裂解酶基因algp的部分序列进行比对拼接，再通过生物信息学方法确定褐藻胶裂解酶基因algp的开放阅读框，得到褐藻胶裂解酶基因algp的序列(图1)，序列全长(含终止子)1581bp(SEQIDNO:1)，编码一个含有526个氨基酸的蛋白质(图2)(SEQIDNO:2)。

实施列3、褐藻胶裂解酶基因algp表达载体的构建

根据得到的褐藻胶裂解酶基因algp全序列设计：

上游引物algexf：5’-AACCGGATCCATGAAACATATTTTTCTAAA-3’(SEQIDNO:11)，

下游引物algexr：5’-GCATCTCGAGTTTACCAGTGTATGTATCATG-3’(SEQIDNO:12)。

用PCR扩增得到褐藻胶裂解酶基因全序列。该PCR条件为95℃预变性5min，随后95℃30s、48℃30s、72℃1min进行30个循环，最后在72℃延伸10min。琼脂糖凝胶电泳显示1550bp左右处有一特异性条带，将其从琼脂糖凝胶上切下，用BamHI和XhoI酶切，琼脂糖凝胶电泳回收1550左右的DNA片段。

将大肠表达载体pET-28a同样用BamHI和XhoI酶切，琼脂糖凝胶电泳回收5300bp的DNA片段，将其与上述所得1550bp的DNA片段连接后，按照标准的氯化钙法转化入大肠杆菌Top10中，筛选具有硫酸卡那霉素抗性的转化子。LB液体培养基(含硫酸卡那霉素)中培养后使用通用引物M13进行PCR验证，PCR验证程序为95℃预变性5min，随后95℃30s、48℃30s、72℃1min进行30个循环，最后在72℃延伸10min。

琼脂糖凝胶电泳显示在1600bp左右有正确条带的为阳性转化子，将对应的正确的菌株送测序，测序显示序列正确，质粒构建正确。

将该阳性转化子命名为pET28a-algp/Top10，含有的质粒命名为pET28a-algp。

实施例4、能高效表达褐藻胶裂解酶的大肠杆菌工程菌株SW(DE3)的构建

将表达载体pET28a-algp按照标准的氯化钙法转入大肠杆菌HMS174(DE3)(购自上海宜腾生物科技有限公司)中，筛选具有硫酸卡那霉素抗性的转化子。LB液体培养基(含硫酸卡那霉素)中培养后使用通用引物M13进行PCR验证，PCR验证程序为95℃预变性5min，随后95℃30s、48℃30s、72℃1min进行30个循环，最后在72℃延伸10min。

琼脂糖凝胶电泳显示，在1600bp左右有正确条带的为阳性转化子，将阳性转化子命名为SW(DE3)。

实施例5、利用大肠杆菌重组株SW(DE3)生产重组褐藻胶裂解酶

挑取大肠杆菌重组株SW(DE3)单克隆接种在5mL含有硫酸卡那霉素的LB培养基中，37℃，200r/min培养过夜，再将过夜培养的菌株1:100接种于3个100mL含有硫酸卡那霉素的LB培养基中培养5小时后1:10接种于5L发酵罐中。

5L发酵罐装液量3L。

发酵培养基组分为：酵母粉2g/L，甘油5g/L，泡敌60μl/L，Na₂HPO₄6g/L，KH₂PO₄3g/L，NH₄Cl1g/L，NaCl0.5g/L，MgSO₄0.5g/L，CaCl₂溶液2ml/L，微量元素2ml/L。

CaCl₂溶液：10g无水CaCl₂溶于1L去离子水中。

微量元素：FeSO₄·7H₂O4.8g/L，MnSO₄·H₂O2.4g/L，ZnSO₄·7H₂O2.4g/L，CuSO₄·5H₂O0.96g/L，1MH₂SO₄2ml/L。

补料培养基：

稀料：蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，甘油60g/L，MgSO₄1.25g/L。

浓料：蛋白胨80g/L，酵母粉40g/L，甘油240g/L，MgSO₄5g/L。

发酵调控过程为：首先进行批培养，利用发酵培养基原有的营养成分进行培养，待菌体生长到约OD₆₀₀＝3左右，培养基初始营养耗完此时开始补稀料，根据溶氧反馈(使溶氧保持在30％左右波动)缓慢提升补料速率，待稀料补完换成浓料进行补料(5L罐发酵时，稀料配1L，待1L稀料都补完时换成浓料进行补料)。整个发酵过程控制溶氧在30％左右。菌体生长到OD₆₀₀＝40左右暂停补料，此时溶氧迅速回升，待停补料约10min后进行IPTG添加，添加后维持30min后再进行补料，期间进行酶活与菌浓的测定，待菌体生长缓慢、酶活不再增长后下罐放料。

酶活测定方法为：

800μl底物(0.3％(w/v)褐藻酸钠溶解于50mMpH7.1磷酸盐缓冲液中，加入200μl酶液，在40℃反应10min后加入0.5mlDNS试剂沸水浴煮沸5min后流水冷却，加入4ml去离子水。最后测定反应体系在540nm的光吸收值。空白对照：800μl底物中加入200μl去离子水测定。

最终胞外蛋白酶活数据最高达到1941U/ml，为海洋弧菌(Vibriosp.)QY102菌株(野生型的QY102菌株)所产酶活的22.37倍，胞内蛋白酶活数据最高达到2731U/ml，为海洋弧菌(Vibriosp.)QY102菌株所产酶活的31.48倍，胞内胞外蛋白总酶活数据最高达到4276U/ml，为海洋弧菌(Vibriosp.)QY102菌株所产酶活的49.29倍。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种褐藻胶裂解酶，其特征在于，其是：

(a)SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的多肽；或

(b)将SEQIDNO:2所示氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽活性的由(a)衍生的多肽；

(c)氨基酸序列与(a)限定的多肽的氨基酸序列有90％以上相同性且具有(a)多肽活性的多肽；或

(d)具有(a)多肽功能的SEQIDNO:2的蛋白片段。

2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码权利要求1所述的褐藻胶裂解酶的多核苷酸。

3.如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。

4.一种表达载体，其特征在于，它含有权利要求2所述的多核苷酸。

5.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求4所述的载体，或基因组中整合有权利要求2所述的多核苷酸。

6.权利要求1所述的褐藻胶裂解酶的用途，用于酶解褐藻胶。

7.一种生产褐藻胶裂解酶的方法，其特征在于，包括步骤：

(1)培养权利要求5所述的宿主细胞，获得培养物；和

(2)从培养物中分离褐藻胶裂解酶。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的宿主细胞是大肠杆菌细胞，所述的方法包括：

使所述宿主细胞在5L发酵罐中采用发酵培养基生长，生长到OD₆₀₀＝3±0.5时，开始补稀料，根据溶氧反馈缓慢提升补料速率，待1±0.2L稀料补完换成浓料进行补料；整个发酵过程控制溶氧在30±10％；菌体生长到OD₆₀₀＝40±3时暂停补料，此时溶氧迅速回升，待停补料约10min后进行IPTG诱导，添加IPTG后维持30±5min后再进行补料，待菌体生长缓慢、酶活不再增长后停止发酵。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的发酵培养基的组分为：酵母粉2g/L，甘油5g/L，泡敌60μl/L，Na₂HPO₄6g/L，KH₂PO₄3g/L，NH₄Cl1g/L，NaCl0.5g/L，MgSO₄0.5g/L，CaCl₂溶液2ml/L，微量元素2ml/L；

所述各组分的用量在所指定数值基础上可浮动±20％。

10.一种用于酶解褐藻胶的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包含权利要求1所述的褐藻胶裂解酶。