CN102465136A - 金银花查尔酮异构酶(LjCHI)基因及其编码的蛋白和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种查尔酮异构酶基因及其编码的蛋白酶与用途，该基因为首次从金银花的cDNA文库中得到，填补了我国传统中药材金银花中分离克隆出查尔酮异构酶基因的空白。本发明所提供的查尔酮异构酶基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或者添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸的同源序列或其等位基因及其衍生的核苷酸序列。所述基因编码的蛋白质具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列或者添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸的同源序列。本发明提供的查尔酮异构酶基因可以通过生物技术提高金银花中黄酮类活性成分金银花黄酮类的含量，有助于金银花药材的品质改良，同时可以进行品种选育，具有很好的应用前景。

Description

金银花查尔酮异构酶(LjCHI)基因及其编码的蛋白和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，主要涉及通过构建金银花cDNA文库技术获得查尔酮异构酶基因及其编码产物，属于药用植物基因工程领域。

背景技术

药用植物有效成分(次生代谢产物)的形成是植物次生代谢途径中特有基因群的产物。随着植物功能基因组研究的广泛与深入，独具特色又有广阔应用前景的药用植物次生代谢合成相关功能基因的研究逐渐成为研究的热点，这些基因的克隆将为解析药用植物有效成分的生物合成途径及其调控机制和解释药材品质的形成提供理论基础，同时为利用生物技术提高目标成分含量或直接生产有效成分或中间体带来广阔的应用空间。黄酮类化合物是植物中重要的次生代谢产物之一，且黄酮类成分也已被2010年药典作为金银花的质量控制标准。查尔酮异构酶(chalcone isomerase，CHI)是第1个被认识的黄酮类化合物合成相关酶，也是黄酮代谢途径中的关键酶之一，它催化柚皮苷查尔酮异构化形成有生物活性的二羟基黄烷酮，对植物具有非常重要的生理意义。因此查尔酮异构酶(LjCHI)基因的获得，为用基因工程手段提高金银花有效部位的含量提供重要基础。在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中所提及的金银花黄酮类酶基因及其氨基酸序列。

发明内容

本发明的目的在于提供一种金银花查尔酮异构酶(LjCHI)基因。

本发明第二个目的是提供该基因编码的蛋白质。

本发明还提供了含有该基因的重组载体和宿主细胞。

本发明的另一个目的在于提供该基因的应用。

本发明所提供的金银花查尔酮异构酶(LjCHI)，为以下核苷酸序列之一：

(1)SEQ ID No.1的DNA序列；

(2)在严格条件下与SEQ ID No.1的DNA序列杂交且编码具有金银花查尔酮异构酶活性的蛋白质分子的DNA分子；

(3)编码SEQ ID No.2所示氨基酸序列的核苷酸序列；

(4)编码对SEQ ID No.2经添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸且具有金银花查尔酮异构酶活性的蛋白质的核苷酸序列。

本发明所提供的金银花查尔酮异构酶(LjCHI)，其特征在于，是以下氨基酸序列之一：

(1)具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；

(2)SEQ ID No.2经添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸且具有金银花查尔酮异构酶活性的序列。

含有本发明的金银花查尔酮异构酶(LjCHI)基因全序列或部分序列的重组载体，如原核类载体，真核类表达载体及RNAi载体均属于本发明的保护范围

含有本发明的金银花查尔酮异构酶(LjCHI)基因全序列或部分序列的宿主细胞，如含有上述的重组载体的宿主细胞也属于本发明的保护范围。

所述宿主细胞为有价值的活体材料。

本发明的金银花查尔酮异构酶(LjCHI)基因的应用，包括用所述的重组载体，如植物表达载体转化植物细胞；或者用所述含有该基因的农杆菌与植物细胞共培养，得到转基因的植物发根系；或者用所述的发根细胞再生植株；或者用所述的金银花查尔酮异构酶(LJCHI)基因全序列或部分序列转化获得转基因生物体。

本发明技术方案中涉及的概念具体内容如下：

所说的金银花查尔酮异构酶(LjCHI)基因的DNA分子包括：编码具有金银花查尔酮异构酶(LjCHI)活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸第1-980位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40-55℃条件下与SEQ ID NO.1中从核苷酸第1-980的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO.1中从核苷酸第1-980位的核苷酸序列。本发明分离出的金银花查尔酮异构酶(LjCHI)基因多肽包括：具有SEQ ID NO.2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.2序列的多肽。本发明中的DNA分子包含所述的DNA分子中8-100个连续核苷酸。在本发明中，“分离的”、“纯化的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。

本发明中术语“金银花查尔酮异构酶(LjCHI)(或多肽)”基因指：编码具有金银花查尔酮异构酶(LjCHI)活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1中第1-980位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.1序列的编码框第1-980位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.1，中第1-980位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.2所述的序列。还包括能在中度严谨条件下，更佳的在高度严谨条件下与SEQ ID NO.1中从核苷酸第1-980位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。还包括与SEQ IDNO.1中从核苷酸第1-980位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。还包括能编码具有与天然的金银花查尔酮异构酶(LjCHI)相同功能的蛋白的SEQ ID NO.1中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为，1-90个，较佳地，1-60个，更佳地，1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

本发明中术语“金银花查尔酮异构酶(LjCHI)蛋白或多肽”指：具有金银花查尔酮异构酶(LjCHI)活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。该术语还包括具有与天然金银花查尔酮异构酶(LjCHI)相同功能的SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括金银花查尔酮异构酶(LjCHI)的活性片段和活性衍生物，还包括能够可操作地连于信号肽、启动子或者核糖体结合位点序列所组成的衍生物。本发明的金银花金银花查尔酮异构酶(LjCHI)多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与金银花查尔酮异构酶(LjCHI)DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用金银花查尔酮异构酶(LjCHI)多肽的血清获得的多肽或蛋白。

本发明中金银花查尔酮异构酶(LjCHI)保守性变异多肽指：与SEQ ID NQ.2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽可根据表1，进行替换而产生。

本发明还包括金银花查尔酮异构酶(LjCHI)或多肽的类似物。这些类似物与天然金银花查尔酮异构酶(LjCHI)多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。所述修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。

表1：保守性变异多肽中的取代残基

最初的残基	代表性的取代残基	优选的取代残基
			Ala(A)	Val；Leu；IIe	Val
Arg(R)	Lys；GIn；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Leu
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu

Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

在生产本发明的金银花查尔酮异构酶(LjCHI)多肽时，可以将金银花查尔酮异构酶(LjCHI)基因的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，从而形成金银花查尔酮异构酶(LjCHI)表达载体。所述“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。本发明中宿主细胞为原核细胞或者真核细胞。常用的原核宿主细胞包括大肠杆菌；常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、烟草细胞和其它植物细胞。

本发明还可用Northern印迹法技术分析金银花查尔酮异构酶(LjCHI)基因产物的表达，即分析金银花查尔酮异构酶(LjCHI)的RNA转录物在细胞中的存在和数量。

此外，本发明中可用作探针的核酸分子通常具有金银花查尔酮异构酶(LjCHI)核苷酸编码序列的8-100个连续核苷酸，较佳地具有15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码金银花查尔酮异构酶(LjCHI)的核酸分子。本发明涉及检测样品中是否存在金银花查尔酮异构酶(LjCHI)核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于金银花查尔酮异构酶(LjCHI)核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。此外，根据本发明的金银花查尔酮异构酶(LjCHI)核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选金银花查尔酮异构酶(LjCHI)源基因或同源蛋白。

为了得到与金银花查尔酮异构酶(LjCHI)相关的金银花cDNAs的点阵，可以用DNA探针筛选金银花cDNA文库，这些探针是在低严谨条件下，用³²P对金银花查尔酮异构酶(LjCHI)基因的全部或部分做放射活性标记而得的。最适合于筛选的cDNA文库是来自金银花的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clontech，Stratagene，Palo Alto，Cal.。这种筛选方法可以识别金银花查尔酮异构酶(LjCHI)的基因家族的核苷酸序列。

本发明的金银花查尔酮异构酶(LjCHI)的基因家族的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Solid-hase Peptide Synthesis，WHFreeman Co.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc85：2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。利用本发明的金银花查尔酮异构酶(LjCHI)，通过各种常规筛选方法，可筛选出与金银花查尔酮异构酶(LjCHI)发生相互作用的物质，或者受体、抑制剂或拮抗剂等。

本发明所提供的金银花查尔酮异构酶(LjCHI)基因是首次从金银花中克隆制备的，填补了从我国药物植物金银花查尔酮异构酶(LjCHI)基因的空白。利用本发明可以通过基因工程技术来提高金银花等植物中黄酮类物质的含量，转基因结果显示，金银花金银花查尔酮异构酶(LjCHI)基因对促进金银花黄酮类含量的提高有明显作用。金银花查尔酮异构酶(LjCHI)基因可通过转基因技术用于提高金银花黄酮含量的研究和产业化，尤其可用于中药材金银花的品质改良，对提高金银花黄酮类物质产量具有较好的促进作用，具有很好的应用前景。

附图说明：

图1：金银花RNA、cDNA、cDNA文库克隆的PCR扩增电泳图；

图2：LjCHI功能域预测分析(来源于NCBI数据库)；

图3：LjCHI系统进化树(邻接法)；

图4：植物表达载体pC1301物理图谱；

具体实施方式

实施例1、金银花全长cDNA文库的构建

1、金银花总RNA的分离和检测

取金银花(Lonicera japonica Thunb)花蕾2g，在研钵中用液氮快速研磨成粉末，快速转移至65℃预热的10mL提取缓冲液中(CTAB(W/V)2％，Tris-HCl(pH8.0)100mmol·L^-1，EDTA 25m mol·L^-1，NaCl 2.0mol·L^-1，PVP402％，亚精胺0.5g/L，巯基乙醇2％)，充分振荡混匀；用等体积氯仿抽提两次，7500g离心15分钟。上清液加入1/4体积的10M LiCl，混匀后放置4℃沉淀过夜；7500g离心20分钟，沉淀用500μL SSTE(SDS 0.5％，NaCl 1mol·L^-1，Tris-HCl(pH8.0)10mmol·L^-1，EDTA 1mmol·L^-1，在65℃溶解5分钟。用等体积氯仿抽提，13000g离心5分钟；上清液加入2倍体积无水乙醇，-70℃放置2h；4℃13000g离心20分钟，沉淀室温干燥10分钟后溶于100μL DEPC处理的水中，用1.0％琼脂糖电泳检测RNA的完整性，用GenQuant核酸定量仪测定A260、A280比值和浓度。置于-80℃冰箱备用。

2、cDNA文库的构建

采用mRNA纯化试剂盒(QuichprepTM Micro mRNA PurifiCation Kit，Pharmacia公司)分离mRNA后，采用Clontech公司的Creator Smart cDNA Library Construction Kit(Cat.No.634903)进行建库，原理为SMART(switch mechanism at 5′end of mRNA template)。

实施例2：金银花相关基因的克隆

随机挑取5000个单克隆进行菌落PCR鉴定。取适量PCR薄壁管，置于冰上，每管先加入17.3ul的灭菌水。用灭过菌的10ul小枪头挑取单克隆白斑至灭菌水中，振荡混匀。依次加入：Taq buffer 2.5μL，MgCl₂(25mM)1.8μL，dNTP(2.5mM)1μL，M13+引物(10pmol)1μL，M13-引物(10pmol)1μL，Taq酶0.4μL。各试剂均加好后，离心机上甩一下，使之沉底，置于PCR仪上。PCR反应条件为94℃预变性5分钟后，94℃40秒，54℃40秒，72℃4分钟，35个循环后72℃延伸10分钟，4℃保存。待PCR反应进入4℃后，取下PCR薄壁管，取7ulPCR产物加入3ul溴芬兰跑电泳，半小时后照相，观察胶图，根据胶图粗略鉴定插入片段的大小及小片段率(图1)。

选择条带单一扩增产物送至华大基因公司进行测序，获得金银花相关基因序列。

实施例3、LjCHI基因的生物信息学分析

本发明涉及的金银花查尔酮异构酶基因全长cDNA的长度为1102bp，详细序列见序列表中的序列1，其中开放读码框位于208～930bp。将金银花全长cDNA序列用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translation+PDB+Swissprot+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸同源性检索。该基因在氨基酸水平上与其它物种中的CHI有较高的同源性(图2和3)。

实施例4、LjCHI基因功能研究

1.植物表达载体的构建

以LjCHI cDNA为模板，利用引物P1：5’-GAGTCAGTGAGCGAGGAAGC  -3’，P2：5’-TTCACGCTTCAGCAACCTTC-3’进行PCR反应，取5ul扩增产物加入3ul溴芬兰跑电泳，半小时后照相，观察胶图，扩增片段为800bp。用BglII和BstEII在37℃下酶切扩增产物2小时，利用回收试剂盒(Takara公司，中国)纯化酶切产物。同时利用BglII和BstEII在37℃下酶切pCAMBIA1301载体2小时，加入5ul溴芬兰进行琼脂糖凝胶电泳，观察胶图，并利用回收试剂盒回收10000bp片段。

将回收的两个片段混合，在DNA连接酶的作用下于16℃反应12小时，连接产物利用CaCl₂法转入大肠杆菌DH5α中，挑取单克隆并在含有50mg/L的LB培养基中培养，利用SDS法提取基因组DNA。利用BglII和BstEII在37℃下酶切DNA 2小时，加入5ul溴芬兰进行琼脂糖凝胶电泳，观察胶图，结果表明完全酶切后存在两个片段，大小分别为10000和800bp。该植物表达载体命名为pC1301(图4)。

2.转基因烟草

利用Gibco BRL电穿孔法将植物表达载体pC1301导入致瘤农杆菌LBA4404。采用叶盘法用含有pC1301的根癌农杆菌转化烟草(Nicotiana tabacum)。筛选转化苗的培养基为MS添加200mg/L潮霉素、500mg/L羧苄霉素和1.0mg/l 6-BA、0.2mg/l NAA；诱导生根培养基为MS。提取T0代转基因苜蓿的总DNA，利用引物P1：5’-AAGCAGAGCTCAAAACCAGAAC-3’、P2：5’-AGCTTGAAGGGGCTAATGAATC-3’进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增片段为800bp，说明LjCHI基因已经整合到烟草的基因组中。

3.转基因烟草代谢产物分析

根据Shelagh R Muir等(Shelagh R Muir，Geof J Collins，Susan Robinson，et aLOverexpression of petunia chalcone isomerase in tomato results in fruit containingin creased levels of flavonols)的方法，取200m干燥叶片测定黄酮的含量。结构表明，转基因烟草中的黄酮含量为非转基因烟草的4倍。

实施例5、突变LjCHI基因的功能分析

根据SEQ ID No.1序列设计突变引物，且在5’端加上PstI酶切位点，3’端加上BglII酶切位点，由上海生工生物技术公司合成引物，序列如下：5’-GAGTCACTGATCGAGGCAGC-3’，通过PCR方法扩增得到1个含有3个碱基突变的LjCHI基因。将突变基因克隆到p1301载体的Pst I/Bgl II酶切位点中，获得系列植物表达载体，采用叶盘法将含有缺失载体的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)分别转化烟草(Nicotiana tabacum)，提取转基因烟草的总黄酮，具体方法同实施例4。结果表明突变基因的转录活性与LjCHI基因没有显著差异。

Claims (5)

1.一种金银花查尔酮异构酶(LjCHI)基因，其特征在于，它是下列核苷酸序列之一：

(1)SEQ ID No.1的DNA序列；

(2)在严格条件下与SEQ ID No.1的DNA序列杂交且编码具有金银花查尔酮异构酶活性的蛋白质分子的DNA分子；

(3)编码SEQ ID No.2所示氨基酸序列的核苷酸序列；

(4)编码对SEQ ID No.2经添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸且具有金银花查尔酮异构酶活性的蛋白质的核苷酸序列。

2.一种金银花查尔酮异构酶(LjCHI)，其特征在于，是以下氨基酸序列之一：

(1)具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；

(2)SEQ ID No.2经添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸且具有金银花查尔酮异构酶活性的序列。

3.重组载体，其特征在于：含有权利要求1所述的金银花查尔酮异构酶(LjCHI)基因全序列或部分序列。

4.宿主细胞，其特征在于：其含有权利要求1所述的金银花查尔酮异构酶(LjCHI)基因全序列或部分序列。

5.要求1所述的基因和权力要求2所述的氨基酸序列在金银花育种中的应用。

Images