CN102080089B - 一种增强植物抗旱等抗逆性的基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明发现了可增强植物抗旱等抗逆能力的基因。本发明构建了包含上述基因的重组载体，分别将它们转化至原核及真核宿主细胞。实验证实，将本发明发现的基因在植物中表达后，获得的转基因植物增强了对干旱的抗性。

Description

一种增强植物抗旱等抗逆性的基因及其应用

技术领域

本发明涉及一种增强植物抗旱等抗逆性的基因，本发明还涉及所述基因在改良植物对干旱胁迫抗性方面的应用。

背景技术

微生物细胞在极端条件下，如寒冷，干旱等环境中会产生冷激反应，并形成一种特殊的蛋白——冷激蛋白(CSP)。已有研究表明，冷激蛋白在转录与翻译过程中起调节子的作用。它们作为一种分子伴侣与单链核酸非特异性结合，具有稳定单链核苷酸二级结构的作用，使细胞在极端环境下存活下来。

将微生物中的冷激蛋白基因转入植物，可以快速获得具有抗逆性状的转基因植物。

Deinococcus gobiensis(D.gobiensis)是一株环境胁迫抗性极强的极端微生物，对于干旱有着较强的耐受性。研究该菌的冷激蛋白基因(csp基因)，有望改良作物的性状，培育出抗干旱的作物新品种。

但尚未见到现有技术中有关D.gobiensis的csp基因提高植物干旱抗性的报道。

发明内容

本发明的目的是从Deinococcus gobiensis基因组中发现能够增强植物抗旱等抗逆性的DNA序列。并将该序列转入植物中，培育抗旱性的转基因植物。

本发明发现如SEQ ID NO：1所示的DNA序列具有增强植物抗旱等抗逆性的功能。序列SEQ ID NO：1来源于D.gobiensis(CGMCC 2358)菌株基因组其中的一段。

本发明还提供了一种重组载体，它包含SEQ ID NO：1所述的DNA。本发明利用上述重组载体转化宿主细胞，这些宿主包括原核细胞，也包括真核细胞。常用的原核宿主细胞包括Trans 109，常用的真核宿主细胞包括酵母细胞和其他植物细胞。

本发明还进行了SEQ ID NO：1所示的DNA序列所编码的氨基酸(SEQ ID NO：2所示)的一级结构和高级结构分析。分析结果表明，所述的氨基酸一级结构，具有相当保守的RNP1与RNP2(单链核苷酸结合模体)；同源建模分析表明，SEQ ID NO：2所示的氨基酸能够形成有利于结合单链核苷酸的桶状结构。

本发明还提供了一种利用转基因技术将SEQ ID NO：1转化入植物的方法，以提高植物对干旱胁迫的抗性，其步骤如下：

(1)将SEQ ID NO：1所示序列可操作地连于植物表达调控序列，形成植物表达载体；

(2)将步骤(1)得到的表达载体转入植物细胞；

(3)经筛选获得转化细胞并最终再生转基因植株及其后代，包括植物种子及植物组织。

上述“可操作地连于”表示如下情况：即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

上述载体可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。

在本发明的一个实例中，将步骤(1)中的表达载体转入农杆菌，将含表达载体的农杆菌同真核宿主细胞共培养，在22-28℃条件下，暗培养1-2天后，通过筛选如抗生素筛选，获得含有SEQ ID NO：1基因的转化细胞并最终再生转基因植株及其后代，包括植物种子及植物组织。

经实验证实，上述转基因植株对干旱胁迫具有增强的抗性作用。

此外，本发明还提供了一种可用作探针的核酸分子，该分子通常具有SEQ ID NO：1核苷酸编码序列的8-100个连续核苷酸，较佳地具有15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码SEQ ID NO：1的核酸分子。

本发明还提供了检测样品中是否存在SEQ ID NO：1核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于SEQ ID NO：1核苷酸编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。

在本发明中，“SEQ ID NO：1”指编码具有SEQ ID NO：2蛋白活性的多肽的核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指所述序列中有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。

在本发明中，“SEQ ID NO：2保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行替换而产生。

表1氨基酸替换表

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala  (A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg  (R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn  (N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp  (D)	Glu	Glu
			Gln  (Q)	Asn	Asn
Glu  (E)	Asp	Asp
			Gly  (G)	Pro；Ala	Ala
His  (H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
			Ile  (I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
Leu  (L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
			Lys  (K)	Arg；Gln；Asn	Arg
Phe  (F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro  (P)	Ala	Ala
Ser  (S)	Thr	Thr
			Trp  (W)	Tyr；Phe	Tyr
Tyr  (Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
			Val  (V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

发明还包括SEQ ID NO：2蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然SEQ ID NO：2多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

还可用Northern印迹法技术分析SEQ ID NO：1基因产物的表达，即分析SEQ ID NO：1的RNA转录物在细胞中的存在与否和数量。

SEQ ID NO：1RNA的Northern印迹分析和SEQ ID NO：2特异抗体的Western印迹分析可以联合使用，以证实SEQ ID NO：1在生物样本中的表达。

此外，根据本发明的核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选SEQ ID NO：1同源基因或同源蛋白。

为了得到与SEQ ID NO：1基因相关的D.gobiensis cDNAs的点阵，可以用DNA探针筛选D.gobiensis cDNA文库，这些探针是在低严紧条件下，用³²P对SEQ ID NO：1的全部或部分做放射活性标记而得的。最适合于筛选的cDNA文库是来自D.gobiensis的文库。构建来自感兴趣的细胞或者组织的cDNA文库的方法是分子生物学领域众所周知的。另外，许多这样的cDNA文库也可以购买到，例如购自Clontech，Stratagene，Palo Alto，Cal.。这种筛选方法可以识别与SEQ ID NO：1相关的基因家族的核苷酸序列。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工化学合成的方法来合成有关序列。在本申请之前，现有技术已完全可以通过先合成多个多核苷酸小片段，然后再进行连接而获得编码本发明D.gobiensis的SEQ ID NO：2蛋白的核酸序列。然后，可将该核酸序列引入本领域中各种现有的DNA分子(如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

除了用重组法产生之外，本发明蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WH Freeman Co.，SanFrancisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 85：2149-2154)。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成仪(Foster City，CA)来自动合成肽。可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。

附图说明

图1是含有SEQ ID NO：1表达载体的大肠杆菌(Escherichia coli)在含3M山梨醇的培养基中生长状况，证明SEQ ID NO：1具有抗旱性功能。图1中的菌株如下：

1号是含空载体(pRADZ₃)的E.coli Trans 109菌株；

2号是含有SEQ ID NO：1序列表达载体的E.coli Trans 109菌株。

图2是含有SEQ ID NO：1表达载体的大肠杆菌在含4M NaCl的培养基中生长状况，证明SEQ ID NO：1具有耐盐抗性。图2中的菌株如下：

1号是含空载体(pRADZ₃)的E.coli Trans 109菌株；

2号是含有SEQ ID NO：1序列表达载体的E.coli Trans 109菌株。

图3，图4和图5是含SEQ ID NO：1核苷酸序列的表达载体在烟草细胞中进行真核细胞表达。其中图3是转基因烟草在MS₂培养基上生长状况，生长状态良好；图4是在MS₃培养基中转基因烟草阴性苗与阳性苗的根系生长状况，转基因烟草的根系生长良好，图5是转基因无菌苗移入珍珠岩中的生长情况，生长状态良好。

图6是部分经PCR检测的阳性转基因烟草植株的Northern blot分析结果，杂交结果表明SEQ ID NO：1核苷酸序列能在转基因烟草中表达。

图7是含SEQ ID NO：1核苷酸序列的转基因植株的抗旱性鉴定结果对比。图中显示对烟草植物停止浇灌2个月后，观察其性状。

图中左边是转基因烟草，右边是非转基因烟草。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于举例说明本发明的方法，而不用于限制本发明的范围。凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1SEQ ID NO：1核苷酸序列在大肠杆菌中的表达和抗性的分析

1.核苷酸序列SEQ ID NO：1的克隆

根据已测序的Deinococcus gobiensis基因组序列设计一对PCR特异性引物，从D.gobiensis基因组DNA中扩增完整的核苷酸序列。

2.构建大肠杆菌表达载体及验证

将上述克隆片段用NdeI和SpeI双酶切消化，与相同酶切过的含D.gobiensis通用启动子groESL的载体pRADZ₃连接，取代lacZ基因，得到大肠杆菌表达载体pRADcsp。转化E.coli Trans 109，涂布于含Amp的LB固体培养基上，挑取单菌落碱裂解法提质粒筛选不同的重组子，用NdeI和SpeI双酶切及测序验证，得到一株含该核苷酸序列表达载体的E.coli Trans 109菌株。酶切分析表明，含groESL启动子的基因片段为530bp。

3.大肠杆菌表达载体的抗旱性功能验证

将OD值相同的含有SEQ ID NO：1核苷酸序列表达载体的E.coli Trans 109菌株和对照pRADZ₃菌株以1％的接菌量分别接种于含有50μg/mL Amp的新鲜的LB液体培养基中，37℃振荡培养，于600nm波长测定OD值，培养菌株至对数期且OD值相同，收集菌体，并重悬于含有适量Amp、3M山梨醇的LB液体培养基中冲击2小时，每个样品立即用无菌去离子水等比稀释至10^-4，取10μL点在LB固体培养基表面，经37℃培养16小时，观察照相。从图1中可看出含有SEQ ID NO：1核苷酸序列表达载体的E.coli Trans109菌株能耐受3M山梨醇，生长状况良好，而只含空载体的E.coli Trans 109菌株在3M山梨醇的培养基中冲击后生长较差。

4.大肠杆菌表达载体的耐盐抗性功能验证

将OD值相同的含有SEQ ID NO：1核苷酸序列表达载体的E.coli Trans 109菌株和对照pRADZ₃菌株以1％的接菌量分别接种于含有50μg/mL Amp的新鲜的LB液体培养基中，37℃振荡培养，于600nm波长测定OD值，培养菌株至对数期且OD值相同，收集菌体，并重悬于含有适量Amp、4M NaCl的LB液体培养基中冲击2小时，每个样品立即用无菌去离子水等比稀释至10^-4，取10μL点在LB固体培养基表面，经37℃培养16小时，观察照相。从图2中可看出含有SEQ ID NO：1核苷酸序列表达载体的E.coli Trans109菌株能耐受4M NaCl，生长状况良好，而只含空载体的E.coli Trans 109菌株在4MNaCl的培养基中冲击后生长较差。

实施例2SEQ ID NO：1核苷酸序列在烟草细胞中进行真核细胞表达及转基因植株的抗旱性鉴定

(一)含目的基因表达载体的构建

根据全长编码序列(SEQ ID NO：1)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在正反引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将序列cDNA克隆至中间载体(如pBluescript)，进一步克隆到双元表达载体(如pBI121和pCAMBIA2200)，在保证阅读框架的前提下鉴定好的表达载体，再将其转入农杆菌中，利用叶盘法技术转化模式植物烟草。

(二)利用叶盘法转化烟草

用无菌牙签挑取YEB选择平板上的阳性菌落，接种于2mL YEB液体(Sm+，Kan+)，28℃，200rpm振荡培养24-36小时；

室温下4,000×g离心10min；弃上清，菌体用1/2MS液体培养基悬浮，稀释到原体积的5-20倍，使菌液的OD₆₀₀＝0.5左右；

取生长两周左右的烟草的无菌叶片，去掉其主叶脉，将其剪成约1平方厘米见方的小叶片；

将叶片放入制备好的菌液中，浸泡2-5min，在无菌滤纸上吸干菌液；

把经侵染的叶片放于MS培养基上，28℃暗培养48小时；

将叶片转到愈伤培养基(MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+Kan 50mg/L+Cb250mg/L)上，25-28℃光照下培养，7-15天可见愈伤组织的形成；

约20天后可见分化芽长出，待芽长大后，切下，置于生根培养基(1/2MS+NAA0.5mg/L+Kan 25mg/L)上进行生根培养，2-7天左右生根；

等根系发达后，将植株取出，用无菌水洗净附着的固体培养基，移入土壤中，刚开始用玻璃罩罩几天，待植株健壮后再取下玻璃罩，温室中培养。图3是转基因烟草在MS₂培养基上生长状况，生长状态良好，图4是在MS₃培养基中转基因烟草阴性苗与阳性苗的根系生长状况，转基因烟草的根系生长良好，图5是转基因无菌苗移入珍珠岩中的生长情况，生长状态良好。

(三)利用Northern blot检测SEQ ID NO：1在转基因烟草植株中的表达

1.RNA的提取：制备参考《分子克隆》(Sambrook等，1989)

2.RNA的定量：参考《分子克隆》(Sambrook等，1989)，分光光度计测OD₂₆₀；RNA含量计算：1OD₂₆₀＝40μg/mL。

3总RNA琼脂糖凝胶电泳分离：1)取6mL 25×电泳缓冲液，加入117mL无菌水，混匀。2)称取1.5g琼脂糖，加入到上述溶液中，于微波炉里加热熔化，转入55℃水浴中。3)于通风橱中取26.8mL甲醛，加入到55℃的凝胶溶液中，混匀。4)迅速倒入制胶板中，室温水平放置30分钟，待胶凝固。5)将提取的RNA30μg溶解于15mLRNA稀释溶液中，在55℃-65℃下加热10分钟，然后立即放在冰上。6)在样品中加入2μL 10×上样缓冲液，混匀。9)在电泳液未盖过胶的条件下点样，80V电压电泳10分钟，待样品全部进入胶后，加电泳液盖过胶面约半厘米。80-100V电泳5小时。

4.RNA尼龙膜上转移：1)转移之前，将尼龙膜用10×SSC浸泡。2)将湿润的膜准确地盖在膜上，将两张与膜大小相同的滤纸置2×SSC溶液中湿润，盖在膜上，排除气泡。3)滤纸上放一叠与膜大小相同的吸水纸，在吸水纸上放一玻璃板和一重物，水平放置，转移12-20小时。4)转移后，将膜于80℃烘烤1-2小时。

5.膜上RNA的检测：1)将膜浸在4×SSC中10分钟，取出膜置滤纸上吸去多余的液体，将膜放入预杂交液中(50％甲酰胺，5×SSC，50mmol/L磷酸钠(Ph6.4)5×Dendart0.1％SDS，0.1mg/mL鲑鱼精DNA)，42℃下预杂交过夜。2)到出预杂交液，换入等量的杂交液，将用³²P标记的DNA探针在沸水中变性5分钟，加入杂交液(50％甲酰胺，5×SSC，50mmol/L磷酸钠(Ph6.4)10％葡聚糖硫酸脂，1×Dendart，0.1％SDS，0.1mg/mL鲑鱼精DNA)中，于42℃杂交24-48小时。3)取出膜，置洗膜液I(1×SSC，1％SDS)中，于42℃漂洗3次，每次5分钟。转入洗膜液II(0.1×SSC，1％SDS)中，于55℃-65℃漂洗1-3次。

用X光片压片1-7天，然后显影、定影。图6是部分经PCR检测的阳性转基因烟草植株的Northern blot分析结果。图6的杂交结果表明SEQ ID NO：1核苷酸序列能在转基因烟草中表达。

(四)含SEQ ID NO：1核苷酸序列的转基因植株的抗旱性鉴定

鉴于该核苷酸序列已被证明在大肠杆菌中对干旱胁迫具有抗性，进一步对转基因植株进行抗旱性鉴定。

对转基因烟草与非转基因烟草植物进行灌溉，然后停止灌溉2个月，观察性状。从图7可知转基因烟草能够正常生长，而非转基因烟草不能生长，结果证明，该序列对干旱的胁迫确有抗性。

SEQUENCE LISTING

<110>中国农业科学院生物技术研究所

<120>一种增强植物抗旱等抗逆性的基因及其应用

<130>09-11

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>263

<212>DNA

<213>deinococcus gobiensis

<400>1

ATGGCTAACG GTAAAGTGAA GTGGTTCAAC GCGGAGAAGG GTTTCGGTTT CATCGAGTCG     60

GCGGGCGGTC CCGACGTGTT CGCGCACTTC AGCGCGATCC AGGGCAGCGG CTTCAAGAAG    120

CTCAACGAAG GCGACGAAGT CGAATTCGAA ATTGAAGAAG GCCAGCGCGG CAAGGGCCCC    180

CAGGCCAAGA ACATCGTCGT GACCAAGGCT GCTCCGGTCA GCTCGTACAA CGACCGTCCG    240

GCCCGCCGCG ACGACCGCTG GTA                                            263

<210>2

<211>87

<212>PRT

<213>deinococcus gobiensis

<400>2

MET Ala Asn Gly Lys Val Lys Trp Phe Asn Ala Glu Lys Gly Phe Gly

1               5                   10                  15

Phe Ile Glu Ser Ala Gly Gly Pro Asp Val Phe Ala His Phe Ser Ala

            20                  25                  30

Ile Gln Gly Ser Gly Phe Lys Lys Leu Asn Glu Gly Asp Glu Val Glu

        35                  40                  45

Phe Glu Ile Glu Glu Gly Gln Arg Gly Lys Gly Pro Gln Ala Lys Asn

    50                  55                  60

Ile Val Val Thr Lys Ala Ala Pro Val Ser Ser Tyr Asn Asp Arg Pro

65                  70                  75                  80

Ala Arg Arg Asp Asp Arg Trp

                85

Claims (5)

1.一种增强植物抗旱等抗逆性的的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.权利要求1所述基因编码的氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.包含SEQ ID NO：1所示基因的重组载体。

4.用权利要求3所述的重组载体转化的宿主细胞，包括原核细胞和真核细胞。

5.权利要求1所述的基因培育抗旱性植物的用途。

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