CN102633870B - 水稻广谱抗稻瘟病基因的克隆及分子标记 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及水稻广谱抗稻瘟病基因的克隆及分子标记。首次筛选到一份抗性广谱突出的籼稻品种，并进而找到该品种中含有的具有广谱抗病性的显性基因，定名为Pigm1。基于该基因，可制备抗病能力增强的转基因植物，或制备出鉴定植物抗病能力的分子标记物。本发明还提供了特异性鉴定Pigm1的分子标记物。

Description

水稻广谱抗稻瘟病基因的克隆及分子标记
技术领域
本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及水稻广谱抗稻瘟病基因的克隆及分子标记。
背景技术
稻瘟病是由子囊菌Magnaporthe grisea(Hebert)Barr[无性世代为Pyriculariagrisea(Cooke)Sacc.]引起的，广泛分布于水稻栽培的国家和地区，是水稻上最重要的病害之一。近年来其危害面积逐年扩大，危害程度日趋严重，已成为水稻高产、稳产的主要障碍因素之一。目前生产上一般采用传统的化学防治和种植抗性品种来控制病害。由于水稻的单一种植和稻瘟病菌生理小种遗传的复杂性和高度变异的致病性，一般新选育出优良品种在大面积推广3-5年就丧失抗病性。所以寻找和利用具有广谱抗性的抗源和抗性基因是当前控制稻瘟病的最有效、最经济的措施。传统的抗病育种依赖于抗性鉴定和植株表型选择，要求具有丰富的经验和长达数年甚至十几年的时间，常规育种中很难选育出同时具有多个抗病基因的持久抗病品种。
上个世纪60年代日本利用传统的形态标记鉴定了14个抗病位点。但随着分子标记技术的迅速发展，在水稻的12染色体上发现了大概50多个抗稻瘟病位点，这些抗病位点分布在除第3染色体外的其余11条染色体，利用与这些抗病基因紧密连锁的分子标记实现多个抗病基因的聚合，拓宽水稻的抗谱。但有部分位点被重复定位到染色体的同一位置附近，如，定位在第11染色体的Pik及其4个等位基因Piks、Pikh、Pikp、Pikm的位置上，还定位了Pi1、Pi18、Pi7、Pif。另外在这个区域还定位了抗白叶枯病基因Xa3、Xa4、Xa26、Xa22。在第12染色体靠近着丝粒的附近定位至少7个抗稻瘟病基因。主要包括Pi4、Pita、Pita2、Pi62(t)、Pi6及Pi39。在第6染色体上的Piz位点附近也发现了抗稻瘟病基因Piz5(Pi2)、Pizt、Pi9、Pigm、Pi40、Pi26及Pi42。目前这些抗病基因之间的关系还不明确，所以克隆这些抗稻瘟病基因对认识抗病基因结构组成、进化与广谱抗病机理提供重要的线索。同时也为这些抗病基因的利用奠定基础。
目前已经克隆的抗稻瘟病基因有14个：Pib、Pita、Pi2/Pizt、Pi9、Pi36、Pi37、Pid2、Pid3、Pik、Pikm、Pikh、Pit、Pb1、Pi3/Pi5。Pigm至今未被成功克隆获得。其中Pid2编码一类新的含有胞外的B型植物凝集素受体激酶结构域和胞内的丝氨酸/苏氨酸激酶结构域的抗病蛋白，为研究抗病机制提供新的线索。含有Pib、Pita、Pi2/Pizt、Pi9、Pi36、Pi37、Pid3、Pik、Pikm、Pikh、Pit、Pb1、Pi3/Pi5基因编码非常典型的NBS-LRR类抗病蛋白，Pib、Pita分别来自日本的粳稻，对中国的稻瘟病菌小种的抗谱窄。最初从日本的水稻品种Toride1引进具有广谱抗性Pizt转育出水稻品种中花9号，对稻瘟病普遍表现高度抗病，在北方大面积推广后，导致侵染Pizt稻瘟病菌生理小种的迅速增殖，从而使中花9号的推广范围受到限制。具有广谱抗性的基因还有Pi1、Pi3/Pi5、Pi33、Pi9这些抗源在杂交水稻的抗病育种的应用价值较大。
目前，单一利用一个广谱抗病基因非常容易被稻瘟病菌克服，所以非常有必要从水稻生产寻找和筛选具有广谱持久抗性抗源，分析它们的抗病组成及广谱抗病机理来指导生产上的抗病育种。
发明内容
本发明的目的在于提供水稻广谱抗稻瘟病基因的克隆方法及分子标记。
在本发明的第一方面，提供一种分离的多肽，该多肽选自下组：
(a)SEQ ID NO：3氨基酸序列的多肽；
(b)将SEQ ID NO：3氨基酸序列经过一个或多个(如1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，更佳地1-10个，更佳地1-5个，更佳地1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抗微生物侵染的功能的由(a)衍生的多肽。
在另一优选例中，所述的微生物是对植物有害的微生物，较佳地所述微生物为子囊菌亚门真菌(Magnaporthe grisea(Hebert)Barr；较佳地，无性世代为Pyricularia grisea(Cooke)Sacc.。
在另一优选例中，该多肽是具有SEQ ID NO：3氨基酸序列的多肽。
在另一优选例中，所述的植物是单子叶植物；较佳地，所述的植物是禾本科植物；更佳地，所述的植物选自(但不限于)：水稻、小麦、大麦、高粱、玉米、黑麦等。
在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组：
(a)编码所述多肽的多核苷酸；
(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
在另一优选例中，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的多肽。
在另一优选例中，所述的多核苷酸是：
如SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的多核苷酸；
如SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的多核苷酸；或
如SEQ ID NO：2中第2001-9065位所示核苷酸序列的多核苷酸。
在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。
在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体；或其基因组中整合有所述的多核苷酸。
在本发明的另一方面，提供一种植物，其包含前面任一项所述的多核苷酸。
在本发明的另一方面，提供所述的多肽的制备方法，该方法包含：
(a)在适合表达的条件下，培养所述的宿主细胞；
(b)从培养物中分离出所述的多肽。
在本发明的另一方面，提供所述的多肽或其编码基因的用途，用于提高植物的抗微生物侵染能力。
在本发明的另一方面，提供一种提高植物的抗微生物侵染能力的方法，该方法包括：使植物表达所述的多肽；或提高植物中所述的多肽的表达或活性。
在另一优选例中，所述方法包括：将编码所述的多肽的多核苷酸转入到植物基因组中。
在另一优选例中，所述方法包括：
(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有所述多肽的编码序列；
(2)将植物细胞、组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使所述多肽的编码序列转入植物细胞。
在另一优选例中，借助基因枪等方法将含有所述的多肽的编码序列转入植物细胞。
在另一优选例中，所述方法还包括：
(3)选择出转入所述多肽的编码序列的植物细胞、组织或器官；
(4)将步骤(3)中的植物细胞、组织或器官再生成植株。
在另一优选例中，所述方法还包括：同时使植物表达其它具有抗微生物感染功能的多肽；或同时提高植物中其它具有抗微生物感染功能的多肽的表达或活性。
在另一优选例中，所述其它具有抗微生物感染功能的多肽选自下组：Pib蛋白、Pita蛋白、Pi2/Pizt蛋白、Pi9蛋白、Pi36蛋白、Pi37蛋白、Pid2蛋白、Pid3蛋白、Pi1蛋白、Pik蛋白、Pikm蛋白、Pikh蛋白、Pit蛋白、Pb 1蛋白、Pi3/Pi5蛋白。
在本发明的另一方面，提供一种由前述方法制备获得的转基因植物。
在本发明的另一方面，提供所述的多肽或其编码基因的用途，用于鉴定植物的抗微生物感染能力(抗病性)；或用于制备鉴定植物的抗微生物感染能力的分子标记物。
在本发明的另一方面，提供一种鉴定植物的抗微生物感染能力的分子标记物，所述的分子标记物特异性识别所述的多肽或其编码基因(包括外显子、内含子或5’或3’侧翼序列(含启动子))。
在另一优选例中，所述的分子标记物选自(但不限于)：特异性的引物、特异性的探针、特异性的限制性内切酶、或特异性的抗体(单克隆抗体或多克隆抗体)。
在另一优选例中，所述的分子标记物是特异性扩增所述的多肽的编码基因(包括外显子、内含子或5’或3’侧翼序列(含启动子))的引物对；且，该引物的扩增产物中包括SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列或序列片段。
在另一优选例中，所述的引物对选自：
SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示核苷酸序列的引物对；
SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的引物对；或
SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示核苷酸序列的引物对。
在本发明的另一方面，提供所述的分子标记物的用途，用于鉴定植物的抗微生物感染能力。
在本发明的另一方面，提供一种鉴定植物的抗微生物感染能力的试剂盒，包含所述的分子标记物。
在另一优选例中，所述的试剂盒中还包含：使用说明书。
在本发明的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，其是包括SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列的多核苷酸。
在本发明的另一方面，提供SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列的多核苷酸的用途，用于鉴定植物的抗微生物感染能力。
在本发明的另一方面，提供一种鉴定植物的抗微生物感染能力(抗病性)的方法，所述方法包括：
检测植物中所述的多肽或其编码基因的存在与否；若存在，则表明植物具有抗微生物感染能力。
在另一优选例中，检测植物中所述的多肽的编码基因的存在与否的方法是：
(1)以该植物的基因组为模板，以引物对进行PCR扩增；其中，所述的引物对选自：
SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示核苷酸序列的引物对；
SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的引物对；或
SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示核苷酸序列的引物对；
(2)分析(1)的扩增产物，若其中包括SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列或序列片段，则表明植物具有抗微生物感染能力。
在另一优选例中，所述的SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示核苷酸序列的引物对的扩增产物的大小为856bp；所述的SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的引物对的扩增产物的大小为472bp；所述的SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示核苷酸序列的引物对的扩增产物的大小为777bp。
在另一优选例中，所述的分析扩增产物的方法包括(但不限于)：测序鉴定、限制性内切酶酶切鉴定或电泳鉴定等。
在本发明的另一方面，提供一种分离的启动子，所述的启动子选自下组：
(1)如SEQ ID NO：2中第1-2000位所示的核苷酸序列的多核苷酸；
(2)在严格条件下能够与(1)限定的多核苷酸序列杂交且具有启动目的基因表达(组成型表达)的功能的多核苷酸；或
(3)与(1)限定的多核苷酸序列具有90％以上(优选95％以上，更优选98％以上，最优选99％以上)相同性且具有启动目的基因表达的功能的多核苷酸。
在本发明的另一方面，提供所述的启动子的用途，用于启动目的基因的组成型表达。
在本发明的另一方面，提供一种构建物，所述的构建物含有所述的启动子。
在另一优选例中，所述构建物中，所述的启动子的下游含有至少一个多克隆位点(如酶切位点)，其与所述的启动子可操作性连接，用于插入目的基因。
在另一优选例中，所述的构建物是表达载体。
在另一优选例中，所述的构建物含有以下可操作性连接的元件：所述的启动子；和目的基因。
在另一优选例中，所述的目的基因是外源基因。
在另一优选例中，所述的目的基因是结构基因。
在另一优选例中，所述的目的基因可编码具有特定功能的多肽。
在另一优选例中，所述的目的基因位于所述启动子的下游，且与所述启动子的间隔小于2000bp (优选的，小于1000bp；更优选的，小于500bp；最优选的，小于300bp)。
在本发明的另一方面，提供一种启动目的基因表达的方法，所述的方法包括：将构建物转化植物，所述的构建物含有所述的启动子以及与所述的启动子可操作地连接的目的基因。
在另一优选例中，所述方法包括：
(a)提供携带表达载体的农杆菌，所述表达载体中含有构建物，所述的构建物含有所述的启动子以及与所述的启动子可操作地连接的目的基因；
(b)将植物细胞、组织或器官与步骤(a)中的农杆菌接触，从而使所述的构建物转入植物。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、载体plndigoBAC-5图谱。
图2、载体pCAMBIA 1301图谱。
图3、Pigm初步定位在第6染色体。a表示定位Pi9、Pi2的标记，b表示定位Pi25、Pi26的标记。
图4、A、B分别是CAPS标记C5483和C0428检测10个重组交换个体的多态性。
C、表示共分离标记S29742在不同抗感池中扩增的带型。
P1：谷梅4；P2：Maratelli；F1：谷梅4与Maratelli杂交1-10感病交换单株；
R1、S1-R6、S6分别是由菌株CH109、CH63、101/1/1、101/4/8、01-19和CH199接种F2构建的抗感池。
图5、Pigm的精细定位图谱。A，根据1556感病单株构建覆盖Pigm的contig图谱。这些BAC/PAC均来自IRGP测序的日本晴，标记下面的括号里数字代表是该标记存在的交换个数，B，Pigm精细定位在标记C5483和C0428间，与标记S29742、c24901，pc22705共分离。C，Pigm位点对应的日本晴的70kb序列中包含6个抗病基因和9311基因组中含有5个抗病基因。
图6、水稻谷梅4大分子量基因组DNA。
图7、最佳部分酶切条件的确定。
M：Markers；1-7：1/8DNA凝胶块分别用0、0.5、1、2、3、5、10单位的HindIII酶切的结果。
图8、酶切后DNA片段的两次选择A，第一次脉冲场电泳分离，切下含100-300Kb DNA大片段的胶带(图中黑洞处)；B，第二次脉冲场电泳分离，切下含100-300Kb DNA大片段的压缩胶带(图中黑洞处)。
图9、水稻谷梅4基因组BAC文库插入片段大小检测。
图10、水稻谷梅4基因组BAC文库插入片段的分布。
图11、含Pigm基因阳性候选BAC克隆的PCR筛选。A，图中1-12，A-H为不同BAC质粒DNA池，B，图中1-20为不同BAC克隆质粒。
图12、由筛选的候选BAC克隆构建的覆盖Pigm的物理图谱。BC2F2-R：抗病BC2F2-S：感病。
图13、谷梅4基因组中Pigm位点R基因与对应的日本晴及9311基因组的同源序列比较。
图14、Pigm位点包含的抗病基因数目多于Pi9、Pi2。
图15、反转录转座子Ty3/gyspy的结构示意图。
图16、不同的Pigm候选抗病基因具有相同的结构。
图17、Pigm位点的不同抗病基因间序列一致性分析。
图18、Sau3AI部分酶切BAC30质粒DNA。
图19、回收2U/ml Sau3AI部分酶切BAC30质粒DNA的15-30kb的片段。
图20、HindIII(A)和BamHIII(B)酶切验证亚克隆插入片段大小。
图21、覆盖整个BAC30的亚克隆重叠连锁群。
图22、引物S26205检测57的T1代转基因植株。
图23、Pigm1基因组成型表达。0表示未接种时取样，4、12、24、48、96，不受病原菌的诱导，在根，叶，幼苗，穗部位表达一致。
图24、在黑龙江农科院2008年接种统计结果(左)以及在湖北恩施国家病圃鉴定结果(右)。
图25、Pigm/Pi9/Pi2位点的抗病基因基因的成员聚类分析。主要依据基因的编码序列进行分析，没有完整的编码框的选取其基因组序列。
图26、分子标记M26205鉴定Pigm的转育株系和Pi9，Piz，Pi2，Pizt。
图27、Pigm位点不同抗病蛋白(R4、R6、R8)与Pi9、Pi2、Pizt蛋白序列比较。
图28、pCambria 1301N质粒图谱。
具体实施方式
本发明人经过广泛的研究，首次筛选到一份抗性广谱突出的籼稻品种，并进而找到该品种中含有的具有广谱抗病性的显性基因，定名为Pigm1。基于该基因，可制备抗病能力增强的转基因植物，或制备出鉴定植物抗病能力的分子标记物。本发明还提供了特异性鉴定Pigm1的分子标记物。
如本文所用，所述的“植物”没有特别的限制，只要所述“植物”是易于被微生物侵染的，如各种农作物、花卉植物、或林业植物等。所述的植物比如可以是(不限于)：双子叶植物、单子叶植物、或裸子植物。更具体地，所述的植物包括(但不限于)：棉花、小麦、大麦、黑麦、水稻、玉米、高梁、甜菜、苹果、梨、李、桃、杏、樱桃、草莓、木莓、黑莓、豆、扁豆、豌豆、大豆、油菜、芥、罂粟、齐墩果、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、花生、葫芦、黄瓜、西瓜、亚麻、大麻、黄麻、柑桔、柠檬、葡萄柚、菠菜、苘苣、芦笋、洋白菜、大白菜、小白菜、胡萝卜、洋葱、土豆、西红柿、青椒、鳄梨、桂皮、樟脑、烟叶、坚果、咖啡、茄子、甘蔗、茶叶、胡椒、葡萄树、蚝麻草、香蕉、天然橡胶树和观赏植物等。作为本发明的优选方式，所述的植物是禾本科植物，包括但不限于水稻、小麦、大麦、高粱、玉米、黑麦等。
如本文所用，所述的微生物是一些对植物有害的微生物。较佳地为子囊菌亚门真菌(Magnaporthe grisea(Hebert)Barr，其无性世代为Pyricularia grisea(Cooke)Sacc.；更佳地为稻梨孢属的真菌；更佳地为稻瘟病菌。所述微生物可以侵染杂草(如画眉草)、禾本科植物(大麦、水稻、短柄草等)。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的植物抗病多肽(蛋白)”、“分离的提高植物抗病能力的蛋白”、“分离的Pigm1蛋白”或“分离的Pigm1多肽”是指Pigm1蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化Pigm1蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。本文中，“多肽”和“蛋白”代表了等同的意义，可互换使用。
如本文所用，所述的“抗微生物感染”与“抗病”可互换使用。
如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......构成”、“基本上由......构成”、和“由......构成”；“主要由......构成”、“基本上由......构成”和“由......构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选的是重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括Pigm1蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的Pigm1蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中，术语“Pigm1蛋白”指具有提高植物抗病能力的功能的SEQ IDNO：3序列的多肽。该术语还包括具有提高植物抗病能力的、SEQ ID NO：3序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个或1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为50个以内，较佳地20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括Pigm1蛋白的活性片段和活性衍生物。
多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与Pigm1蛋白的DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗Pigm1蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含Pigm1蛋白或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了Pigm1蛋白的可溶性片段。通常，该片段具有Pigm1蛋白序列的至少约20个连续氨基酸，通常至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约100个连续氨基酸，更佳地至少约300个连续氨基酸，最佳地至少约600个连续氨基酸。
本发明还提供Pigm1蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然Pigm1蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，“Pigm1蛋白保守性变异蛋白”指与SEQ ID NO：3的氨基酸序列相比，有至多50个，较佳地至多30个，更佳地至多20个，更佳地至多10个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表0进行氨基酸替换而产生。
表0
  氨基酸残基   代表性的取代   优选的取代
  Ala(A)   Val；Leu；Ile   Val
  Arg(R)   Lys；Gln；Asn   Lys
  Asn(N)   Gln；His；Lys；Arg   Gln
  Asp(D)   Glu   Glu
  Cys(C)   Ser   Ser
  Gln(Q)   Asn   Asn
  Glu(E)   Asp   Asp
  Gly(G)   Pro；Ala   Ala
  His(H)   Asn；Gln；Lys；Arg   Arg
  Ile(I)   Leu；Val；Met；Ala；Phe   Leu
  Leu(L)   Ile；Val；Met；Ala；Phe   Ile
  Lys(K)   Arg；Gln；Asn   Arg
  Met(M)   Leu；Phe；Ile   Leu
  Phe(F)   Leu；Val；Ile；Ala；Tyr   Leu
  Pro(P)   Ala   Ala
  Ser(S)   Thr   Thr
  Thr(T)   Ser   Ser
  Trp(W)   Tyr；Phe   Tyr
  Tyr(Y)   Trp；Phe；Thr；Ser   Phe
  Val(V)   Ile；Leu；Met；Phe；Ala   Leu
本发明还提供了编码本发明Pigm1蛋白或其保守性变异多肽的多核苷酸序列。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：2所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：3的蛋白质，但与SEQ ID NO：1或SEQID NO：2所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码SEQ ID NO：3的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％，更佳地至少90％，更佳地至少95％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在80％以上，较好至少90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO：3所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码Pigm1蛋白的多聚核苷酸。
本发明的Pigm1蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或Pigm1蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的Pigm1蛋白。一般来说有以下步骤：
(1).用本发明的编码Pigm1蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2).在合适的培养基中培养宿主细胞；
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，Pigm1蛋白多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含Pigm1蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的卡那霉素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、水稻幼胚转化法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得性状发生改变的植物。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
重组的Pigm1蛋白有多方面的用途。例如用于筛选促进或对抗Pigm1蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组Pigm1蛋白筛选多肽库可用于寻找有价值的能抑制或刺激Pigm1蛋白功能的多肽分子。
本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析。用Pigm1蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测Pigm1蛋白的转录产物。
本发明还涉及一种改良植物(提高植物的抗病能力)的方法，该方法包括提高所述植物中Pigm1基因的表达或蛋白活性。
增加Pigm1基因表达的方法是本领域周知的。例如，可通过转入携带Pigm1编码基因的表达构建物使植株过表达Pigm1；或可通过用强启动子驱动从而增强Pigm1基因的表达；或者通过增强子(如水稻waxy基因第一内含子、Actin基因第一内含子等)来增强该Pigm1基因的表达。适用于本发明方法的强启动子包括但不限于：35S启动子、水稻、玉米的Ubi启动子等。
作为本发明的一种优选方式，获得Pigm1蛋白高表达的植株的方法如下：
(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有Pigm1蛋白的DNA编码序列；
(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使该Pigm1蛋白DNA编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；
(3)选择出转入所述Pigm1蛋白DNA编码序列的植物细胞或组织；和
(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织再生成植株。
其中，可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施此方法。
本发明还包括Pigm1蛋白或其编码基因的激动剂。由于Pigm1的激动剂可调节Pigm1的活性或表达，因此，所述的Pigm1的激动剂也可通过对Pigm1的影响来提高植物的抗病能力，从而达到性状改良的目的。
所述的Pigm1的激动剂是指任何可提高Pigm1的活性、维持Pigm1的稳定性、促进Pigm1表达、延长Pigm1有效作用时间、或促进Pigm1的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于提高植物的抗病能力有用的物质。
鉴于本发明发现Pigm1是一种广谱的、高效的植物抗病基因，表明包含该基因的植株具有良好的抗病性。因此，本发明所述的Pigm1蛋白或其编码基因还可用于鉴定植物的抗微生物感染能力(抗病性)或用于制备鉴定植物的抗微生物感染能力的分子标记物。
基于本发明的新发现，鉴定植物中特定的蛋白或基因的试剂及方法是本领域人员所已知的。在蛋白水平上，可通过设计特异性识别Pigm1蛋白或Pigm1蛋白片段而不识别其它蛋白的抗体来实现鉴定，鉴定的方法例如包括(但不限于)：Western Blot，ELISA等。在基因水平上，可通过设计特异性识别Pigm1基因的探针或引物来实现鉴定，鉴定的方法例如包括(但不限于)PCR扩增，Southern Blot，DNA电泳等。
此外，一些能够特异性识别蛋白氨基酸序列的特定位置或特异性识别DNA序列的特定位置的限制性内切酶也可用于鉴定。
作为本发明的优选方式，所述的分子标记物是特异性扩增所述的Pigm1基因(包括外显子、内含子或5’或3’侧翼序列(含启动子))的引物对；且，该引物的扩增产物中包括SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列或序列片段。更优选地，所述的引物对选自：SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示核苷酸序列的引物对(特异性扩增Pigm1基因中856bp的片段)；SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的引物对(特异性扩增Pigm1基因中472bp的片段)；或SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示核苷酸序列的引物对(特异性扩增Pigm1基因中777bp的片段)。
所述的标记物可用于制备鉴定植物的抗微生物感染能力的试剂盒。所述的试剂盒中，除了包含本发明的分子标记物，还可包含其他用于蛋白或基因鉴定的试剂，例如(但不限于)：PCR扩增试剂，免疫印迹试剂，电泳试剂等等。此外，还可包括：使用说明书，序列分析软件。
本发明还涉及分离自Pigm的启动子。如本文所用，所述的“启动子”或“启动子区(域)”是指一种核酸序列，其通常存在于目的基因编码序列的上游(5’)，能够引导核酸序列转录为mRNA。一般地，启动子或启动子区提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。在本文中，所述的启动子或启动子区包括启动子的变异体，该变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。所述变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。
如本文所用，所述的“可操作性连接”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。
本发明提供一种启动子，所述的启动子选自下组：
(1)具有SEQ ID NO：2中第1-2000位所示的核苷酸序列的多核苷酸；或
(2)在严格条件下能够与(1)限定的多核苷酸序列杂交且具有启动目的基因表达(组成型表达)的功能的多核苷酸。
在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在80％以上，较好至少90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸也具有启动目的基因表达的功能。
多核苷酸的杂交是本领域技术人员熟知的技术，特定的一对核酸的杂交特性指示它们的相似性或同一性。因此，本发明还涉及与SEQ ID NO：2中第1-2000位所示的核苷酸序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少60％，更佳地至少70％，更佳地至少80％，更佳地至少85％，更佳地至少90％(例如95％、96％、97％、98％、或99％)相同性的多核苷酸。
本发明的启动子是启动目的基因表达的。在本发明的实例中，本发明人发现，在本发明的启动子的指导下，可以使目的基因组成型地表达。
本发明的启动子可以被可操作地连接到目的基因上，该目的基因相对于启动子可以是外源(异源)的。所述的目的基因通常可以是任何核酸序列(优选结构性核酸序列)，所述的目的基因优选编码具有特定功能的蛋白，如Pigm1基因。
本发明的启动子还可以被可操作地连接到被改进的目的基因序列上，该目的基因相对于启动子是外源(异源)的。所述的目的基因可以被改进来产生各种期望的特性。例如，目的基因可以被改进来增加表达量，改变翻译后的修饰(如磷酸化位点)，将翻译产物转运到细胞外，改善蛋白的稳定性，插入或删除细胞信号等。
此外，启动子和目的基因可以设计成下调特定基因。这一般是通过将启动子连接到目的基因序列上来实现，该序列以反义反向被引导。本领域的普通技术人员熟悉这种反义技术。任何核酸序列可以以这种方式被调节。
任何一种前述的启动子和目的基因序列可被包含在构建物中，更具体地如重组载体中。
所述的重组载体一般包括可操作性连接的(通常从5’到3’方向)：引导目的基因转录的启动子，和目的基因。如果需要，所述的重组载体还可以包括3’转录终止子，3’多聚核苷酸化信号，其它非翻译核酸序列，转运和靶向核酸序列、抗性选择标记、增强子或操作子。
通常，所述的目的基因位于所述的启动子的下游，且与所述启动子的间隔小于2000bp(优选的，小于1000bp；更优选的，小于500bp；最优选的，小于300bp)。
重组载体中除了含有本发明的启动子，还可含有一种或多种其它启动子。所述的其它启动子例如是：组织特异性的、组成型的或诱导型的。
包含上述适当的启动子和目的基因的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够在适当的环境下表达蛋白质。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
本发明人利用来自不同水稻栽培区30个强致病力稻瘟病菌小种，从500多份抗源中筛选一份抗性广谱突出的籼稻品种谷梅4。对这些稻瘟病菌生理小种表现为免疫，明显好于目前应用的广谱抗瘟基因Pi-1、Pi-2、Pi-3、Pi9以及一些著名的抗源如Tetep、Moroberkan等。利用9个稻瘟病菌生理小种进行遗传分析表明谷梅4中含有一个广谱抗性的显性位点，定名为Pigm，采用图位克隆的方法获得该基因，Pigm位点含有12个NBS-LRR类抗病基因。根据Pigm的基因序列设计特异的分子标记，鉴定水稻品种是否含有Pigm，利用这个分子标记辅助选育了6个抗病水稻品系，在苗期和田间病圃鉴定结果均表现与谷梅4一样的广谱抗瘟性。具体详述如下：
I.材料与方法
水稻材料及群体的构建
水稻材料：谷梅4(见文章Deng et al，Theoretical and AppliedGenetics，2006，113(4)：705-713)、C101A51(Pi2)(见文章Deng et al，Theoretical andApplied Genetics，2006，113(4)：705-713)、75-1-127(见文章Deng et al，Theoreticaland Applied Genetics，2006，113(4)：705-713)、Toridel(Pizt)(浙江农科院植保所)、Zenith(Piz)(浙江农科院植保所)为抗稻瘟病品种；Maratelli(见文章Deng et al，Theoretical and Applied Genetics，2006，113(4)：705-713)、Cpslo17(见文章Deng et al，Theoretical and Applied Genetics，2006，113(4)：705-713)和日本晴(浙江农科院作核所)为感病品种。水稻MP3(Pigm)是以谷梅4为抗病亲本与感病亲本Maratelli杂交，以感病水稻感病亲本Maratelli作为轮回亲本进行回交4次后又自交获得含有Pigm的纯合抗病品系。YFZ作为湖南桃江病圃试验点的感病对照品种(该病圃为国家病圃，湖南农科院植保所)。LJXTHG作为浙江东辉病圃试验点的感病对照品种(该病圃属于浙江农科院作核所)。
以谷梅4与感病的亲本Maratelli和Cpslo17杂交获得F1，然后F1自交获得F2定位群体。同时F1分别再与感病亲本Maratelli和Cpslo17杂交获得BC1F1，BC1F1自交获得BC1F2定位群体，谷梅4与C101A51(Pi2)、75-1-127(Pi9)分别杂交构建等位性分析的F2群体。
实施例中涉及定其它水稻材料，如非特别说明，均获自浙江农科院植保所或参考Deng et al，Theoretical and Applied Genetics，2006，113(4)：705-713中所述。
稻瘟病菌培养、接种与调查方法
稻瘟病菌株CHL685、CHL541来自华南农业大学提供。菌株CH109、CH63、101/1/1、101/4/8、CH199、03-5-2、09-33-1、91-162-1、2000-18-2、05-20-1、09-30-1、09-13-1、98-271、09-31-1、09-14-1、09-34-1、2000-2、08-7-3、07-14、09-16-1、06-17-1、07-21、07-13、99-188、08-4-1、85-14、GUY11、TH12、ZJ72、CH97、CH227、CH131、CH188、CH102、TH16、sample、os9649、Race007、PH14、CH43、KA3、06-56、05-20-1、06-11-1、06-7-2、05-9-1、99-30-1、01-19、01-12由浙江农科院植保所提供。除非另外说明，其它菌株也获自浙江农科院植保所。
稻瘟病菌株均在冷冻低温下保存。在使用前把保存在滤纸片上供试的稻瘟病菌孢子在燕麦培养基上活化7天，然后再转到米糠培养基上进行纯化培养7天(光照、黑暗各12小时)，这时可以获得少量的新鲜稻瘟病菌孢子。当需要大量的稻瘟病菌孢子进行接种实验时，将活化后的稻瘟病菌株接种在盛有大麦粒培养基(大麦粒在沸水中煮20分钟左右，再经过湿热灭菌20分钟)的三角瓶中，置于25～28℃温度下培养14天左右，待大麦粒表面长满菌丝后用无菌水洗掉菌丝，然后将大麦粒摊在无菌瓷盘上，盖上潮湿的无菌纱布，在25～28℃下培养。当大麦粒表面形成大量孢子后，用含有0.02％Tween20的自来水洗下孢子，双层纱布过滤，配成孢子悬浮液。喷雾接种的孢子浓度为5×105个/mL，在10×10倍的显微镜下，平均每个视野有30-50个孢子。
将各亲本和所有的F2和BC1F2群体的种子在清水中浸泡48小时，温度25℃，然后在35℃发芽箱催芽至露白后，播到育秧盘中。每盘10行，每行30粒种子，亲本和F1各播一行，F2视种子量尽可能多播。在出苗到2叶期喷施氮肥一次，苗长得嫩绿，在接种的前5天左右再喷施氮肥一次。在水稻苗长至3-4叶期时进行喷雾接种。利用连接空气压的喷枪在接种箱内进行喷雾接种，每个育秧盘内喷70毫升孢子悬浮液。接种后，在26℃保温箱内黑暗保湿培养24小时，然后再移至喷雾的温室培养，温度保持在26℃左右，并定时喷水保持水稻幼苗叶片有水珠。
接种后7-9天调查发病情况，用目测法调查和记载各株水稻的发病情况和病斑的大小、多少。调查按Tharreu D的6级制统一标准(Tharreu D et.al，2000)来记载病情，0级(HR)：无任何病斑或不侵染；1级(R)：有零星直径小于0.5mm的褐色斑点；2级(MR)：有少数直径约为0.5～1mm的褐色病斑；3级(MS)：出现直径小于3mm的圆形至椭圆形病斑；中央灰白色，边缘褐色；4级(S)：典型的纺锤形稻瘟病斑，直径3mm或更长，病斑稍有融合或无融合；5级(HS)：典型的纺锤形稻瘟病斑，直径3mm或更长，病斑融合连成片，致使叶片的局部或整体枯死。0-2级为抗病表型，3-5级为感病表型。把双亲、部分抗病单株及全部的感病单株幼苗转移到塑料盆中待长到分蘖盛期，取单株叶片提取DNA供定位用。
抗谱测定及等位性分析
利用来自不同稻区的稻瘟病菌株喷雾接种3-4叶期的谷梅4、MP3(Pigm的单基因系)、C101A51(Pi2)(Deng et al，Theoretical and AppliedGenetics，2006，113(4)：705-713)、75-1-127(Pi9)(Deng et al，Theoretical andApplied Genetics，2006，113(4)：705-713)、Toride1(Pizt)(浙江农科院植保所)和Zenith(Piz)(浙江农科院植保所)的幼苗，进行它们间的抗谱比较。利用对Pigm、Pi2和Pi9均无毒的菌株01-19在苗期接种谷梅4与C101A51(Pi)、75-1-127(Pi9)杂交获得的F2群体，观察抗感分离情况。
水稻基因组DNA的提取
实验中亲本及F1个体的DNA和部分F2和BC1F2个体的DNA采用大量提取的方法，所得DNA量多且质量较好，不仅适用于PCR中的模板，还可用于Southernblot分析。DNA提取液(100mmol/L Tris·Cl，pH8.0，20mmol/L EDTA，500mmol/LNaCl，1.5％SDS)。具体步骤如下：
(1)在50ml离心管中加入20ml提取缓冲液I，60℃水浴预热。
(2)水稻幼苗或叶子5-10g，剪碎，在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中，剧烈摇动混匀，60℃水浴保温30-60分钟(时间长，DNA产量高)，不时摇动。
(3)加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液，颠倒混匀(需带手套，防止损伤皮肤)，室温下静置5-10分钟，使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。
(4)室温下12000rpm离心10分钟。
(5)仔细移取上清液至另一50ml离心管，加入1倍体积异丙醇，混匀，室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。
(6)在1.5ml Eppendorf管中加入1ml TE，用钩状玻璃棒捞出DNA絮团，在干净吸水纸上吸干，转入含TE的离心管中，DNA很快溶解于TE。
(7)如DNA不形成絮状沉淀则可用5000rpm离心5分钟，再将沉淀移入TE管中。这样收集的沉淀，往往难溶解于TE，可在60℃水浴放置15分钟以上，以帮助溶解。
(8)将DNA溶液3000rpm离心5分钟，上清液倒入干净的5ml离心管。
(9)加入5μl Rnase(10μg/μl)，37℃10分钟，除去RNA(RNA对DNA的操作、分析一般无影响，可省略该步骤)。
(10)加入1/10体积的3mol/L NaAc及2倍体积的冰乙醇，混匀，-20℃放置20分钟左右，DNA形成絮状沉淀。
(11)用玻棒捞出DNA沉淀，70％乙醇漂洗，再在干净吸水纸上吸干。
(12)将DNA重溶解于1ml TE，-20℃贮存。
(13)取2μl DNA样品在0.8％Agarose胶上电泳，检测DNA的分子大小。同时取2μl稀释100倍，测定OD260/OD280，检测DNA含量及质量。
对于大量的定位群体中单株个体DNA的提取采用简易TPS提取法，步骤：
(1)取约1-2cm2的水稻叶片于含有200μl TPS的1.5ml离心管中，用1ml枪头。将叶片稍微捣碎并压到管底，75℃水浴30分钟。
(2)12,000rpm，离心10分钟。
(3)取120μl上清液于96孔板中，加入等体积的异丙醇，12,000rpm，离心10分钟。
(4)弃上清，取沉淀，加入120ul 70％的乙醇洗涤，7500rpm，离心5分钟。
(5)弃上清，取沉淀，室温干燥10-20分钟，加入30μl 1/10TE溶解。
PCR反应时20μl反应体系取1μl提好的DNA做模板。
TPS溶液组成：100mM的Tris-HCl(pH8.0)，10mM的EDTA(pH8.0)，1M的KCl。
SSR、InDel和CAPS标记分析
以前的研究结果Pigm被定位在第6染色体的SSR标记SRF5与SRF52两个标记间，本发明人又扩大定位群体，在这两个标记间继续根据http://grnome.cornell.edu/rice和WWW.gramene.org/misrosat/提供的SSR引物信息，选取在两亲本间有多态的SSR标记进行定位。在没有SSR标记可利用的情况下，根据现在国际水稻基因组测序计划已经完成的粳稻日本晴序列(http://rgp.dna.affrc.go.jp/cgi-bin/statusdb/status.pl)和籼稻9311的shot-gun序列(http://rise.genomics.org.cn/rice/index2.jsp)，利用BLASTN和BLAST2软件比对两者间序列的差异，对于发现有插入或缺失序列的区域，即可根据日本晴的序列在插入或缺失序列的区域两端设计引物，发展为InDel标记，利用InDel标记检测两亲本间是否存在多态，存在多态的标记就可以进行感病单株的连锁分析。在精细定位的过程中，随着分子标记定位范围的不断缩小，在找不到可用的InDel标记时，就需要根据粳稻日本晴序列和9311序列间的SNP来寻找合适的限制内切酶酶切位点，在含有合适酶切位点的SNP序列区域两端设计引物，就发展为CAPS标记，利用CAPS标记可进一步把Pigm定位在更小的范围内。
PCR反应体系(20μl)：DNA 1μl；缓冲液(含Mg2+)2μl；引物(10μM)1μl；dNTP(2μM)2μl；Taq酶(2U/μl)0.5μl；H2O 13.5μl。PCR扩增反应在MJ ResearchPT250的PCR仪上进行。实验中PCR的条件为：94℃预变性3分钟，接着是94℃变性45秒，55℃退火45秒，72℃廷伸45秒，35个循环后再72℃补充延伸10分钟，最后16℃保温。
SSR标记一般采用3％的琼脂糖凝胶电泳检测多态，InDel标记的PCR产物采用1％的琼脂糖凝胶电泳检测多态。而CAPS标记的PCR产物直接经限制性内切酶酶切后在电泳检测多态。
CAPS标记的PCR产物内切酶酶切体系(20μl)：PCR产物10μl；内切酶1μl；缓冲液2μl；H2O 7μl。内切酶稍微过量是为了保证PCR产物的充分酶切。酶切时间一般为2小时，在1％的琼脂糖电泳凝胶。
Pigm精细定位
(1)连锁遗传分析
连锁遗传分析采用Mapmaker/exp 3.0(置信值为3.0)软件，进行SSR和CAPS遗传标记与目的抗病基因的连锁关系分析。统计分析时，将显示出具有谷梅4号和Maratelli亲本带型的个体分别赋值1和2，具有双亲带型(即杂合带型)的个体赋值3。用Excel表格的格式存贮数据，再输入到Mapmaker软件的操作界面，进行自动分析。
(2)覆盖Pigm的精细定位图谱构建
根据精细定位的标记对应国际水稻基因组测序计划IRGP测序的粳稻日本晴的BAC克隆群和重组交换率构建覆盖Pigm的BAC克隆连锁群。
基因组文库的构建
(1)实验材料与载体
含有Pigm基因的水稻品种谷梅4号。
BAC载体(plndigoBAC5)购自EPICENTRE公司，选用HindIII酶切的载体见图1。大肠杆菌(E.coli)感受态细胞(ElectroMAXTM DH10BTM-T1RElectrocompetent Cells，简称DH10B)购自Invitrogen公司。
(2)BAC文库构建
a、谷梅4基因组DNA的制备
(1)水稻谷梅4种子催芽两天后均匀地撒在铺有吸水纸的瓷盘中，在培养箱中适宜的温度28℃下黑暗培养2个星期，长出2-3张叶片的黄化幼苗。
(2)称取去根后的黄化苗约50克，用液氮研磨成粉末，按照1：10的比例加入预冷的1×HB溶液(0.01mol/L Tris-HCl，0.08mol/L KCl，0.01mol/L EDTA，1mmol/L精胺，1mmol/L亚精胺，0.5mol/L蔗糖，0.15％β-巯基乙醇，0.5％TritonX-100，PH＝9.4～9.5)，冰上搅拌大约15分钟直至均匀。
(3)利用两层纱布、一层Mirocloth过滤，收集滤液，1800×g、4℃离心20min，沉淀用30mL 1×HB溶液悬浮，60×g、4℃离心5min，把上清液转移至新管中，1800×g、4℃离心20min。
(4)弃上清，然后加入700μL 1×HB溶液(无β-巯基乙醇和Triton X-100)把沉淀完全悬浮起来，加入等体积的50℃预热的1％的低熔点琼脂糖(Invitrogen)，混匀后分装入琼脂糖凝胶块模子中(BIO-RAD Plug Mold)。
(5)胶块凝固后取出，置于10倍体积的裂解液[0.4mol/L EDTA(pH 8.0)，2％SDS，0.1mg/mL蛋白酶K(GIBCOBRL)]中，50℃裂解两次(每次约24h)。裂解完毕后，胶块用0.1mol/L EDTA(pH 8.0)洗涤两次，4℃保存于0.1mol/LEDTA(pH 8.0)中备用。
(6)通过脉冲场电泳(电泳条件：BIO-RAD CHEF MAPPERTM电泳仪，1％琼脂糖凝胶，0.5×TBE，6V/cm电压，0.1-40s脉冲时间，14℃电泳16h)检测DNA制备质量。
b、基因组DNA部分酶切条件的确定
为了获得适合建库的谷梅4号的基因组DNA，首先利用不同含量的HindIII部分酶切包在琼脂糖凝胶块的高分子量的DNA确定能产生最大量DNA的条件。在进行酶切之前，将含有高分子量DNA的凝胶块通过脉冲场电泳(电泳条件：1％琼脂糖凝胶，0.5×TBE，4V/cm电压，5s脉冲时间，14℃电泳16h)去除小分子量DNA及其它杂质。除杂后将胶块重新从胶孔中取出，用0.1mol/L EDTA(pH8.0)洗涤两次，4℃保存于0.1mol/L EDTA(pH 8.0)中备用。
取其中1块除杂后的胶块进行部分酶切条件的确定。首先在酶切缓冲液平衡2-3小时后，平均分成8小块，在20μL体系中按照0、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10个单位的HindIII酶量于37℃酶切45min，然后放在冰上加入2μl 0.5mol/LEDTA(pH 8.0)溶液终止反应。酶切后的凝胶块通过脉冲场电泳(电泳条件BIO-RAD CHEF MAPPERTM电泳仪，1％琼脂糖凝胶，0.5×TBE，6V/cm电压，0.1-40s脉冲时间，14℃电泳16h)检查酶切效果，确定能最大量产生所需片段范围(100-300Kb)的酶切条件。
c、大片段DNA的获得
根据建库所需要的DNA量，按照已确定的最佳酶切条件，进行大量的基因组DNA的部分酶切，分两次选择酶切片段。
第一次选择酶切的DNA片段：把部分酶切的10个琼脂糖凝胶块，经第一次脉冲场电泳分离(电泳条件：1％琼脂糖凝胶，0.5×TBE，6V/cm电压，0.1-40s脉冲时间，11℃电泳16h；4V/cm电压，5s脉冲时间，11℃电泳6h)后，切下两端Marker和带有样品边缘约3毫米的胶块用EB染色，将染色的胶块放回原处在紫外灯下根据Marker的位置切下含100-300Kb未经EB染色DNA大片段的凝胶块，再放入透析袋中通过脉冲场电泳(电泳条件：0.5×TBE，6V/cm电压，30s脉冲时间，11℃电泳4h)透析回收DNA大片段。
第二次选择回收DNA片段：把第一次回收的DNA片段再进行第二次脉冲场电泳分离(电泳条件：1％琼脂糖凝胶，0.5×TBE，4V/cm电压，5s脉冲时间，11℃电泳12h)在这种条件下≥100Kb的DNA片段被压缩成带，按照第一次回收的方法，切下含有这条带的凝胶块放入透析袋中，再次电泳(电泳条件和第一次透析相同)透析回收DNA大片段。得到的大片段DNA浓度通过与λDNA标准浓度梯度比较确定。
d、连接、转化
100μl的连接反应体系：质粒：2μl；DNA：50μL；10×链接缓冲液：10μL；100mM ATP：1μL；T4-连接酶：3μL；ddH2O：34μL。
载体与插入片段按7∶1(摩尔浓度比)的比例进行在4℃下连接过夜。连接物经脱盐处理后，进行电激转化。取1.5μL的连接产物加到20μL的DH10B的感受态细胞中混匀后转到电击杯进行电击(BIO-RAD GenePulser XcellTM电激仪，0.1mm BIO-RAD电击杯，1800V/cm)，电击产物悬浮于1mL S℃培养基中，37℃培养1h。取适量涂于含有氯霉素12.5μg/ml，X-Gal(40μg/ml)和IPTG(0.4mM)的固体LB培养基，在37℃培养20小时左右，放在4℃保存。
e、文库的鉴定及收集保存
随机挑取100个克隆接种到3mL含氯霉素(25μg/mL)的LB培养基中，37℃培养过夜。用碱裂解法提取质粒DNA，Not I酶切后，通过脉冲场电泳(电泳条件0.5×TBE，6V/cm电压，0.1-40s脉冲时间，14℃电泳16h)检测插入片段的大小及空载率。挑选插入片段较大的克隆4个接种到含有氯霉素的3mL的液体LB中37℃培养过夜，次日取培养物接种到新的含有氯霉素的3mL的液体LB中37℃培养过夜，连续培养5天后，这样分别提取第一天与第五天的BAC质粒DNA进行酶切鉴定检测BAC克隆在继代培养中的稳定性。
将所有电击的连接产物涂于含氯霉素的LB平板上，计算每块板约150个克隆，向平板上加3mL液体LB培养基，用涂布器把平板上的菌落刮下来混匀保存到1.5mL的无菌Eppendorf管中作为一个BAC克隆池放在-80℃保存。
BAC文库的筛选
利用克隆池和PCR技术分三步进行BAC文库的筛选。第一步，取在-80℃保存的BAC克隆池的菌液少许分别转到96孔板的孔在37℃培养，把96孔板的菌液提取质粒DNA，然后再按照纵并、横并成12、8个BAC克隆DNA池，然后利用与Pigm共分离的标记S26205，通过PCR技术筛选BAC克隆池。第二步，把筛选到的阳性克隆池菌液稀释成不同浓度梯度，取100μl涂含有氯霉素12.5μg/ml的固体LB培养基，根据不同梯度的平板长出的克隆数计算培养约2000个克隆所需要的原始阳性克隆菌液数，加入约10ml含抗性的LB均匀稀释原始菌液，按照每孔100μl分装到96孔板中37℃培养2天，再按照第一步的方法并孔，PCR筛选，得到克隆数进一步缩小的克隆池。第三步，取上一步得到克隆池的菌液少许稀释到合适的浓度，涂到含有氯霉素12.5μg/ml的固体LB培养基，在37℃培养20小时左右，分别提取质粒的DNA，利用共分离标记通过PCR技术即可筛选到所要的阳性克隆。
覆盖Pigm跨叠克隆群的构建
把筛选到的阳性BAC克隆的末端测序，用NotI和BamHI酶切，建立指纹图谱，根据BAC克隆的末端序列、BAC的大小、重叠关系以及定位标记的位置参考日本晴的序列建立覆盖Pigm的跨叠克隆群。
候选BAC克隆测序
候选BAC克隆的测序工作在中科院国家基因研究中心进行。
(1)BAC克隆DNA提取
BAC克隆DNA的提取按照QIAGEN Large-Construct Kit Protocol进行。
1)挑取单菌落于3ml含氯霉素(12.5μg/mL)LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。
2)取0.5-1.0ml菌液加到500mL的含氯霉素(12.5μg/mL)LB液体培养基，37℃剧烈振荡培养12-16小时。
3)在4℃条件下，6,000×g离心15分钟收集菌体。
4)去上清，用20ml预冷的溶液P1振荡，充分悬浮菌体。
5)加入20ml溶液P2，缓慢混匀，充分颠倒4-6次，室温放置5分钟。
6)加入20ml预冷的溶液P3，快速混匀，轻微颠倒4-6次，冰上放置10分钟。
7)4℃20,000×g离心30分钟。
8)取上清液过滤后，向滤液中加入0.6倍体积异丙醇，混匀。4℃15,000×g离心30分钟。
9)去上清，70％乙醇5ml洗涤沉淀，15000×g离心15分钟
10)去上清，室温干燥。加入9.5ml的溶液EX完全溶解沉淀。
11)加入200μL的ATP依赖的核苷酸外切酶和300μL的ATP充分混匀，37℃酶切1小时。
12)加10ml QBT溶液平衡QIAGEN-tip-500。
13)加10ml QS溶液于核苷酸外切酶酶解后的DNA溶液，混匀后加到平衡后QIAGEN-tip-500过滤。
14)加两次30ml的溶液QC冲洗QIAGEN-tip。
15)加65℃预热的溶液QF溶解DNA
16)加10.Sml的室温异丙醇与DNA的溶解液中，混匀，4℃15000×g离心30分钟。
17)去上清，加70％乙醇5ml洗涤沉淀，15000×g离心15分钟。
18)去上清，凉干沉淀5-10分钟，加100μL TE(PH8.0)溶解质粒DNA。
(2)测序的亚克隆文库的构建
a、目的DNA片段的制备
BAC克隆质粒DNA通过超声波随机打断BAC质粒，再用T4DNA聚合酶补平片段末端得到的。方法如下：
1)混合60μl充分溶解的2μg BAC质粒、20μl dNTP混合物(每种脱氧核糖核甘酸浓度为2.5mM)和20μl 5XT4DNA聚合酶缓冲液；在超声波仪的角杯中加入150ml冰预冷的水，将小管用一浮子放于角杯中，管底离角杯底部约1cm，用20％的能量，30％的循环，超声波打12秒。
2)取2μl进行琼脂糖胶电泳检测(如大量弥散带仍大于4kb，重新用超声波打碎DNA混合物，然后再取2μl进行琼脂糖胶电泳检测，直至弥散带多位于2～4kb)，在所剩的DNA片段混合液中加入1μl T4DNA聚合酶，16℃，过夜补平；
3)电泳回收补平的DNA片段。检测回收产物的浓度，备用。
b、电转化感受态细胞的制备
1)划线DH5α于SOB平板，37℃过夜；
2)挑取DH5α单菌落于2ml SOB培养基(无镁离子)中，37℃剧烈振荡过夜(300rpm)；
3)取1ml过夜培养菌液至100ml SOB(无镁离子)中(按1％稀释)，剧烈振荡约3小时，培养液中看到云雾状时可收集菌液；
4)5000rpm，4℃离心10分钟收集菌液；用冰预冷的10％(W/V)甘油水溶液100ml重悬，然后4℃离心，5000rpm，15分钟离心收集菌液；
5)重复用冰浴的10％(W/V)甘油水溶液100ml洗涤细菌(步骤4)，然后5000rpm，4℃离心15分钟收集菌液；
6)尽量除去溶液，并用剩余的甘油水溶液重悬细菌。按每份25μl分装，并迅速转移至-70℃保存。
c、脱磷pKS载体的制备
载体pKS质粒的抽提采取碱裂解法，获得载体经SmaI酶切，产生平末端。
50μl的酶切体系：pKS质粒(中科院国家基因中心)10μg，10×缓冲液H 5μl，SmaI(10U/μl)1μl，ddH2O补至50μl。
将以上混合物在30℃反应2小时，其后在酶切反应液中再加入0.5μl SmaI，30℃继续酶切2小时；取1μl进行电泳检测，如酶切不完全则补少许酶继续酶切。酶切产物中加牛小肠碱性磷酸酶CIAP脱磷处理后回收质粒DNA，电泳检测浓度备用。
d、连接与转化
20μl连接体系：脱磷处理的pKS载体50ng，回收的2-4kb片段150ng，2×连接缓冲液10μl，T4DNA连接酶1μl，无菌双蒸水补至20μl。
16℃连接过夜，把连接产物脱盐处理后，取1μl的连接产物加入20μl的感受态细胞，混匀后，进行电击转化。电击转化产物经过37℃1小时复苏后，取100μl铺LB板(含50μg/ml氨苄青霉素，40μg/ml X-Gal和0.4mM IPTG)，37℃培养过夜。挑取阳性克隆于96孔板中，37℃培养过夜后保存在-70℃冰箱。
(3)序列测定、拼接组装
a、96孔板抽提亚克隆质粒DNA
1)亚克隆接种于96深孔板中，每个孔中加入1ml含50μg/ml的氨苄青霉素的LB培养基，37℃剧烈振荡过夜；
2)平板离心机最高转速离心3分钟，收获菌液，细菌重悬于200μl solution I(按照分子克隆配制)；
3)加入200μl solution II，上下颠倒数次，室温放置5分钟；
4)加入200μl solution III，颠倒数次混匀后，沸水浴煮5分钟；
5)迅速转入冰水浴中，放置10分钟；
6)吸取200μl裂解液于Millpore 96孔过滤柱中，过滤柱下接一个96深孔板，平板离心机最高转速离心3分钟；
7)加入0.6体积的异丙醇，混匀后平板离心机最高转速离心20分钟；
8)倒弃丙醇，加入70％的乙醇，平板离心机最高转速离心10分钟；
9)倒扣96深孔板于铺有2层吸水纸的离心机上，离心至转速650rpm，彻底去掉残留的乙醇；
10)室温放置干燥10分钟，加入50μl含20ng/μl的RNA酶的无菌水中。
b、序列测定
利用通用引物T3/T7对亚克隆进行双向测序，测序仪是ABI3730，试剂为BIGdye terminator测序试剂盒。
c、序列的拼接与组装及验证
利用软件PHRED/PHRAP分析亚克隆序列，Phred/Phrap-gap4软件进行序列组装。对于薄弱的区域的克隆模板重新进行测序。对于缺口采用定向步移和测插入大片段的亚克隆进行填补。利用组成全序列的亚克隆框架、序列的SwaI的酶切片段组成和通过实验获得的BAC克隆的SwaI指纹对照分析两种方法，可以帮助确定组装的准确性。
BAC克隆序列分析
BAC克隆的序列的基因的预测采用软件RiceGAAS(http://ricegaas.dna.affrc.go.jp/)FGENESH(WWW.softberry.com)和GENESCAN(http://genes.mit.edu/GENSCAN.html)进行分析。对于预测编码区的序列利用BLASTX和BLASTP检查核酸序列的编码蛋白在蛋白质数据库中是否有同源序列；同时利用BLASTN检查核酸序列可能匹配的水稻或其它植物的EST同源序列。重复序列分析采用软件RepeatMasker(http://repeatmasker.org/cgi-bin/WEBRepeatMasker)和BLASTN。
转化亚克隆文库的构建
(1)BAC质粒DNA提取
按照前述方法提取BAC质粒DNA。
(2)载体质粒DNA提取
构建亚克隆的载体选用pCAMBIA1301(图2)，质粒提取采用碱裂解小量抽提法。获得的载体质粒最后用QIAGEN的Tip 20 Kit过柱纯化。
碱法小量抽提质粒DNA步骤如下：
1)挑取一个新活化的单菌落于3ml含抗生素的LB液体培养基中，37℃振荡培过夜。
2)取1.5ml菌液，12,000rpm离心1分钟。
3)去上清，用100μl预冷的溶液I悬浮菌体。
4)加入200μl新配制的溶液II，立刻轻轻颠倒混匀。
5)加入150μl预冷的溶液III，上下颠倒混匀，冰上放置5分钟。
6)12,000rpm离心10分钟。
7)等体积的苯酚-氯仿(1∶1)抽提一次。
8)移上清于另一离心管，加入2倍体积的乙醇或1倍体积异丙醇，混匀，12,000rpm离心10分钟。
9)去上清，70％乙醇洗涤DNA沉淀
10)7500rpm离心5分钟。
11)去上清，室温干燥。沉淀溶于20-25μl含10μg/ml RNaseA的TE(pH8.0)中。
(3)BAC质粒DNA的部分酶切
BAC质粒DNA用Sau3AI(Takara公司)进行部分酶切。预酶切实验选用的条件为：内切酶的浓度梯度为0，0.2，0.5，1.0，5.0，10U/ml；时间10分钟；DNA的量为0.5μg。37℃温浴10分钟后置冰上，65℃酶灭活10分钟后用0.8％Agarose电泳。通过电泳检测后，根据回收片段在15-30kb的范围，最终选择0.2U/mlSau3AI的酶切条件进行部分酶切。
部分酶切按如下体系：40μl DNA(12μg)，160μl 1.2×缓冲液H，5μl 0.1U/μlSau3AI，并加入1μl 0.5M的亚精胺，分装成5管(每管40μl)，37℃温浴10分钟后置冰上，再取少量电泳检测，然后65℃酶灭活10分钟。
酶切后的反应溶液点样于0.8％的低熔点胶中，用高压脉冲反转电场(CHEFDR II系统，Bio-Rad公司)电泳，电压参数是：5v/cm，15秒至1秒，过夜(18小时)。
(4)载体pCAMBIA1301的制备
1)用内切酶BamHI酶切载体pCAMBIA1301质粒(购自CAMBIA)。
50μl酶切体系：pCAMBIA1301质粒DNA(1μg/μl)5μl，BamHI(10U/μl)2μl，10×缓冲液5μl，ddH2O 38μl。
2)37℃酶切40分钟，取0.5μl电泳观察酶切效果。
3)牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)对BamHI酶切载体pCAMBIA1301进行脱磷处理。
50μl的反应体系：BamHI酶切反应液43μl，10×CIAP缓冲液5μl，CIAP(10U/μl)2μl。在37℃水浴15分钟，50℃水浴15分钟后，在65℃水浴15分钟中止反应。加等体积的酚/氯仿(1∶1)抽提2次，加2.5倍的冷无水乙醇和1/10体积的3M醋酸钠(PH5.2)在-20℃保冷30分钟。12000rpm 15分钟离心回收沉淀，用500μl的70％的乙醇洗一次沉淀，在室温干燥30分钟，加20μl的TE溶解沉淀。检测浓度-20℃保存备用。
(5)酶切产物的回收与连接
a、酶切产物的回收
部分酶切BAC质粒的产物经脉冲电泳完成后，将分子量Marker所在的泳道割下，在EB溶液中染色半小时，并在紫外灯下确定所要的大小为15-30kb的DNA片段的相对位置，再与未染色的电泳胶比对，切出未染色的酶切产物泳道内的DNA片段，把切下的胶块放于透析袋中通过电洗脱获得目的DNA片段。脱盐定量后直接用于连接反应。
b、酶切产物的连接
属于同尾酶的BamHI和Sau3AI切出DNA序列的粘性未端是相同的，因此用Sau3AI进行部分酶切的BAC质粒的DNA片段回收后，可与用BamHI酶切处理的pCAMBIA1301载体连接。
20μl的连接反应体系为：部分酶切的BAC质粒片段10μl，pCAMBIA1301载体DNA 1μl，T4DNA连接酶2μl，缓冲液(10×)2μl，ddH2O5μl。20μl体系中需要载体大约40ng，载体与插入片段的分子数比是5∶1。在16℃连接过夜。
(6)连接产物电击转化
首先制备高效率的大肠杆菌DH10B感受态细胞。挑取大肠杆菌DH10B单菌落接种于2ml SOB培养基中，培养约6小时后接种于400ml SOB培养基，37℃，200rpm摇床培养至OD550＝0.5～0.6，3,000rpm离心10分钟收集细菌。菌体用10％甘油洗涤2～3次并离心，最后将细菌按每管100μl分装，保存于-70℃。
将连接产物透析脱盐后，取1μl与20μl(约1∶20的比例)的大肠杆菌DH10B电击感受态细胞均匀混合，用BioRad电激仪(参数：1,300-1,600V；升压器电阻200Ω；电容25μF；电击杯型号为1mm)进行电击转化。用S℃培养基1ml洗出电击后菌液，37℃恢复培养1小时。然后取50μl恢复培养后的菌液涂在含有25μg/ml卡那霉素(Kan)X-Gal(40μg/ml)和IPTG(0.4mM)的固体LB培养基上，37℃培养14小时，挑取单克隆白斑菌落分别接种于装有5ml LB液体培养基的试管内(含25μg/ml Kan)，37℃摇床培养14小时。部分菌液用甘油(终浓度为15％)保存在-70℃冰箱中备用，剩下菌液用于抽提质粒DNA，抽提方法同上。
(7)转化子大小的的初步鉴定
将转化子分别挑取20个单克隆菌落，提取质粒用限制性内切酶HindIII和BamHI充分酶切，1％的琼脂糖胶电泳。电泳后，依据分子量Marker分析插入片段的大小。
候选亚克隆的筛选
根据BAC克隆的核苷酸序列设计特异性引物，通过PCR方法筛选亚克隆文库鉴定阳性克隆，利用内切酶HindIII和HBamHI鉴定阳性克隆的插入片段的大小。挑出含有目的基因的阳性克隆进行末端测序，构建覆盖整个BAC的跨叠亚克隆群。把含有抗病基因的亚克隆进行转基因验证功能。
农杆菌和基因枪介导的水稻遗传转化
(1)农杆菌感受态细胞的制备与转化
农杆菌EHA105(参见Hood，E.E.等，Transgenic Res.，1993，2，208-218)热激感受态细胞制备方法如下：
1)用无菌牙签从-80℃冻存的农杆菌EHA105菌株中挑取少许，划板于LB平板，含利福平(Rif)20mg/L。
2)待长出菌落后，挑单菌落于5ml液体YEB培养基(含20mg/L Rif)培养，28℃过夜振荡培养。
3)按1∶10的比例接种于50ml的YEB培养基(含20mg/L Rif)扩增培养，28℃振荡培养约6-7小时，至OD600达到0.4-0.6，将菌液悬于冰上30分钟。
4)4℃5,000rpm离心15分钟，弃上清，加10ml 0.15M Nacl溶液悬浮菌体。
5)4℃5,000rpm离心15分钟，弃上清，用预冷的1ml 20mM CaCl2滴加悬浮。
6)用1.5ml离心管分装，每管200μl，用于质粒转化。或加入15％(v/v)无菌甘油，快速于液氮中冷冻，于-80℃保存。
农杆菌EHA105热激转化及阳性克隆鉴定方法如下：
1)取200μl农杆菌EHA105感受态细胞，加入1-5μg质粒DNA混匀。
2)冰浴30分钟，液氮冷冻3-5分钟，37℃水浴5分钟。
3)加入1ml YEB液体培养基，28℃振摇培养4小时。
4)10000rpm，室温离心30秒钟，弃上清，加入200μl YEB液体培养基重新悬浮菌体，涂布于(含50mg/L Kan，20mg/L Rif)YEB平板上，28℃培养2天。
5)挑取单克隆于YEB液体培养基(含50mg/L Kan，20mg/L Rif)28℃振荡培养，提取质粒按照碱裂解的方法进行。
6)通过PCR的方法鉴定阳性克隆，也可以把从农杆菌中提取的质粒DNA转化到大肠杆菌(DH5α)中，挑取单克隆进行液体培养，提取质粒DNA，再通过酶切鉴定阳性克隆。鉴定正确的克隆用于下一步的水稻遗传转化。
(2)农杆菌介导的水稻成熟胚愈伤组织的转化
a、水稻成熟胚愈伤组织的诱导
感病的水稻日本晴和Maratelli种子去壳，70％乙醇浸泡1分钟，20％(v/v)次氯酸钠浸泡20-30分钟，并不停摇晃，用无菌水漂洗5-6次。无菌滤纸洗干，播于NBD培养基诱导愈伤，26℃暗培养。一周后，剔去胚乳、胚芽、胚根等，剥取愈伤组织，并继代于NBD上暗培养。每2-3周继代一次。
b、准备转化用菌液
第一天上午：从-70℃保存的菌种中挑少许于5ml YEB(Rif 20mg/L+Kan50mg/L)液体培养基，28℃振荡培养过夜。
第二天上午：从含有农杆菌的YEB培养液中吸取1-2ml，转入25-50mlAB(20mg/L Rif+50mg/L Kan)液体培养基中培养，28℃培养4小时左右至OD600＝0.5左右。
c、共培养
第二天下午：测OD600值，菌液离心5,000rpm，15分钟，菌体沉淀悬浮于AAM(含AS100)至菌液OD600＝0.4-0.6。将菌液倒入装有水稻愈伤的三角瓶中，使愈伤浸泡其中20分钟，并不时摇晃；用无菌纸吸干菌液(或用吸管吸干菌液)，把已浸泡过的愈伤组织转移到垫有一层无菌滤纸的含2.5％Phytagel的NBD(AS100)培养基上共培养2-3天。每皿再加1ml AAM(+AS100)培养液充分湿润无菌滤纸。
d、筛选
将愈伤组织用无菌滤纸吸干(换一次滤纸)，转至含潮霉素(hygromycin，Hyg)的筛选培养基上筛选抗性愈伤(暗培养30天左右，中间换一次筛选培养基)。
筛选培养基：
第一次筛选用：含0.26％Phytagel MS+Timentin 100mg/L+Hyg 30mg/L。
第二次筛选用：含0.26％Phytagel NBD+Timentin 100mg/L+Hyg 50mg/L。
第三次筛选用：含0.26％Phytagel MS+Timentin 100mg/L+Hyg 50mg/L。
e、预分化
将筛选的水稻愈伤转至预分化培养基，培养10天。
预分化培养基：含0.45％Phytagel的MS+BAP 2mg/L+NAA 1mg/L+ABA5mg/L+Hyg 50mg/L，pH 5.7，无2，4-D。
f、分化
将经过预分化的水稻愈伤转至分化培养基上分化成苗(光照，15-30天)。
分化培养基：
含0.45％Phytagel的NB+BAP 3mg/L+NAA 0.5mg/L，pH 5.7，无2，4-D。
g、生根
将绿色小苗转至生根培养基上长根。
生根培养基：含0.45％Phytagel的1/2MS+Hyg 50mg/L，pH 5.7，无2，4-D。
生根2周的幼苗就可取出，洗去琼脂培养基，炼苗2-3天后栽到土里。
(3)基因枪介导的遗传转化
a、基因枪轰击愈伤组织
用农杆菌转化效率偏低的愈伤组织，也可同时采用基因枪微弹轰击方法。使用的基因枪型号为PDS-1000/He(Bio Rad)。供轰击转化的愈伤组织事先在高渗培养基上培养4-6小时，高渗培养基成分：NB基本培养基+甘露醇47g/L+山梨醇47g/L。轰击愈伤过程如下：先用70％乙醇对基因枪表面及样品室消毒。同时，用70％乙醇将可裂膜、微粒载片浸泡15分钟，放在超净台无菌滤纸上晾干。事先用95％酒精浸泡阻挡网、微粒载片固定器，取用时需在火焰上灼烧灭菌，滤纸上冷却待用。打开稳压电源、真空泵及氦气瓶开关，使气压高于所选可裂膜压力200psi左右。将微粒载片嵌入固定环中，取10μl已制备的DNA-金粉粒于微粒载片中心，干燥。(4)旋下可裂膜挡盖，将可裂膜(1100psi型)放在挡盖中央，将挡盖旋上，并加固。(5)把微粒发射装置移出轰击室，旋下盖子，放入阻挡网，把微粒载片安装在固定糟中(有金粉微粒的一面朝下)，旋上盖子，将微粒发射装置放回轰击室。(6)将愈伤样品盘放置于轰击室的适当槽位。(7)抽真空，可裂膜会破裂，金粉颗粒轰击到愈伤。(8)放气入真空轰击室，取出样品。
(4)抗性愈伤的筛选及植株再生
轰击转化后的愈伤组织留于高渗培养基上过夜培养，然后再转入继代培养基NBD，恢复生长一周后转入含30mg/L Hyg的MS养基，2-3周为一轮筛选周期，将筛选2-3轮后的抗性愈伤转入预分化培养基暗条件下预分化培养两周；经过预分化处理的愈伤再转入分化培养基光照下分化成苗；3-4周后，将分化苗移入生根培养基壮苗生根；生根2周，便可洗去琼脂培养基，炼苗2-3天后栽于温室。
转基因植株的鉴定
(1)Gus染色鉴定
剪下5mm左右T0代转基因水稻幼苗叶片浸泡在30μl GUS染色液(含100mM pH7.0磷酸钠缓冲液，10mM EDTA，0.1％Triton100，1mM X-Gluc)，37℃放置1-2小时后观察叶片剪切处的GUS染色情况。
(2)PCR鉴定
根据转化克隆的核苷酸序列设计特异引物(引物序列见表3，表中P18849，S35395，S26205，S48590)，通过PCR方法筛选阳性植株。同时还可以利用pCAMBIA1301载体所带的潮霉素基因序列设计引物(引物序列为：Hyg-f，5’CGA CAG TGG TCC CAA AGA 3’(SEQ ID NO：60)；Hyg-r，5’TAT TTC TTTGCC CTC GGA CG 3’(SEQ ID NO：61))，PCR扩增出1.29kb大小的DNA片段。
表3、精细定位和筛选Pigm的PCR标记
候选基因的cDNA扩增及表达分析
(1)水稻总RNA的提取
采用上海华舜生物公司RNArose Reagent提取水稻叶片的总RNA。
1)取水稻3-4叶期的幼苗0.2g，液氮研磨。
2)移入1ml RNArose中，剧烈震荡混匀。
3)室温放置10分钟后，4℃12,000rpm离心10分钟。
4)取上清加入200μl氯仿，轻微震荡混匀，室温放置10分钟使之分层。
5)4℃12,000rpm离心15分钟。
6)小心将上层水相转移另一离心管中，加等体积的异丙醇混匀，室温放置10分钟。
7)4℃12,000rpm离心10分钟后，小心彻底弃上清。加1ml 75％的乙醇洗涤沉淀。
8)4℃7,500rpm离心5分钟后，去上清，室温干燥5-10分钟。
9)加20μl水溶解，-70℃保存。
注：使用的枪头、离心管及双蒸水等试剂均为RNase free。
(2)RNA的反转录
RNA的反转录选用ThermoScriptTM RT-PCR System(Invitrogen)，具体步骤如下：
1)在0.2ml管中加入如下试剂：Oligo(dT)20(50μM)1μl，RNA 3μg，10mM dNTPMix 1μl，DEPC处理的水加至10μl。
2)65℃变性5分钟，随后置冰上。
3)按照下面顺序配制cDNA合成混合液：10×RT缓冲液2μl，25mM Mgcl24μl，0.1M DTT 2μl，RNaseOUTTM(40U/μl)1μl，SuperScriptTMIII RT(200U/μl)0.25μl，DEPC处理的水0.75μl。
4)把10μl的cDNA合成混合液加到RNA/Oligo(dT)的混合液中，轻微混匀，50℃温浴50分钟。
5)85℃处理5分钟终止反应。
6)稍微离心后加1μl RNase H，37℃温浴20分钟。
7)cDNA合成产物稀释一倍后-20℃保存或直接PCR用。
(3)抗病基因的表达分析
播种转克隆57(含有R6)的T1代植株，在3-4叶期幼苗期喷雾接种稻瘟病菌株99-30-1，在喷雾接种前取0.1克叶片作为0小时对照，接种后分4，12，24，48，96小时五个时间段取样，各取0.1克叶片。提取这6个时期的样品RNA，然后反转录，利用引物S35395进行RT-PCR检测R6基因的表达情况。
谷梅4的感病突变体的筛选与分析
取大约1000克谷梅4的种子经中度剂量的γ-ray辐射诱变，然后把获得M1全部播种，自交收获单株的种子，获得M2群体，利用菌株CH109喷雾接种3-4叶幼苗期的M2植株，筛选鉴定感病的植株再通过M3进一步接种确认。对于确定的感病植株，通过PCR分析Pigm的候选区域是否发生突变。
Pigm位点抗病基因的进化分析
Pigm的位点候选基因的序列比对采用软件Clustal X1.83和GeneDoc3.2完成。进化分析采用软件MEGA4.0，采用邻位相连法(Neighbor-joining)，Bootstrap值n＝500。
抗稻瘟病基因Pigm分子育种应用
首先鉴定利用BAC30序列设计特异的标记是否可以用来确定Pigm抗病基因的存在，然后再利用这些标记进行Pigm抗病基因的世代跟踪选择，接种鉴定标记选择含有Pigm的品系是否具有抗病性。统计分子标记鉴定与表型鉴定结果的符合程度。
II.实施例
实施例1、构建Pigm精细定位群体
利用菌株CH109接种抗病的水稻品种谷梅4(籼稻)与感病的亲本Cpslo 17(粳稻)构建的F2群体，抗感表型分离明显，其中抗病株为1021株，感病株为306株，抗感分离比例符合3∶1，同样的菌株接种谷梅4(籼稻)与感病的Maratelli(粳稻)的BC1F1群体，分离出抗病株为3842株，感病株为1250株，同样抗感符合3∶1的分离比例，进一步验证了以前的遗传分析结果。总共获得了1556个隐性感病单株作为精细定位的群体。
实施例2、亲本间SSR标记筛选与连锁分析
在初步定位的SSR标记SRF5与SRF52间搜索SSR标记，在WWW.GRAMENE.ORG/MARKER的SSRIT软件搜索设计SSR标记，在亲本谷梅4号与Cpslo17、Maratelli间存在多态的SSR标记，用来检测定位群体中重组交换单株，进行连锁分析。Pigm被进一步定位在C26348与S47656间的4.3em的区域。见图3，在Pigm定位的区域附近已经定位过Pi9、Pi2/Pizt、Piz、Pi25和Pi26，根据以前这些抗病基因的定位标记在染色体上位置，可以确定Pi9、Pi2/Pizt、Piz、Pi26和Pigm是等位或紧密连锁的。但这些抗病基因的来源不同，其中Pi9是来自四倍体的小粒野生稻O.mmuta，Pi2是来自在南美的一个抗性品系5137，Piz是从美国的水稻品种Zenith中鉴定的抗病基因，Pizt在日本的粳稻TorideI中鉴定的抗病基因，Pi26来自谷梅4的另一个姊妹系谷梅2，它可能和Pigm是同一个基因。以上这些抗病基因在不同栽培地区遭受不同稻瘟病菌生理小种的选择，它们都表现广谱的抗性。它们的抗谱不同，研究这些基因间的关系及其广谱的抗病机理，为更好地利用这些抗病基因奠定基础。
实施例3、Pigm与Pi9、Pi2是等位或紧密连锁，但抗谱不同
利用无毒菌株01-19接种谷梅4与75-1-127(Pi9)的F2群体717株，没有发现感病分离的植株，同时感病品种日本晴发病很严重。表明Pigm与Pi9可能是等位的或者是抗病基因簇中紧密连锁的。同样利用无毒菌株01-19接种谷梅4和C101A51(Pi2)的F2群体545株，全部表现抗病，表明Pigm与Pi2的关系可能是等位或者是抗病基因簇中紧密连锁(见表1)。这与现在已经克隆的Pi9与Pi2是同一抗病基因簇中不同的抗病基因的结果一致。
表1、抗病基因Pigm与Pi9、Pi2等位性分析
利用18个来自不同水稻栽培区的强致病力稻瘟病菌株接种含有不同抗病基因水稻品种谷梅4(Pigm)，MP3(Pigm)，75-1-127(Pi9)，C101A51(Pi2)，Toride1(Pizt)，Zenith(Piz)，以高感病品种Maratelli做感病对照，详细接种结果见表2。结果表明谷梅4与Pigm的单基因系MP3的抗谱最广，可以抵抗全部18个菌株的侵染。而且谷梅4与MP3抗谱一样，同时也进一步证实了水稻谷梅4对稻瘟病菌的广谱持久抗性是由Pigm位点控制。75-1-127(Pi9)对其中的11个菌株表现抗性，Toride1(Pit)对12个菌株表现抗性，C101A51(Pi2)的抗性最差，仅仅对其中4个菌株有抗性。以上结果表明，Pigm表现抗性要好于Pi9和Pizt，都比Pi2的抗性强。
表2、不同抗病基因间的抗谱差异
R：抗病；MR：中抗；S：感病；MS：中感；ND：No Data。
实施例4、Pigm精细定位
根据Pigm定位的标记C26348与S47656的引物序列，通过NCBI提供的工具软件BLASTN(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)将它们分别定位到国际水稻基因组测序计划(IRGP)公布的粳稻日本晴的BAC克隆AP005695和AP006054上，这两个克隆间还有14个BAC/PAC克隆，根据这些日本晴BAC/PAC克隆的序列通过BLASTN软件与籼稻9311的shot-gun序列进行比对，寻找大于30bp的片段插入或缺失位点设计引物，发展InDel标记，共设计30对引物，其中12对在亲本谷梅4与Maratelli间有多态，利用这些标记去筛选感病的1556个定位单株，发生交换的个体数见图5。在缺少可用的InDel标记时，同样的方法比对日本晴与9311的序列中存在的SNP(single nucleotide polymorphism)，寻找SNP在常用的内切酶的识别位点内的区域设计引物，发展为CAPS标记。设计了20对引物，其中5个标记在两亲本扩增的片段经酶切有差异的，利用这5个标记筛选定位群体的单株，标记C5483筛到2个交换单株，C0428筛到8个交换单株，最终Pigm的位置确定在C5483与C0428之间，与标记S29742、PC22705和C24901共分离。同时利用共分离的标记S29742筛选由6个稻瘟病菌株接种BC1F2定位群体构建的不同抗、感池，发现这6对抗、感池的带型分别与抗、感亲本的带型对应一致，表明Pigm位点还控制对这6个稻瘟病菌株的抗性。根据定位标记所对应的日本晴的BAC/PAC克隆构建覆盖Pigm重叠连锁群图谱(图4-5)。
Pigm的紧密连锁标记C5483与C0428在日本晴的PAC克隆(RGP)AP005659(全长序列公布于NCBI)上距离是70kb，这个区域中包含了5个NBS-LRR类抗病基因(Os06g17880，Os06g17900，Os06g17920，Os06g17930，Os06g17950)和一个没有明显阅读框的抗病基因的同源序列。同时通过BLASTN搜索对应的9311基因组，结果发现这个区域的9311的基因组序列并不完整，存在测序缺口，但找到了5个NBS-LRR类抗病基因。这5个抗病基因与对应的日本晴的抗病基因在核苷酸序列上存在95-99％的一致性。由于日本晴和9311都是感病品种，对定位所用的菌株均表现感病，所以它们的基因组中并不含有Pigm基因。由于这些抗病基因的核苷酸序列相似性非常高，不可能通过长距离PCR技术获得完整的抗病基因。为精确分析Pigm位点的抗病基因组成情况，必须构建水稻谷梅4的基因组文库。
实施例5、BAC文库的构建与鉴定分析
构建高覆盖率的BAC文库首先要获得高质量的大片段DNA，提取水稻的黄化苗细胞核制备大分子DNA可以有效排除叶绿体细胞器DNA的污染，保证建库所需要的DNA的质量和浓度(见图6)。
为了确定最佳的酶切条件，设计了0、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、10个单位的HindIII酶量对大小均分凝胶块进行部分酶切实验。如图7所示，1.0和2.0单位的酶切的片段主要集中在100-300kb，根据预酶切的结果决定用1.5单位为最佳部分酶切量。根据预酶切用的胶块和最佳酶量，成比例的增长进行大量酶切。大量酶切后的大片段DNA的获得是通过两次脉冲电泳的选择。这样可以尽可能的把小片段DNA和杂质去掉，保证获得大片段DNA主要集中在100-300kb见图8。采用7∶1(摩尔浓度比)的载体与插入片段比例的连接产物，经过充分的脱盐处理，电击转化的产物涂平板获得58850克隆，保存在384个1.5ml Eppendorf管中。
随机挑取100克隆，提取质粒DNA经NotI、SfiI、DraI、SwaI酶切后，通过脉冲电泳检测插入片段的大小及空载率，见图9。结果发现，NotI、SfiI酶切的片段较多，不利于统计插入片段的大小，可能是由于该水稻品种基因组GC含量高，改用识别AT含量高的DraI、SwaI酶切时产生的条带较少，可以精确的鉴定文库插入片段的大小。统计结果表明，99％的克隆含有外源插入片段，插入片段的大小在50-200kb之间，平均插入大小在104kb，见图10。按水稻基因组390M计算，覆盖水稻基因组大约14倍，筛选到目的DNA片段的概率99.9％。为了评估BAC克隆的插入片段能否在宿主大肠杆菌中稳定传代，随机选取4个克隆继代培养100代后，经酶切检测0代与100代的BAC克隆的带型一致，说明BAC克隆在大肠杆菌中稳定存在。
实施例6、筛选阳性BAC克隆及跨叠克隆群的构建
根据前期的精细定位的结果，检测Pigm基因两端最近的定位标记C5483、C0428和共分离的标记S29742是否适合筛选BAC文库，结果这三个标记几乎在所有的BAC克隆池中PCR扩增出的片段大小与水稻谷梅4的大小一致，很难区分阳性克隆池。所以参考日本晴已经测序的BAC克隆P0649C01中目标区域的序列设计筛选阳性克隆的标记5个，最后确定利用特异的标记S35395和S54246筛选384个BAC克隆池，获得6个阳性克隆池6B、A4、D4、D5、G5、H9(为构建克隆保菌时的编号。同样利用标记S35395和S54246按照“12+8”的方式并孔分别筛选6个阳性克隆池的阳性克隆，在6B中筛选到5个阳性克隆，这5个BAC克隆的NotI酶切图谱一致，表明克隆池6B中筛到的5个阳性克隆为同一个阳性克隆BAC30。然后分别把从BAC克隆池A4、D4、D5、G5、H9中筛选到的阳性克隆，利用BamHI和HNotI酶切图谱鉴定，确定了两个与BAC30不同的阳性克隆BAC5、BAC7。标记C5483、S29742和S35395在BAC5中PCR扩增出阳性片段，标记S29742、S35395和S54246在BAC30中PCR扩增出阳性片段，标记C0428和S54246在BAC7中PCR扩增出阳性片段，根据这些标记的位置可以初步确定这三个BAC克隆的重叠关系。然后把这三个阳性克隆BAC30、BAC5和BAC7末端测序，构建覆盖Pigm的跨叠克隆群。见图11-12。
实施例7、BAC30克隆的测序及组装
选取包含完整Pigm位点的BAC30进行shot-gun测序。首先构建测序用的插入片段在2-4kb的亚克隆库，构建亚克隆库的BAC克隆质粒DNA的质量要求高，既要保证质粒DNA的完整性，又要避免大肠杆菌基因组DNA的污染。本发明人采取QIAGEN Large-Construct Kit试剂盒提取BAC30克隆的质粒DNA，符合建库的要求。采用超声波随机打断BAC30质粒DNA获得2-4kb的小片段，并经T4DNA聚合酶修补片段末端回收构建亚克隆文库，保存了2000个单克隆。在测序前，利用内切酶SwaI鉴定插入片段的大小，酶切BAC30质粒DNA的产物经脉冲电泳检测包含37kb、30kb、25kb和8kb的片段，表明BAC30克隆中插入片段大小约为100kb，根据这个克隆的大小，随机挑取了1600个阳性亚克隆进行双向测序，有效的测序反应为2400个。把获得的所有克隆末端序列，采用Staden package软件进行序列组装，用rungap编辑组装过后的数据。序列组装依据两个原则：(1)同一亚克隆两个方向的序列间距不超过4kb；(2)对于存在单核苷酸差异的序列应装到不同位置。对于软件自动组装的序列又进行人为手工计算，判断序列拼装位置的可靠性，将错误组装的序列进行拆分，再有目的地组装到正确的位置。组装后的序列覆盖率约10倍左右，有3个序列缺口，然后以跨过缺口的亚克隆为模板，设计了填补缺口的引物，对PCR产物进行测序。其中两个缺口通过引物定向测序得以填补。第3个缺口的测序结果不理想，采用以覆盖该区域的大片段亚克隆2-17质粒DNA为模板，利用高保真酶扩增了5kb的PCR产物，改用针对GC富含序列的测序试剂盒GC-Big dye terminator后，填补上了这个缺口。最后对第3个缺口边界序列的观察发现，该缺口是由特殊的序列-GC富含区所造成。
由于BAC30克隆中的大片段重复的序列非常多，而且序列的相似性高，给序列拼装带来了巨大的困难。另外利用插入片段为15-30kb的转化亚克隆可进一步验证组装的可靠性。把这些大片段的亚克隆末端进行测序，然后采用软件BLAST2(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/wblast2.cgi)把这些亚克隆末端序列定位到相应的BAC位置，检查亚克隆两末端序列间的距离是否在15kb左右，结果发现有两个亚克隆57和74的两个末端对应BAC30序列位置间的距离分别达到了40kb，这表明BAC30序列组装还存在问题，然后对其中的一个亚克隆74进行的shot-gun测序，获得完整22kb的序列，根据亚克隆74的完整序列对BAC30序列进行重新组装调整，最后获得104,650bp的完整BAC30序列。结果发现BAC30序列中存在一个12kb的大片段重复。BAC30DNA的SwaI酶切产物电泳分析图谱与电子酶切图谱一致，同样验证序列组装结果的正确性。
实施例8、Pigm的进一步定位及物理图谱的构建
克隆BAC30的完整序列通过BLASTN搜索水稻全基因组序列，发现其末端1-9364bp序列对应日本晴的PAC克隆AP005659的29771-38933bp处，一致性达到99％，另一末端序列82724-104650bp序列对应克隆AP005659的35048-56965bp处，一致性达到99％。寻找二者的序列中存在的插入与缺失片段设计InDel标记，其中S48590在谷梅4与Maratelli两亲本间存在多态，然后检测定位群体，结果还有7个发生交换。另外引物S26205与P18849在以谷梅4的基因组DNA为模板扩增出目的PCR产物，以Maratelli基因组DNA为模板无带。这样的标记属于显性标记，同样也可以用来定位，检测所有10个交换单株，结果均未扩增出PCR产物，表明标记S26205与P18849与Pigm共分离。利用共分离标记S29742、S26205与P18849进行BC2F2(谷梅4/Maratelli//Maratelli)群体中单株基因型的鉴定，共鉴定了3500株，找到一株S29742发生交换，而S26205与P18849为感病基因型的单株，经表型鉴定结果感病。最后把Pigm定位S29742与S48590间约100kb的区域，结合另外两个阳性克隆BAC5和BAC7的位置构建覆盖Pigm的物理图谱。见图12。
实施例9、克隆BAC30序列分析
利用软件RepeatMasker(http://repeatmasker.org/cgi-bin/WEBRepeatMasker)分析BAC30的完整序列。结果见表4，整个BAC克隆序列的GC含量为43.85％，BAC30含有的相似重复序列达到27.52％，低于水稻的平均含量35％。其中Retroelements占整个BAC序列长度的18.12％，包括SINEs占0.58％，LTR elements占17.55％。DNA transposons占整个序列长度的7.97％。另外还存在少量的Simple repeats和low complexity重复序列。
表4、BAC30中重复序列分析
对BAC30整个序列的基因预测采用了FGENESH、GENESCAN等软件，结合BLAST和BLASTP搜索数据库分析。共预测有15个开放阅读框，其中包含9个NBS-LRR类抗病基因，分别命名为R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10，还有1个非常典型编码Ty3/gypsy类反转录转座子。
将BAC30的核苷酸序列与已经完成测序的感病品种日本晴、9311基因组序列进行比对，发现BAC30序列的两个末端分别对应日本晴PAC克隆AP005659的29711bp与56965bp处，它们之间的距离约为27kb，包含3个NBS-LRR类抗病基因，分别命名为R2-nipb，R9-nipb，R10-nipb。由于9311基因组采取的是shot-gun的策略测序，其中存在测序的gap，通过BLAST搜索分别在ContigAAAA02018910、ContigAAAA02018911和ContigAAAA02018915上找到3个NBS-LRR抗病基因，分别命名为R2-9311、R9-9311和R10-9311。这些日本晴和9311基因组中的抗病基因与谷梅4的对应基因序列在核苷酸水平上一致性达到95-99％(见图13)。利用Pigm共分离的标记S26205和p18849以日本晴和9311基因组DNA为模板PCR不能扩增出任何产物，说明在日本晴和9311基因组不含有Pigm候选基因的同源序列。把BAC30序列与已经克隆的具有广谱抗性的Pi2/Pi9位点的序列进行比较，发现在Pi2/Pi9位点对应区域内仅包含5个抗病基因，比Pigm位点少4个抗病基因见图14。同时在Pigm位点含有非常典型的反转录转座子，它可能对Pigm位点的R基因的进化复制起到重要的作用。这些对应的抗病基因在核苷酸上的序列一致性在90％-99％，序列差异主要存在这些基因的内含子中。表明Pigm位点控制的广谱抗性与其含有多个抗病基因直接相关。
序列分析发现BAC30的68452～73937bp这段序列编码逆转录转座子Gal-Pol多聚体蛋白。BLAST2以及人工搜索确定了该逆转录转座子的完整结构，其与RIRE8BI相似性最高，全长12kb，5’LTR、3’LTR与中间区域的长度分别为2999bp、2999bp与5485bp。编码蛋白区域的poi基因顺序为逆转录酶(rt)-RNaseH(rh)-整合酶(int)，因而属于Ty3型逆转录转座子。5’LTR和3’LTR的左右两个边界序列为TGTCAC.........GTGACA的倒转重复，整个反转录转座子的两边界是5bp(AATTT)的插入靶位点DNA的正向重复(TSD)。在5’LTR下游序列中，有与tRNAi Met 3’末端18个碱基序列互补的引物结合位点(PBS)，是逆转录转座子合成负链DNA所必须的。而3’LTR上游的7个嘌呤(AGGGGGG)形成了多嘌呤位点(PPT)，该位点参与逆转录转座子正链DNA的合成。图15是该反转录转座子的结构示意图。
该逆转录转座子的两端2.999kb的LTR序列间仅存在4个SNP，按照中性的ADH的碱基每年的突变频率6.5×10-9计算，该转座子的插入年限大概是4.3万年。和水稻籼粳亚种分化的时间差不多。
实施例10、候选基因分析
Pigm基因定位在BAC30上100kb的范围内，在这个区域内包含9个NBS-LRR类抗病基因。根据已有的抗病蛋白信息，对软件预测的这些抗病基因结构进行分析并进行了相应的调整，依据基因的5’UTR和3’UTR的序列设计引物通过RT-PCR方法获得了抗病基因R2、R4(Pigm3)、R6(Pigm1)和R8(Pigm2)的全长cDNA，这些基因的结构表现惊人一致，详细信息见图16。这些基因的第1外显子都为116bp，第3外显子31bp，中间是一个较大的2952bp外显子。在第1与第2外显子间内含子较大，分别5569bp、4001bp、3838bp、4034bp，它们的差异主要集中在内含子上，整个编码框的核苷酸序列一致性在97-99％。在第2与3外显子间是一个非常保守的128bp内含子。
对于Pigm2基因，其基因结构与R2一致，其3-UTR与R2基因同源性高，但整个基因组的DNA序列与R10的同源性最高，推测Pigm2可能是由于反转录转座子的插入形成的嵌合基因。发现其表达量非常低，利用特异的引物进行RT-PCR，经过35轮循环仍然只有模糊的带型。同时分析BAC30的组装图谱发现覆盖Pigm2基因的克隆测序结果都不理想，峰值不高，发现这段序列中存在明显的高级结构，局部GC含量高。试图通过以BAC30的质粒DNA为模板进行PCR扩增Pigm2的基因序列进行验证都很困难，最后通过酶切两个17kb的亚克隆再构建小片段亚克隆进行步移测序验证Pigm2基因的序列组装结果是正确的。可能是与基因处在Ty3/gyspy反转录转座子序列附近被甲基化有关。
R2是Pi9、R2-Pi2的等位基因，通过RT-PCR获得其全长的cDNA，分析序列发现其在249bp处缺失一个碱基T，直接导致编码序列改变，在366bp处产生一个终止密码子TGA，翻译提前终止，它们在核苷酸序列上一致性达到97.5％，其中R2-Pi9是有抗病功能，而R2-Pi2丧失了抗病功能，它们间的SNP主要集中在LRR功能域上，与过去认为LRR是决定抗病基因的小种专化抗性的功能是一致的。
Pigm3与Pigm1基因的基因组DNA在核苷酸序列一致性高达99.9％，仅在内含子中存在一处163bp的碱基缺失和少量的SNP。这两个基因5’UTR和3’UTR的序列也是高度一致，编码框中在第2外显子中存在6个SNP。表明Pigm位点在进化过程中发生明显的抗病基因的复制现象。Pigm3与其等位基因Pi2、R5-Pi9在核苷酸水平一致性分别达到98.4％、97.5％，但Pigm3的等位基因Pi2表现广谱抗性的功能，而同样也表达的R5-Pi9却表现抗性功能的丧失，所以研究Pigm位点的Pigm3与Pigm1基因的功能对下一步广谱抗病机理的阐明具有重要的意义。
R10是另外一个具有同样结构的抗病基因。但在第2外显子的5’端发生了313bp的缺失，缺少明显的第3外显子。R10与Pigm2的序列同源性非常高，第1外显子序列完全一致，R10的2.4kb内含子与R8的序列一致性达到99％。
R3与R5的编码区同源性非常高，主要差异在内含子中，没有获得其完整的cDNA序列。R7和R9序列同源性高，但仅是抗病基因的同源序列，没有完整的编码框。可能是由于抗病基因簇在染色体交换重组过程中产生的嵌合基因。
实施例11、构建转化的大片段亚克隆文库
根据软件预测分析和获得部分抗病基因的cDNA结果，表明BAC30中的大部分抗病基因长度在12kb左右，同时试图构建包含2个抗病基因的较大片段克隆进行遗传转化验证基因的功能。不可能通过普通的酶切的方法构建转化克隆，必须构建大片段插入的亚克隆表达文库。按照6个浓度梯度的内切酶Sau3AI部分酶切BAC30质粒DNA 10分钟，根据插入目的片段在15kb以上的要求，选择最佳部分酶切条件为0.2U/ml，利用浓度为0.2U/ml的内切酶Sau3AI部分酶切大量的BAC30质粒DNA，见图18。通过脉冲场电泳和电洗脱的方法回收15-30kb的大片段的DNA见图19，鉴定回收产物的浓度大约为10ng/μl，然后连接到BamHI完全酶切后脱磷的pCAMBIA1301载体上，通过电击转化和蓝白斑筛选，随机挑取了120个白斑克隆提取质粒DNA。
首先通过PCR和限制酶切图谱的方法鉴定亚克隆的插入片段的大小及在BAC30上的大概位置。根据BAC30的序列设计引物通过PCR筛选可能包含候选抗病基因的阳性克隆55个。然后利用内切酶HindIII和BamHI酶切鉴定插入片段大小(见图20)，大部分克隆插入片段在15-20kb，有少部分在20-24kb，没有发现超过25kb的片段。根据以前利用pCAMBIA1300构建大片段亚克隆文库经验认为pCAMBIA1300载体的插入片段能力是16kb，所以酶切鉴定插入片段在20kb以上的克隆非常少。选取鉴定的亚克隆进行末端测序，根据末端序列把这些亚克隆定位BAC30上，构建覆盖整个BAC30的亚克隆重叠群。根据这些亚克隆在BAC30位置，确定插入片段最大的克隆2-39，插入片段达到24431bp，克隆74插入了22298bp，克隆57插入片段为20993bp，表明pCAMBIA1301载体容量可达到24kb。这些候选阳性克隆分别通过农杆菌介导的遗传转化，转到感病的品种日本晴和Maratelli中。
实施例12、不同的启动子驱动Pigm1的克隆构建
为了验证Pigm1的功能，除了利用包含Pigm1的基因组DNA转化日本晴株系，另外还采用了不同的启动子来驱动Pigm1全长cDNA的构建进行遗传转化，检测Pigm1的功能，首先采用2kb的Pigm1自身的启动子驱动Pigm1的全长cDNA。利用引物R6P(R6P-F：ccaatttggagttcatatgagtg(SEQ ID NO：12)，R6P-R：ggactAGTcgttcgactctcccttc(SEQ ID NO：13)，下划线部分为引入的SpeI酶切位点)扩增出Pigm1的启动子，通过T-A克隆到T-easy载体上用ApaI和SpeI酶切获得Pigm1的启动子DNA，利用引物R6C(R6C-F：gaagggagagtcgaacgACTagtcc(SEQ ID NO：14)，R6C-R：tcagccagcttgagctgtgccta(SEQ ID NO：15)，下划线部分为引入的SpeI酶切位点)PCR扩增出Pigm1的全长cDNA并克隆到T-easy载体上，利用ApaI酶切和SpeI部分酶切该克隆质粒DNA，然后把Pigm1的启动子插入到Pigm1的cDNA的前端获得含有Pigm1自身的启动子驱动Pigm1的全长cDNA克隆，再利用ApaI酶切和SpeI部分酶切获得5.1KBPigm1自身的启动子驱动Pigm1的全长cDNA并克隆到pCambria 1301N(图28)表达载体的多克隆位点ApaI和SpeI间。利用农杆菌转化的方法获得15个独立的株系，经过抗病检测与亚克隆57转基因株系表现同样的抗病表型。Pigm1的启动子序列如SEQ ID NO：2中第1-2000位。
另外采用35s启动子超表达Pigm1，采用与上述类似的克隆构建方法，构建在pCambria 1301N表达载体上，利用农杆菌转化的方法获得18个独立的株系，接菌实验证实具有抗病功能。
Eui Promoter是特异在水稻的幼穗表达，在叶片表达量非常低，利用该启动子(启动子是来自日本晴的EUI基因)驱动Pigm1基因的克隆也是采用同上的构建方法，构建在pCambria 1301N表达载体上，通过农杆菌转化日本晴获得31个株系，发现Pigm1在水稻的叶片表达量非常低，基本没有抗病性，而在水稻穗部表达，表现抗水稻穗瘟。
综合以上的结果，表明Pigm1在不同启动子驱动下，在水稻不同表达部位表现抗病性。
实施例13、候选基因功能验证和表达分析
根据构建的BAC30亚克隆重叠连锁群，选取其中包含9个候选基因的亚克隆分别通过遗传转化的方法验证候选基因的功能。目前已经获得8个亚克隆的转基因植株，分别利用PCR的方法和GUS染色验证获得阳性苗。由于获得转基因阳性植株在苗期很难存活，所以采用在分蘖期注射接种的方法进行抗性鉴定。接种菌株CH109和01-19的鉴定结果表明克隆3-27、3-17、2-33、2-38、2-20、2-39的转基因T0代植株和日本晴的表型一致，表现感病。亚克隆74和2-13的转基因阳性T0植株的鉴定结果不明确，还需要进行验证T1代植株。亚克隆57的T0转基因植株对这两个菌株均表现高度抗性，叶片仅有注射的针眼，无病斑扩散，和谷梅4的抗病表型一致。随机选取的10株抗病的T0代植株收获的种子T1，在3-4叶幼苗期喷雾接种，统计结果见表5。抗、感分离均表现3∶1，表明这些转基因植株均为单拷贝插入。同时利用引物S26205进行PCR验证，表明所有表现抗病的植株与抗病亲本谷梅4一致有目的带型，而表现感病的植株和受体亲本日本晴一样，均不能扩增出相应的PCR产物，见图22。但对于57的转基因纯合植株验证是否具有广谱的抗性，需要进一步鉴定其抗谱。另外一个亚克隆3-6s的转化愈伤很难分化，目前还没获得绿苗。所以其包含的Pigm2基因的功能不能确定。
表5接种克隆57转基因T1代植株
分析亚克隆57序列发现其仅包含一个抗病基因Pigm1，其编码框长度为3099bp，编码1032个氨基酸。其N端含有CC和NBS保守结构，1-192氨基酸为CC功能域，含有WAEQIRDLSYDIEDSLDEF保守的非TIR序列。在NBS结构域中有明显的3个激酶位点：kinase1a(1-loop)GMGGLGKT(193-200)，kinase2KRYFVVLDDLW(277-287)，kinase3a GSRIVITTRNVDL(307-319)。Pigm1的N端是包含17个LRR重复的结构域，重复结构IXX(L)XX(L)XX(L)(其中X代表任意氨基酸)，Pigm1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3。其中，第1-192氨基酸为CCdomain，193-575氨基酸为NBS domain，其中3个斜体下划线处为磷酸激酶位点；第576-975位氨基酸为LRR domain。
SEQ ID NO：3：
MAETVLSMARSLVGSAISKAASAAADETSLLLGVEKDIWYIKDELKTMQAFLRAAELMKKKDELLKVWAEQIRDLSYDIEDSLDEFKVHIESQTLFRQLVKLRERHRIAIRIHNLKSRVEEVSSRNTRYSLVKPISSGTEIDMDSYAEDIRNQSAHNVDEAELVGFSDSKKRLLEMIDTNANDGPAKVICVVALSRKIFESEEDIRKNFPCNAWITVSQSFHRIELLKDMIRQLLGPSSLDQLLQELQGKVVVQVHHLSEYLIEELKELHDWNWINEIAFPKNNKKAEKCATASLVYHLDFLQMNDAITLLLRKTNKNHEDMESNKNMQKMVERIVNKCGRLPLAILTIGAVLATKQVSEWEKFYEQLPSELEINPSLEALRRMVTLGYNHLPSHLKPCFLYLSIFPEDFEIKRNRLVGIWIAEGLVRPKVGMTTKDVGESYFYELINRSMIQRSRVGIAGKIKTCRIHDIIRDITVSISRQENFVLLPMGDGSDLVQENTRHIAFHGSMSCKTGLDWSIIRSLAIFGDRPKSLAHAVCPDQ
LRMLRVLDLEDVTFLITQKDFDR
IALLCHLKYLSIGYSSSIYSLPRS
IGKLQGLQTLNMPSTYIAALPSE
ISKLQCLHTLRCIGQFHYDNFSLNHP
MKCITNTICLPKVFTPLVSRDDRAKQ
IAELHMATKSCWSESFGVKVPKGIGK
LRDLQVLEYVDIKRTSSRA
IKELGQLSKLRKLGVITKGSTKEKCKILYAA
IEKLSSLQYLYVNAAL
LSDIETLECLDSISSPPPL
LSTLRLNGSLEEMPNW
IEQLTHLKKFYLRRSKLKEGKTMLI
LGALPNLMFLSLYHNSYLGEKLVFKTGAFPNLRTLC
IYELDQLREIRFEDGSSPL
LEKIEIGKCRLESG
IIGIIHLPKLKEIPITYGSK
VAGLGQLEGEVNAHPNRPVLLMDSDRRYHDLGAEAEG
SSIEVQTADPVPDAEGSVTVAVEATDPLPEQEGESSQSQVITLTTNDSEEIGTAQAG
其相应全长cDNA序列为(SEQ ID NO：1)：
atggcggagacggtgctgagcatggcgaggtcgctggtgggcagcgccatcagcaaggccgcctccgctgctgccgacgagaccagcctcctgctgggcgtcgagaaagacatctggtatatcaaagatgagctaaaaacgatgcaagcattccttagagctgctgaacttatgaaaaagaaagatgaactattaaaggtttgggcagagcaaatacgtgacctgtcatatgacattgaagattcccttgatgaatttaaggtccatattgaaagccaaaccctatttcgtcagttggtgaaactcagagaacgccaccgaattgctatccgtatccacaaccttaaatcaagagttgaagaagtgagtagcaggaacacacgctacagtttagtcaagcctatttcctctggcacagagattgacatggattcctatgcagaagacattcgtaatcagtcagctcacaatgtggatgaagctgagcttgttgggttttctgactccaagaaaaggttgcttgaaatgatcgataccaatgctaatgatggtccggccaaagtaatctgtgttgttgggatgggtggtttaggcaagacagctctttcgaggaagatctttgaaagcgaagaagacattaggaagaacttcccttgcaatgcttggattacagtgtcacaatcatttcacaggattgagctactcaaagatatgatacgccaacttcttggccccagttctctggatcaactcttgcaagaattgcaagggaaggtggtggtgcaagtacatcatctttctgagtacctgatagaagagctcaaggagaagaggtactttgttgttctagatgatctatggattttacatgattggaattggataaatgaaattgcatttcctaagaacaataagaagggcagtcgaatagtaataaccactcggaatgttgatcttgcggagaagtgtgccacagcctcactggtgtaccaccttgatttcttgcagatgaacgatgccataacattgctactgagaaaaacaaataaaaatcatgaagacatggaatcaaataaaaatatgcaaaagatggttgaacgaattgtaaataaatgtggtcgtctaccattagcaatacttacaataggagctgtgcttgcaactaaacaggtgtcagaatgggagaaattctatgaacaacttccttcagaactagaaataaacccaagcctggaagctttgaggagaatggtgaccctaggttacaaccacctaccatcccatctgaaaccatgctttttgtatctaagtatctttcctgaggattttgaaatcaaaaggaatcgtctagtaggtatatggatagcagaagggttggttagaccaaaggttgggatgacgactaaggatgtcggagaaagttacttttatgagctaatcaaccgaagtatgattcaacgatcaagagtgggcatagcaggaaaaattaagacttgtcgaattcatgatatcatccgtgatatcacagtttcaatctcgagacaggaaaattttgtattattaccaatgggagatggctctgatttagttcaggaaaacactcgccacatagcattccatgggagtatgtcctgcaaaacaggattggattggagcattattcgatcattagctatttttggtgacagacccaagagtctagcacatgcagtttgtccagatcaattgaggatgttacgggtcttggatcttgaagatgtgacattcttaatcactcaaaaagatttcgaccgtattgcattgttgtgccacttgaaatacttgagtattggatattcgtcatccatatattcacttcccagatccattggtaaactacagggcctacaaactttgaacatgccgagcacatacattgcagcactaccaagtgagatcagtaaactccaatgtctgcatactcttcgttgtataggacagtttcattatgacaactttagtctaaaccacccaatgaagtgcataactaacacaatatgcctgcctaaagtattcacacctttagttagtcgcgatgatcgtgcaaaacaaattgctgaattgcacatggccaccaaaagttgctggtctgaatcattcggtgtgaaggtacccaaaggaataggtaagttgcgagacttgcaggttctagagtatgtagatatcaagcggaccagtagtagagcaatcaaagagctggggcagttaagcaagttgaggaaattaggtgtgataacaaaaggctcgacaaaggaaaaatgtaagatactttatgcagccattgagaagctctcttccctccaatatctctatgtgaatgctgcgttattatcagatattgaaacacttgagtgcctagattctatttcatctcctcctcccctactaagtacactcaggttgaatggaagtcttgaagagatgcctaactggattgagcagctcactcacctgaagaagttctacttacggaggagcaaactaaaggaaggtaaaaccatgctgatacttggggcactgcccaacctcatgttcctttctctttatcataattcttatcttggggagaagctagtattcaaaacgggagcattcccaaatcttagaacactttgtatttacgaattggatcagctaagagagatcagatttgaggacggcagctcacccctgttggaaaagatagaaataggcaagtgcaggttggaatctgggattattggtatcattcaccttccaaagctcaaggagattccaattacatacggaagtaaagtggctgggcttggtcagctggagggagaagtgaacgcacacccaaatcgccccgtgctgctaatggacagtgaccgaaggtatcacgacctgggggctgaagccgaaggatcttctatagaagtgcaaacagcagatcctgttcctgatgccgaaggatcagtcactgtagcagtggaagcaacggatccccttcccgagcaggagggagagagctcgcagtcgcaggtgatcacgttgacgacgaatgatagcgaagagataggcacagctcaagctggctga
Pigm1的基因组序列(SEQ ID NO：2，包含启动子和终止子)
ccaatttggagttcatatgagtgagataaactagtttcaaatttttaaattttattttcgcatacggctccttaagacgtccgtatggaaaaattgatttttccacgcgggctcttaagttgtccgcacgcaaaatgagctcattttggcgtcttgaggagtcgtatgcgaaaatgccgacgcggcaagttgtgatccgtttggaaaaatcatagggtctcgtacaaaagaaattgtttgtgtagtagcgaggggtttttatattccgattaatattcatcaccgtattcgtttcgctctgtatttgtattcgataatattccatttcgtttttatatccgggtttccagttccgaaaaaaaaagaaagtgaatacgatagagctagtttctgaccatattcgatccgttttcatccctaccaccaccgcagccgctactgcccttccatccccgctgccatcttgccatcctcccgcaccttctcgcagtcatcgagctccgacggcacacggcgcagacggcccaccgtggtagcccgcaccgccgtcgccacgaactcctcgccaccaccgcctcgaccgccagactccttcgggcgctgggtctgccgtcggcgcggccaggttcgcctcaccgacgccatcccctcgccacccccaccgccagatgctgccgaaggctgccatcccctccccttgcctcccctgccgccatcgccatccccgccaccagacgccgccgccggccaccatcccgccagatccaggtgcggatctggcggtttcctccgtcgccgtaaacgcctcgaacgccgctgccaccaccatcagacaccaccgccgcaccgctcagccccgctgccagctgccccattgccagatccggccgggcggcacagatctgggctgttctgctgccccgagcaggcccccctcctatgcccgagcacgaggatgaagccccgccgccactgtctttgtggccgcgtgactttgccggcgactgcttgggcagcggcgaggcagaggagggaaagggagatgagcaccggcgaggtcgtcgcctcccagttgcccgtggggaggggcgacacgagaggccaagcgctactcaactgcctgatgctcatccaaagtgagaaagatgcttgaagctgtcgctcgaagcaactttcagtcctcgatataattcgatataagtgatttctctctccatatttgtttggagaaatgctagttataagaaactaagtgtgaccatgtgttatagatgtcagagaaaacagttcattttctcaattctcaaggtaattgggaaaatggagaattactgagcgatacgtgttgctggaaaattgagaatcactgatgatcgcctccatctgaaaattaccgagcgatatttattgctgccaaatcaaaatgattctattcaacccgtgccatggcatggccggatggccccagttcactgattgatcacttaatatatggactgaacaataaatcatggtactttggttgtcgagcatgatcattatttgtggaccacagattcaccgaattaattgggatattgaatcggtcacacacacgacgggcgtactccgctcgtcttaaaataaatggattggacgtgacattatctattacaacgaatctggattagatagtgtctcatccaatcctaaattggtttattttgtgacggagggagtatgatgttaacgtagatggaaatgaggaattgagtagacagtgtggggctggaaaataatggaggacagtaacatcttggagtgtagtgaggcctggagggtcgtccttgacatccaaaccgcacctaactctatgataagcatcctctctcagattgttcagtgcaaaagctaccaatactgctccgagagccagaaaaaagcgctggtcgcctagtgctatcttctatgcagtcgtgagattggttgctctaagcttgaagggagagtcgaacgagtcc(启动子及5-UTR序列)
atggcggagacggtgctgagcatggcgaggtcgctggtgggcagcgccatcagcaaggccgcctccgctgctgccgacgagaccagcctcctgctgggcgtcgagaaagacatctg(外显子1)
gtacgtactgcgtgactctcgttaatttattctgtagatgctcaggaatcagcaactattgtgttgatttccatcgtagcatatcgattttgttggccaccaattctaatcggccggaacaagctagtcactaaatctggcaaatcgatcagctgctgagtgcacaaacatgcatgttattcttttttttttgggttatatgttaagcaacaaagccccttggtaagatatgcatggcaaatgaactaatatcgacatacgtaaagcggaggacccctcgttccatgcgtgggtgactcgagcggtgacaaatcctagcacctccacctccttggatggcctgtggtgacgctttcggccccgagtttcccttgaatacatcatctacaaggtgctattaatgtctagtcacatcatttacgaggcgctattattgcctagtctgcccgaagatagtttagacaacactcttggatggcggtgtccttcgcccagtgatgtccaagagcccgtggatgtttaattgtttagacatggtgttgggtggtgcactagtgggcctgatgggccagttgtaggtccagtggtaaccaatcatgcttagcaatagccggatgcccggattggtgcttgttcttttttcggtgtcgacgcatggtagtatttacttttcctgtttttcctgattatagcatcctaggctatactcttctaatttattcatgctatattaatattaaaacttggtatggtttgtttcattcaagacccttggtggtcaaaggcttgtttggttcaagttcattcctagccttaccaactttttggcaatagcaagaaatggtcattgaaaaaaaaaggcaaaaattggctaggcctacagtttatttcctagcaaagttatactttagcattccactaagccaaataattcggcaatgccattttcttatctacatgccaaatatatggctaatattttggcattaattactcttattttttttggcaaaattgatcaaaagttcacatttttagctctatagtatcaaaagttatctattcactttaatagaacgaaagtttactcggttccgtttttagcactaccgtctcttttctcttgatttgccgtcaattttgaccggcagtcctacccccaggagacattgagcagcagcccgtgatccccctctctcgccgccggtgacgctgtggtggcatcgttcctgctgcgggcagaataagtctggcgtcatcgccctatcgcctggagctgcaaccaccactaccgggcccatcgatcgtctagagcgttatccaccctgcctgccccattacttgcagctccggctgggtcagaacctctccatgcctgacaaattggttcaagattgtcgctgtccggccagcgcttgaattttcagaatatgccatcgaatacgcgctgcttttaagatatgctacccgattcgtgctaattttagaatacgccatcggaacacgaattttcttcgttccgtgccactccgtctctcggagtcagtcgtgccgtcgtcatccgtccgcccagcactgtcgtcgtcagtccgccacccgtgcctgactgcccgttcagctgcgccgtcgtccgtccgtcgccgccatcgccgtcgtccactgtcgcgcccgcacctgcacccgtgtcaggcgcgccgtcgtccgtccgctgtcaccatcatcgtcgtccactgcggcgagcgcagacggctgtggacggatgattgcgcggcaagcgcaagcggcggtggacggacgacggggcagtgcacgcgagcacggtagccgatggactgacgttggcggcattgggagatggacgacgacggcatgattgacgtggggaacggaatgtcacggaacggagaaaattcgcactccggtggcgtatattccgaaaatagcacgaattgggtggcatatcctaaaaacagtgcctattcggtggcatattctaaaaattctcggtcagcataatccccatcaatccccaatccctcaacagttgggttaatattcctggagatgtgttcggttgtttaggttgaagttctccacttcacctccatgagtacatgcacctctacacgtacgttcttaatgagtttgtttgttctatcctccgcttgggttctattttgttggttccgatctgatttgatctggagcggggtcgatcttccacgacggcgagagagacgttgttcgggctgctcgatttggttcaactgtttaggtcgaagggaggggtagaattgcaattcaagtgcatggtcagtcaatttgggtcaaaattaacatcaaactgggataaagagacgacagtgccaaaattggtaacgggaaaactttgagttctattaaagtgaaccagtaactttcgttgctatagaataaaaacgtaaacttttgatgctccttggttgagcttggtacaaaccaaacagacgtaaaataaacactatcctgaatcaagtctactaagttccattgaactcaaccaggatacgtacacttcctcttagaagatgtcttgttttcactttgtacaattttttctattgtaaatttggtacctcgttgtacctaggtacaagaggtaccatgagataccaaattttacactaaaattttggtacctcatggtacctcctcaacgaccgtagaattgctcttaatttaatttaaaaaaaaacataatatttttaaagcatattatggaaattttagtaattattacttttgtaatatatgagttacggttatactcgagatatcctaaattgcttggagatgaataattacaaggtatatcaaagatgagttgaaaataatgcaggcattccttagagctgcagaagttatgaaaaagaaagacgaactattaaaggtttgggtagagcaaatacgtgacctgtcatatgacattgaagattcccttgatgaatttaaggtccatgttgaaagtcaaaccctatttcgtcagttggtgaaacttagatagcgtcaccggatcgctagcccgtggatgtttagttgtttgcacatggtgctggatggtgcgctcatggtcttgttgtaggtctggtaccaaccagtcatgcttagaaatagccggatcagtgcacggtgctaggactttacttggtggtctgtgcagcgctatcgacatgtggtggtgtgcttttttttttttccggattacaatctcatagggctacactctagttattttgctgctatattaatatgaaaacttggtatggttcgtttcttatagaaaaaaacctagttgatcaagggctagttttcttcaagtgcattcctaatcttagcttcttttttttttgcaatggcaagaattgttcattaaaaaaattgataaaaattggctaggcctacgttttgtttcttaccaaagttgtactttaacaataaactaaggcaaatatttcggcaatgccattttcttgtctacagaccaaatatatggctaaattttggcataaccatttttttgtttgcttggttgagcttggtacaaaccaaacagacccaaaataaacagtgtcatgaatcacgtctactaaattcctttgaactgaactagaatatagttgctcttaaaagatttcttgatttcactcggtaccatttactagtacaaacttagatttaatttttaaaaataaaatcataatattgttattatggaaaatttagtcatagtacttttgtaatatatgagatgggttatacttgagatatcctaaattgctttaagatgaataattgctag(内含子1)
gtatatcaaagatgagctaaaaacgatgcaagcattccttagagctgctgaacttatgaaaaagaaagatgaactattaaaggtttgggcagagcaaatacgtgacctgtcatatgacattgaagattcccttgatgaatttaaggtccatattgaaagccaaaccctatttcgtcagttggtgaaactcagagaacgccaccgaattgctatccgtatccacaaccttaaatcaagagttgaagaagtgagtagcaggaacacacgctacagtttagtcaagcctatttcctctggcacagagattgacatggattcctatgcagaagacattcgtaatcagtcagctcacaatgtggatgaagctgagcttgttgggttttctgactccaagaaaaggttgcttgaaatgatcgataccaatgctaatgatggtccggccaaagtaatctgtgttgttgggatgggtggtttaggcaagacagctctttcgaggaagatctttgaaagcgaagaagacattaggaagaacttcccttgcaatgcttggattacagtgtcacaatcatttcacaggattgagctactcaaagatatgatacgccaacttcttggccccagttctctggatcaactcttgcaagaattgcaagggaaggtggtggtgcaagtacatcatctttctgagtacctgatagaagagctcaaggagaagaggtactttgttgttctagatgatctatggattttacatgattggaattggataaatgaaattgcatttcctaagaacaataagaagggcagtcgaatagtaataaccactcggaatgttgatcttgcggagaagtgtgccacagcctcactggtgtaccaccttgatttcttgcagatgaacgatgccataacattgctactgagaaaaacaaataaaaatcatgaagacatggaatcaaataaaaatatgcaaaagatggttgaacgaattgtaaataaatgtggtcgtctaccattagcaatacttacaataggagctgtgcttgcaactaaacaggtgtcagaatgggagaaattctatgaacaacttccttcagaactagaaataaacccaagcctggaagctttgaggagaatggtgaccctaggttacaaccacctaccatcccatctgaaaccatgctttttgtatctaagtatctttcctgaggattttgaaatcaaaaggaatcgtctagtaggtatatggatagcagaagggttggttagaccaaaggttgggatgacgactaaggatgtcggagaaagttacttttatgagctaatcaaccgaagtatgattcaacgatcaagagtgggcatagcaggaaaaattaagacttgtcgaattcatgatatcatccgtgatatcacagtttcaatctcgagacaggaaaattttgtattattaccaatgggagatggctctgatttagttcaggaaaacactcgccacatagcattccatgggagtatgtcctgcaaaacaggattggattggagcattattcgatcattagctatttttggtgacagacccaagagtctagcacatgcagtttgtccagatcaattgaggatgttacgggtcttggatcttgaagatgtgacattcttaatcactcaaaaagatttcgaccgtattgcattgttgtgccacttgaaatacttgagtattggatattcgtcatccatatattcacttcccagatccattggtaaactacagggcctacaaactttgaacatgccgagcacatacattgcagcactaccaagtgagatcagtaaactccaatgtctgcatactcttcgttgtataggacagtttcattatgacaactttagtctaaaccacccaatgaagtgcataactaacacaatatgcctgcctaaagtattcacacctttagttagtcgcgatgatcgtgcaaaacaaattgctgaattgcacatggccaccaaaagttgctggtctgaatcattcggtgtgaaggtacccaaaggaataggtaagttgcgagacttgcaggttctagagtatgtagatatcaagcggaccagtagtagagcaatcaaagagctggggcagttaagcaagttgaggaaattaggtgtgataacaaaaggctcgacaaaggaaaaatgtaagatactttatgcagccattgagaagctctcttccctccaatatctctatgtgaatgctgcgttattatcagatattgaaacacttgagtgcctagattctatttcatctcctcctcccctactaagtacactcaggttgaatggaagtcttgaagagatgcctaactggattgagcagctcactcacctgaagaagttctacttacggaggagcaaactaaaggaaggtaaaaccatgctgatacttggggcactgcccaacctcatgttcctttctctttatcataattcttatcttggggagaagctagtattcaaaacgggagcattcccaaatcttagaacactttgtatttacgaattggatcagctaagagagatcagatttgaggacggcagctcacccctgttggaaaagatagaaataggcaagtgcaggttggaatctgggattattggtatcattcaccttccaaagctcaaggagattccaattacatacggaagtaaagtggctgggcttggtcagctggagggagaagtgaacgcacacccaaatcgccccgtgctgctaatggacagtgaccgaaggtatcacgacctgggggctgaagccgaaggatcttctatagaagtgcaaacagcagatcctgttcctgatgccgaaggatcagtcactgtagcagtggaagcaacggatccccttcccgagcaggagggagagagctcgcagtcgcaggtgatcacgttgacgacgaatgatag(外显子2)
gtcagtcactccctagatggcagcttaattaacttgtttctaattctcttcttgttcagtattagccatcaggtgagggcgatgatttcaactcacttttcatctctctcgttttcttaacctgacag(内含子2)
cgaagagataggcacagctcaagctggctga(外显子3)
cgatctcctcccccatcagcgtcgtcatcagcgaacagaaagggcagagcttccctgcttctgcgtgcacctcaccgctctgactcggagggacatgatgatcaatgaggcttccagtttccaaatgtgtggctaacacaccaggttgtccctatccgaggtatgaattgatgatccaatttttttccttccggtgaggttcaaacatttgatgcttagtttcatgagggtattctgtgtttcgggttgtgatatgcacaattactcccagtttatggtttgatgctgagtttttatttctcttcttacacgtgcactcttcatttccatttcattcaaaacagaaaccaagttgattgcattgtggaggggaatatgagatcagaaatcaaatggttagttgtggttttcttatttcgtttgctatgcgcagttgcgcaccaaccgtttgctagaatgtctgaaagagcctatgtacatatggtggcctgaacattacaagttatcatattttatattgttgctagctttcctttcaaaaaaaaaaaattgttcctaaccgatcacatagtccagtagtccagtagtaagatttttgttaagtttattgttactgaatatattgtttggcctgcagttgttatttctctcaaaacaaaattatttggtagtctcaagtacaaaaagaaagacagatcagacaagttgttttactctactagtttcaaattgatcatctctgtttgttcttcattcattttctttctgtaagagagtttgctaggatggtgatgtggtcatgtggatgatcaaatggactacatcagacgcatcacactgctgcccaacctttacccactgttgacaaatggagtgcaggtcctaaaccaggccagaagtttgttcagtgttcttgttccaaaataaacattctggatggcaggttatttcattataacattcactcttatagcttgcttagtcaaaactacaaataaggtctcctaaaaaaatgcatcgacgttgatatctgtgttttctgccatgcagaatgacttgctctcaatggttgaagctgcaatcttccaggctcatttctggctgaacccaaattggtggcttggaggccggagctgcatgacatcagagataacaatggccactttttgttgccatgggtgagggtacatggatcatgccgctaagcctttactccgagctagcagaaaactggctggctgtagatcgagttcgccatcgccctcaactttgtcgatgcgatggcgatcatggatagatgtatgtcacatagcgcaaagcggagcttccaatgttcgcaaccgtactgtaaatgtgggaggggaaaatttctcaaggggacaaccatggaacagaggagatggagcaaagtagttgctcttgctatcatttcagagctcaggctgatctctagctcagataggagtactaattcgtatgtgtgtgtatttgatctatgatggtacgttttaagagttgaaccagatattgcttgatcattacatgatgatatgtaaaaaatggtattgacaaggagacgcaggaacagggtggttcattgctctgtttaatcttaatcttggagagctaggatggaaaactgagttggtggttatatctctactacttttgatgttgtccaaaacaaatttgtttctactcatgtacgaatgtaaaaacaaatacaaaacttatttttctctttaatcagattattaatcagggggatttttctttctctagtactgtataaaaatacttttttatcgtcaatcctcctaaaattcctatttataaactcatttttcttcagttttttttctgtattttggttttctttcctctacgtgactacacattttgaattgaacatgctctgtatctgctcggaatacttattattcagccaacttaaatgcatgagatttgctccggttcaccaaaaattacctcgaggtacc(3’-UTR和终止子)
由于在GM4和MP3的基因组中Pigm3与Pigm1同源性极高，不能利用RT-PCR的方法检测Pigm1基因的时空表达模式，所以接种克隆57(仅含有Pigm1)的转基因T 1代植株，检测0，4，12，24，48，96小时的R6基因的表达，见图23，表明Pigm1不受病原菌的诱导表达，而且接种后不同时间点的表达也是一致的，在根，幼苗，叶和穗的表达量也一致。同时用50个稻瘟病菌株在苗期接种含有Pigm1和Pigm3的转基因植株发现Pigm1可以完全抵抗这些菌株的侵染，表现广谱抗瘟性。而Pigm3却表现与亲本日本晴一样完全感病，见表6。另外在黑龙江、湖北恩施、湖南桃江和浙江东辉病圃田间鉴定结果均表明Pigm1具有广谱的抗瘟性。见表7图24。
表6、菌株接种鉴定Pigm1，Pigm3的抗瘟性
表7、2008-2010年在全国的重点田间病圃鉴定结果
2008年湖南桃江病圃鉴定结果
其中，T1-T17分别为表示通过常规育种选出的含有Pigm1基因品系。。
2009年浙江东辉病圃表现高抗或免疫
其中，L1-L7分别表示以感病品种Maratelli为背景选育的含有Pigm近等基因系。6-1～6-3分别表示以日本晴为背景选育的含有Pigm1的近等基因系，4-1～4-3分别表示以日本晴为背景选育的含有Pigm3基因的近等基因系，8-1～8-3分别表示以日本晴为背景选育的含有Pigm1和Pigm3的近等基因系。
实施例14、谷梅4感病突变体的筛选与分析
采用在3-4叶幼苗期喷雾接种的方法，共筛选了42250个诱变谷梅4的M2植株，获得了16个感病单株，所有的感病单株种植田间，经过M3表型鉴定结合注射接种鉴定，最后确定4株感病突变的谷梅4单株。对这4株采用Pigm位点候选基因特异引物进行PCR确认突变位点。确认这4株在Pigm3、Pigm1、Pigm2位点发生片段缺失。但很难区分Pigm3和Pigm1的突变，但目前转基因的结果已经确认Pigm1是具有抗性的Pigm候选基因，Pigm3没有抗病性。
实施例15、Pigm位点进化分析
Pigm位点的各成员中R2、Pigm3、Pigm1、Pigm2的基因结构与已经克隆的Pi9、Pi2一致，它们之间的核苷酸序列一致性在95.6-99％，Pigm3与Pigm1的编码区和非编码区以及启动子区的核苷酸序列的一致都达到99％，仅存在Pigm1蛋白的858位苯丙氨酸，860位丝氨酸，909位谷氨酸和961位的天冬氨酸与Pigm3蛋白的858位缬氨酸，860位酪氨酸，909位谷氨酰胺和961位酪氨酸不同，所以推测Pigm1可能是由Pigm3复制产生的。Pigm位点的其它抗病基因在编码区的一致性非常高，差异主要集中在N端内含子与5’UTR以及启动子区，N端内含子大小1209-5569bp变化。Pigm位点的抗病基因序列与Pi9、Pi2对应的同源基因进行聚类分析(图25)，结果表明，这些抗病位点的等位基因序列一致性要高于它们各自的同源基因，表明Pigm、Pi9、Pi2可能由同一个祖先进化而来。但在Pigm位点由于反转录转座子的插入和不平等交换的发生导致基因复制进化出更多的抗病基因。
Pigm位点的R2、Pigm3、Pigm1、Pigm2与Pi9、Pi2和Pizt的编码区序列差异主要集中在LRR结构域上(图27)，另外少量出现在CC功能域，很少发现在NBS区域。表明R基因在受到病原菌多样性的选择压力，促使其基因的序列发生多样的变化，产生新的抗性基因以适应病原菌的突变。
实施例16、Pigm的分子标记辅助育种
根据BAC30的序列进行BLASTN，搜索已有的信息资源，设计Pigm特异的引物进行抗病辅助育种，根据基因簇中的序列设计可以特异鉴定Pigm的分子标记M26205，引物序列：M26205-f：GTTCTCCACTTCACCTCCAT(SEQ ID NO：6)；M26205-R：TTGCTCTACCCAAACCTTTA(SEQ ID NO：7)。其中在基因Pigm1中PCR产物是856bp，在Pigm3处PCR产物是1019bp，其中这两段PCR产物的序列差异为163bp(accgtagaattgctcttaatttaagagcaattctacagtccttg aggaggtaccattttttctattgtaaatttagtacctcgtggtacctaggtacaatgaggtaccatgaggtaccaaattttacactaaaattttggtaccttatgatacctcctcaaga；SEQ ID NO：4)，这个差异的163bp中101到163bp处为重复序列，为Pigm位点特有的重复，所以只有包含这163bp差异的标记才可以正确检测Pigm1基因。
另外，引物序列M26556-F：AAACTTTTGATGCTCCTTGG(SEQ ID NO：8)，M26556-R：CTTTCTTTTTCATAACTTCTGC(SEQ ID NO：9)。在Pigm1中PCR产物为472bp，在Pigm3中PCR产物为636bp。
另外，引物序列M26254-F：AATGAGTTTGTTTGTTCTATCCTC(SEQ IDNO：10)，M26254-R：CTTTCTTTTTCATAACTTCTGC(SEQ ID NO：11)。在Pigm1处PCR产物是777bp，在Pigm3处PCR产物是940bp。
这3对引物序列均来自Pigm1和Pigm3的内含子1的序列，它们的PCR产物均包含差异的163bp，这163bp为Pigm3基因内含子1中包含的序列。只要能够扩增出这163bp差异的引物都可以作为鉴定Pigm1的分子标记。优选的，扩增出的片段在容易检测的范围，如3kb，200bp等。
Pigm1的内含子1的序列(见SEQ ID NO：2中内含子1部分)
gtacgtactgcgtgactctcgttaatttattctgtagatgctcaggaatcagcaactattgtgttgatttccatcgtagc
atatcgattttgttggccaccaattctaatcggccggaacaagctagtcactaaatctggcaaatcgatcagctgctgagtgcacaaacatgcatgttattcttttttttttgggttatatgttaagcaacaaagccccttggtaagatatgcatggcaaatgaactaatatcgacatacgtaaagcggaggacccctcgttccatgcgtgggtgactcgagcggtgacaaatcctagcacctccacctccttggatggcctgtggtgacgctttcggccccgagtttcccttgaatacatcatctacaaggtgctattaatgtctagtcacatcatttacgaggcgctattattgcctagtctgcccgaagatagtttagacaacactcttggatggcggtgtccttcgcccagtgatgtccaagagcccgtggatgtttaattgtttagacatggtgttgggtggtgcactagtgggcctgatgggccagttgtaggtccagtggtaaccaatcatgcttagcaatagccggatgcccggattggtgcttgttcttttttcggtgtcgacgcatggtagtatttacttttcctgtttttcctgattatagcatcctaggctatactcttctaatttattcatgctatattaatattaaaacttggtatggtttgtttcattcaagacccttggtggtcaaaggcttgtttggttcaagttcattcctagccttaccaactttttggcaatagcaagaaatggtcattgaaaaaaaaaggcaaaaattggctaggcctacagtttatttcctagcaaagttatactttagcattccactaagccaaataattcggcaatgccattttcttatctacatgccaaatatatggctaatattttggcattaattactcttattttttttggcaaaattgatcaaaagttcacatttttagctctatagtatcaaaagttatctattcactttaatagaacgaaagtttactcggttccgtttttagcactaccgtctcttttctcttgatttgccgtcaattttgaccggcagtcctacccccaggagacattgagcagcagcccgtgatccccctctctcgccgccggtgacgctgtggtggcatcgttcctgctgcgggcagaataagtctggcgtcatcgccctatcgcctggagctgcaaccaccactaccgggcccatcgatcgtctagagcgttatccaccctgcctgccccattacttgcagctccggctgggtcagaacctctccatgcctgacaaattggttcaagattgtcgctgtccggccagcgcttgaattttcagaatatgccatcgaatacgcgctgcttttaagatatgctacccgattcgtgctaattttagaatacgccatcggaacacgaattttcttcgttccgtgccactccgtctctcggagtcagtcgtgccgtcgtcatccgtccgcccagcactgtcgtcgtcagtccgccacccgtgcctgactgcccgttcagctgcgccgtcgtccgtccgtcgccgccatcgccgtcgtccactgtcgcgcccgcacctgcacccgtgtcaggcgcgccgtcgtccgtccgctgtcaccatcatcgtcgtccactgcggcgagcgcagacggctgtggacggatgattgcgcggcaagcgcaagcggcggtggacggacgacggggcagtgcacgcgagcacggtagccgatggactgacgttggcggcattgggagatggacgacgacggcatgattgacgtggggaacggaatgtcacggaacggagaaaattcgcactccggtggcgtatattccgaaaatagcacgaattgggtggcatatcctaaaaacagtgcctattcggtggcatattctaaaaattctcggtcagcataatccccatcaatccccaatccctcaacagttgggttaatattcctggagatgtgttcggttgtttaggttgaagttctccacttca cctccat(标记M26205正向引物)gagtacatgcacctctacacgtacgttcttaatgagtttgtttgttctatcctc(标记M26254 正向引物)cgcttgggttctattttgttggttccgatctgatttgatctggagcggggtcgatcttccacgacggcgagagagacgttgttcgggctgctcgatttggttcaactgtttaggtcgaagggaggggtagaattgcaattcaagtgcatggtcagtcaatttgggtcaaaattaacatcaaactgggataaagagacgacagtgccaaaattggtaacgggaaaactttgagttctattaaagtgaaccagtaactttcgttgctatagaataaaaacgtaaacttttgatgctccttgg(标记M26556正向引物)ttgagcttggtacaaaccaaacagacgtaaaataaacactatcctgaatcaagtctactaagttccattgaactcaaccaggatacgtacacttcctcttagaagatgtcttgttttcactttgtacaattttttctattgtaaatttggtacctcgttgtacctaggtacaagaggtaccatgagataccaaattttacactaaaattttggtacctcatggtacctcctcaacgaccgtagaattgctcttaatttaatttaaaaaaaaacataatatttttaaagcatattatggaaattttagtaattattacttttgtaatatatgagttacggttatactcgagatatcctaaattgcttggagatgaataattacaaggtatatcaaagatgagttgaaaataatgcaggcattccttagagctgcagaagttatgaaaaagaaag(标记M26556反向引物，标记M26254反 向引物)acgaactattaaaggtttgggtagagcaa(标记M26205反向引物)atacgtgacctgtcatatgacattgaagattcccttgatgaatttaaggtccatgttgaaagtcaaaccctatttcgtcagttggtgaaacttagatagcgtcaccggatcgctagcccgtggatgtttagttgtttgcacatggtgctggatggtgcgctcatggtcttgttgtaggtctggtaccaaccagtcatgcttagaaatagccggatcagtgcacggtgctaggactttacttggtggtctgtgcagcgctatcgacatgtggtggtgtgcttttttttttttccggattacaatctcatagggctacactctagttattttgctgctatattaatatgaaaacttggtatggttcgtttcttatagaaaaaaacctagttgatcaagggctagttttcttcaagtgcattcctaatcttagcttcttttttttttgcaatggcaagaattgttcattaaaaaaattgataaaaattggctaggcctacgttttgtttcttaccaaagttgtactttaacaataaactaaggcaaatatttcggcaatgccattttcttgtctacagaccaaatatatggctaaattttggcataaccatttttttgtttgcttggttgagcttggtacaaaccaaacagacccaaaataaacagtgtcatgaatcacgtctactaaattcctttgaactgaactagaatatagttgctcttaaaagatttcttgatttcactcggtaccatttactagtacaaacttagatttaatttttaaaaataaaatcataatattgttattatggaaaatttagtcatagtacttttgtaatatatgagatgggttatacttgagatatcctaaattgctttaagatgaataattgctag
Pigm3的内含子1的序列(SEQ ID NO：5)
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同时利用标记M26205，也可以鉴定Pi9，Pi2，Piz，Pizt基因。见图26。
利用引物M26205鉴定2007年所有参加国家南方区试的品种，仅有4个品系可以检测到与GM4一致的带型。表明目前Pigm这个抗病基因具有尚未在目前的育种中大规模利用，其广谱抗性还具有非常广阔的育种价值，验证这对引物可以鉴定Pigm抗病基因。同时利用这两对引物检测部分抗病品种，只有在与Pigm等位的Pi9、Piz、Pizt可以扩增出目的带型，但与Pigm存在大小差异。表明利用这对引物可以进行分子标记辅助选择抗病育种。
利用这个标记选择了6个育种组合，把含有Pigm的后代在3-4叶幼苗期进行喷雾接种验证，经浙江农科院植保所鉴定了25个菌株(均来自浙江农科院植保所)的抗性，这些稳定的株系的抗谱与谷梅4表现一致。见表8，表明利用标记选择的品系与表型鉴定选择的结果是一致，利用两个标记进行抗病基因的分子标记辅助选择育种是可靠的。
表8.接种不同含有Pigm的育种株系
GM4：谷梅4；Z1-Z6：不同的株系；YFZ：感病对照；0-2：抗病；3-5：感病。
讨论
1、定位群体的构建
利用图位克隆技术进行基因定位和克隆首先要建立一个好的作图群体。在构建作图群体时要确定亲本材料在待测性状上的表现是否有很明显的差异(比如抗病或感病)，以保证在后代性状分离群体中表型鉴定的准确性。其次，选择的亲本在遗传背景上差异大，这样比较容易找到有多态的分子标记。在抗病基因Pigm的遗传分析与图位克隆研究中，在构建作图群体之前，利用大量的菌株对抗病亲本和感病亲本进行了接种鉴定，同时进行遗传分析，利用致病性稳定，产孢子量大，抗、感反应分明的菌株进行抗病性分离分析和差异性测定。并且利用感病的粳稻和籼稻谷梅4杂交来构建作图群体。
2、以PCR技术为基础的分子标记加快了Pigm的精细定位
用于基因定位和克隆的分子标记多达20种以上，其中RFLP标记是最早应用于遗传作图的标记，McCouch应用RFLP标记构建了水稻的第一张分子标记连锁图。早期的基因定位大部分都用RFLP标记。但由于RFLP标记以Southern杂交技术为基础，操作复杂、检测时间长，需要的DNA量又大，因此大规模应用时受到限制，在实际育种过程中很难广泛使用。而且RFLP标记在基因组中分布不均匀，数量有限，多态性相对较低，通常在亚种内很难找到多态性的标记。RAPD，SSR，STS，CAPS等以PCR技术为基础的分子标记，具有操作简单、花费少、稳定性高，需要的DNA量较少等优点，符合育种过程中大规模检测的要求。
RAPD是利用随机引物对基因组进行扩增，若基因组在扩增区域发生DNA片段的插入、缺失或替换，就可导致扩增片段呈多态性，扩增产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来检测。但是由于RAPD的稳定性较差，并且也不能确定其在染色体上的位置，应用受到了限制。
微卫星序列由串联的2个、3个或4个核苷酸重复排列组成，它们以多拷贝方式均匀分布于真核生物的基因组中，由于基本重复单位在个体间具有高度的变异，因而呈现出高度多态性。SSR标记是一种极为有用的分子标记技术，由于它广泛地分布于水稻基因组中，而且具有快速简便、可靠性强、重复性高、品种间多态性丰富等特性，现已广泛地应用于分子标记连锁图的构建、基因定位、遗传关系分析、品种鉴定等领域。本发明中，从已经公布的水稻微卫星标记遗传图中筛选到连锁的SSR标记，快速地实现了Pigm基因的初步定位。
然而，对于图位克隆来说，需要在较小的特定范围内做到尽量精细的定位，这就需要尽量多的多态性分子标记。虽然微卫星标记在基因组水平上数量丰富，但在特定的小范围内其数量可能并不能满足要求，需要开发其它类型的标记来实现精细定位。因此，在对Pigm基因进行初步定位以后，利用RGP公布的Nipponbare基因组序列和北京基因组研究所shot-gun测序的籼稻9311的序列中存在片段的插入和缺失以及单核苷酸差异(SNP)进行设计InDel和CAPS标记，并且扩大作图群体，进一步精细定位Pigm在更小的范围，根据日本晴的BAC/PAC克隆构建了覆盖Pigm目的基因区域的电子物理重叠群。根据日本晴的序列信息把Pigm定位在70kb的范围，发现在此区域感病的日本晴基因组中含有6个NBS-LRR类抗病基因。所以，国际水稻基因组计划测序的水稻品种日本晴序列和9311序列的公布加快了Pigm基因的精细定位，并为克隆Pigm基因奠定了重要基础。
3、谷梅4基因组文库与候选基因亚克隆的构建
随着分子生物学技术的不断发展，构建真核生物基因组文库变得越来越容易。最早用来构建基因组文库的载体是柯斯质粒(cosmid)，其最大的插入能力为50kb，克隆的片段容易纯化，但其装载能力小限制了它的应用。而后又发展了酵母人工染色体YAC(yeast artificial chromosome)克隆载体，其可以插入上千Kb左右的外源DNA，能够获得大而复杂的基因组片段，只需要很少的克隆就可以覆盖整个基因组，但利用YAC有嵌合、重排和缺失现象，其插入片段的分离较难，克隆转化效率低等缺陷。随后又发展了基于小F因子的细菌人工染色体BAC(bacterial artificial chromosome)。相比而言，尽管BAC克隆的最大容量(500Kb)较YAC小，但具有遗传稳定性好、嵌合现象出现少、容易操作、转化效率高、筛选基因方便等优点，弥补了YAC的不足，已成为目前构建大插入片段基因组文库应用最广泛的载体系统。
构建高覆盖率的基因组文库是步移克隆和获得候选基因的关键。而高分子量基因组DNA的制备是文库构建中重要的一步，采用暗室培养以获取黄化苗进行细胞核DNA的提取，这样可以减少叶绿体DNA的污染同时可以高效地获得细胞核DNA。在液氮中进行研磨时，不能研磨过细，以防细胞核的破裂，加入抽提缓冲液进行搅拌、过筛时动作要轻柔。包埋的低熔点琼脂糖凝胶浓度要低(一般为0.6％)，否则会影响部分酶切的效果。由于载体具有优先连接小片段的趋势，尽量在连接反应时使用的DNA片段长度一致，为了获得大小集中的酶切片段，一般进行两次脉冲凝胶电泳进行分离(并对脉冲时间进行调整)，如有必要可以在第一次脉冲凝胶电泳进行4h后暂停，切去150kb以上(甚至100kb)的凝胶，再进行电泳，这样可以减少在较大片段中出现一些小片段。
在进行连接反应时要对DNA溶液进行定量，由于外源DNA量很少，不可能使用分光光度计进行定量，可以使用已知量的λDNA标准通过琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察DNA条带的亮度进行其浓度估测。进行连接反应温度一般为4℃条件下连接14-16小时。在4℃条件下，反应体系中DNA分子末端之间易形成可供连接酶作用的底物。
文库构建完成后，阳性BAC克隆的筛选与鉴定是构建跨叠克隆群的关键。依据分子标记的性质筛选文库可用PCR法和菌落杂交法。菌落杂交法筛选文库首先要将文库的所有克隆点到尼龙膜上，而点膜是一项复杂而繁重的工作。用连锁标记作探针筛选文库采用Southern杂交，标记探针要使用同位素，放射性元素对人和环境都会产生影响，成本也高。所以使用PCR法筛选文库越来越受到欢迎。本发明筛选到与目的基因共分离标记和两侧紧密连锁标记都是PCR标记，因此筛选文库采用PCR法。本文库采用克隆池保存的方法，利用连锁标记通过PCR筛选获得阳性池后再进行单菌落筛选，直接用菌液进行PCR。这样即省时、省力又省成本，筛选BAC克隆池加快了文库筛选。
对于转基因的亚克隆的构建采用表达载体pCAMBIA1301，可以通过GUS染色的方法非常方便地鉴定转基因阳性植株。构建插入片段为15-30kb的亚克隆首先要获得高质量的经BamHI酶切脱磷处理的pCAMBIA1301载体，其次保证最佳的连接反应条件，20μl的反应体系中pCAMBIA1301载体量为40ng，载体与插入片段的分子数比例为5∶1最佳，电击转化一定选用高效率的感受态。通过PCR方法筛选候选基因克隆，酶切和末端测序鉴定阳性克隆的大小，在亚克隆文库中鉴定的克隆插入片段大小一般为16-20kb，最大的插入片段有24kb的克隆，表明pCAMBIA1301载体的容纳能力可达到24kb，为下一步的转基因鉴定候选克隆奠定了基础。同时根据这些克隆的末端序列可以鉴定BAC序列拼装是否正确。
4、阳性BAC克隆的测序及序列分析
序列拼接过程中常常出现Gap，使序列不能全部拼接完成。主要原因可能为GC富含区、重复序列区或测序克隆数量不够，对于克隆数量不够的可以通过增加克隆数来弥补，GC富含区和重复序列区则很难，所以填补序列间隙是首要难题。本发明中对BAC30的测序过程中出现的Gap，主要通过采用LA Taq酶、GC缓冲液进行长链PCR扩增等获得片段，通过walking法进一步测序补平Gaps。由于在BAC30的序列拼装过程中分析其序列存在多个大片段的重复，所以通过插入大片段的亚克隆的末端序列可以验证拼装的可靠性。同时也可以利用插入大片段的亚克隆的序列来填补Gaps。在序列分析时主要采用各种生物信息学的软件，同时采用分子生物学的实验手段验证分析结果的正确性和可靠性。这样既提高实验效率也保证实验结果的可靠性。
5、抗病位点的基因分析
大多数抗病基因是以基因簇的方式在染色体上排列分布的，决定对病原菌不同小种、变种，甚至专化性的抗病基因，通常以串联方式组成一个复合抗病基因座，构成基因家族成簇存在，控制广谱抗病性。在水稻第6染色体上的Pi9位点还定位Pi2、Pigm、Pi26、Piz、Pizt、Pi40、Pi42。除Pi9来自BBCC组的小粒野生稻，Pi40来自EE组的野生稻外，其余的Pi2、Pigm、Pi26、Piz、Pizt、Pi42均来自栽培稻，它们均表现广谱的抗瘟性，所以首先要比较鉴定它们抗谱的差异，确定它们之间的关系，为认识广谱抗病机制和抗病基因的进化与演变奠定基础。已经克隆了3个广谱抗稻瘟病基因Pi9，Pi2和Pizt。Pi9和Pi2位点包含有9个NBS-LRR类抗病基因。Pizt基因是通过同源克隆获得的Pi2的等位基因，其位点包含的抗病基因数目仍不清楚，在Piz位点仍然还不清楚是哪个基因有功能。所以对于Piz，Pizt位点的抗病基因组成还不能确定是否同Pi9、Pi2的一致。非常惊奇的是Pi9的功能基因在多数的栽培稻中均存在其等位基因，只不过在序列上存在小的差异，说明该基因的功能是非常保守的，在水稻的驯化过程中被保留下来，其中在检测的栽培稻中未发现来自Pi9位点R3的等位基因存在，可能在驯化过程中丢失。目前克隆的Pigm位点是由13个NBS-LRR类抗病基因组成，在数目上比Pi9，Pi2位点多4个，其排列方式与Pi9、Pi2也存在差异，而且这4个基因全部为原有抗病基因复制产生的，Pigm位点控制更广谱的抗性可能与这4个复制的抗病基因有关。而感病的日本晴基因组中也包含7个抗病基因。表明在此区域在进化上是非常活跃的，在此处形成了很大的包含不同数目抗病基因的复合基因座。而这个复合基因座在进化上可能来自于一次偶然的减数分裂时的不等交换和转座子的插入导致的基因复制，形成串联重复后，植物就有可能采用不等交换和基因转换的机制将抗病基因座的原有序列加以重组，产生新的抗病专化性基因，以适应病原菌无毒基因的突变。所以在水稻的栽培驯化和人工选择过程中导致抗病基因不断的被积累，产生广谱持久的抗性。
转座元件包括转座子、反转录转座子、长末端重复(LTR)等是抗病基因簇中的重要组成部分。在Pigm位点包括一个非常典型的Ty3/gypsy类反转录转座子，13个LTR，33个DNA转座子。但在Pi9、Pi2位点以及在日本晴基因组的位点中仅发现了11个solo-LTR，没有反转录转座子和DNA转座子。说明在Pigm位点的抗病基因进化机制可能与Pi9、Pi2位点不同。转座元件对Pigm位点抗病基因的聚积与进化起着非常重要的作用。
6、抗病基因的聚合育种
目前生产中稻瘟病仍然是杂交育种首要克服的难关，近年来在部分地区，特别是在四川、湖南、江西省稻瘟病的发生有加重的趋势。所以目前解决水稻抗稻瘟病的问题越来越重要。虽然已经鉴定了大量的抗性位点，但目前如何应用这些抗性基因来解决生产的实际问题非常迫切。首先要明确这些抗病基因之间的相互关系，明确这些抗病基因的抗谱，就可以有目的的实现这些抗病基因的有效聚合。但这些基因聚合表现的抗性如何还需要鉴定。在过去的实验室与病圃实验中Pigm表现出广谱的抗性，但是在水稻的生产中利用单一抗病基因是非常危险的，过去已经有非常多的教训提醒我们，大面积推广单一品种会促使稻瘟病菌变异的加快，最终导致该品种的抗性丧失。所以目前对付稻瘟病的方法主要有：1、聚合广谱抗病基因，把多个具有广谱抗性的基因聚合到一个品种中，这样稻瘟病菌就不容易克服多个抗病基因的抗性，可以延长抗病品种的推广栽培寿命。2、田间品种栽培多样性，目前在云南省已经证明在同一田里交叉栽培不同水稻抗感品种，明显可以减弱稻瘟病的发病率。同时验证了生物多样性在控制植物病害中的重要作用。3、多个广谱抗病基因的轮换使用和不同地区的推广使用。在不同的年份和地区推广使用不同的抗病基因，这样可以起到减缓稻瘟病菌的变异，延长抗病品种的使用寿命。总之，聚合具有广谱抗病基因是控制稻瘟病的最经济有效的方式，同时也要及时根据田间稻瘟病菌群体的发病规律制定相应的抗病育种策略。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (17)

1.一种分离的多肽，其特征在于，该多肽是氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的多肽。
2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸序列选自下组：
(a)编码如权利要求1所述多肽的多核苷酸；
(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。
3.如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，它是：
SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的多核苷酸；
SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的多核苷酸；或
SEQ ID NO:2中第2001-9065位所示核苷酸序列的多核苷酸。
4.一种载体，其特征在于，它含有权利要求2或3所述的多核苷酸。
5.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求4所述的载体；或其基因组中整合有权利要求2或3所述的多核苷酸；所述的宿主是原核宿主。
6.权利要求1所述的多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含：
(a)在适合表达的条件下，培养权利要求5所述的宿主细胞；
(b)从培养物中分离出权利要求1所述的多肽。
7.权利要求1所述的多肽或其编码基因的用途，其特征在于，用于提高植物的抗微生物侵染能力；或用于鉴定植物的抗微生物感染能力；或用于制备鉴定植物的抗微生物感染能力的分子标记物；
其中，所述的植物是水稻；所述的微生物是稻梨孢属的真菌。
8.一种提高植物的抗微生物侵染能力的方法，其特征在于，该方法包括：使植物表达权利要求1所述的多肽；其中，所述的植物是水稻；所述的微生物是稻梨孢属的真菌。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法包括：将编码权利要求1所述的多肽的多核苷酸转入到植物中。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，包括：
(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有权利要求1所述的多肽的编码序列；
(2)将植物细胞、组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使所述多肽的编码序列转入植物；
(3)选择出转入所述多肽的编码序列的植物细胞、组织或器官；和
(4)将步骤(3)中的植物细胞、组织或器官再生成植株。
11.一种鉴定植物的抗微生物感染能力的分子标记物，其特征在于，所述的分子标记物是特异性识别权利要求1所述的多肽的编码基因的引物对；其中，所述的植物是水稻；所述的微生物是稻梨孢属的真菌；
其中，所述的引物对选自：
SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的引物对；
SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的引物对；或
SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示核苷酸序列的引物对。
12.权利要求11所述的分子标记物的用途，用于鉴定植物的抗微生物感染能力；其中，所述的植物是水稻；所述的微生物是稻梨孢属的真菌。
13.一种鉴定植物的抗微生物感染能力的试剂盒，其特征在于，包含权利要求11所述的分子标记物；其中，所述的植物是水稻；所述的微生物是稻梨孢属的真菌。
14.一种分离的多核苷酸，其特征在于，其是核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的多核苷酸。
15.权利要求14所述的多核苷酸的用途，用于鉴定植物的抗微生物感染能力；其中，所述的植物是水稻；所述的微生物是稻梨孢属的真菌。
16.一种鉴定植物的抗微生物感染能力的方法，其特征在于，所述方法包括：
检测植物中权利要求1所述的多肽或其编码基因的存在与否；若存在，则表明植物具有抗微生物感染能力；其中，所述的植物是水稻；所述的微生物是稻梨孢属的真菌。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，检测植物中权利要求1所述的多肽的编码基因的存在与否的方法是：
(1)以该植物的基因组为模板，以引物对进行PCR扩增；其中，所述的引物对选自：
SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的引物对；
SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的引物对；或
SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示核苷酸序列的引物对；
(2)分析(1)的扩增产物，若其中包括SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，则表明植物不具有抗微生物感染能力。
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