CN109652426A - 一种水稻稻瘟病抗性基因对tp22及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种水稻稻瘟病抗性基因对TP22及其应用。本发明公开了水稻稻瘟病新抗性基因对TP22中两个基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸多肽序列。该基因对中两个基因均属于NBS‑LRR类型抗病基因家族的成员。本发明中的抗稻瘟病的两个基因克隆自对稻瘟病菌表现出高抗的水稻品系，并将其同时转化至对稻瘟病菌感病的品种中，利用稻瘟病菌侵染的方法对其抗病能力进行评估，从而最终确定该基因对对于水稻稻瘟病具有抗性。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其是涉及一种水稻稻瘟病抗性基因对 TP22及其应用。
背景技术
水稻是全球重要的粮食作物，养活了全世界超30亿的人口，也是我国最主 要的粮食栽培作物之一。然而每年有10-30％的水稻产量会由于稻瘟病而损失 (Skamnioti andGurr 2009；Miah et al.2012；Imam et al.2013)。作为水稻最致命性 的病害，它的病原物，稻瘟病菌可以感染几乎所有生长发育阶段的水稻，且有 侵害时间长、病症情况多于感染部位广等特点。稻瘟病可以根据其感染水稻的 时期与侵染部位进行分类。如苗瘟、叶瘟、叶枕瘟、节瘟、穗颈瘟和谷粒瘟等。
自然界中的植物，包括水稻都在长期与病原菌的互作中进化出了数量庞大 的抗病基因，基于这一理论基础，植物抗病及抗病相关分子水平的研究取得了 突破性进展，人们对抗病基因的结构功能与遗传变异有了全新的认识，辅以日 渐成熟的分子生物学和农业栽培技术，抗病基因的分离和利用使水稻抗病基因 库和抗性品种得以丰富，其中主要类型的抗病基因为NBS-LRR结构类型 (Nucleotide-binding site and leucine-rich-repeat，即核苷酸结合位点和富亮氨酸重 复蛋白)的抗病基因，它们在结构与功能上具高度的相似性和独特的遗传特性， 为快速克隆和鉴定这些基因提供了理论基础和机遇。
实践证明，目前最有效的防治稻瘟病菌的策略是利用水稻自身的稻瘟病抗 性基因进行抗性育种(Skamnioti et al.2009)，这种方法可以既可以避免传统的 农药防治的低效和环境污染，也解决了杂交培育耗时耗力的问题。然而由于稻 瘟病致病生理小种极快的变异速度(Xue at al.2012；Kiyosawa.1982)，我们仍然 面对着已有抗病基因的抗性迅速丧失且寻找新的抗病资源越来越难的局面。
人们普遍认为，对应易变的病原菌，水稻必须拥有很多抗病基因，我们发 现，利用水稻抗病品种Tetep为抗性来源的现代栽培稻中，其抗性表现也与其继 承的NBS-LRR基因数量有关。但我们也发现Tetep基因组中的NBS-LRR基因 数量并没有明显多于其他水稻栽培种如日本晴、明恢63和R498。另一方面，在 物理距离上，NBS-LRR基因多在基因组中成簇存在；功能上，已有若干报道证 实在拟南芥及水稻中，两个NBS-LRR基因可以构成抗病功能单元，在这样的基 因对中，其中一个基因(即“感应基因”)编码可以识别病原菌效应分子的蛋白， 另一个基因(即“辅助基因”)则激活防御反应的信号转导，二者共同发挥功能， 可以对病原物表现出强抗性。，而在Tetep基因组中我们发现20％以上的 NBS-LRR基因成对存在，这就提示我们传统的针对单个抗病基因的利用思路忽 略了抗病基因通过组合、协作发挥更强抗性表现的机制，这可能也是目前通过 克隆技术得到改良的品系少有能够表现出对稻瘟病菌广谱而持久的抗性的原 因。由于现阶段克隆并直接转化抗病基因可能仍是最直接有效的培育抗病品种 的途径，因此我们需要从NBS-LRR基因对的抗病机制出发，对抗病基因资源进 行挖掘和转化，以期显著改善水稻抗病育种效率。
本发明利用生物信息学手段，结合NBS-LRR类抗病基因对的结构特征和进 化模式，在Tetep基因组中鉴定可能的抗病基因对并将其两两快速克隆转化，经 过筛选，能够高效地从Tetep中分离出具有广谱稻瘟病抗性的基因对。
发明内容
本发明的目的是针对上述问题，提供一种对水稻稻瘟病具有抗性的水稻稻 瘟病抗性基因对TP22及其应用。
本发明的目的是，分离克隆水稻抗病品种Tetep中携带的稻瘟病抗性基因对 TP22及包含调控这两个基因(chr11.fgenesh2445/chr11.fgenesh2446)的启动子的 DNA片段。
本发明的另一个目的是提供上述稻瘟病抗性基因对TP22中两个基因(chr11.fgenesh2445/chr11.fgenesh2446)所编码的蛋白质序列。
本发明的另一个目的是提供含有上述抗性基因的载体。
本发明的另一个目的是提供上述载体转化的转基因植株。
本发明的另一个目的是提供上述蛋白质在制备抗稻瘟病药物中的应用。
为达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：本发明的一种水稻抗稻瘟 病基因对TP22，为如下(1)至(3)所述的基因对：
(1)核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
(2)核苷酸序列与序列表中的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸 序列在相似度上≥95％相似的核苷酸序列，或其核苷酸序列的功能相当于SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2所示核苷酸序列的亚片段；
(3)将序列表中的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列经过替 换、缺失或增加一个或多个核苷酸且编码相同氨基酸序列的核苷酸序列。本发 明涉及克隆和鉴定一种抗性基因对TP22中两个基因 (chr11.fgenesh2445/chr11.fgenesh2446)的DNA片段，此基因对中的两个基因编码 的蛋白共同作用能使水稻对稻瘟病菌所引起的病害产生广谱性的抗病反应。
本发明所述的水稻抗稻瘟病基因对TP22的编码蛋白对。
进一步地，所述的编码蛋白对的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，或SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的序列经过替换、缺失、或添 加部分氨基酸而形成的具有相同功能的氨基酸序列。这两段DNA序列均编码 NBS-LRR类蛋白，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。所 分离、克隆的TP22抗性基因对编码的NBS-LRR蛋白包含两个主要的结构域： NBS和LRR区域，其中chr11.fgenesh2445编码的蛋白的C-末端有11个LRR 重复，chr11.fgenesh2446编码的蛋白的C-末端有3个LRR重复。
本发明的一种调控所述水稻抗稻瘟病基因对TP22中两个基因的启动子，其 启动子的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。
本发明的含有所述的基因对的转化载体。
本发明的含有所述的转化载体的宿主细胞为根癌农杆菌EHA105。
本发明的含有所述的转化载体的转基因植物。
本发明所述的水稻抗稻瘟病基因对TP22在抗稻瘟病水稻育种中的应用。
本发明所述的编码蛋白对在制备抗稻瘟病药物中的应用。
有益效果：本发明将克隆的抗稻瘟病基因对转入感病的植物中，有助于获 得新的抗病植物。克隆的抗病基因对能在不同的物种间转移并利用，从而能够 克服传统抗病育种中远缘杂交的困难。此外，鉴于基因对在水稻的抗病过程中 以功能单元的形式共同发挥作用，能够有效提高转基因植株的抗性，扩大其对 稻瘟病菌的抗谱。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)本发明提供的稻瘟病抗性基因对TP22具有重要的应用价值。将所述 的TP22基因对中的两个序列用任何一种转化方法同时导入水稻或其他植物细 胞，可获得表达所述基因对的转基因抗病品种，从而应用于生产。本发明所述 的基因对构建到植物转化载体中，可以对所述基因或其调控序列适当修饰，也 可以用其它启动子取代所述基因原有的启动子，从而拓宽抗谱或增强抗性。
(2)本发明还能够进一步提供或应用上述DNA片段获得的抗病转基因植 株和相应的种子，以及用本发明的基因或基于该基因的重组体转化的植株或由 这类植株获得的种子。可以用有性杂交的方式将本发明的基因转入其他植株。
附图说明
图1为本发明流程示意图。图1A：抗稻瘟病候选位点的确定；图1B，C： 抗稻瘟病基因对的分离克隆与遗传转化；图1D：转化体的侵染鉴定。
图2为稻瘟病抗性基因对TP22的转化体的潮霉素抗性基因和启动子的PCR检测 电泳图；图2A为启动子的PCR扩增产物，泳道1为载体pCAMBIA1300-AscI 质粒的PCR扩增产物，泳道2为受体TP309的非转化体的PCR扩增产物，泳道 3-8为转化体的PCR扩增产物；图2B为潮霉素抗性基因的PCR产物，泳道1 为载体pCAMBIA1300-AscI质粒的PCR扩增产物，泳道2为受体TP309的非转 化体的PCR扩增产物，泳道3-8为转化体的PCR扩增产物。
图3为转化有基因对TP22的植株抗性鉴定图。图3A：对照植株TP309的 抗性鉴定图；图3B：稻瘟病抗性基因对TP22的转化植株的抗性鉴定图。
具体实施方式
以下实施例仅处于说明性目的，而不是想要限制本发明的范围。
根据本发明提供的TP22基因对序列信息(SEQ ID NO:l和SEQ ID NO:2)， 本领域技术人员可以通过以下方法获得与TP22等同的两个基因片段：(1)通过 数据库检索获得；(2)以TP22基因对中的两个基因片段为探针筛选水稻或其它 植物的基因组文库或cDNA文库获得；(3)根据TP22基因对中两个基因的序列 信息设计寡核苷酸引物，用PCR扩增的方法从水稻或其它植物的基因组、 mRNA和cDNA中获取；(4)在TP22基因对中的两个基因序列的基础上用基 因工程方法改造获得；(5)用化学合成的方法获得该基因对。
实施例1
稻瘟病抗性基因对TP22的确定
我们在Tetep基因组中搜索呈现“头对头”结构的NBS-LRR基因对，并对其 在日本晴、Tetep和短柄草基因组中的序列及其同源序列构建系统进化树进一步 确认成对关系。总共在Tetep中得到了43对抗病基因， TP22(chr11.fgenesh2445/chr11.fgenesh2446)是其中一对，该基因对具有以下的特 点：(1)chr11.fgenesh2445(感应基因)与chr11.fgenesh2446(辅助基因)在进 化树中分别属于进化速度较快和较慢的不同分支。(2)chr11.fgenesh2445(感应 基因)相比chr11.fgenesh2446(辅助基因)有更高的核苷酸多态性(π)和核苷 酸差异度(Dxy)。
实施例2
稻瘟病抗性基因TP22(chr11.fgenesh2445/chr11.fgenesh2446)的分离与克隆
利用Tetep基因组和公共数据库测序品种日本晴(Nipponbare)为参考序列， 设计克隆引物(引物两端皆带有酶切位点AscI)及融合引物。引物序列参见序 列表，chr11.fgenesh2445的正向克隆引物序列如SEQ ID NO:7所示；反向克隆 引物序列如SEQID NO:8所示；chr11.fgenesh2446的正向克隆引物序列如SEQ ID NO:9所示；反向克隆引物序列如SEQ ID NO:10所示。chr11.fgenesh2445的 正向融合引物序列如SEQ ID NO:11所示；反向融合引物序列如SEQ ID NO:12 所示；chr11.fgenesh2446的正向融合引物序列如SEQ ID NO:13所示；反向融合 引物序列如SEQ ID NO:14所示。以抗病水稻品种Tetep为模板，利用长片段PCR 技术(Long-PCR)先使用克隆引物分别扩增两段候选基因片段，PCR程序如下： 95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，60℃复性45秒，68℃延伸7分钟，共35 个循环，随后72℃保温10分钟，最后10℃恒温。随后对PCR产物进行割胶回 收；再使用融合引物，利用融合PCR技术连接两段基因片段构成基因对，PCR 程序如下：95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，60℃复性45秒，68℃延伸7 分钟，共33个循环，随后72℃保温10分钟，最后10℃恒温。随后对PCR产物 进行割胶回收。
实施例3
双功能基础载体的准备
将稀有酶切位点AscI导入双功能载体pCAMBIA1300的多克隆位点BamHI 和SalI之间，取代酶切位点XbaI，构成带有稀有酶切位点AscI的基础载体 pCAMBIA1300-AscI。
实施例4
候选抗性基因对与基础载体的连接
用限制性内切酶AscI，在37摄氏度条件下同时酶切PCR产物与基础载体 质粒3h，之后进行纯化回收。在T4连接酶的作用下，将回收过的酶切好的候选 基因对片段和切开的基础载体pCAMBIA1300-AscI片段在15摄氏度条件下连接 过夜。
实施例5
候选抗性基因的遗传转化
将携有候选基因对的双功能载体导入根瘤农杆菌EHA105，采用农杆菌介导 法，即可将候选基因对同时转化到同一株普感品种TP309水稻中，获得若干独 立的转化体。
实施例6
PCR分子检测
以转化体植株提取出的DNA为模板，用潮霉素抗性基因及其上游启动子的 特异性引物进行PCR反应。潮霉素抗性基因的引物序列参见序列表，正向引物 序列如SEQ ID NO:9；反向引物序列如SEQ ID NO:10。CaMV35S启动子的引 物序列参见序列表，正向引物序列如SEQ ID NO:17；反向引物序列如SEQ ID NO:18。
实施例7
转化体的抗性鉴定
选择9-11个来源地不同，区别力好的独立稻瘟病菌生理小种作为检测的病 原菌种，将其孢子悬浮液通过注射器注射到半抽穗时期的水稻穗苞中。利用此 接种方法感染T2代转基因植株和对照品种，筛选抗病性改变的转化体。抗性鉴 定结果显示候选基因对TP22在普感品种TP309的遗传背景下，对11个病原菌 株都显示不同程度的抗性，而只转入TP22中辅助基因chr.11fgenesh2446时转化 体只能对9个病原菌株中的1个表现抗性。以上结果表明候选基因对TP22具有 较为广谱的抗性且被成功克隆(图2和图3)。
实施例8
稻瘟病抗性基因对TP22中两个基因的结构和蛋白结构分析
采用步移法对TP22中的两个基因(chr11.fgenesh2445和chr11.fgenesh2446) 的DNA序列进行了测序。chr11.fgenesh2445基因DNA长度为9951bp，含有2 个内含子和3个外显子。感应基因chr11.fgenesh2445编码的蛋白序列如SEQ ID NO:2所示。chr11.fgenesh2445基因编码1个由979个氨基酸残基组成的蛋白多 肽。chr11.fgenesh2445蛋白属于NBS-LRR蛋白，其蛋白的C-末端为11个LRR 重复；辅助基因chr11.fgenesh2446基因DNA长度为11095bp，2个内含子和3 个外显子。Chr11.fgenesh2446编码的蛋白序列如SEQ ID NO:2所示。 Chr11.fgenesh2446基因编码1个由920个氨基酸残基组成的蛋白多肽， chr11.fgenesh2446蛋白属于NBS-LRR蛋白，其蛋白的C-末端为3个LRR重复。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业 的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中 描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明 还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及 其等效物界定。
Claims (9)
1.一种水稻抗稻瘟病基因对TP22，为如下(1)至(3)所述的基因对：
(1)核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
(2)核苷酸序列与序列表中的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列在相似度上≥95％相似的核苷酸序列，或其核苷酸序列的功能相当于SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的亚片段；
(3)将序列表中的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列经过替换、缺失或增加一个或多个核苷酸且编码相同氨基酸序列的核苷酸序列。
2.权利要求1所述的水稻抗稻瘟病基因对TP22的编码蛋白对。
3.根据权利要求2所述的编码蛋白对，其特征在于：所述的编码蛋白对的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，或SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的序列经过替换、缺失、或添加部分氨基酸而形成的具有相同功能的氨基酸序列。
4.一种调控如权利要求1所述水稻抗稻瘟病基因对TP22中两个基因的启动子，所述的启动子的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。
5.含有权利要求1所述的基因对的转化载体。
6.含有权利要求5所述的转化载体的宿主细胞为根癌农杆菌EHA105。
7.含有权利要求6所述的转化载体的转基因植物。
8.权利要求1所述的水稻抗稻瘟病基因对TP22在抗稻瘟病水稻育种中的应用。
9.权利要求2所述的编码蛋白对在制备抗稻瘟病药物中的应用。
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