CN102168083B - 一种培育蜡质减少的转基因植物的方法 - Google Patents
一种培育蜡质减少的转基因植物的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102168083B CN102168083B CN 201010610602 CN201010610602A CN102168083B CN 102168083 B CN102168083 B CN 102168083B CN 201010610602 CN201010610602 CN 201010610602 CN 201010610602 A CN201010610602 A CN 201010610602A CN 102168083 B CN102168083 B CN 102168083B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- wax
- gene
- plant
- seq
- osgl1
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 title claims abstract description 12
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 title abstract 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 title abstract 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 87
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 54
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 claims abstract description 39
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 claims abstract description 39
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 22
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 18
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 8
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 claims description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 4
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 claims description 3
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 claims description 3
- 230000008676 import Effects 0.000 claims description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 claims 1
- 241000209094 Oryza Species 0.000 abstract description 38
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 13
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 9
- 238000010186 staining Methods 0.000 abstract description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 abstract description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 abstract description 2
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 abstract 3
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 abstract 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract 2
- 238000012407 engineering method Methods 0.000 abstract 1
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 67
- 101100242305 Caenorhabditis elegans osgl-1 gene Proteins 0.000 description 56
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 23
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 19
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 19
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 15
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 14
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 14
- 230000008859 change Effects 0.000 description 13
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 13
- 235000019156 vitamin B Nutrition 0.000 description 12
- 239000011720 vitamin B Substances 0.000 description 12
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 11
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 11
- 101150109036 osgl-1 gene Proteins 0.000 description 9
- 229920002148 Gellan gum Polymers 0.000 description 8
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 8
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 8
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 8
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 8
- 108010079058 casein hydrolysate Proteins 0.000 description 8
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 description 8
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 description 8
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 8
- ZUFQODAHGAHPFQ-UHFFFAOYSA-N pyridoxine hydrochloride Chemical compound Cl.CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O ZUFQODAHGAHPFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229960004172 pyridoxine hydrochloride Drugs 0.000 description 8
- 235000019171 pyridoxine hydrochloride Nutrition 0.000 description 8
- 239000011764 pyridoxine hydrochloride Substances 0.000 description 8
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 8
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 7
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 7
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 239000005631 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Substances 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N Hygromycin-B Natural products OC1C(NC)CC(N)C(O)C1OC1C2OC3(C(C(O)C(O)C(C(N)CO)O3)O)OC2C(O)C(CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 6
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 6
- 229930003270 Vitamin B Natural products 0.000 description 6
- UCKZMPLVLCKKMO-LHLIQPBNSA-N cephamycin Chemical compound S1CC(C)=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](C)[C@]21OC UCKZMPLVLCKKMO-LHLIQPBNSA-N 0.000 description 6
- GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N hygromycin B Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H]2O[C@@]3([C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C(N)CO)O3)O)O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N 0.000 description 6
- 229940097277 hygromycin b Drugs 0.000 description 6
- 229940064880 inositol 100 mg Drugs 0.000 description 6
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 5
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 4
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 4
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 230000000763 evoking effect Effects 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 4
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 4
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 4
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 4
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 4
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 3
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 229930002875 chlorophyll Natural products 0.000 description 3
- 235000019804 chlorophyll Nutrition 0.000 description 3
- ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M chlorophyll a Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 3
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 3
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150002663 GL1 gene Proteins 0.000 description 2
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000002582 Oryza sativa Indica Group Species 0.000 description 2
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 2
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000010411 cooking Methods 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 2
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N heavy water Substances [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 2
- YQYJSBFKSSDGFO-FWAVGLHBSA-N hygromycin A Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](C(=O)C)O[C@@H]1Oc1ccc(\C=C(/C)C(=O)N[C@@H]2[C@@H]([C@H]3OCO[C@H]3[C@@H](O)[C@@H]2O)O)cc1O YQYJSBFKSSDGFO-FWAVGLHBSA-N 0.000 description 2
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 2
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 2
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 2
- RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K iron trichloride Chemical compound Cl[Fe](Cl)Cl RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 2
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 2
- 238000012256 transgenic experiment Methods 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108700003861 Dominant Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 240000008467 Oryza sativa Japonica Group Species 0.000 description 1
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000723806 Sugarcane mosaic virus Species 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- 238000005267 amalgamation Methods 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000009412 basement excavation Methods 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 229940027138 cambia Drugs 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 239000012084 conversion product Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- KXZOIWWTXOCYKR-UHFFFAOYSA-M diclofenac potassium Chemical compound [K+].[O-]C(=O)CC1=CC=CC=C1NC1=C(Cl)C=CC=C1Cl KXZOIWWTXOCYKR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 230000024346 drought recovery Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 244000037666 field crops Species 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 1
- 238000003976 plant breeding Methods 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000005068 transpiration Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明公开了一种培育蜡质减少的转基因植物的方法。该培育蜡质减少的转基因植物的方法,包括如下步骤:使出发植物中的SEQ ID NO:1所示蛋白的编码基因的功能丧失,得到蜡质减少的转基因植物。本发明基因影响叶片蜡质形成,是一个控制叶片蜡质形成的基因,具体是对叶片蜡质形成起正调控作用。本发明基因对了解水稻叶片蜡质形成的机制具有重要的应用价值,可以探索将其用于水稻育种,通过基因工程手段改良水稻叶表皮性状从而提高抗旱能力。此外,本发明的基因和蛋白控制表皮蜡质的含量,表皮蜡质的含量会影响水稻叶片GUS染色的效果,降低表皮蜡质的含量可以增强水稻叶片GUS染色的效果,因此可利用该基因来培育检测外源基因在叶片表达情况的转基因实验材料。
Description
技术领域
本发明涉及一种培育蜡质减少的转基因植物的方法。
背景技术
植物表皮蜡质是覆盖在植物表面最外层,不溶解于水而溶解于有机溶剂(氯仿等)的一类混合物的总称,它们是由表皮细胞所合成和分泌,一般认为表皮蜡质具有阻止植物组织内水分的非气孔性散失、维持植物表面清洁与植物表面防水、防止植物被有害光线损伤、保护植物避免被病菌侵害和防止某些昆虫的蚕食等功能。此外,表皮蜡质的含量通常会影响表皮结构的变化,而表皮结构的变化通常会影响表皮对水分子的吸附和渗透,例如,表皮蜡质的含量会影响水稻叶片GUS染色的效果,疏水性的表皮蜡质含量越高,GUS染色液就越难被叶表皮吸附和渗透,水稻叶片GUS染色的效果就越差,导致只有叶片的切口边缘很小一部分区域能被染色,其他大部分区域很难被染色。而蜡质含量越少,就越有利于GUS染色液的吸附和渗透,GUS染色的效果就越好。
同时对一些作物的研究结果表明,作物表皮蜡质与作物水分利用效率、产量、收获指数和角质蒸腾等都有较好的相关性,有蜡质表型的材料其抗旱节水性和产量都要高于无蜡质表型的材料。水稻是世界三大粮食作物之一,但水稻生产需要大量的水,干旱已成为缺水地区水稻生产最大的限制性因子,因此耐旱相关基因的挖掘和抗旱品种培育,是目前稳定粮食生产的最有效途径。目前,利用正向遗传学和反向遗传学的方法,人们已经从许多物种中克隆出了蜡质相关基因并进行了相关的功能分析。根据这些基因的功能可将它们分为以下几类:蜡质合成基因,蜡质转运基因,蜡质调控基因等。虽然这方面的研究取得了不少进展,但目前与耐旱性状相关的水稻叶片蜡质缺失突变体却鲜有报道,因此利用水稻叶片蜡质缺失突变体克隆与叶片蜡质形成相关的基因,并分析其功能,进一步了解水稻叶表皮蜡质与耐旱性之间的相关性,具有重要的理论意义和实际意义。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种与蜡质形成相关的RNA分子。
本发明所提供的RNA分子,其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
表达上述RNA分子的重组干扰载体也属于本发明的保护范围。
上述重组干扰载体按照包括如下步骤的方法得到:将SEQ ID NO:3所示DNA片段插入出发载体的多克隆位点,得到所述重组干扰载体。
上述重组干扰载体中,所述出发载体为pCam13OX;
所述pCam13OX按照包括如下步骤的方法制备得到:将CaMV35S启动子片段插入载体pCAMBIA1300的Pst I和Hind III的识别位点间,得到的重组载体记作pCam13OXM;将Nos终止子片段插入载体pCam13OXM的EcoR I和Sac I识别位点间,得到的重组载体即为pCam13OX。
本发明的另一个目的是提供一种培育蜡质减少的转基因植物的方法。
本发明所提供的培育蜡质减少的转基因植物的方法,包括如下步骤:使出发植物中的SEQ ID NO:1所示蛋白的编码基因的功能丧失,得到蜡质减少的转基因植物。
上述方法中,所述使出发植物中的SEQ ID NO:1所示蛋白的编码基因的功能丧失的方法为抑制出发植物中的SEQ ID NO:1所示蛋白的编码基因表达。
上述方法中,所述抑制出发植物中的SEQ ID NO:1所示蛋白的编码基因表达的方法包括如下步骤:向所述出发植物中导入上述任一所述重组干扰载体。
上述方法中,所述蜡质为植物表皮蜡质;所述植物表皮蜡质可为植物叶片表面蜡质;
上述方法中,所述植物为单子叶植物。所述单子叶植物为水稻。
上述方法中,所述SEQ ID NO:1所示蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
SEQ ID NO:1所示蛋白或SEQ ID NO:1所示蛋白的编码基因在调节植物中蜡质形成中的应用也属于本发明的保护范围。
SEQ ID NO:1所示蛋白或SEQ ID NO:1所示蛋白的编码基因在培育耐旱植物中的应用也属于本发明的保护范围。
上述应用中,所述蜡质为植物表皮蜡质;所述植物表皮蜡质可为植物叶片表面蜡质;
上述应用中,所述植物为单子叶植物。所述单子叶植物为水稻。
上述应用中,所述SEQ ID NO:1所示蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明基因影响叶片蜡质形成,是一个控制叶片蜡质形成的基因,具体是对叶片蜡质形成起正调控作用。本发明基因对了解水稻叶片蜡质形成的机制具有重要的应用价值,可以探索将其用于水稻育种,通过基因工程手段改良水稻叶表皮性状从而提高抗旱能力。此外,本发明的基因和蛋白控制表皮蜡质的含量,表皮蜡质的含量会影响水稻叶片GUS染色的效果,降低表皮蜡质的含量可以增强水稻叶片GUS染色的效果,因此可利用该基因来培育检测外源基因在叶片表达情况的转基因实验材料。
附图说明
图1为野生型与突变体osgl1植株和叶片表型。
图2为野生型3037和突变体osgl1的表型。
图3为野生型3037与突变体osgl1的叶表皮属性分析。
图4为干旱对野生型3037与突变体osgl1的影响。
图5为互补表达载体的构建。
图6为野生型与pGL1RNAi转基因植株及其叶片表型。
图7为野生型日本晴(WT)和转pGL1RNAi植株OsGL1基因表达量。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1、基因的发现
1、水稻蜡质缺失突变体osgl1的表型分析
水稻蜡质缺失突变体osgl1是野生型3037的自然突变体。在正常情况下,突变体osgl1与野生型3037相比没有明显差异(图1A),但在在下雨天或者人工淋浴的情况下,突变体osgl1的叶片表现出高度亲水的表型。在野生型3037中,由于叶表皮蜡质的大量存在,水分子往往会在叶表面聚合形成球形状的水珠,只要稍微抖动一下叶片,都会导致叶片上这些水珠的滴落。而在突变体osgl1中,由于叶片高度亲水,水分子将会均匀散布在整个叶表面而不形成水珠(图1B)。图1中,左为野生型,右为突变体。
2、突变体osgl1的电镜观察分析
通过扫描电镜观察发现,与野生型3037相比(图2A,B),突变体osgl1叶表皮近轴端与远轴端的蜡质严重减少(图2D,E),而透射电镜的研究结果表明,野生型3037表皮膜可分为两层结构,最外层为透明层,最内层为非透明层(图2C),与野生型3037相比,突变体osgl1叶表皮膜变薄,最外层的透明层消失,只含有最内层的非透明层(图2F)。图2中,A为野生型3037的远轴端叶片表面;B为为野生型3037的近轴端叶片表面;C为野生型3037的表皮膜结构;D为突变体osgl1的远轴端叶片表面;E为为突变体osgl1的近轴端叶片表面;F为突变体osgl1的表皮膜结构。P:乳突细胞;CW:细胞壁;TL:透明层;OL:非透明层。
3、水稻蜡质缺失突变体osgl1叶表皮属性的分析
叶表皮属性分析的检测包括叶绿体渗透实验和叶片的水分散失实验,对于叶绿体渗透实验,主要在暗室中进行,我们以抽穗期每个水稻分蘖的倒三叶为研究对象,将叶片切割成3厘米长并侵泡在浓度为80%的30毫升乙醇中,在1-12小时内,每隔1小时测定叶绿素的含量,每个时间点的叶绿素渗透率,以该时间点渗透出来的叶绿素含量占第12个小时渗透出来的叶绿素含量的百分比表示。对于水分散失实验,也是在暗室中进行,也是以抽穗期每个水稻分蘖的倒三叶为研究对象,在0小时,0.5小时,1小时,1.5小时,2小时,3小时,4小时,5小时,6小时,7小时,8小时这11个时间点分别测定样品的重量,每个时间点的水分散失率,以该时间点损失的水分重量占最初样品重量的百分比表示。水稻蜡质缺失突变体osgl1与野生型3037的叶绿体渗透率、水分散失率的测定结果如图3所示,表明蜡质缺失突变体osgl1与野生型3037相比,叶绿体渗透型降低,而水分散失率增加。图3中,A为野生型3037与突变体osgl1的叶绿体渗透实验;B为野生型3037与突变体osgl1的水分散失实验。每个样品重复三次。W:野生型3037;M:突变体osgl1。
4、水稻蜡质缺失突变体osgl1的干旱实验分析
将野生型3037和突变体osgl1种在同一个盆里,在正常情况下生长6周后,停止给他们浇水,干旱持续12天后再给他们浇水,观察他们表型的变化。结果表明,野生型3037的大部分叶片能够恢复正常,而突变体osgl1只有少部分叶片能够恢复正常(图4),这表明突变体osgl1对于干旱更敏感。图4中,A为干旱实验开始之前的野生型3037(左)与突变体osgl1(右);B为干旱实验结束后的野生型3037(左)与突变体osgl1(右)。
5、水稻蜡质缺失突变体osgl1的遗传分析
水稻蜡质缺失突变体osgl1和粳型野生型材料中花11,二品种杂交得F1代,F1代自交产生F2代,对F2代植株进行表型鉴定,中花11和osgl1分别作为正、负对照,F2代植株的表型鉴定结果如表1所示,表明水稻蜡质缺失这一性状符合单基因控制遗传规律。表1中,正常株数是指具有中花11表型的株数,蜡质缺失osgl1株数是指具有osgl1表型的株数。
表1水稻蜡质缺失突变体osgl1的遗传分析
组合 | 正常株数 | osgl1株数 | 总株数 | 分离比 |
osgl1/中花11 | 410 | 127 | 537 | 3.11∶1 |
实施例2、OsGL1及其编码基因OsGL1的获得
1、图位克隆OsGL1的基因组基因
为了克隆OsGL1基因,将用纯合的突变体叶片蜡质缺失突变体和中花11进行杂交,获得的F1代自交得到F2群体,对其中180个F2隐性个体(具有叶片蜡质缺失表型的F2代个体)进行OsGL1基因的初步定位。应用STS分子标记,利用PCR的方法,发现位于第9号染色体上的STS标记P1、P2、P3、P4、P5和P6与突变位点在位置上具有明显的连锁性。突变位点和P3之间的交换单株,绝大多数在突变位点和P1、P2之间也进行交换,而突变位点和P4之间的交换单株,绝大多数包含在突变位点和P5、P6之间的交换单株中。同时突变位点和P3之间的交换单株与突变位点和P4之间的交换单株不同,因此推断突变基因可能位于标记P3和标记P4之间的区域。在此基础上,进一步扩大突变体osgl1和中花11的杂交组合,获得了包含1842株突变单株的F2分离群体用于OsGL1精细定位。参照已经完成的水稻基因组序列(http://www.tigr.org/tdb/e2k1/osa1/和http://btn.genomics.org.cn),对粳稻和籼稻的序列进行比较,利用序列差异发展了5个新的STS分子标记(表2)。最终将OsGL1精细定位于BAC克隆AP005568标记P7和P9之间,这两个标记之间的物理距离约为35kb。利用水稻基因组注解数据库RiceGAAS(http://ricegaas.dna.affrc.go.jp/rgadb)分析表明,35kb区域内只有1个功能注释的基因09g25850,该基因与玉米GL1基因的同源性高达85%,而玉米GL1基因的突变导致叶表皮的蜡质严重缺失。将其作为候选基因,通过DNA序列测定进行了突变体和野生型3037序列比较。结果表明,该基因在第十个外显子中发生了一个单碱基的置换,导致该处的氨基酸由组氨酸变成了天冬氨酸。因此,将该基因确定为候选基因,命名为OsGL1(此处OsGL1指野生型基因)。利用水稻基因组注解数据库RiceGAAS信息表明,该基因从起始密码子到终止密码子的基因组全长为4488bp,共有10个外显子,9个内含子,mRNA的全长为1857bp,共编码619个氨基酸。
表2STS标记
2.OsGL1基因全长ORF的获得
水稻中籼3037叶片总RNA提取采用Bioteke公司RNA提取试剂盒(Bioteke,RP1201)按照说明书操作。以Oligo(dt)-18为引物,以所提取的总RNA为模板进行反转录合成第一链cDNA。以此cDNA为模板,primer 1(5’-ATGGGTGCCGCATTCTTGTC-3’)和primer 2(5’-TCAGACAGGCCGGAGGCCGT-3’),进行PCR扩增反应,反应条件如下:
反应体积50μl,其中含有:
模板(cDNA) 5μl(5ng)
引物正向引物、反向引物终浓度各0.2μM
dNTP 终浓度各200μM
Taq DNA聚合酶 2.5U
10×Taq DNA聚合酶缓冲液 5μl
用双蒸水补足至50μl体积。
反应温度、时间:94℃,变性5分钟;然后94℃变性30秒,58℃退火30秒,72℃延伸45秒,扩增30个循环;最后在72℃下延伸8分钟。
扩增产物为3’有碱基A的3’突出粘端片段,用Biomed胶回收试剂盒(Biomed,28706)按产品说明书进行纯化,然后与3’有碱基T的线性pBM19-T载体(Biomed,A1360)在室温下下连接20分钟,使用2mm电极杯,2500V转化大肠杆菌DH5α,转化物在含氨苄青霉素的LB平板培养基上生长,挑选克隆,提取质粒,使用AbI PRISM3700DNA分析仪(Perkin-Elmer/Applied Biosystem)测序,测得的序列如SEQ ID NO:2所示,为OsGL1的cDNA的ORF,其全长1857bp,其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
实施例3、基因OsGL1的应用
一、蜡质缺失突变体osgl1表型的互补实验
1、互补载体pCGL及互补对照载体pCGLC的构建
利用Xbal酶切BAC OSJNBb0057D06,获得包含有OsGL1的起始密码子ATG上游的2899个碱基和终止密码子TGA后的1436个碱基的全长序列的DNA片段(8264bp),克隆到pCAMBIA1300(CAMBIA,Canberra,Australia)的Xbal酶切位点间,得到重组载体;将构建好的互补载体pCGL用HindIII酶切,去除OsGL1部分编码区和基因的5’启动子区,保留3’端的部分编码区和3’调控区,即构建成了互补对照载体pCGLC(图5)。
pCGL,互补表达载体,包括OsGL1基因上游2899bp和下游1436bp;
pCGLC,互补表达载体对照,与pCGL相比少了部分外显子及5`端序列。
2、pCGL和pCGLC转化株系的获得及其表型鉴定
农杆菌(AgroBacterium tumefaciens)株系EHA105购自北京亚平宁生物科技发展有限公司。
两载体pCGL和pCGLC通过电击的方法分别转入农杆菌(AgroBacteriumtumefaciens)株系EHA105中,利用农杆菌的介导法分别将pCGL和pCGLC转入蜡质缺失突变体osgl1与中花11杂交群体的自交F2代隐性个体(具有蜡质缺失表型的个体)。转化的具体方法是将该F2代种子的幼胚灭菌后切出,接种到诱导愈伤组织的培养基中。培养1周后,挑选生长旺盛,颜色浅黄,比较松散的胚性愈伤组织,用作转化的受体。用含有pCGL和pCGLC质粒的EHA105菌株分别侵染水稻愈伤组织,在黑暗处25℃培养3天后,将水稻愈伤组织接于含有50mg/L潮霉素的选择培养基中,在25℃条件下进行第一轮筛选,两周后长出的新鲜愈伤转入选择培养基进行第二轮筛选。经过两到三轮筛选后,选择生长旺盛的抗性愈伤组织转入分化培养基中,于16小时光照8小时暗培养条件下进行分化,再生的小苗在1/2MS培养基生根壮苗,最后将潮霉素抗性植株在阴凉处练苗,7天后移栽到水田,观察转基因植株的表型恢复情况。
通过人工淋浴的鉴定方法,我们发现:互补载体pCGL的转基因植株叶片上能形成球形状的水珠,并且只要稍微抖动一下叶片,都会导致叶片上这些水珠的滴落。而互补对照载体pCGLC的转基因植株叶片则不能形成水珠,水分子均匀散布在整个叶表面。这些结果表明互补载体pCGL能恢复蜡质缺失表型为野生型表型,而互补对照载体pCGLC不能恢复蜡质缺失表型。同时提取互补载体pCGL的转基因植株及对照载体pCGLC的转基因植株的基因组DNA,使用基因组特异性引物(保证扩增出来的序列是基因组序列而不是互补载体pCGL及pCGLC序列,用于检测植株的遗传背景是野生型还是突变体),通过PCR扩增反应并测序,进一步验证互补载体pCGL及对照载体pCGLC的转基因植株的遗传背景。
基因组特异性引物对primer 3(5’-AGAGATTCCAGAAGATACAG-3’)和primer 4(5’-GGGCCCTATGTAAAATCTTA-3’)。
PCR扩增反应条件如下:反应体积20μl,其中含有:模板(基因组DNA)1μl(25ng),正向引物、反向引物终浓度各0.2μM,dNTP终浓度各200μM,Taq DNA聚合酶1U,10×TaqDNA聚合酶缓冲液2μl,用双蒸水补足至20μl体积。
反应温度、时间:94℃,变性5分钟;然后94℃变性25秒,58℃退火25秒,72℃延伸3分钟,扩增若干个循环;最后在72℃下延伸5分钟。
扩增循环数:30个循环。
结果表明:互补载体pCGL及对照载体pCGLC的转基因植株的遗传背景都是突变体背景。互补实验表明OsGL1控制蜡质形成。
诱导愈伤组织的培养基组成:
N6-1:(NH4)2SO4 463mg/L,KNO3 2830mg/L,MgSO4·7H2O 185mg/L。
N6-2:CaCl2·2H2O 166mg/L。
N6-3:KH2PO4 400mg/L。
N6-4:FeSO4·7H2O 27.8mg/L,EDTANa2 37.2mg/L。
N6-5:MnSO4·4H2O 4.4mg/L,ZnSO4·7H2O 1.5mg/L,H3BO3 1.6mg/L,KI 0.8mg/L。
N6-6:甘氨酸2mg/L,盐酸硫胺素B1 1mg/L,盐酸吡哆醇B6 0.5mg/L,烟酸0.5mg/L,肌醇100mg/L。
酪蛋白水解物0.5g/L,蔗糖30g/L,2,4-D 2mg/L,植物凝胶(Phytagel)2.5g/L,pH 5.8,其余为水,pH 5.8。
第一轮抗性筛选培养基组成:
N6-1:(NH4)2SO4 463mg/L,KNO3 2830mg/L,MgSO4·7H2O 185mg/L。
N6-2:CaCl2·2H2O 166mg/L。
N6-3:KH2PO4 400mg/L。
N6-4:FeSO4·7H2O 27.8mg/L,EDTANa2 37.2mg/L。
N6-5:MnSO4·4H2O 4.4mg/L,ZnSO4·7H2O 1.5mg/L,H3BO31.6mg/L,KI 0.8mg/L。
N6-6:甘氨酸2mg/L,盐酸硫胺素B1 1mg/L,盐酸吡哆醇B6 0.5mg/L,烟酸0.5mg/L,肌醇100mg/L。
酪蛋白水解物0.5g/L,蔗糖30g/L,2,4-D 2mg/L,植物凝胶(Phytagel)2.5g/L,pH 5.8,其余为水,pH 5.8。
25mg/L潮霉素B,500mg/L头孢霉素。
第二轮抗性筛选培养基组成:
N6-1:(NH4)2SO4 463mg/L,KNO3 2830mg/L,MgSO4·7H2O 185mg/L。
N6-2:CaCl2·2H2O 166mg/L。
N6-3:KH2PO4 400mg/L。
N6-4:FeSO4·7H2O 27.8mg/L,EDTANa2 37.2mg/L。
N6-5:MnSO4·4H2O 4.4mg/L,ZnSO4·7H2O 1.5mg/L,H3BO3 1.6mg/L,KI 0.8mg/L。
N6-6:甘氨酸2mg/L,盐酸硫胺素B11mg/L,盐酸吡哆醇B60.5mg/L,烟酸0.5mg/L,肌醇100mg/L。
酪蛋白水解物0.5g/L,蔗糖30g/L,2,4-D 2mg/L,植物凝胶(Phytagel)2.5g/L,
pH 5.8,其余为水,pH 5.8。
50mg/L潮霉素B,300mg/L头孢霉素。
分化培养基组成:MS盐分和维生素,酪蛋白水解物0.5g/L,蔗糖30g/L,6-BA2mg/L,NAA 0.5mg/L,KT 0.5mg/L,植物凝胶(Phytagel)3g/L,潮霉素B 50mg/L,头孢霉素200mg/L,其余为水,pH 5.8。
MS盐分和维生素组分:
大量元素(mg/L)
NH4NO3 1650
KNO3 1900
CaCl2·2H2O 440
MgSO4·7H2O 370
KH2PO4 170
微量元素(mg/L)
KI 0.83
H3BO3 6.2
MnSO4·4H2O 22.3
ZnSO4·7H2O 8.6
Na2MoO4·2H2O 0.25
CuSO4·5H2O 0.025
CoCl2·6H2O 0.025
铁盐(mg/L)
FeSO4·7H2O 27.85
Na2-EDTA·2H2O 37.25
有机成分(mg/L)
肌醇 100
烟酸(维生素B5) 0.5
盐酸吡哆醇(维生素B6) 1
盐酸硫胺素(维生素B1) 0.5
甘氨酸 2
二、osGL1基因RNA干扰实验
中籼3037和农杆菌EHA105在文献“农杆菌介导籼稻中籼3037转化体系的优化及其应用.王歆,于恒秀,曾燕楠,刘巧泉,龚志云,程祝宽.分子植物育种,2008,6(3)”中公开过,公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
1、干扰载体pGL1RNAi的构建
载体pCam13OX的构建方法:用引物对35S-F :(5’-AAGCTTCCCAGATTAGCCTTTTCAAT-3’)和35S-R:(5’-CTGCAGTCCCCCGTGTTCTCTCCAA-3’)PCR扩增质粒pBI121(购自北京鼎国生物技术有限公司,货号:MCV032)得到约850bp的组成型CaMV35S启动子片段,将该片段用PstI和Hind III双酶切然后连入载体pCAMBIA1300(购自北京鼎国生物技术有限公司,货号:MCV033)的Pst I和Hind III识别位点间,构成中间载体pCam13OXM。用EcoR I和Sac I双酶切质粒pBI121,将回收的约300bp的Nos终止子片段连入中间载体pCam13OXM的EcoR I和Sac I识别位点间,最终得到过表达载体pCam13OX。
利用获得的OsGL1的cDNA的一个片段反向重复地分别连到内含子序列的两端,然后将这三段拼合的序列与组成型CaMV35S启动子连接,克隆到pCam13OX的Pst I和Sal I识别位点间,即构建成了RNAi干扰载体pGL1RNAi。
pGL1RNAi详细构建方法:
提取水稻中籼3037的RNA,反转录成cDNA;以cDNA为模板,用引物对primer3(5’-AGAGATTCCAGAAGATACAG-3’)和primer 4(5’-TCAGACAGGCCGGAGGCCGT-3’)进行PCR扩增。
反应条件如下:反应体积50μl,其中含有:模板(cDNA)5μl(5ng),引物正向引物、反向引物终浓度各0.2μM,dNTP 终浓度各200μM,Taq DNA聚合酶2.5U,10×Taq DNA聚合酶缓冲液5μl,用双蒸水补足至50μl体积。
反应温度、时间:94℃,变性5分钟;然后94℃变性30秒,58℃退火30秒,72℃延伸30秒,扩增30个循环;最后在72℃下延伸8分钟。
扩增产物为3’有碱基A的3’突出粘端片段,用Biomed胶回收试剂盒(Biomed,28706)按产品说明书进行纯化,然后连入3’有碱基T的线性载体pMD19-T(Takara,D101)中得到载体pMD19-GL1,分别用Sal I和BamHI以及Pst I和Xba I双酶切载体pMD19-GL1得到422bp左右的片段1(即包含SEQ ID NO:3中第7bp-428bp片段)和422bp左右的片段2(即包含SEQ ID NO:3中第640bp-1061bp片段),用Bgl II和Xba I双酶切载体pUCCRNAi得到约211bp左右的片段3(即包含SEQ ID NO:3中第429bp-639bp片段);用Pst I和SalI酶切过表达载体pCam13OX,回收载体大片段;将载体大片段和片段1、片段2、片段3连接,得到重组载体,记作RNAi干扰载体pGL1RNAi。
载体pUCCRNAi在文献“Gan,D.,Zhang,J.,Jiang,H.,Jiang,T.,Zhu,S.,and Cheng,B.Bacterially expressed dsRNA protects maize against SCMV infection.Plant Cell Rep 29,1261-1268.”中公开过,公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。
将干扰载体pGL1RNAi进行测序验证,结果在pCam13OX的Pst I和Sal I识别位点间插入的DNA片段序列如SEQ ID NO:3所示。SEQ ID NO:3中,第7-428位核苷酸为干扰序列,第429-639位核苷酸为内含子,第640-1061位核苷酸为干扰序列的反向重复序列。
2、转化
通过电击的方法将载体pGL1RNAi转入农杆菌(AgroBacterium tumefaciens)株系EHA105中,抗性筛选得到阳性重组农杆菌。
利用农杆菌的介导法将干扰载体转入粳型野生型材料日本晴中,具体如下:
将日本晴种子的幼胚灭菌后切出,接种到诱导愈伤组织的培养基中,培养1周后,挑选生长旺盛,颜色浅黄,比较松散的胚性愈伤组织,用作转化的受体。用含有干扰载体pGL1RNAi的EHA105菌株侵染水稻愈伤组织,在黑暗处25℃培养3天后,将水稻愈伤组织接于含有50mg/L潮霉素的选择培养基中,在25℃条件下进行第一轮抗性筛选培养,两周后长出的新鲜愈伤转入选择培养基进行第二轮筛选。经过两轮筛选后,选择生长旺盛的抗性愈伤组织转入分化培养基中,于25℃、16小时光照8小时暗培养条件下进行分化,再生的小苗在1/2MS培养基生根壮苗,最后将潮霉素抗性植株在阴凉处练苗,7天后移栽到水田。
诱导愈伤组织的培养基组成及浓度如下:
N6-1:(NH4)2SO4 463mg/L,KNO3 2830mg/L,MgSO4·7H2O 185mg/L。
N6-2:CaCl2·2H2O 166mg/L。
N6-3:KH2PO4 400mg/L。
N6-4:FeSO4·7H2O 27.8mg/L,EDTANa2 37.2mg/L。
N6-5:MnSO4·4H2O 4.4mg/L,ZnSO4·7H2O 1.5mg/L,H3BO3 1.6mg/L,KI 0.8mg/L。
N6-6:甘氨酸2mg/L,盐酸硫胺素B1 1mg/L,盐酸吡哆醇B6 0.5mg/L,烟酸0.5mg/L,肌醇100mg/L。
酪蛋白水解物0.5g/L,蔗糖30g/L,2,4-D 2mg/L,植物凝胶(Phytagel)2.5g/L,pH 5.8,其余为水,pH 5.8。
第一轮抗性筛选培养基组成:
N6-1:(NH4)2SO4 463mg/L,KNO3 2830mg/L,MgSO4·7H2O 185mg/L。
N6-2:CaCl2·2H2O 166mg/L。
N6-3:KH2PO4 400mg/L。
N6-4:FeSO4·7H2O 27.8mg/L,EDTANa2 37.2mg/L。
N6-5:MnSO4·4H2O 4.4mg/L,ZnSO4·7H2O 1.5mg/L,H3BO3 1.6mg/L,KI 0.8mg/L。
N6-6:甘氨酸2mg/L,盐酸硫胺素B1 1mg/L,盐酸吡哆醇B6 0.5mg/L,烟酸0.5mg/L,肌醇100mg/L。
酪蛋白水解物0.5g/L,蔗糖30g/L,2,4-D 2mg/L,植物凝胶(Phytagel)2.5g/L,pH 5.8,其余为水,pH 5.8。
25mg/L潮霉素B,500mg/L头孢霉素。
第二轮抗性筛选培养基组成:
N6-1:(NH4)2SO4 463mg/L,KNO3 2830mg/L,MgSO4·7H2O 185mg/L。
N6-2:CaCl2·2H2O 166mg/L。
N6-3:KH2PO4 400mg/L。
N6-4:FeSO4·7H2O 27.8mg/L,EDTANa2 37.2mg/L。
N6-5:MnSO4·4H2O 4.4mg/L,ZnSO4·7H2O 1.5mg/L,H3BO3 1.6mg/L,KI 0.8mg/L。
N6-6:甘氨酸2mg/L,盐酸硫胺素B1 1mg/L,盐酸吡哆醇B6 0.5mg/L,烟酸0.5mg/L,肌醇100mg/L。
酪蛋白水解物0.5g/L,蔗糖30g/L,2,4-D 2mg/L,植物凝胶(Phytagel)2.5g/L,pH 5.8,其余为水,pH 5.8。
50mg/L潮霉素B,300mg/L头孢霉素。
分化培养基组成:
大量元素(mg/L)
NH4NO3 1650
KNO3 1900
CaCl2·2H2O 440
MgSO4·7H2O 370
KH2PO4 170
微量元素(mg/L)
KI 0.83
H3BO3 6.2
MnSO4·4H2O 22.3
ZnSO4·7H2O 8.6
Na2MoO4·2H2O 0.25
CuSO4·5H2O 0.025
CoCl2·6H2O 0.025
铁盐(mg/L)
FeSO4·7H2O 27.85
Na2-EDTA·2H2O 37.25
有机成分(mg/L)
肌醇 100
烟酸(维生素B5) 0.5
盐酸吡哆醇(维生素B6) 1
盐酸硫胺素(维生素B1) 0.5
甘氨酸 2
酪蛋白水解物0.5g/L,蔗糖30g/L,6-BA 2mg/L,NAA 0.5mg/L,KT 0.5mg/L,植物凝胶(Phytagel)3g/L,潮霉素B 50mg/L,头孢霉素200mg/L,其余为水,pH 5.8。
同时设转空载体pCam13OX对照。
3、pGL1RNAi植株OsGL1表达量的定量检测:
取转基因植株及野生型材料日本晴的抽穗期叶片,提取总RNA,采用Bioteke公司RNA提取试剂盒(Bioteke,RP1201)按照说明书操作。以Oligo(dt)-18为引物,以所提取的总RNA为模板进行反转录合成第一链cDNA。通过semi-qPCR扩增反应比较转基因植株及野生型材料日本晴的抽穗期叶片cDNA中OsGL1基因的表达量,以水稻Ubiquitin基因的表达量做参照。扩增OsGL1基因用引物对primer 5(5’-ACCCCAACGTACCACACGAT-3’)和primer 6(5’-ACCCCTGCGCTGGTTTTCTT-3’)。扩增Ubiquitin基因用引物对primer 7(5’-CAAGATGATCTGCCGCAAATGC-3’)和primer8(5’-TTTAACCAGTCCATGAACCCG-3’)。
PCR扩增反应条件如下:反应体积20μl,其中含有:模板(cDNA)1μl(25ng),正向引物、反向引物终浓度各0.2μM,dNTP终浓度各200μM,Taq DNA聚合酶1U,10×TaqDNA聚合酶缓冲液2μl,用双蒸水补足至20μl体积。
反应温度、时间:94℃,变性5分钟;然后94℃变性25秒,58℃退火25秒,72℃延伸25秒,扩增若干个循环;最后在72℃下延伸5分钟。
扩增循环数:OsGL1基因30个循环;Ubiquitin基因25个循环。
结果显示以水稻Ubiquitin基因的表达量做参照,转pGL1RNAi植株中OsGL1基因的表达明显下调,确实达到了干扰的效果。图7为野生型(WT)和转pGL1RNAi植株OsGL1的基因表达量;上为OsGL1基因的表达量,下为对照Ubiquitin(UBQ)基因的表达量;左为野生型材料日本晴(WT)抽穗期叶片的cDNA,右为转pGL1RNAi植株抽穗期叶片的cDNA。转空载体植株与野生型植物的OsGL1表达量无显著差异。
4、观察移入大田后的植株的表型
以野生型日本晴作为对照,观察植株各个时期的、下雨或者人工淋雨后的叶片表面蜡质表型。
实验设3次重复。
结果:得到的转基因植株在幼苗期即显示出蜡质缺失叶片亲水的表型,随着植株生长,蜡质缺失叶片亲水的表型逐渐明显,到抽穗期时,整个叶面几乎都表现出蜡质缺失叶片亲水的表型;而野生型对照在整个生长时期均没有蜡质缺失叶片亲水的表型(图6,A为植株,B为叶片)。图6中,左图为野生型,右图为转pGL1RNAi植株。而空载体pCam13OX对照的转基因植株与野生型表型相同。
获得的干扰植株由于蜡质含量较少,有利于GUS染色液的吸附和渗透,这非常方便于外源基因在叶片表达情况的GUS染色检测,同时,由于其来源于日本晴背景,转化效率比较高,因此是理想的检测外源基因在叶片等组织中表达的转基因实验材料。
Claims (5)
1.一种RNA分子,其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
2.表达权利要求1所述RNA分子的重组干扰载体。
3.根据权利要求2所述的重组干扰载体,其特征在于:所述重组干扰载体按照包括如下步骤的方法得到:将SEQ ID NO:3所示DNA片段插入出发载体的多克隆位点,得到所述重组干扰载体。
4.根据权利要求3所述的重组干扰载体,其特征在于:所述出发载体为pCam13OX;
所述pCam13OX按照包括如下步骤的方法制备得到:将CaMV35S启动子片段插入载体pCAMBIA1300的Pst I和Hind III的识别位点间,得到的重组载体记作pCam13OXM;将Nos终止子片段插入载体pCam13OXM的EcoR I和Sac I识别位点间,得到pCam13OX。
5.一种培育蜡质减少的转基因植物的方法,包括如下步骤:使出发植物中的SEQID NO:1所示蛋白的编码基因的功能丧失,得到蜡质减少的转基因植物;
所述使出发植物中的SEQ ID NO:1所示蛋白的编码基因的功能丧失的方法为抑制出发植物中的SEQ ID NO:1所示蛋白的编码基因表达;
所述抑制出发植物中的SEQ ID NO:1所示蛋白的编码基因表达的方法包括如下步骤:向所述出发植物中导入权利要求2-4中任一所述重组干扰载体;
所述出发植物为水稻;
所述SEQ ID NO:1所示蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN 201010610602 CN102168083B (zh) | 2010-12-29 | 2010-12-29 | 一种培育蜡质减少的转基因植物的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN 201010610602 CN102168083B (zh) | 2010-12-29 | 2010-12-29 | 一种培育蜡质减少的转基因植物的方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN102168083A CN102168083A (zh) | 2011-08-31 |
CN102168083B true CN102168083B (zh) | 2013-03-20 |
Family
ID=44489401
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN 201010610602 Expired - Fee Related CN102168083B (zh) | 2010-12-29 | 2010-12-29 | 一种培育蜡质减少的转基因植物的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN102168083B (zh) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103421814B (zh) * | 2013-07-23 | 2015-01-28 | 华中农业大学 | Dwa1基因控制水稻抗旱性及叶表皮蜡质合成中的应用 |
CN104561352B (zh) * | 2015-01-29 | 2017-01-11 | 江苏丘陵地区镇江农业科学研究所 | 一种水稻叶片亲水基因的分子标记方法 |
CN107326033B (zh) * | 2017-08-28 | 2019-08-09 | 中国科学院东北地理与农业生态研究所 | OsROC4基因在调控水稻表皮蜡质合成中的应用 |
CN114480488B (zh) * | 2022-02-17 | 2023-08-01 | 河南农业大学 | 一种拟轮枝镰孢菌相关的ZmWAX基因的应用 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1552874A (zh) * | 2003-06-02 | 2004-12-08 | 上海师范大学 | 生产蛋白质含量提高的水稻种子的新方法 |
JP2005185101A (ja) * | 2002-05-30 | 2005-07-14 | National Institute Of Agrobiological Sciences | 植物の全長cDNAおよびその利用 |
CN1957679A (zh) * | 2005-11-04 | 2007-05-09 | 上海师范大学 | 一种软米育种方法及其应用 |
-
2010
- 2010-12-29 CN CN 201010610602 patent/CN102168083B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005185101A (ja) * | 2002-05-30 | 2005-07-14 | National Institute Of Agrobiological Sciences | 植物の全長cDNAおよびその利用 |
CN1552874A (zh) * | 2003-06-02 | 2004-12-08 | 上海师范大学 | 生产蛋白质含量提高的水稻种子的新方法 |
CN1957679A (zh) * | 2005-11-04 | 2007-05-09 | 上海师范大学 | 一种软米育种方法及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
Mohammand Asadl Islam 等.Characterization of Glossyl-homologous genes in rice involved in leaf wax accumulation and drought resistance.《Plant molecular biology》.2009,第4卷(第70期),443-456. * |
王新其 等.水稻蜡质基因(WX)反义片段在转基因后代中的遗传稳定性.《上海农业学报》.2003,第19卷(第2期),12-16. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN102168083A (zh) | 2011-08-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2363980T3 (es) | Uso de una secuencia de ácido nucleico para la generación de plantas transgénicas que tienen tolerancia a la sequía mejorada. | |
CN102803291B (zh) | 具有增强的产量相关性状和/或增强的非生物胁迫耐受性的植物和制备其的方法 | |
CN103993018B (zh) | 控制水稻株高、提高抗倒伏能力、增加有效分蘖数和产量的基因及其应用 | |
CN102066568A (zh) | 具有增强的产量相关性状的植物和用于产生该植物的方法 | |
CN102186877A (zh) | 具有增强的产量相关性状的植物和用于产生该植物的方法 | |
US20200095600A1 (en) | Corn genes zmspl1 and zmspl2 and uses thereof | |
CN105112441A (zh) | 具有增强的产量相关性状的植物和用于产生该植物的方法 | |
Li et al. | Development of highly regenerable callus lines and Agrobacterium-mediated transformation of Chinese lawngrass (Zoysia sinica Hance) with a cold inducible transcription factor, CBF1 | |
CN1876813B (zh) | 一种提高结缕草抗寒性的方法 | |
CN106148390A (zh) | Chy锌指蛋白转录激活辅因子及其应用 | |
CN102168083B (zh) | 一种培育蜡质减少的转基因植物的方法 | |
ES2400540T3 (es) | Promotores inducibles por deficiencia de agua | |
CN113355335A (zh) | 二色补血草基因LbHLH及其应用 | |
CN101698854A (zh) | 转盐芥cbf1基因提高玉米、小麦抗旱耐盐性的应用 | |
CN106892973A (zh) | 植物抗逆性相关蛋白GhMYB4及编码基因与应用 | |
CN103773795A (zh) | 具有增强的产量相关性状的植物及其生产方法 | |
CN101883572A (zh) | 高粱铝耐受基因SbMATE | |
CN113930444B (zh) | 水稻OsRDR6蛋白质及其编码基因在调控植物雄性育性中的应用 | |
CN105175519A (zh) | 蛋白srl2在培育叶卷曲水稻中的应用 | |
US11319548B2 (en) | Cold- and water-inducible promoter from rice | |
US20170067071A1 (en) | Corn genes zmspl1 and zmspl2 and uses thereof | |
CN104293808A (zh) | 一种杂交鹅掌楸LhMKK2基因及其表达蛋白和应用 | |
CN104673803A (zh) | 基因甲基化在调控基因表达方面的应用 | |
CN112342218B (zh) | Boc1蛋白在调控水稻愈伤组织褐化中的应用 | |
CN113666992B (zh) | 一种草莓白粉病抗性基因及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20130320 |
|
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |