ES2400540T3 - Promotores inducibles por deficiencia de agua - Google Patents

Abstract

Un vector de expresión que comprende un promotor inducible por deficiencia de agua que comprendeSEQ ID NO: 6 o una parte funcional del mismo, en el que la parte funcional incluye una función de promotorinducible por deficiencia de agua, en el que dicho promotor o parte funcional del mismo está operativamente ligado ay regula la expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido que confiere elevada tolerancia a condicionesde deficiencia de agua.

Description

Promotores inducibles por deficiencia de agua

ACUERDO DE INVESTIGACIÓN CONJUNTA

[0001] La presente invención, en el campo de la genómica funcional y la caracterización de genes de plantas para la mejora de plantas, se hizo por o en nombre de Mendel Biotechnology, Inc. y Monsanto Corporation como resultado de actividades realizadas dentro del alcance de un acuerdo de investigación conjunta vigente en o antes de la fecha en que se hizo la presente invención.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0002] La presente invención se refiere a genómica de plantas y más específicamente se refiere a promotores inducibles por deficiencia de agua que median en la expresión génica durante una respuesta de la planta a deficiencia de agua.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0003] En el entorno natural, las plantas frecuentemente crecen bajo condiciones desfavorables que incluyen condiciones de deficiencia de agua tales como sequía, una grave forma de baja disponibilidad de agua generalmente caracterizada como un periodo prolongado de deficiencia de agua. La deficiencia de agua, o privación de agua, puede retrasar el crecimiento y desarrollo, reducir la productividad y, en casos extremos, hacer que la planta muera. La baja disponibilidad de agua es un factor importante en la reducción del rendimiento de cultivos en el mundo. Los problemas de las plantas producidas por baja disponibilidad de agua incluyen estreses mecánicos producidos por la retirada de agua celular. La sequía también hace que las plantas se vuelvan más susceptibles a diversas enfermedades (Simpson, ed. (1981) “The Value of Physiological Knowledge of Water Stress in Plants”, en Water Stress on Plants, Praeger, NY, pág. 235-265).

[0004] Se ha mostrado que varios polipéptidos, que incluyen, por ejemplo, factores de transcripción (FT), mejoran la tolerancia de especies de plantas a condiciones de deficiencia de agua (por ejemplos, véase la publicación nº WO2004076638). Sin embargo, limitaciones importantes en el uso de diversas proteínas que confieren tolerancia a la deficiencia de agua a especies de cultivo cuando las proteínas se expresan en exceso pueden incluir efectos secundarios negativos asociados a la expresión en exceso constitutiva de estos polipéptidos. Posibles efectos pleiotrópicos tales como tamaño pequeño, crecimiento retrasado, elevada sensibilidad a enfermedades y desarrollo y alteración en el momento del florecimiento son comunes. Se ha propuesto que genes que confieren tolerancia a la deficiencia de agua impongan un coste a la idoneidad y desarrollo global. Para vencer estas limitaciones, los presentes estudios se iniciaron para descubrir y evaluar la utilidad de numerosas secuencias promotoras que responden a condiciones de deficiencia de agua. Estas secuencias promotoras pueden usarse para regular la expresión de proteínas durante periodos de sequía u otras condiciones de deficiencia de agua y, por tanto, pueden usarse para inducir expresión en exceso de polipéptidos que pueden conferir tolerancia a la deficiencia de agua mejorada cuando se necesita sin los efectos de desarrollo o morfológicos adversos que pueden asociarse a su expresión en exceso constitutiva. Se desarrollaron numerosas plantas transgénicas usando estas secuencias promotoras para regular polipéptidos y las plantas se analizaron para su tolerancia a condiciones de deficiencia de agua. Muchas de estas secuencias promotoras pueden usarse para producir plantas y cultivos comercialmente valiosos, además de los procedimientos para producirlas y usarlas.

[0005] Por tanto, la presente invención se refiere a procedimientos y composiciones para producir plantas transgénicas en las que la expresión en exceso inducible por deficiencia de agua de factores de transcripción confiere tolerancia potenciada a la deficiencia de agua con impacto reducido o sin impacto sobre el rendimiento, aspecto, calidad o idoneidad, con respecto a plantas que expresan constitutivamente en exceso los mismos factores de transcripción. Otros aspectos y realizaciones de la invención se describen más adelante y pueden derivarse de las enseñanzas de la presente divulgación en conjunto.

[0006] El documento US 2005/097631 se refiere a plantas transgénicas que tienen ADN recombinante que expresa un factor de transcripción G1073. El documento EP 1 209 228 se refiere a la identificación de promotores inducibles por estrés medioambiental. El documento WO 2005/047516 desvela los factores de transcripción G47, G1274 y G1792 y su uso en la producción de plantas transgénicas con rasgos alterados.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0007] La presente invención se refiere a secuencias promotoras que pueden usarse para transformar una planta. Las secuencias promotoras pueden responden a condiciones de deficiencia de agua y pueden usarse para accionar la expresión de una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido que puede conferir elevada tolerancia a la deficiencia de agua, que incluye sequía, desecación, deshidratación, o un estrés hiperosmótico relacionado (por ejemplo, congelación o alta concentración de sales). Por tanto, el polipéptido puede expresarse en un modo inducible por deficiencia de agua. Por consiguiente, la presente invención proporciona un vector de expresión que comprende un promotor inducible por deficiencia de agua que comprende SEQ ID NO: 6 o una parte funcional del mismo, en el que la parte funcional incluye una función de promotor inducible por deficiencia de agua, en el que dicho promotor o parte funcional del mismo está operativamente ligado a y regula la expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido que confiere elevada tolerancia a condiciones de deficiencia de agua. La invención se define adicionalmente en las reivindicaciones adjuntas.

[0008] Un promotor inducible por deficiencia de agua de la invención puede comprender una parte funcional del mismo, a condición de que la parte funcional también incluya una función de promotor inducible por deficiencia de agua. La parte funcional del promotor puede tener aproximadamente 50, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 447, 450, 460, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 605, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 766, 775 ó 776, nucleótidos contiguos de las secuencias de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 6, además de todas las longitudes de nucleótidos contiguos dentro de tales tamaños.

[0009] En el presente documento se describen vectores de expresión que pueden comprender una secuencia promotora, que es un promotor inducible por deficiencia de agua que puede comprender cualquiera de SEQ ID NO: 1 a 9, o una parte funcional del mismo, a condición de que la parte funcional también incluya una función de promotor inducible por deficiencia de agua. El promotor comprende un dominio de iniciación de la transcripción que tiene un sitio de unión de ARN polimerasa. El promotor se localiza 5' con respecto a y está operativamente ligado a una secuencia codificante que codifica un polipéptido que confiere a una planta elevada tolerancia a condiciones de deficiencia de agua. Muchos de los vectores de expresión proporcionados como SEQ ID NO: 10 a 54 (cada uno de los cuales comprende un promotor de cualquiera de SEQ ID NO: 1-9, además de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido que confiere elevada tolerancia a la deficiencia de agua) han sido introducido en plantas, y no sólo se ha mostrado que las plantas tienen mayor tolerancia a la deficiencia de agua que una planta de control, sino que las plantas transformadas son frecuentemente de morfología y desarrollo natural o próximo a natural (muchos polipéptidos que contribuyen a tolerancia mejorada a la deficiencia de agua también pueden producir rasgos morfológicos y/o de desarrollo no deseables cuando los polipéptidos se expresan constitutivamente en exceso).

[0010] En el presente documento se describe una célula de planta huésped que comprende un promotor inducible por deficiencia de agua que comprende cualquiera de SEQ ID NO: 1 a 9 o una parte funcional del mismo, en el que la parte funcional incluye una función de promotor.

[0011] En el presente documento se describe una planta transgénica que comprende un promotor inducible por deficiencia de agua que comprende cualquiera de SEQ ID NO: 1 a 9 o una parte funcional del mismo, en el que la parte funcional incluye una función de promotor, y semilla transgénica producida por dichas plantas transgénicas.

[0012] Procedimientos para producir una planta transgénica que tiene mayor tolerancia a condiciones de deficiencia de agua que una planta de control, o para aumentar la tolerancia de una planta a deficiencia de agua, se describen en el presente documento. Las etapas de procedimiento incluyen la generación de un vector de expresión que comprende una secuencia promotora de cualquiera de SEQ ID NO: 1-9 o una parte funcional del mismo, en el que la parte funcional incluye una función de promotor. La secuencia promotora está operativamente ligada a una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que aumenta la tolerancia a la deficiencia de agua en una planta, y durante condiciones de deficiencia de agua la secuencia promotora acciona la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido. Entonces, una planta diana se transforma con el vector de expresión para producir una planta transgénica. Cuando el polipéptido se expresa en exceso en la planta transformada (por ejemplo, durante periodos de deficiencia de agua), la planta transformada tendrá mayor tolerancia a condiciones de deficiencia de agua que la planta de control. Una planta transgénica que se produce por este procedimiento puede cruzarse consigo misma, una planta de la misma línea que la planta transgénica, una planta no transgénica, una planta natural, u otra planta transgénica de una línea transgénica diferente de plantas, para producir una semilla transgénica que comprende el vector de expresión.

Breve descripción del Listado de secuencias y dibujos

[0013] El Listado de secuencias proporciona secuencias de polinucleótidos y de polipéptidos a modo de ejemplo. Los rasgos asociados al uso de las secuencias están incluidos en los ejemplos.

La Figura 1 muestra un cálculo estimado conservativo de relaciones filogenéticas entre los órdenes de plantas en florecimiento (modificado de Soltis y col. (1997) Ann. Missouri Bot. Gard. 84: 1-49). Aquellas plantas con un único cotiledón (monocotiledóneas) son un clado monofilético anidado dentro de al menos dos linajes principales de dicotiledóneas; las eudicotiledóneas se dividen adicionalmente en rósidas y astéridas. Arabidopsis es un eudicotiledónea rósida clasificada dentro del órden Brassicales; el arroz es un miembro del órden de las monocotiledóneas Poales. La Figura 1 se adaptó de Daly y col. (2001) Plant Physiol. 127: 1328-1333.

La Figura 2 muestra un dendograma filogénico que representa relaciones filogenéticas de taxones de plantas superiores que incluyen clados que contienen tomate y Arabidopsis; adaptado de Ku y col. (2000) Proc. Natl. Acid. Sci. USA 97: 9121-912; y Chase y col. (1993) Ann. Missouri Bot. Gard. 80: 528-580.

La Figura 3 muestra la inducción de genes nativos de Arabidopsis correspondientes a nueve promotores de sequía en un ensayo de sequía en macetas de arcilla. Para este experimento se usaron plantas de control naturales estresadas por sequía y con pMEN65 (vector vacío) bien regadas. Las plantas se estresaron por sequía al punto de marchitamiento (como es típico para el ensayo en macetas de arcilla hasta el momento en el que se volverían a regar normalmente) y se realizó RT-PCR usando cebadores específicos para gen para cada uno de los genes indicados en el eje x. El valor de recuentos umbral de ciclos fue el número de ciclos de PCR en tiempo real al que el transcrito de ARN de interés fue detectable por encima de la referencia, se normalizaron con ARN 18S. Las barras cuadriculadas representan el valor umbral de ciclos promedio para plantas bien regadas. Las barras rellenas indican el valor umbral de ciclos promedio para las plantas estresadas por sequía.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0014] La presente divulgación se refiere a polinucleótidos y polipéptidos para modificar fenotipos de plantas, particularmente secuencias promotoras asociadas a elevada tolerancia a la deficiencia de agua tal como desecación, deshidratación o sequía, con respecto a una planta de control (por ejemplo, una planta genéticamente no alterada o no transgénica tal como una planta natural de la misma especie, o una línea de plantas transgénicas que comprende un vector de expresión vacío). En toda la presente divulgación se mencionan diversas fuentes de información. Las fuentes de información incluyen artículos de revistas científicas, documentos de patente, libros de texto y direcciones de la malla mundial. La referencia a estas fuentes de información indica claramente que pueden usarse por un experto en la materia. El contenido y las enseñanzas de todas y cada una de las fuentes de información pueden depender de y usarse para preparar y usar realizaciones de la invención.

[0015] Como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas de la invención, las formas en singular “un”, “una”, “el” y “la” incluyen la referencia en plural, a menos que el contexto dicte claramente de otro modo. Por tanto, por ejemplo, una referencia a “una célula huésped” incluye una pluralidad de tales células huésped, y una referencia a “un estrés” es una referencia a uno o más estreses y equivalentes de los mismos conocidos para aquellos expertos en la materia, etc.

DEFINICIONES

[0016] “Molécula de ácido nucleico” se refiere a un oligonucleótido, polinucleótido o cualquier fragmento del mismo. Puede ser ADN o ARN de origen genómico o sintético, bicatenario o monocatenario, y combinarse con hidrato de carbono, lípidos, proteína u otros materiales para realizar una actividad particular tal como transformación

o formar una composición útil tal como un ácido nucleico de péptido (PNA).

[0017] “Polinucleótido” es una molécula de ácido nucleico que comprende una pluralidad de nucleótidos polimerizados, por ejemplo, al menos aproximadamente 15 nucleótidos polimerizados consecutivos. Un polinucleótido puede ser un ácido nucleico, oligonucleótido, nucleótido, o cualquier fragmento del mismo. En muchos casos, un polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido (o proteína) o un dominio o fragmento del mismo. Adicionalmente, el polinucleótido puede comprender un promotor, un intrón, una región potenciadora, un sitio de poliadenilación, un sitio de iniciación de la traducción, regiones sin traducir de 5' o 3', un gen indicador, un marcador de selección, o similares. El polinucleótido puede ser ADN o ARN monocatenario o bicatenario. El polinucleótido comprende opcionalmente bases modificadas o un esqueleto modificado. El polinucleótido puede ser, por ejemplo, ADN genómico o ARN, un transcrito (tal como un ARNm), un ADNc, un producto de PCR, un ADN clonado, un ADN o ARN sintético, o similares. El polinucleótido puede combinarse con hidrato de carbono, lípidos, proteína, u otros materiales para realizar una actividad particular tal como transformación

o formar una composición útil tal como un ácido nucleico de péptido (PNA). El polinucleótido puede comprender una secuencia en orientaciones tanto sentido como antisentido. “Oligonucleótido” es sustancialmente equivalente a los términos amplímero, cebador, oligómero, elemento, diana y sonda y es preferentemente monocatenario.

[0018] Un “polinucleótido recombinante” es un polinucleótido que no está en su estado nativo, por ejemplo, el polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos no encontrada en la naturaleza, o el polinucleótido está en un contexto distinto del que naturalmente se encuentra, por ejemplo, separado de secuencias de nucleótidos con las que normalmente está en proximidad en la naturaleza, o adyacente (o contiguo con) secuencias de nucleótidos con las que normalmente no está en proximidad. Por ejemplo, la secuencia en cuestión puede clonarse en un vector, o de otro modo recombinarse con uno o más ácidos nucleicos adicionales.

[0019] Un “polinucleótido aislado” es un polinucleótido, tanto si se produce naturalmente como recombinantemente, que está presente fuera de la célula en la que normalmente se encuentra en la naturaleza, tanto si está purificado como si no. Opcionalmente, un polinucleótido aislado está sometido a uno o más procedimientos de enriquecimiento o purificación, por ejemplo, lisis de células, extracción, centrifugación, precipitación, o similares.

[0020] “Gen” o “secuencia de genes” se refiere a la secuencia codificante parcial o completa de un gen, su complemento y sus regiones sin traducir de 5' o 3'. Un gen también es una unidad funcional de herencia, y en términos físicos es un segmento particular o secuencia de nucleótidos a lo largo de una molécula de ADN (o ARN, en el caso de virus de ARN) que participa en la producción de una cadena de polipéptidos. Esta última puede someterse a procesamiento posterior tal como modificación química o plegamiento para obtener una proteína o polipéptido funcional. Un gen puede aislarse, aislarse parcialmente o encontrarse con un genoma del organismo. A modo de ejemplo, un gen de factor de transcripción codifica un polipéptido de factor de transcripción, que puede ser funcional o requerir el procesamiento para servir de iniciador de la transcripción.

[0021] Operacionalmente, los genes pueden definirse por la prueba de cis-trans, una prueba genética que determina si dos mutaciones se producen en el mismo gen y que puede usarse para determinar los límites de la unidad genéticamente activa (Rieger y col. (1976) Glossary of Genetics and Cytogenetics: Classical and Molecular, 4ª ed., Springer Verlag, Berlin). Un gen generalmente incluye regiones que preceden (“conductoras”; en la dirección 5') y que siguen (“remolques”; en la dirección 3') a la región codificante. Un gen también puede incluir secuencias no codificantes intercaladas denominadas “intrones”, localizadas entre segmentos codificantes individuales denominados “exones”. La mayoría de los genes tienen una región promotora asociada, una secuencia reguladora 5' del codón de iniciación de la transcripción (hay algunos genes que no tienen un promotor identificable). La función de un gen también puede regularse por potenciadores, operadores y otros elementos reguladores.

[0022] Un “promotor” o “región promotora” se refiere a un sitio de unión de ARN polimerasa sobre un segmento de ADN, generalmente encontrado en la dirección 5' o 5' con respecto a una secuencia codificante bajo el control del promotor regulador. El promotor comprenderá generalmente elementos de respuesta que son reconocidos por factores de transcripción. Los factores de transcripción se unen a las secuencias promotoras, reclutando ARN polimerasa, que sintetiza ARN de la región codificante. Las diferencias en secuencias promotoras explican diferentes eficiencias de iniciación de la transcripción y, por tanto, diferentes niveles de expresión relativos de diferentes genes.

[0023] “Función de promotor” incluye regular la expresión de las secuencias codificantes bajo un control del promotor proporcionándose un sitio de reconocimiento para ARN polimerasa y/u otros factores, tales como factores de transcripción, todos los cuales son necesarios para el inicio de la transcripción en un sitio de iniciación de la transcripción. Una “función de promotor” también puede incluir el grado al que una de secuencia codificante de gen se transcribe al grado determinado por una secuencia promotora.

[0024] Un promotor o región promotora puede incluir variaciones de promotores encontrados en el presente Listado de secuencias, que pueden derivarse por ligación a otras secuencias reguladoras, mutagénesis al azar, mutagénesis controlada y/o mediante la adición o duplicación de secuencias potenciadoras. Los promotores desvelados en el presente Listado de secuencias y equivalentes o variaciones biológicamente funcionales de los mismos pueden accionar la transcripción de secuencias codificantes operativamente ligadas cuando están comprendidas dentro de un vector de expresión e introducirse en una planta huésped. Promotores tales como aquellos encontrados en el Listado de secuencias (es decir, SEQ ID NO: 1-9) pueden usarse para generar promotores similarmente funcionales que contienen elementos promotores esenciales. Promotores funcionales de la divulgación también pueden incluir una parte funcional de cualquiera de SEQ ID NO: 1-9, a condición de que la parte funcional también incluya una función de promotor inducible por deficiencia de agua.

[0025] Un “polipéptido” es una secuencia de aminoácidos que comprende una pluralidad de residuos de aminoácidos polimerizados consecutivos, por ejemplo, al menos aproximadamente 15 residuos de aminoácidos polimerizados consecutivos. En muchos de los casos mencionados en la presente solicitud, un polipéptido comprende una secuencia de residuos de aminoácidos polimerizados que es un factor de transcripción o un dominio

o porción o fragmento del mismo. Adicionalmente, el polipéptido puede comprender: (i) un dominio de localización;

(ii)

un dominio de activación; (iii) un dominio de represión; (iv) un dominio de oligomerización; (v) un dominio de unión a ADN; o similares. El polipéptido comprende opcionalmente residuos de aminoácidos modificados, residuos de aminoácidos que se producen naturalmente no codificados por un codón, residuos de aminoácidos que se producen no naturalmente.

[0026] “Proteína” se refiere a una secuencia de aminoácidos, oligopéptido, péptido, polipéptido o porciones de los mismos, tanto si se producen naturalmente como si son sintéticos.

[0027] Un “polipéptido recombinante” es un polipéptido producido por traducción de un polinucleótido recombinante. Un “polipéptido sintético” es un polipéptido creado por polimerización consecutiva de residuos de aminoácidos aislados usando procedimientos muy conocidos en la técnica. Un “polipéptido aislado,” tanto si es un polipéptido que se produce naturalmente como si es recombinante, está más enriquecido en (o de) una célula que el polipéptido en su estado natural en una célula natural, por ejemplo, enriquecido más de aproximadamente el 5%, enriquecido más de aproximadamente el 10%, o enriquecido más de aproximadamente el 20%, o más de aproximadamente el 50%, o más, es decir, alternativamente se denota: enriquecido el 105%, 110%, 120%, 150% o más, con respecto al natural normalizado al 100%. Un enriquecimiento tal no es el resultado de una respuesta natural de una planta natural. Alternativamente, o adicionalmente, el polipéptido aislado se separa de otros componentes celulares con los que normalmente está asociado, por ejemplo, por cualquiera de los diversos procedimientos de purificación de proteínas en el presente documento.

[0028] “Homología” se refiere a la similitud de secuencias entre una secuencia de referencia y al menos un fragmento de un inserto de clon recientemente secuenciado o su secuencia de aminoácidos codificada.

[0029] “Identidad” o “similitud” se refiere a la similitud de secuencias entre dos secuencias de polinucleótidos o entre dos secuencias de polipéptidos, siendo la identidad una comparación más estricta. Los términos “porcentaje de identidad” y “% de identidad” se refieren al porcentaje de similitud de secuencias encontrado en una comparación de dos o más secuencias de polinucleótidos o dos o más secuencias de polipéptidos. “Similitud de secuencias” se refiere al porcentaje de similitud en la secuencia de pares de bases (como se determina por cualquier procedimiento adecuado) entre dos o más secuencias de polinucleótidos. Dos o más secuencias pueden ser similares en cualquier parte del 0-100%, o cualquier valor entero entre ellos. La identidad o similitud puede determinarse comparando una posición en cada secuencia que puede alinearse para los fines de comparación. Cuando una posición en la secuencia comparada está ocupada por la misma base de nucleótido o aminoácido, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. Un grado de similitud o identidad entre secuencias de polinucleótidos es una función del número de nucleótidos idénticos, coincidentes o correspondientes en las posiciones compartidas por las secuencias de polinucleótidos. Un grado de identidad de secuencias de polipéptidos es una función del número de aminoácidos idénticos en posiciones correspondientes compartidas por las secuencias de polipéptidos. Un grado de homología o similitud de secuencias de polipéptidos es una función del número de aminoácidos en posiciones correspondientes compartidas por las secuencias de polipéptidos.

[0030] “Complementario” se refiere al enlace de hidrógeno natural por apareamiento de bases entre purinas y pirimidinas. Por ejemplo, la secuencia A-C-G-T (5' -> 3') forma enlaces de hidrógeno con sus complementos A-C-G-T (5' -> 3') o A-C-G-U (5' -> 3'). Dos moléculas monocatenarias pueden considerarse parcialmente complementarias, si sólo algunos de los nucleótidos se unen, o “completamente complementarias” si se unen todos los nucleótidos. El grado de complementariedad entre cadenas de ácidos nucleicos afecta la eficiencia y fuerza de las reacciones de hibridación y amplificación. “Completamente complementario” se refiere al caso en el que el enlace se produce entre cada par de bases y su complemento en un par de secuencias, y las dos secuencias tienen el mismo número de nucleótidos.

[0031] Los términos “parálogo” y “ortólogo” se definen más adelante en la sección titulada “Ortólogos y parálogos”. En resumen, los ortólogos y parálogos son genes evolutivamente relacionados que tienen secuencias y funciones similares. Los ortólogos son genes estructuralmente relacionados en diferentes especies que se derivan por un evento de especiación. Los parálogos son genes estructuralmente relacionados dentro de una única especie que se derivan por un evento de duplicación.

[0032] El término “equiválogo” describe miembros de un conjunto de proteínas homólogas que están conservadas con respecto a la función desde su último ancestro común. Proteínas relacionadas se agrupan en familias de equiválogos, y de otro modo en familias de proteínas con otros tipos de homología jerárquicamente definida. Esta definición se proporciona en el sitio de la malla mundial (www) del Instituto de Investigación genómica (TIGR), “ tigr.org” bajo el encabezamiento “Términos asociados a TIGRFAMs”.

[0033] En general, el término “variante” se refiere a moléculas con algunas diferencias, generadas sintéticamente o naturalmente, en sus secuencias de bases o de aminoácidos con respecto a un polinucleótido o polipéptido de referencia (nativo), respectivamente. Estas diferencias incluyen sustituciones, inserciones, deleciones

o cualquier combinación deseada de tales cambios en un polinucleótido nativo de secuencia de aminoácidos.

[0034] Con respecto a variantes de polinucleótidos, las diferencias entre polinucleótidos presentemente desvelados y variantes de polinucleótidos están limitadas de manera que las secuencias de nucleótidos de los primeros y las segundas son estrechamente similares en conjunto y, en muchas regiones, idénticas. Debido a la degeneración del código genético, las diferencias entre la primera y segunda secuencias de nucleótidos pueden ser silenciosas (es decir, los aminoácidos codificados por el polinucleótido son los mismos, y la secuencia de polinucleótidos de variante codifica la misma secuencia de aminoácidos que el polinucleótido presentemente desvelado). Las secuencias de nucleótidos de variante puede codificar diferentes secuencias de aminoácidos, en cuyo caso tales diferencias de nucleótidos producirán sustituciones, adiciones, deleciones, inserciones, truncaciones

o fusiones de aminoácidos con respecto a las secuencias de polinucleótidos desveladas similares. Estas variaciones pueden producir variantes de polinucleótidos que codifican polipéptidos que comparten al menos una característica funcional. La degeneración del código genético también dicta que muchos polinucleótidos de variante diferentes pueden codificar polipéptidos idénticos y/o sustancialmente similares, además de aquellas secuencias ilustradas en el Listado de secuencias.

[0035] También está dentro del alcance de la divulgación una variante de un promotor de gen enumerado en el Listado de secuencias, es decir, una que tiene una secuencia que se diferencia de una de las secuencias de polinucleótidos en el Listado de secuencias, o una secuencia complementaria.

[0036] El término “planta” incluye plantas completas, órganos/estructuras vegetativas de brotes (por ejemplo, hojas, tallos y tubérculos), raíces, flores y órganos/estructuras florales (por ejemplo, brácteas, sépalos, pétalos, estambres, carpelos, anteras y óculos), semilla (incluyendo embrión, endosperma y cubierta de la semilla) y fruto (el ovario maduro), tejido de planta (por ejemplo, tejido vascular, tejido fundamental y similares) y células (por ejemplo, estomas, óvulos y similares), y progenie de la misma. La clase de plantas que puede usarse en el procedimiento de la invención es generalmente tan amplia como la clase de plantas superiores e inferiores aceptadas para técnicas de transformación, que incluye angiospermas (plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas), gimnospermas, helechos, colas de caballo, psilofitas, licofitas, briofitas y algas multicelulares (véase, por ejemplo, la Figura 1, adaptada de Daly y col. (2001) arriba, la Figura 2, adaptada de Ku y col. (2000) arriba; y véase también Tudge (2000) en The Variety of Life, Oxford University Press, Nueva York, NY, pág. 547-606.

[0037] Una “planta de control” como se usa en la presente invención se refiere a una célula de planta, semilla, componente de planta, tejido de planta, órgano de planta o planta completa usada para comparar con planta transgénica o genéticamente modificada con el fin de identificar un fenotipo potenciado en la planta transgénica o genéticamente modificada. Una planta de control puede ser en algunos casos una línea de planta transgénica que comprende un vector vacío o gen marcador, pero no contiene el polinucleótido recombinante de la presente invención que se expresa en la planta transgénica o genéticamente modificada que se evalúa. En general, una planta de control es una planta de la misma línea o variedad que la planta transgénica o genéticamente modificada que se prueba. Una planta de control adecuada incluiría una planta genéticamente no alterada o no transgénica de la línea parental usada para generar una planta transgénica en el presente documento.

[0038] Una “planta transgénica” se refiere a una planta que contiene material genético no encontrado en una planta natural de la misma especie, variedad o cultivar. El material genético puede incluir un transgén, un evento de mutagénesis insercional (tal como por transposón o mutagénesis insercional de T-ADN), una secuencia de marcado de activación, una secuencia mutada, un evento de recombinación homólogo o una secuencia modificada por quimeroplastia. Normalmente, el material genético extraño se ha introducido en la planta por manipulación humana, pero cualquier procedimiento puede usarse según reconoce un experto en la materia.

[0039] Una planta transgénica puede contener un vector de expresión o casete. El casete de expresión normalmente comprende una secuencia codificante de polipéptidos operativamente ligada (es decir, bajo el control regulador de) a una secuencia reguladora inducible, tal como un promotor de la invención, que permite la expresión controlada del polipéptido. El casete de expresión puede introducirse en una planta por transformación o por cultivo después de la transformación de una planta parental. Una planta se refiere a una planta completa, además de a una parte de planta, tal como semilla, fruto, hoja o raíz, tejido de planta, células vegetales o cualquier otro material de planta, por ejemplo, un explante de planta, además de a la progenie de la misma, y a sistemas in vitro que imitan componentes bioquímicos o celulares o procesos en una célula.

[0040] “Natural”, como se usa en el presente documento, se refiere a una célula de planta, semilla, componente de planta, tejido de planta, órgano de planta o planta completa que no ha sido genéticamente modificado o tratado en un sentido experimental. Células naturales, semilla, componentes, tejido, órganos o plantas completas pueden usarse como controles para comparar niveles de expresión y el grado y naturaleza de la modificación del rasgo con células, tejido o plantas de la misma especie en la que se altera la expresión de un polipéptido, tal como un polipéptido de factor de transcripción, por ejemplo, en el que se ha expresado en exceso o se ha expresado ectópicamente.

[0041] Un “rasgo” se refiere a una característica fisiológica, morfológica, bioquímica o física de una planta o material o célula de planta particular. En algunos casos, esta característica es visible para el ojo humano, tal como tamaño de la semilla o planta, o puede medirse por técnicas bioquímicas tales como detectando la proteína, almidón

o contenido de aceite de semilla u hojas, o por observación de un proceso metabólico o fisiológico, por ejemplo, midiendo la tolerancia a una forma de deficiencia de agua tal como sequía, o concentraciones de sal o azúcar particulares, o por la observación del nivel de expresión de un gen o genes, por ejemplo, empleando análisis Northern, RT-PCR, ensayos de expresión génica de micromatrices, o sistemas de expresión de genes indicadores, o por observaciones agrícolas tales como grado de marchitamiento, turgencia, tolerancia a estrés hiperosmótico o rendimiento. Sin embargo, puede usarse cualquier técnica para medir la cantidad de, nivel comparativo de o diferencia en cualquier compuesto químico seleccionado o macromolécula en las plantas transgénicas.

[0042] “Modificación del rasgo” se refiere a una diferencia detectable en una característica en una planta que expresa ectópicamente un polinucleótido o polipéptido de la presente invención con respecto a una planta que no lo hace, tal como una planta natural. En algunos casos, la modificación del rasgo puede evaluarse cuantitativamente. Por ejemplo, la modificación del rasgo puede implicar al menos aproximadamente un aumento o disminución del 2%,

o una diferencia incluso mayor, en un rasgo observado en comparación con una planta de control o natural. Se sabe que puede haber una variación natural en el rasgo modificado. Por tanto, la modificación del rasgo observada implica un cambio de la distribución y magnitud normal del rasgo en las plantas con respecto a plantas de control o naturales.

[0043] Si dos o más plantas son “morfológicamente similares”, tienen formas o aspectos comparables, que incluyen características análogas tales como dimensión, altura, anchura, masa, masa de raíces, forma, brillo, color, diámetro del tallo, tamaño de las hojas, dimensión de las hojas, densidad de hojas, distancia internodal, ramificación, ramificación de raíces, número y forma de inflorescencias, y otras características macroscópicas en un estadio particular de crecimiento. Si las plantas son morfológicamente similares en todos los estadios de crecimiento, también son “similares en el desarrollo”. Puede ser difícil distinguir dos plantas que sean genotípicamente distantes, pero morfológicamente similares, basándose sólo en características morfológicas.

[0044] El término “perfil del transcrito” se refiere a los niveles de expresión de un conjunto de genes en una célula en un estado particular, particularmente en comparación con los niveles de expresión de ese mismo conjunto de genes en una célula del mismo tipo en un estado de referencia. Por ejemplo, el perfil del transcrito de una proteína de factor de transcripción particular en una célula en suspensión es los niveles de expresión de un conjunto de genes en una célula que inactiva o que expresa en exceso esa proteína de factor de transcripción en comparación con los niveles de expresión de ese mismo conjunto de genes en una célula en suspensión que tiene niveles normales de esa proteína de factor de transcripción. El perfil del transcrito puede presentarse como una lista de aquellos genes cuyo nivel de expresión es significativamente diferente entre los dos tratamientos, y las relaciones de diferencia. Las diferencias y similitudes entre niveles de expresión también pueden evaluarse y calcularse usando procedimientos estadísticos y de agrupación.

[0045] “Expresión ectópica o expresión alterada” en referencia a un polinucleótido indica que el patrón de expresión en, por ejemplo, una planta transgénica o tejido de planta, es diferente del patrón de expresión en una planta natural o una planta de referencia de la misma especie. El patrón de expresión también puede compararse con un patrón de referencia de la expresión en una planta natural de la misma especie. Por ejemplo, el polinucleótido o polipéptido se expresa en un tipo de célula o tejido distinto de un tipo de célula o tejido en el que la secuencia se expresa en la planta natural, o por expresión en un momento distinto del momento en el que la secuencia se expresa en la planta natural, o por una respuesta a diferentes agentes inducibles tales como hormonas

o señales medioambientales, o a diferentes niveles de expresión (tanto superiores como inferiores) en comparación con aquellos encontrados en una planta natural. El término también se refiere a patrones de expresión alterados que se producen reduciendo los niveles de expresión a por debajo del nivel de detección o aboliendo completamente la expresión. El patrón de expresión resultante puede ser transitorio o estable, constitutivo o inducible. En referencia a un polipéptido, el término “expresión ectópica o expresión alterada” puede referirse adicionalmente a niveles de actividad alterados resultantes de las interacciones de los polipéptidos con moduladores exógenos o endógenos o de interacciones con factores o como resultado de la modificación química de los polipéptidos.

[0046] El término “expresión en exceso” como se usa en el presente documento se refiere a un mayor nivel de expresión de un gen en una planta, célula de planta o tejido de planta, en comparación con la expresión en una planta natural, célula o tejido, en cualquier estadio de desarrollo o temporal para el gen. La expresión en exceso puede producirse cuando, por ejemplo, los genes que codifican una o más proteínas de factor de transcripción están bajo el control de un promotor fuerte (por ejemplo, la región de iniciación de la transcripción de 35S del virus del mosaico de la coliflor). La expresión en exceso también puede estar bajo el control de un promotor inducible tal como un promotor inducible por deficiencia de agua. Por tanto, la expresión en exceso puede producirse a lo largo de una planta o en presencia de señales medioambientales particulares, dependiendo del promotor usado.

[0047] La expresión en exceso puede tener lugar en células vegetales que normalmente carecen de expresión de polipéptidos funcionalmente equivalente o idéntica a un polipéptido que puede conferir elevada tolerancia a la deficiencia de agua. La expresión en exceso también puede producirse en células vegetales en las que normalmente se produce la expresión endógena de las presentes proteínas que confieren tolerancia a la deficiencia de agua potenciada, o moléculas funcionalmente equivalentes, pero tal expresión normal es a un nivel inferior. Por tanto, la expresión en exceso produce una producción superior a la normal, o “producción en exceso” de la proteína que confiere tolerancia a la deficiencia de agua mejorada en la planta, célula o tejido.

[0048] El término “región reguladora de la transcripción” se refiere a una secuencia reguladora de ADN que regula la expresión de uno o más genes en una planta cuando un factor de transcripción que tiene uno o más dominios de unión específica se une a la secuencia reguladora de ADN. Los factores de transcripción poseen un dominio conservado. Los factores de transcripción también comprenden una subsecuencia de aminoácidos que forma un dominio de activación de la transcripción que regula la expresión de uno o más genes de resistencia a estreses bióticos en una planta cuando el factor de transcripción se une a la región reguladora.

DESCRIPCIÓN DE LAS REALIZACIONES ESPECÍFICAS

[0049] Varios polipéptidos producidos por plantas participan en numerosas rutas que pueden conferir tolerancia potenciada a privación de agua. Los presentes inventores han mostrado que la expresión en exceso de factores de transcripción puede conducir a tolerancia a la deficiencia de agua potenciada en plantas de Arabidopsis. Sin embargo, la expresión en exceso de estos factores de transcripción puede tener su precio; la planta que se expresa en exceso puede ser pequeña, puede tener elevada susceptibilidad a enfermedades, o puede tener otros efectos del desarrollo no deseables tales como desarrollo retrasado, bajo rendimiento o fertilidad. Esto plantea una cuestión obvia: ¿puede controlarse la regulación de las rutas de factores de transcripción de un modo que confiera tolerancia a la deficiencia de agua y todavía evite gran parte o toda la penalización del crecimiento y desarrollo? La expresión en exceso y la tolerancia a la deficiencia de agua asociada sin efectos morfológicos adversos significativos haría que estos factores de transcripción estuvieran disponibles como herramientas comerciales eficaces para potenciar la tolerancia a la deficiencia de agua. Uno de tales medios es el uso de promotores inducibles por sequía que pueden conferir tolerancia a la deficiencia de agua a la vez que mitigan los efectos no deseables de la expresión en exceso constitutiva de factores de transcripción responsables de esa tolerancia.

[0050] El desarrollo de tolerancia a la deficiencia de agua eficaz en estas plantas es probable que requiera un promotor(es) que responda(n) rápidamente a la baja disponibilidad de agua, además de expresión sostenida durante todo el periodo de baja disponibilidad de agua para maximizar la eficacia. Por tanto, la estrategia de selección para identificar promotores inducibles por sequía comercialmente valiosos consideró los siguientes criterios. Los promotores de interés serían

•

expresados a un bajo nivel basal, es decir, en ausencia de deficiencia de agua;

•

fuertemente inducidos y a un nivel de induccion sostenido temprano en el transcurso de la disponibilidad de agua reducida; y

•

especificos para la respuesta a deficiencia de agua (la capacidad para ser inducidos por otros factores medioambientales aumenta la frecuencia de expresión y la probabilidad de que la planta tuviera tamaño o rendimiento reducido).

[0051] El perfilado de transcritos (TxP) es una potente herramienta para el descubrimiento de promotores, proporcionando una visión global de la expresión génica, regulación y niveles de inducción en la respuesta de la planta a deficiencia de agua. Como se explica resumidamente más adelante, promotores inducibles por deficiencia de agua se han identificado en micromatrices por perfilado de transcritos de plantas expuestas a exposiciones relacionadas con deficiencia de agua. Si una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido (por ejemplo, un factor de transcripción) conocido por conferir tolerancia a la deficiencia de agua, pero que también produce consecuencias morfológicas adversas significativas, se expresó en exceso, y la expresión del polinucleótido estuvo bajo el control regulador de promotores inducibles por deficiencia de agua, el resultado fue frecuentemente la producción de plantas con tolerancia a la deficiencia de agua de altura y desarrollo normal (es decir, natural) o próximo a normal.

[0052] Promotores que muestran inducción temprana en un estrés relacionado con deficiencia de agua y poca

o ninguna expresión de la referencia podrían usarse para accionar la expresión de factores de transcripción para proporcionar tolerancia a la deficiencia de agua potenciada con poca pérdida de rendimiento (“arrastre”). Es menos probable que promotores de genes que se inducen relativamente tarde en responder a deficiencia de agua sean eficaces, ya que reflejan una inducción tardía de factores de respuesta. Por tanto, los presentes inventores se concentraron en los momentos de tiempo tempranos y los eventos tempranos tras el reconocimiento de proteínas de respuesta a estrés derivado de deficiencia de agua.

[0053] Los promotores descritos en el presente documento se proporcionan como SEQ ID NO: 1-9, y ejemplos de vectores de expresión que han sido o pueden construirse usando estos promotores que pueden conferir tolerancia a la deficiencia de agua mejorada incluyen SEQ ID NO: 10-54. En el presente documento también se describe un promotor inducible por deficiencia de agua que comprende una parte funcional de cualquiera de SEQ ID NO: 1-9, a condición de que la parte funcional del promotor también incluya una función de promotor inducible por deficiencia de agua. La parte funcional del promotor puede tener aproximadamente 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 447, 450, 460, 500, 550, 600, 605, 650, 700, 750, 766, 776, 780, 800, 850, 900, 907, 928 ó 936 nucleótidos contiguos de las secuencias de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 1-9, además de todas las longitudes de nucleótidos contiguos dentro de tales tamaños, a condición de que la parte funcional del promotor incluya una función de promotor inducible por deficiencia de agua.

[0054] Pueden prepararse promotores que son similares a aquellos enumerados en el Listado de secuencias que tienen algunas alteraciones en la secuencia de nucleótidos y todavía retienen la función de las secuencias enumeradas. Al nivel de nucleótidos, las secuencias promotoras de la divulgación normalmente compartirán al menos aproximadamente el 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%. 97%, 98%, 99% o el 100% de identidad de secuencias de nucleótidos con cualquiera de SEQ ID NO: 1-9, o con construcciones SEQ ID NO: 10-54.

[0055] El porcentaje de identidad puede determinarse electrónicamente, por ejemplo, usando el programa MEGALIGN (DNASTAR, Inc. Madison, Wis.). El programa MEGALIGN puede crear alineamientos entre dos o más secuencias según diferentes procedimientos, por ejemplo, el procedimiento clustal (véase, por ejemplo, Higgins y Sharp (1988)). El algoritmo clustal agrupa secuencias en agrupaciones examinando las distancias entre todos los pares. Las agrupaciones son alineadas por pares y luego en grupos. Pueden usarse otros algoritmos o programas de alineamiento, que incluyen FASTA, BLAST, o ENTREZ, FASTA y BLAST, y que pueden usarse para calcularporcentaje de similitud. Éstos están disponibles como parte del paquete de análisis de secuencias GCG (Universidad de Wisconsin, Madison, WI), y pueden usarse con o sin parámetros por defecto. ENTREZ está disponible del Centro nacional para información biotecnológica. En una realización, el porcentaje de identidad de dos secuencias puede determinarse por el programa GCG con un peso por hueco de 1 (véase el documento USPN 6.262.333).

[0056] El software para realizar análisis de BLAST está públicamente disponible, por ejemplo, del Centro nacional para información biotecnológica (véase la página web de internet http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica identificar primero pares de secuencias de alta puntuación (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de búsqueda, que tanto coinciden como satisfacen alguna puntuación de valor umbral positivo T cuando se alinea con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T se denomina el umbral de puntuación de palabras en la vecindad (Altschul (1990); Altschul y col. (1993)). Estas palabras comunes en la vecindad iniciales actúan de semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSP más largos que las contengan. Entonces, las palabras comunes se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia para que, en la medida de lo posible, pueda puntuarse el alineamiento acumulativo. Las puntuaciones acumuladas se calculan usando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de residuos coincidentes; siempre > 0) y N (puntuación de penalización para residuos no coincidentes; siempre < 0). Para secuencias de aminoácidos se usa una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulada. La extensión de las palabras comunes en cada dirección se detiene cuando: la puntuación de alineamiento acumulada se sale por la cantidad X de su máximo valor alcanzado; la puntuación acumulada tiende a cero o por debajo debido a la acumulación de uno o más alineamientos de residuos de puntuación negativos; o se alcanza el extremo de cualquier secuencia. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y velocidad de un alineamiento. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa como valores por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una esperanza (E) de 10, un corte de 100, M=5, N=-4 y una comparación de ambas cadenas. Para secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa como valores por defecto una longitud de palabra (W) de 3, una esperanza (E) de 10, y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff & Henikoff (1989)). A menos que se indique lo contrario para comparaciones de polinucleótidos predichos, “identidad de secuencias” se refiere al % de identidad de secuencias generadas a partir de tblastx usando la versión de NCBI del algoritmo con los parámetros por defecto usando alineamientos con huecos con el filtro “apagado” (véase, por ejemplo, la página web de internet http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

EJEMPLOS

Ejemplo I. Experimentos del transcurso de tiempo en micromatrices y criterios de selección

[0057] Promotores inducibles por sequía candidatos se seleccionaron principalmente basándose en un experimento TxP del transcurso de tiempo de la sequía realizado. En este experimento, macetas de arcilla de plantas de Arabidopsis en el estadio de roseta tardía bien regadas cultivadas bajo condiciones de días cortos se transfirieron a papel absorbente, y se detuvo el riego adicional durante el posterior periodo de sequía. Los datos se generaron para cinco estadios de sequía fisiológicamente determinados: estrés leve, estrés moderado, estrés grave y dos estadios después de volver a regar. El estado de estrés de cada planta se determinó midiendo indicadores fisiológicos de sequía, que incluyen contenido de agua relativo, asimilación de carbono fotosintético, además de niveles de ABA y prolina. Diariamente se recogieron muestras de tejido de hoja durante un periodo de sequía de dos semanas, y la muestra de plantas que tenían fisiología similar para cada estado pre-definido se reunieron para análisis de micromatrices. Los controles bien regados también se muestrearon cada día. Para cada uno de los cinco estados fisiológicos analizados, un duplicado de micromatrices consistió en tejido de hoja reunido de seis plantas (18 hojas). Se analizaron dos duplicados de cada estadio de sequía sobre micromatrices, y se promediaron los datos resultantes. Se generaron relaciones de expresión comparando cada muestra del estadio de sequía con un control bien regado apropiado (de la misma edad).

[0058] Se seleccionaron candidatos a promotores basándose en los siguientes criterios: 1) fuerte expresión durante estadios al menos moderados y graves de deficiencia de agua, y una vuelta a niveles iniciales bien regados en el plazo de 24 h desde que se volvieron a regar, 2) bajo nivel de expresión basal en la mayoría de los tejidos de Arabidopsis no estresados, y 3) inducibilidad de sequía similar para genes de soja ortólogos, si estos datos estuvieron disponibles.

Ejemplo 11. Inducción de sequía de genes promotores candidatos nativos

[0059] Inicialmente se identificaron candidatos a promotores inducibles por sequía basándose en un experimento del perfil de transcripción de sequía inicial natural (TxP). En la evaluación de la eficacia de combinaciones de factores de transcripción inducibles por sequía fue esencial garantizar que la sequía impuesta a las plantas durante el tratamiento de deficiencia de agua (los presentes inventores usaron un ensayo de sequía basado en tierra en macetas de arcilla,) fue suficiente para accionar expresión génica inducible mediante los promotores en un modo similar al que se observa en el experimento de sequía TxP original. Los nueve genes endógenos en la Figura 3 mostraron fuerte inducción tras el tratamiento de sequía. Estos resultados confirmaron que el ensayo de sequía basado en tierra en macetas de arcilla fue suficiente para la inducción basada en deficiencia de agua de genes candidatos a promotor. La mayoría de estos genes se expresan a niveles indetectables o extremadamente bajos en plantas no estresadas. Sin embargo, en la mayoría de los casos, hay expresión considerablemente alta en semillas en maduración, debido al procedimiento de secado similar a sequía inherente durante este estadio de desarrollo. Adicionalmente, varios de los genes mostraron una respuesta a ABA tratamiento osmótico o con frío. Sólo un gen (AT3G46230) mostró una respuesta a tratamiento térmico. Este gen codifica una proteína de choque térmico de 17,4 kDa, de manera que no es sorprendente que, además de inducción de sequía, este gen también muestre regulación de la temperatura.

[0060] Se examinaron plantas de control de vector vacío pMen65 estresadas por sequía y bien regadas para la inducción de los genes promotores candidatos en el eje x de la Figura 3. Las plantas se estresaron por sequía hasta el punto de marchitamiento y se realizó RT-PCR usando cebadores específicos para gen para cada uno de los genes indicados en el eje x de la Figura 3. Los recuentos umbral de ciclos se normalizaron con ARN 18S.

Ejemplo III. Preparación de plantas transgénicas

[0061] Clonación del promotor. Para genes que muestran patrones de regulación apropiados, aproximadamente 1,2 kb de secuencia en la dirección 5' se clonó por PCR (a menos que esta región contuviera otro gen, en cuyo caso la secuencia en la dirección 5' se clonó hasta el siguiente gen). Cada promotor se clonó en un vector de expresión (vectores usados en este estudio pueden incluir SEQ ID NO: 10-54, y SEQ ID NO: 10-27, 33-36, 43-45 y 51-54 han sido probados en plantas) delante de tanto proteína verde fluorescente (GFP) como un polinucleótido que codifica un factor de transcripción, tal como SEQ ID NO: 55, 57, 59, 61 ó 59, que se ha mostrado que proporciona elevada tolerancia a la deficiencia de agua. En algunos de estos casos, los factores de transcripción también producen efectos morfológicos perjudiciales en las plantas cuando son constitutivamente expresados en exceso.

[0062] Transformación. La transformación de Arabidopsis se realizó por un protocolo mediado por Agrobacterium basado en el procedimiento de Bechtold y Pelletier (1998) Methods Mol. Biol. 82: 259-266. A menos que se especifique de otro modo, todo el trabajo experimental se realizó usando el ecotipo Columbia.

[0063] Preparación de plantas. Se sembraron semillas de Arabidopsis en macetas cubiertas con malla. Las plantas de semillero se aclararon de forma que quedaran 6-10 plantas uniformemente separadas en cada maceta 10 días después de plantarse. Las flores primarias se cortaron una semana antes de la transformación para romper la dominancia apical y fomentar que se formaran brotes auxiliares. La transformación se realizó normalmente 4-5 semanas después de la siembra.

[0064] Preparación de cultivos bacterianos. Las disoluciones madre de Agrobacterium se inocularon de placas de una única colonia o de disoluciones madre de glicerol y se cultivaron con los antibióticos apropiados y se cultivaron hasta saturación. En la mañana de la transformación, los cultivos saturados se centrifugaron y los sedimentos bacterianos se resuspendieron en medio de infiltración (0,5X MS, 1X vitaminas B5, 5% de sacarosa, 1 mg/ml de ribósido bencilaminopurina, 200 μl/l de Silwet L77) hasta que se alcanzó una lectura de A600 de 0,8.

[0065] Transformación y recolección de semillas. La disolución de Agrobacterium se vertió en recipientes de inmersión. Todos los capullos de flores y hojas de la roseta de las plantas se sumergieron en esta disolución durante 30 segundos. Las plantas se tumbaron sobre su lado y se envolvieron para mantener la humedad alta. Las plantas se mantuvieron de esta forma durante la noche a 4ºC y luego las macetas se colocaron verticalmente y se trasladaron a repisas de crecimiento.

[0066] Las plantas se mantuvieron en la repisa de crecimiento bajo 24 horas de luz hasta que las semillas estuvieron listas para ser recogidas. Las semillas se recogieron cuando el 80% de las silicuas de las plantas transformadas estuvieron maduras (aproximadamente 5 semanas después de la transformación inicial). Esta semilla se consideró semilla T0, ya que se obtuvo de la generación T0, y después se sembró en placas de selección (tanto kanamicina como sulfonamida). Plantas resistentes que se identificaron sobre tales placas de selección comprenden la generación T1.

[0067] Para polinucleótidos que codifican factores de transcripción usados en estos experimentos (SEQ ID NO: 55, 57, 59, 61 ó 63, que codifica SEQ ID NO: 56, 58, 60, 62 ó 64, respectivamente), puede realizarse RT-PCR para confirmar la capacidad de fragmentos de promotor clonados para accionar la expresión del transgén del factor de transcripción en plantas transformadas con los vectores.

[0068] Plantas T1 plantas transformadas con combinaciones de promotor-FT enumeradas en el Listado de secuencias (aquellas designadas con una designación de construcción (SEQ ID NO: 10-27, 33-36, 43-45 y 51-54), se sometieron a análisis morfológico. Los promotores que produjeron una mejora sustancial de los efectos negativos de la expresión en exceso de FT se sometieron a análisis adicionales por propagación en la generación T2, en los que las plantas se analizaron para tolerancia a la deficiencia de agua.

Ejemplo IV. Patrones de expresión de fusión de GFP

[0069] Aunque se mostró que la mayoría de los fragmentos de promotor clonados tenían las secuencias necesarias para accionar la expresión inducible por sequía de ARN, era desconocido si los elementos requeridos para la eficiente traducción de proteínas durante el estrés también se incluyeron en estas construcciones. Para evaluar esto se usaron fusiones de promotor-GFP para medir visualmente la acumulación de proteína GFP durante y después del tratamiento de deficiencia de agua. Se examinaron los nueve promotores, y se encontró que tres promotores en particular, prAT1G52690 (de una proteína LEA), prAT5G52300 (de RD29B) y prAT5G43840 (de FT G1947 de choque térmico), accionaban altos niveles de proteína detectable durante estrés por deficiencia de agua.

[0070] El promotor de prAT1G52690 (SEQ ID NO: 4) fue fidedigna y fuertemente inducido tras la sequía en múltiples eventos. El nivel de expresión, como se mide por fluorescencia de GFP, fue más fuerte que el de tanto el promotor 35S del mosaico de la coliflor (CaMV) constitutivamente expresado como el promotor inducible por estrés RD29A. Tras volver a regar hubo una ligera disminución en el nivel de expresión con el tiempo, pero los niveles todavía estuvieron muy por encima de la expresión de referencia. En términos de expresión específica para tejido, además de hojas, se encontró que este promotor accionaba la expresión en flores, especialmente estomas florales.

[0071] El promotor prAT5G52300 de AT5G52300 (RD29B; SEQ ID NO: 2) produjo alguna penetrancia variable, pero pudieron obtenerse líneas que produjeron expresión tras la inducción relativamente más fuerte que tanto promotores 35S constitutivos como de referencia RD29A inducibles por estrés. Esto indica que el promotor de prAT5G52300 puede estar fácilmente influido por el punto de inserción en el genoma. La expresión de este promotor fue persistente después de volver a regar y, excepto la expresión en hojas, no se observó expresión específica para tejido.

[0072] El promotor prAT5G43840 de AT5G43840 (FT G1947 de choque térmico; SEQ ID NO: 6) también produjo líneas variablemente penetrantes en términos de inducibilidad por fuerte sequía pero, de nuevo, pudieron aislarse líneas fuertes. La expresión de este promotor se debilitó muy ligeramente después de volver a regar, y excepto para tejido de hoja, no se observó expresión específica para tejido.

Ejemplo V. Patrones de expresión de la fusión promotor-G481

[0073] Estos experimentos, realizados con la proteína G481 (SEQ ID NO: 56) ilustran los tipos de experimentos que pueden usarse para identificar promotores que inducen eficazmente la expresión de proteínas relacionadas con deficiencia de agua.

[0074] Además de caracterizar la capacidad de estos promotores para accionar la expresión de proteínas GFP, la acumulación inducible por sequía de la proteína G481 también se examinó en líneas transformadas con tres combinaciones de promotor-G481 diferentes, siendo los promotores prAT1G52690 (SEQ ID NO: 4), prAT5G52300 (SEQ ID NO: 2) y prAT2G37870 (SEQ ID NO: 5). Los dos primeros de estos promotores, prAT1G52690 y prAT5G52300, habían mostrado fuerte inducción de GFP cuando plantas de Arabidopsis se sometieron a tratamiento de sequía. La proteína de plantas bien regadas o tratadas con sequía se sometió a electroforesis en gel y los geles se sondaron luego con un anticuerpo para la proteína G481. La tinción con azul de Coomassie se usó para verificar carga de proteína equivalente. Se encontró que G481 se acumulaba a altos niveles tras tratamiento de deficiencia de agua cuando se expresaba bajo el control regulador de tanto prAT1G52690 como prAT5G52300, similar a lo que era de esperar de experimentos de GFP en los que se mostró que cualquiera de estos promotores inducía eficazmente la expresión de G481. El tercer promotor probado (G481 bajo el control regulador de prAT2G37870) no proporcionó expresión de proteínas G481 inducibles por sequía significativa. De nuevo, este resultado es similar al que se observó con experimentos de GFP.

Ejemplo VI. Ensayos de deficiencia de agua basados en tierra

[0075] Los ensayos de deficiencia de agua basados en tierra (también denominados “ensayos de sequía”) se realizaron en macetas de arcilla y se basaron en el procedimiento descrito por Haake y col. (2002) Plant Physiol.

130: 639-648.

[0076] Las semillas se esterilizaron mediante un tratamiento con etanol de 2 minutos, seguido de 20 minutos en 30% de blanqueante / 0,01% de Tween y cinco lavados en agua destilada. Las semillas se sembraron sobre agar MS en 0,1% de agarosa y se estratificaron durante 3 días a 4ºC, antes de transferirse a vitrinas de crecimiento con una temperatura de 22ºC. Después de 7 días de crecimiento sobre placas de selección, las plantas de semillero se trasplantaron a macetas de arcilla de 3,5 pulgadas (8,9 cm) de diámetro que contenían 80 g de una mezcla 50:50 de vermiculita:perlita cubierta con 80 g de ProMix. Normalmente, cada maceta contuvo 14 plantas de semillero, y las plantas de la línea transgénica que se prueba estuvieron en macetas separadas de los controles naturales. Las macetas que contenían las líneas transgénicas frente a las macetas de control se entremezclaron en la sala de crecimiento, mantenida bajo condiciones de 24 horas luz (18 - 23ºC, y 90 - 100 μE m-2s-1) y se regaron durante un periodo de 14 días. Entonces se aplazó el agua y las macetas se colocaron sobre papel absorbente durante un periodo de 8-10 días. Después de este periodo se asignó una “puntuación de sequía” cualitativa visual de 0-6 para registrar el grado de síntomas de estrés por sequía visible. Una puntuación de “6” se correspondió con síntomas no visibles, mientras que una puntuación de “0” se correspondió con marchitamiento extremo y que las hojas tenían una textura “crujiente”. Al final del periodo de sequía, las macetas volvieron a regarse y se puntuaron después de 5-6 días; se contó el número de plantas supervivientes en cada maceta y se calculó la proporción de plantas totales en la maceta que sobrevivieron.

[0077] Análisis de resultados. Normalmente se compararon 6 o más macetas de una línea transgénica con 6 o más macetas de las plantas de control apropiadas. La puntuación de sequía media y la proporción media de plantas que sobrevivieron (tasa de supervivencia) se calcularon para tanto la línea transgénica como las macetas naturales. En cada caso se calculó un valor de p que indicó la significancia de la diferencia entre los dos valores medios. Entonces, los resultados para cada línea transgénica a través de cada plantación para un proyecto particular se presentaron en una tabla de resultados.

[0078] Cálculo del valor de p. La supervivencia se analizó con una regresión logística para explicar el hecho de que la variable al azar fuera una proporción entre 0 y 1. El valor de p informado fue la significancia de la proporción experimental contrastada con el control, basado en la regresión de los datos transformados con logit.

[0079] La puntuación de sequía, que es un factor ordenado con significado numérico no real, se analizó con una prueba no paramétrica entre los grupos experimentales y de control. El valor de p se calculó con una prueba de Mann-Whitney para datos independientes. La significancia se indicó si la línea experimental rindió mejor o peor que los controles a p < 0,11.

Ejemplo VII. Tolerancia a la deficiencia de agua de plantas transgénicas transformadas con factores de transcripción bajo el control regulador de promotores inducibles por sequía

[0080] Generalmente, para los ensayos de deficiencia de agua descritos en este ejemplo, se probaron tres líneas de expresores en exceso, y los resultados se presentan si se determina que son estadísticamente significativos (p < 0,11). En un conjunto típico de experimentos, las líneas que fueron de aspecto natural se eligieron para ensayos de sequía de tierra, excepto como se observa más adelante.

G481 (SEQ ID NO: polinucleótido 55 y polipéptido 56)

[0081] G481 es una secuencia del factor de transcripción de la familia CAAT que se ha mostrado que confiere tolerancia a la sequía mejorada cuando se expresa constitutivamente. Sin embargo, características morfológicas o físicas desagradables pueden asociarse a expresión en exceso constitutiva de G481 (por ejemplo, florecimiento tardío). Se cree que un promotor inducible por sequía que regula la expresión de G481 puede proporcionar tolerancia a la sequía en plantas, además de una morfología y desarrollo normal.

[0082] Líneas para cada combinación de promotor-G481 generalmente aparecieron naturales, aunque algunas líneas mostraron cambios en el momento del florecimiento, que posiblemente indica expresión de referencia de bajo nivel de G481.

[0083] En general, muchas de las combinaciones de promotor inducible por sequía-G481 no rindieron mejor o peor que los controles en experimentos de deficiencia de agua. Sin embargo, se mostró que algunas líneas para cinco de las construcciones probadas (prAT5G15240, prG1947, prAT5G66780, prAT3G46230 y prAT2G37870) eran más tolerantes a la deficiencia de agua que los controles en al menos una de las dos fechas de plantación, como se observa más adelante.

[0084] Una línea de expresores en exceso de prAT5G15240::G481 se recuperó mejor del tratamiento de deficiencia de agua que los controles en una de las dos ejecuciones del ensayo. No fue evidente inducción obvia del transgén G481 en un experimento de RT-PCR.

[0085] Una línea de expresores en exceso de prG1947::G481 fue más tolerante al tratamiento de deficiencia de agua en una de las dos ejecuciones del ensayo. Se observó inducción de sequía del transgén G481 en el experimento de RT-PCR.

[0086] Una línea de expresores en exceso de prAT3G46230::G481 se recuperó mejor del tratamiento de deficiencia de agua que los controles en una de las dos ejecuciones del ensayo. Se observó inducción de sequía muy leve del transgén G481 en el experimento de RT-PCR.

[0087] Una línea de expresores en exceso de prAT5G66780::G481 fue estadísticamente más tolerante al tratamiento de deficiencia de agua en una de las dos ejecuciones y una plantación separada de esta línea se recuperó mejor del tratamiento de deficiencia de agua que los controles. Se observó inducción de sequía del transgén G481 en el experimento de RT-PCR

[0088] Dos líneas de expresores en exceso de prAT2G37870::G481 demostraron un rendimiento estadísticamente mejor en ensayos de sequía que los controles en fechas de plantación separadas. Para la primera línea, las plantas de una de las fechas de plantación fueron tanto más tolerantes a la deficiencia de agua que los controles como se recuperaron mejor que los controles. Para la segunda línea, las plantas en dos experimentos separados fueron más tolerantes a la deficiencia de agua que los controles y/o se recuperaron mejor del tratamiento que los controles. No se ha examinado inducción de sequía del transgén G481 por RT-PCR.

G1073 (SEQ ID NO: polinucleótido 57 y polipéptido 58)

[0089] G1073 es un miembro de los factores de transcripción de la familia AT-hook y se ha mostrado que confiere tolerancia a la sequía mejorada cuando se expresa constitutivamente. Sin embargo, características morfológicas o físicas desagradables tales como gran tamaño (que puede ser una desventaja bajo algunas circunstancias) puede asociarse a la expresión en exceso constitutiva de G1073. Se cree que un promotor inducible por sequía que regula la expresión de G1073 puede proporcionar tolerancia a la sequía en plantas, además de una morfología y desarrollo más normal.

[0090] Líneas T2 probadas en ensayos de sequía en macetas de arcilla para las diferentes combinaciones de promotor-G1073 generalmente aparecieron naturales. Sin embargo, en la generación T1 se observaron modestas alteraciones en el momento del florecimiento y el tamaño para algunas de las construcciones, que posiblemente indica expresión de referencia de bajo nivel de G1073.

[0091] En general, muchas de las combinaciones de promotor inducible por sequía-G1073 no rindieron mejor

o peor que los controles en experimentos de deficiencia de agua. Sin embargo, varias líneas individuales para cinco de las construcciones mostraron un mejor rendimiento que los controles en al menos una de las dos fechas de plantación (prAT5G15240, prAT5G66780, prG1947, prAT3G17520 y prAT5G52300).

[0092] Una línea de expresores en exceso de prAT5G15240::G1073 se recuperó mejor de un tratamiento de deficiencia de agua en una de las dos ejecuciones del ensayo. No se observó inducción del transgén G1073 en experimentos de RT-PCR.

[0093] Una línea de expresores en exceso de prAT5G66780::G1073 se recuperó mejor de un tratamiento de deficiencia de agua en una de las dos ejecuciones del ensayo. La inducción del transgén G1073 por el tratamiento de sequía se confirmó por RT-PCR.

[0094] Una línea de expresores en exceso de prG1947::G1073 rindió mejor que los controles en la tolerancia a la deficiencia de agua y en su recuperación del tratamiento en una de las dos ejecuciones del ensayo. La inducción del transgén G1073 por el tratamiento de sequía se confirmó por RT-PCR.

[0095] Una línea de expresores en exceso de prAT3G17520::G1073 se recuperó mejor de la deficiencia de agua que los controles en dos experimentos separados. Se ha confirmado la inducción del transgén G1073 por el tratamiento de sequía.

[0096] Una línea de expresores en exceso de prAT5G52300::G1073 se recuperó mejor de la deficiencia de agua que los controles en una de las dos ejecuciones del ensayo. Se ha confirmado la inducción del transgén G1073 por el tratamiento de sequía.

G1274 (SEQ ID NO: polinucleótido 59 y polipéptido 60)

[0097] G1274 es un miembro de la familia WRKY de factores de transcripción y se ha mostrado que confiere tolerancia a la sequía mejorada cuando se expresa constitutivamente. Sin embargo, características morfológicas o físicas desagradables tales como efectos sobre el tamaño (se han observado plantas tanto pequeñas como grandes, ambas de las cuales pueden ser desventajosas bajo algunas circunstancias) pueden asociarse a expresión en exceso constitutiva de G1274. Se cree que un promotor inducible por sequía que regula la expresión de G1274 puede proporcionar tolerancia a la sequía en plantas con morfología y desarrollo más normal.

[0098] En general, las líneas G1274 de promotor inducible por sequía no mostraron ninguna diferencia coherente de la morfología natural, con la excepción de alguna variación incoherente en el momento del florecimiento. Además de prAT5G15240, se confirmó que todos los otros promotores producían transcrito G1274 inducido por sequía, como se mide por RT-PCR.

[0099] En general, muchas de las líneas transformadas con G1274 bajo el control regulador de un promotor inducible por sequía no rindieron mejor o incluso peor que los controles en ensayos de sequía. Sin embargo, varias líneas individuales para tres de las cinco construcciones probadas, prAT5G66780, prAT3G17520 y prAT4G09600, mostraron un mejor rendimiento que los controles en experimentos de deficiencia de agua en una de las dos fechas de plantación, como se observa más adelante.

[0100] Una línea de expresores en exceso de prAT5G66780::G1274 se recuperó mejor del tratamiento de deficiencia de agua que los controles en una de las dos ejecuciones del ensayo. La inducción del transgén G1274 por el tratamiento de sequía se confirmó por RT-PCR.

[0101] En una de las dos ejecuciones de un ensayo de deficiencia de agua, una de las líneas prAT3G17520::G1274 de expresores en exceso se recuperó mejor de la deficiencia de agua que los controles. La inducción del transgén G1274 por el tratamiento de sequía se confirmó por RT-PCR.

[0102] Una línea de expresores en exceso de prAT4G09600::G1274 también se recuperó mejor del tratamiento de deficiencia de agua que los controles en una de las dos ejecuciones del ensayo. La inducción del transgén G1274 por el tratamiento de sequía se confirmó por RT-PCR.

G1792 (SEQ ID NO: polinucleótido 61 y polipéptido 62)

[0103] G1792 es un miembro de los factores de transcripción de la familia AP2 y se ha mostrado que confiere tolerancia a la sequía mejorada cuando se expresa constitutivamente. Sin embargo, características morfológicas o físicas desagradables tales como tamaño pequeño y fertilidad reducida pueden asociarse a expresión en exceso constitutiva de G1792. Se cree que un promotor inducible por sequía que regula la expresión de G1792 puede proporcionar tolerancia a la sequía en plantas con morfología y desarrollo más normal.

[0104] Las líneas para cada combinación de promotor-G1792 generalmente aparecieron naturales, aunque una minoría de las plantas T1 para cada promotor mostraron fenotipos verde oscuro y/o de florecimiento tardío, que indica expresión con pérdidas de G1792 en estas líneas.

[0105] Líneas para cinco promotores inducibles por sequía diferentes directamente fusionadas con G1792 se han sometido a dos ejecuciones del ensayo de sequía de la tierra en macetas de arcilla. Estas combinaciones de promotor inducible por sequía no produjeron resultados convincentes con G1792, y muchas líneas rindieron igual, o peor, que los controles en este ensayo de deficiencia de agua. Sin embargo, una línea para una de las cinco construcciones mostró un mejor rendimiento que los controles en una de las dos fechas de plantación, como se observa más adelante.

[0106] Una línea de expresores en exceso de prAT4G09600::G1792 se recuperó mejor del tratamiento de deficiencia de agua que los controles en una de las dos ejecuciones del ensayo. La inducción de sequía del transgén G1792 se observó en el experimento de RT-PCR.

G47 (SEQ ID NO: polinucleótido 63 y polipéptido 64)

[0107] G47 es un miembro de los factores de transcripción de la familia AP2 y se ha mostrado que confiere tolerancia a la sequía mejorada cuando se expresa constitutivamente. Sin embargo, características morfológicas o físicas desagradables tales como tamaño pequeño y fertilidad reducida pueden asociarse a expresión en exceso constitutiva de G47. Se cree que un promotor inducible por sequía que regula la expresión de G47 puede proporcionar tolerancia a la sequía en plantas con morfología y desarrollo más normal.

[0108] Dos de las combinaciones de promotor-G47 probadas, prAT5G66780, prG1947, produjeron plantas que se desarrollaron algo más tarde, indicando posiblemente una expresión con pérdidas de G47 en estas líneas.

[0109] Líneas para cinco promotores inducibles por sequía diferentes directamente fusionadas con G47 se probaron en dos ejecuciones del ensayo de sequía de la tierra en macetas de arcilla. Varias líneas individuales para cuatro de las cinco construcciones, que comprenden prAT5G15240, prAT3G17520, prAT4G09600 y prG1947, mostraron un mejor rendimiento que los controles en al menos una de las dos fechas de plantación, como se observa más adelante.

[0110] Una línea de expresores en exceso de prAT5G15240::G47 se recuperó mejor de un tratamiento de deficiencia de agua, y otra línea fue visiblemente más tolerante y se recuperó mejor del tratamiento de deficiencia de agua, que las plantas de control en una de las dos ejecuciones del ensayo. La inducción basada en sequía del transgén G47 no se confirmó por RT-PCR.

[0111] Una línea de expresores en exceso de prAT3G17520::G47 se recuperó mejor de un tratamiento de deficiencia de agua que los controles en una de las dos ejecuciones del ensayo. La inducción del transgén G47 por el tratamiento de sequía se confirmó por RT-PCR.

[0112] Una línea de expresores en exceso de prAT4G09600::G47 se recuperó mejor de un tratamiento de deficiencia de agua que los controles en una de las dos ejecuciones del ensayo. Una segunda línea fue visiblemente más tolerante a la deficiencia de agua (observada en una ejecución del ensayo) y se recuperó mejor del tratamiento que las plantas de control (observada en ambas ejecuciones del ensayo). La inducción del transgén G47 por el tratamiento de sequía se confirmó por RT-PCR.

[0113] Una línea de expresores en exceso de prG1947::G47 se recuperó mejor de un tratamiento de deficiencia de agua que los controles en una de las dos ejecuciones del ensayo. Una segunda línea fue visiblemente más tolerante a la deficiencia de agua y se recuperó mejor del tratamiento que plantas de control en una de las dos ejecuciones del ensayo. La inducción del transgén G47 por el tratamiento de sequía se confirmó por RT-PCR en la primera de estas líneas, pero no confirmó la inducción en la segunda.

Ejemplo VIII. Regulación de la expresión de polinucleótidos que codifican especies de ARN que actúan a un nivel de no proteína

[0114] Además del uso de los promotores inducibles por deficiencia de agua para regular la expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido, estos promotores también pueden usarse para regular la expresión de un polinucleótido que codifica una especie de ARN no codificante (que es una que actúa a un nivel de no proteína), tal como un microARN, un precursor de microARN o una secuencia diseñada para actuar mediante ARN interferente (ARNi). Por ejemplo, un número sustancial de especies de microARN (miARN) participa en respuestas a estrés y se ha mostrado que estas moléculas participan en el control de muchos aspectos del crecimiento y desarrollo de la planta (Bartel y Bartel (2003) Plant Physiol. 132: 709-717; Aukerman y Sakai (2003). Plant Cell 15:, 2730-2741; Bartel (2004) Cell 116: 281-297; Juarez y col. (2004) Nature 428: 84-88; Bowman (2004) Bioessays 26: 938-942; Sunkar y Zhu (2004) Plant Cell 16: 2001-2019).

[0115] Debe observarse, para familias particulares de factores de transcripción de plantas altamente relacionados, que la expresión en exceso de uno o más de los miembros de la familia produce un fenotipo comparable al obtenido reduciendo la expresión (por ejemplo, por mutación o soluciones de silenciamiento tales como ARN antisentido o interferente) de uno o más de los miembros de la familia. Por ejemplo, se ha demostrado ampliamente que la expresión en exceso de las proteínas de la familia CBF confiere tolerancia a la sequía y estrés por baja temperatura (por ejemplo, Jaglo y col. (2001) Plant Physiol. 127: 910-917). Sin embargo, Novillo y col.

(2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:, 3985-3990, mostraron que plantas de Arabidopsis mutante cbf2 homocigótica que llevan una alteración en el gen CBF2 también presentan tolerancia a la congelación potenciada. Tales resultados pueden explicarse por regulación cruzada entre los genes que codifican diferentes miembros de la familia de factores de transcripción. En el estudio por Novillo y col., (2004), arriba, se mostró que CBF2 era un regulador de la transcripción negativo de los genes CBF1 y CBF3. Mecanismos comparables probablemente explican el hecho de que los presentes inventores hayan observado tolerancia al estrés de tanto la expresión en exceso como de soluciones de silenciamiento con ciertos genes de la familia NF-Y.

[0116] Los presentes inventores han mostrado usando un promotor 35S que la expresión en exceso de precursores para miARN 169 (SEQ ID NO: 71, 72, 73 ó 74), que eligen como diana NF-YA (genes de factores de transcripción de la clase HAP2; Bartel y Bartel, arriba; Jones-Rhoades y Bartel (2004) Mol. Cell 14: 787-799) producen tolerancia a la deshidratación y estrés osmótico, pero esto va frecuentemente acompañado de cambios en el desarrollo tales como alteraciones en el momento del florecimiento o tamaño reducido. Por tanto, se espera que la expresión de miARN 169 usando un promotor inducible por sequía produzca tolerancia a la deficiencia de agua sin efectos no deseables sobre el desarrollo. Los presentes inventores han obtenido resultados similares de la expresión en exceso de un polinucleótido (P21305, SEQ ID NO: 66) diseñado para efectuar ARN interferente en proteínas NF-YB similares a no LEC1; la construcción de ARNi P21305 (que lleva KanR) elige como diana el clado G481 (este clado comprende las secuencias que están estrecha y evolutivamente relacionadas con G481, SEQ ID NO: 55, que codifican el polipéptido SEQ ID NO: 56). Contiene dos fragmentos que comprende cada uno secuencias del clado G481 de G2345, SEQ ID NO: 67 (pares de bases 185-315 del codón de iniciación; este fragmento se representa por SEQ ID NO: 69) y G485, SEQ ID NO: 68 (pares de bases 61-170 del codón de iniciación, este fragmento se representa por SEQ ID NO: 70). Se mutaron varias bases con el fin de aumentar el porcentaje de homología con los otros miembros del clado. Las bases que aparecen en letras mayúsculas en los dos fragmentos de secuencias enumerados a continuación indican posiciones en las que las mutaciones puntuales se introdujeron en los cebadores de clonación para aumentar el porcentaje de homología con otros miembros del clado.

Fragmento G2345 (bases 185-315), SEQ ID NO: 69 aggaatgTgtctctgaAttcatcagcttcgtcaccagcgaggctagtgataagtgccaaagagagaaAaggaagaccat caatggagatgatttgctttgggctatggccactttaggattCgaAgattac

Fragmento G485 (bases 61-170), SEQ ID NO: 70 gagcaagataggtttctAccgatcgctaacgttagcaggatcatgaagaaagcacttcctgcgaacgcaaaaatctctaa GgatgcTaaagaAacggttcaagagtgtgt

[0117] Se espera que los fragmentos formen una estructura de horquilla del siguiente modo: 35S::fragmento sentido(G2345-G485)::pdkintron::fragmento antisentido(G2345-G485). Líneas de Arabidopsis transgénicas que expresan en exceso P21305 mostraron estrés por tolerancia a la deficiencia de agua y por calor mejorados, pero presentaron anomalías en el desarrollo y cambios en el momento del florecimiento. Por tanto, se espera que la expresión de un polinucleótido tal usando un promotor inducible por sequía produzca tolerancia al estrés sin efectos no deseables sobre el desarrollo y/o la morfología.

Ejemplo IX. Transformación de dicotiledóneas para producir elevada tolerancia al estrés por deficiencia de agua

[0118] Especies de cultivo que incluyen plantas de tomate y soja que expresan en exceso polipéptidos de factor de transcripción que confieren elevada tolerancia a la deficiencia de agua, que incluyen deshidratación, desecación, sequía u otro estrés hiperosmótico tales como altas concentraciones de sal o azúcar, pueden producir plantas con elevada tolerancia a la deficiencia de agua cuando se ponen bajo el control regulador de promotores inducibles por deficiencia de agua de la invención. Estas observaciones indican que estos genes, cuando se expresan en exceso, producirán calidad mejorada y mayor rendimiento que plantas no transformadas en condiciones estresadas, que pueden producirse en el campo a incluso un bajo grado imperceptible en cualquier momento en la estación de crecimiento.

[0119] Por tanto, secuencias promotoras enumeradas en el Listado de secuencias recombinadas en, por ejemplo, uno de los vectores de expresión de la invención, u otro vector de expresión adecuado, pueden transformarse en una planta con el fin de regular las secuencias de respuesta a agua y modificar rasgos de plantas con el fin de mejorar el rendimiento y/o calidad. El vector de clonación puede introducirse en una variedad de plantas por medios muy conocidos en la técnica tales como, por ejemplo, transferencia directa de ADN o transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens. Ahora es rutina producir plantas transgénicas usando la mayoría de las plantas dicotiledóneas (véase Weissbach y Weissbach, (1989) Plant Molecular Biology, Academic Press; Gelvin y col. (1990) Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers; Herrera-Estrella y col. (1983) Nature 303: 209; Bevan (1984) Nucleic Acids Res. 12: 8711-8721; y Klee (1985) Biotechnology 3: 637-642). Los procedimientos para el análisis de rasgos son rutina en la materia y ejemplos se han desvelado anteriormente.

[0120] Previamente se han descrito numerosos protocolos para la transformación de plantas de tomate y soja y son muy conocidos en la técnica. Gruber y col. (1993) en Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, pág. 89-119, y Glick y Thompson ((1993) Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology. CRC Press., Boca Raton, FL) describen varios vectores de expresión y procedimientos de cultivo que pueden usarse para la transformación de células o tejidos y posterior regeneración. Para la transformación de soja, los procedimientos se describen por Miki y col. (1993) en Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, pág. 67-88, Glick y Thompson, eds., CRC Press, Inc., Boca Raton; y la patente de EE.UU. nº 5.563.055, (Townsend y Thomas), concedida el 8 de octubre de 1996.

[0121] Hay un número sustancial de alternativas a los protocolos de transformación mediados por Agrobacterium, otros procedimientos con el fin de transferir genes exógenos a sojas o tomates. Un procedimiento tal es la transformación mediada por microproyectiles en la que el ADN sobre la superficie de partículas de microproyectiles es introducido en tejidos de plantas con un dispositivo biolístico (véase, por ejemplo, Sanford y col. (1987) Part. Sci. Technol. 5:27-37; Christou y col. (1992) Plant. J. 2: 275-281; Sanford (1993) Methods Enzymol. 217: 483-509; Klein y col. (1987) Nature 327: 70-73; patente de EE.UU. nº 5.015.580 (Christou y col.) concedida el 14 de mayo de 1991; y patente de EE.UU. nº 5.322.783 (Tomes y col.) concedida el 21 de junio de 1994).

[0122] Alternativamente, procedimientos de sonicación (véase, por ejemplo, Zhang y col. (1991) Bio/Technology 9: 996-997); captación directa de ADN en protoplastos usando precipitación con CaCl2, poli(alcohol vinílico) o poli-L-ornitina (Hain y col. (1985) Mol. Gen. Genet. 199: 161-168; Draper y col. (1982) Plant Cell Physiol.

23: 451-458); fusión de liposomas o esferoplastos (véanse, por ejemplo, Deshayes y col. (1985) EMBO J.: 4: 27312737; Christou y col. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3962-3966); y electroporación de protoplastos y células y tejidos completos (véase, por ejemplo, Donn y col.(1990) en Abstracts of VIIth International Congress on Plant Cell and Tissue Culture IAPTC, A2-38: 53; D'Halluin y col. (1992) Plant Cell 4: 1495-1505; y Spencer y col. (1994) Plant Mol. Biol. 24: 51-61) se han usado para introducir ADN extraño y vectores de expresión en plantas.

[0123] Después de transformar una planta o célula de planta (y la última se regenera en una planta), la planta transformada puede cruzarse consigo misma o una planta de la misma línea, una planta no transformada o natural, u otra planta transformada de una línea transgénica diferente de plantas. El cruce proporciona las ventajas de producir variedades transgénicas nuevas y frecuentemente estables. Los genes y los rasgos que confieren que han sido introducidos en una línea de tomate o soja pueden moverse a distintas líneas de plantas usando técnicas de retrocruce tradicional muy conocidas en la técnica. La transformación de plantas de tomate puede realizarse usando los protocolos de Koornneef y col. (1986) en Tomato Biotechnology: Alan R. Liss, Inc., 169-178, y en la patente de EE.UU. 6.613.962, el último procedimiento descrito en resumen aquí. Explantes de cotiledón de ocho días de edad se precultivan durante 24 horas en placas de Petri que contienen una capa alimentadora de células en suspensión de híbridos de Petunia sembradas en medio MS con 2% (peso/volumen) de sacarosa y 0,8% de agar complementado con ácido a-naftalenoacético 10 μM y 6-bencilaminopurina 4,4 μM. Entonces, los explantes se infectan con un cultivo durante la noche diluido de Agrobacterium tumefaciens que contiene un vector de expresión que comprende un polinucleótido de la invención durante 5-10 minutos, se secan por transferencia sobre papel de filtro estéril y se cocultivan durante 48 horas sobre las placas de las células alimentadoras originales. Las condiciones de cultivo son como se han descrito anteriormente. Los cultivos durante la noche de Agrobacterium tumefaciens se diluyen en medio MS líquido con 2% (peso/volumen/) de sacarosa, pH 5,7, a una DO600 de 0,8.

[0124] Tras el cocultivo, los explantes de cotiledón se transfieren a placas de Petri con medio selectivo que comprende medio MS con zeatina 4,56 μM, vancomicina 67,3 μM, cefotaxima 418,9 μM y sulfato de kanamicina 171,6 μM, y se cultivan bajo las condiciones de cultivo descritas anteriormente. Los explantes se subcultivaron cada tres semanas sobre medio fresco. Los brotes emergentes se diseccionan del callo subyacente y se transfieren a frascos de vidrio con medio selectivo sin zeatina para formar raíces. La formación de raíces en un medio que contiene sulfato de kanamicina es una indicación positiva de una transformación satisfactoria.

[0125] La transformación de plantas de soja puede realizarse usando los procedimientos encontrados en, por ejemplo, la patente de EE.UU. 5.563.055 (Townsend y col., concedida el 8 de octubre de 1996) descrita en resumen aquí. En este procedimiento, la semilla de soja se esteriliza superficialmente por exposición a gas cloro desprendido en una campana de vidrio. Las semillas germinan sembrando sobre medio de agar solidificado de 1/10 de concentración sin reguladores del crecimiento de plantas y cultivando a 28ºC con una duración del día de 16 horas. Después de tres o cuatro días, la semilla puede prepararse para cocultivo. La cubierta de la semilla se elimina y la radícula que se extiende se quita 3-4 mm por debajo de los cotiledones.

[0126] Los cultivos durante la noche de Agrobacterium tumefaciens que alojan el vector de expresión que comprende un polinucleótido de la invención se cultivan hasta fase logarítmica, se reúnen y se concentran por centrifugación. Las inoculaciones se realizan en lotes de forma que cada placa de semilla se trató con un sedimento nuevamente resuspendido de Agrobacterium. Los sedimentos se resuspenden en 20 ml de medio de inoculación. El inóculo se vierte es una placa de Petri que contiene semilla preparada y los nodos cotiledonarios se maceran con una cuchilla quirúrgica. Después de 30 minutos, los explantes se transfieren a placas del mismo medio que ha sido solidificado. Los explantes se incorporan con el lado adaxial hacia arriba y nivelado con la superficie del medio y se cultivan a 22ºC durante tres días bajo luz fluorescente blanca. Entonces, estas plantas pueden entonces regenerarse según procedimientos bien establecidos en la materia, tales como moviendo los explantes después de tres días a un medio de selección de contador líquido (véase la patente de EE.UU. 5.563.055).

[0127] Los explantes pueden luego recogerse, incorporarse y cultivarse en medio de selección solidificado. Después de un mes sobre medios selectivos, el tejido transformado se vuelve visible como sectores verdes de tejido en regeneración contra una referencia de tejido blanqueado menos sano. Los explantes con sectores verdes se transfieren a un medio de extensión. El cultivo continúa en este medio con transferencias a placas frescas cada dos semanas. Cuando los brotes tienen 0,5 cm de longitud puede escindirse en la base y disponerse en un medio de enraizamiento.

Ejemplo X: Transformación de monocotiledóneas para producir elevada tolerancia a estrés por deficiencia de agua

[0128] Plantas de cereal y otros céspedes tales como, pero no se limitan a, maíz, trigo, arroz, sorgo, cebada, miscanto y césped de pradera pueden transformarse con las presentes secuencias promotoras tales como aquellas presentadas en el presente Listado de secuencias, clonarse en un vector tal como pGA643 y que contiene un marcador de resistencia a kanamicina y expresar induciblemente, por ejemplo, un factor de transcripción que confiere tolerancia a la deficiencia de agua mejorada. Los vectores de expresión pueden ser aquellos encontrados en el Listado de secuencias, o similarmente puede usarse cualquier otro vector de expresión adecuado que incorpore una secuencia promotora de la invención. Por ejemplo, pMEN020 puede modificarse para sustituir la región codificante NptII con el gen BAR de Streptomyces hygroscopicus que confiere resistencia a fosfinotricina. Los sitios KpnI y BglII del gen Bar se eliminan por mutagénesis dirigida a sitio con cambios de codones silenciosos.

[0129] El vector de clonación puede introducirse en una variedad de plantas de cereal por medios muy conocidos en la técnica que incluyen transferencia directa de ADN o transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens. La última solución puede llevarse a cabo mediante una variedad de medios que incluyen, por ejemplo, los de la patente de EE.UU. nº 5.591.616, en los que callo de monocotiledónea se transforma poniendo en contacto tejido desdiferenciante con el Agrobacterium que contiene el vector de clonación.

[0130] Los tejidos de muestra se sumergen en una suspensión de 3x10-9 células de Agrobacterium que contiene el vector de clonación durante 3-10 minutos. El material de callo se cultiva sobre medio sólido a 25ºC en la oscuridad durante varios días. Los callos cultivados sobre este medio se transfieren a medio de regeneración. Las transferencias continúan cada 2-3 semanas (2 ó 3 veces) hasta que se desarrollan brotes. Entonces, los brotes se transfieren a medio de extensión de brotes cada 2-3 semanas. Los brotes de aspecto sano se transfieren a medio de enraizamiento y después de haberse desarrollado las raíces, las plantas se colocan en tierra para macetas húmeda.

[0131] Entonces, las plantas transformadas se analizan para la presencia de la resistencia al gen NPTII/kanamicina por ELISA usando el kit ELISA NPTII de 5Prime-3Prime Inc. (Boulder, CO).

[0132] También es rutina usar otros procedimientos para producir plantas transgénicas de la mayoría de los cultivos de cereales (Vasil (1994) Plant Mol. Biol. 25: 925-937) tal como trigo, trigo, arroz, sorgo (Cassas y col. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11212-11216) y cebada (Wan y Lemeaux (1994) Plant Physiol. 104: 37-48). Procedimientos de transferencia de ADN tales como el procedimiento de microproyectiles puede usarse para maíz (Fromm y col. (1990) Bio/Technol. 8: 833-839; Gordon-Kamm y col. (1990) Plant Cell 2: 603-618; Ishida (1990) Nature Biotechnol. 14:745-750), trigo (Vasil y col. (1992) Bio/Technol. 10:667-674; Vasil y col. (1993) Bio/Technol. 11:1553-1558; Weeks y col. (1993) Plant Physiol. 102:1077-1084) y arroz (Christou (1991) Bio/Technol. 9:957-962; Hiei y col. (1994) Plant J. 6:271-282; Aldemita y Hodges (1996) Plant 199: 612-617; y Hiei y col. (1997) Plant Mol.

Biol. 35:205-218). Para la mayoría de las plantas de cereales, células embriogénicas derivadas de tejidos de escutelo inmaduro son las dianas celulares preferidas para transformación (Hiei y col. (1997), arriba; Vasil (1994), arriba). Para transformar células embriogénicas de trigo derivadas de tejido escutelar inmaduro usando bombardeo de microproyectiles, el genotipo de A188XB73 es el genotipo preferido (Fromm y col. (1990), arriba; Gordon-Kamm y col. (1990), arriba). Después del bombardeo de microproyectiles, los tejidos se seleccionan sobre fosfinotricina para identificar las células embriogénicas transgénicas (Gordon-Kamm y col. (1990), arriba). Las plantas transgénicas se regeneran por técnicas de regeneración de trigo convencionales (Fromm y col. (1990), arriba; Gordon-Kamm y col. (1990), arriba). La transformación mediada por Agrobacterium de césped de pradera también se ha informado por Somleva y col. (2002) Crop Sci. 42: 2080-2087.

Ejemplo XI: Expresión y análisis de factores de transcripción de tolerancia al estrés por deficiencia de agua

[0133] El análisis de transferencia Northern, RT-PCR o análisis de micromatrices de las plantas transformadas regeneradas puede usarse para mostrar la expresión de un polipéptido de factor de transcripción de la invención y genes relacionados que pueden inducir tolerancia al estrés por deficiencia de agua mejorada con respecto a una planta de control.

[0134] Para verificar la capacidad para conferir elevada tolerancia a la deficiencia de agua, plantas maduras que expresan en exceso un factor de transcripción bajo el control regulador de un promotor inducible por deficiencia de agua de la invención, o alternativamente, progenie de plantas de semillero de estas plantas, pueden exponerse a un estrés tal como una deshidratación, sequía, desecación, o una tolerancia relacionada con estrés hiperosmótico tal como sal o manitol. Alternativamente, estas plantas pueden exponerse a una condición de estrés hiperosmótico que también puede medir sensibilidad al azúcar alterada tal como una condición de azúcar alta (por ejemplo, sacarosa). Comparando plantas de control (por ejemplo, plantas no transformadas naturales o de la línea parental, o plantas transformadas con un vector vacío o uno que carece del factor de transcripción) y plantas transgénicas similarmente tratadas, puede mostrarse que las plantas transgénicas tienen mayor tolerancia al estrés relacionado con deficiencia de agua particular.

[0135] Después de que una planta dicotiledónea, planta monocotiledónea o célula de planta haya sido transformada (y la última regenerada en una planta) y se muestre que tiene mayor tamaño o tolerancia al estrés relacionado con deficiencia de agua, o produce mayor rendimiento o calidad con respecto a una planta de control bajo las condiciones de estrés, la planta monocotiledónea transformada puede cruzarse consigo misma a partir de la misma línea, una planta no transformada o monocotiledónea natural, u otra planta monocotiledónea transformada de una línea transgénica diferente de plantas.

[0136] Estos experimentos demostrarían que los polipéptidos de factor de transcripción de la invención pueden identificarse y se muestra que confieren mayor tolerancia al estrés relacionada con deficiencia de agua, mayor rendimiento o mayor calidad en dicotiledóneas o monocotiledóneas, que incluyen tolerancia a más de un estrés relacionado con deficiencia de agua.

Ejemplo XII: Secuencias que confieren mejoras significativas a especies de no Arabidopsis

[0137] Se ha analizado la función de secuencias promotoras de la invención y puede caracterizarse adicionalmente y las secuencias pueden incorporarse en plantas de cultivo. La expresión en exceso ectópica de secuencias del factor de transcripción, o cualquier otra secuencia que pueda conferir tolerancia elevada a estrés relacionado con deficiencia de agua (por ejemplo, a sequía, desecación, deshidratación y/u otro estrés hiperosmótico), puede regularse usando elementos reguladores de la invención. Además de estas secuencias se espera que secuencias de polinucleótidos recientemente descubiertas de, por ejemplo, otras especies que tienen secuencias similares, que pueden estar estrechamente relacionadas con secuencias de polinucleótidos encontradas en el Listado de secuencias, también puedan conferir tolerancia a la deficiencia de agua mejorada de un modo similar a las secuencias encontradas en el Listado de secuencias, cuando se transforman en una cualquiera de una variedad considerable de plantas de diferentes especies, y que incluyen dicotiledóneas y monocotiledóneas. Las secuencias de polinucleótidos y de polipéptidos derivadas de monocotiledóneas (por ejemplo, las secuencias de arroz) pueden usarse para transformar tanto plantas monocotiledóneas como dicotiledóneas, y aquellas derivadas de dicotiledóneas (por ejemplo, los genes de Arabidopsis y soja) pueden usarse para transformar cualquier grupo, aunque algunas de estas secuencias pueden funcionar mejor si el gen se transforma en una planta de la misma clase que de la que se deriva la secuencia.

[0138] Los resultados presentados en los ejemplos anteriores indican que proteínas tales como factores de transcripción que confieren tolerancia a la deficiencia de agua mejorada pueden hacer esto cuando se expresan en exceso bajo el control regulador de una secuencia promotora de la invención, sin que tenga un impacto adverso significativo sobre la morfología y/o desarrollo de la planta. Las líneas que muestran rasgos útiles pueden seleccionarse para posterior estudio o desarrollo comercial.

[0139] Las plantas monocotiledóneas, que incluyen arroz, trigo, trigo, centeno, sorgo, cebada y otras, pueden transformarse con un plásmido que contiene un polinucleótido de factor de transcripción. La secuencia del factor de transcripción de genes puede incluir secuencias derivadas de dicotiledóneas o monocotiledóneas tales como aquellas presentadas en el presente documento. Estos genes de factor de transcripción pueden clonarse en un vector de expresión que contiene un marcador de resistencia a kanamicina, y luego expresarse en un modo inducible bajo el control regulador de una secuencia promotora de la invención.

[0140] El vector de clonación puede introducirse en monocotiledóneas por, por ejemplo, medios descritos en el ejemplo previo que incluyen transferencia directa de ADN o transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens. La última solución puede llevarse a cabo mediante una variedad de medios que incluyen, por ejemplo, los de la patente de EE.UU. nº 5.591.616, en los que callo de monocotiledónea se transforma poniendo en contacto tejido desdiferenciante con el Agrobacterium que contiene el vector de clonación.

[0141] Los tejidos de muestra se sumergen en una suspensión de 3x10-9 células de Agrobacterium que contiene el vector de clonación durante 3-10 minutos. El material de callo se cultiva sobre medio sólido a 25ºC en la oscuridad durante varios días. Los callos cultivados sobre este medio se transfieren a medio de regeneración. Las transferencias continúan cada 2-3 semanas (2 ó 3 veces) hasta que se desarrollan brotes. Entonces, los brotes se transfieren a medio de alargamiento de brotes cada 2-3 semanas. Los brotes de aspecto sano se transfieren a medio de enraizamiento y después de haberse desarrollado las raíces, las plantas se colocan en tierra para macetas húmeda.

[0142] Entonces, las plantas transformadas se analizan para la presencia de la resistencia al gen NPTII/kanamicina por ELISA usando el kit ELISA NPTII de 5Prime-3Prime Inc. (Boulder, CO).

[0143] El análisis de transferencia Northern, RT-PCR o análisis de micromatrices de las plantas transformadas regeneradas puede usarse para mostrar la expresión de un polipéptido de factor de transcripción de la invención que puede conferir tolerancia al estrés relacionado con deficiencia de agua mejorada, o elevado rendimiento o calidad, en las plantas transformadas.

[0144] Para verificar la capacidad para conferir tolerancia al estrés relacionado con deficiencia de agua mejorada, plantas maduras o progenie de plantas de semillero de estas plantas que expresan un gen equiválogo derivado de monocotiledónea pueden exponerse usando procedimientos descritos en el presente documento. Comparando las plantas de control y las plantas transgénicas, se muestra que las últimas son más tolerantes al uno

o más estreses relacionados con deficiencia de agua tales como sequía, deshidratación, desecación, u otro estrés hiperosmótico, con respecto a plantas de control similarmente tratadas. Como un ejemplo de una primera etapa para determinar tolerancia relacionada con deficiencia de agua, semillas de plantas transgénicas pueden someterse a ensayos de germinación para medir la sensibilidad a sacarosa. Por ejemplo, semillas de dicotiledóneas estériles que incluyen, pero no se limitan a, soja y alfalfa, se siembran sobre 80% de medio MS más vitaminas con 9,4% de sacarosa; medios de control que carecen de sacarosa. Entonces, todas las placas de ensayo se incuban a 22ºC bajo 24 horas de luz, 120-130 pEin/m2/s, en una cámara de crecimiento. Entonces, la evaluación de la germinación y el vigor de las plantas de semillero se realiza tres días después de plantarse. Puede encontrarse que las plantas que expresan en exceso proteínas que confieren tolerancia a la deficiencia de agua mejorada, en las que las proteínas están bajo el control regulador de promotores de la invención, son más tolerantes a alta sacarosa por tener mejor germinación, radículas más largas y más expansión de cotiledones que las plantas de control en presencia de la concentración de azúcar. Se espera que secuencias promotoras estrechamente relacionadas y estructuralmente similares también puedan conferir sensibilidad a sacarosa alterada o tolerancia al estrés hiperosmótico mejorada.

[0145] Plantas que expresan en exceso proteínas que confieren elevada tolerancia a la deficiencia de agua, en las que las proteínas están bajo el control regulador de las secuencias promotoras de la invención, también pueden someterse a ensayos de sequía basados en tierra para identificar aquellas líneas que son más tolerantes a la privación de agua que las plantas de control. Por ejemplo, pueden realizarse experimentos de sequía en un invernadero. Las plantas de semillero pre-germinadas de plantas transgénicas (progenie de una planta transgénica heterocigótica que hereda la construcción de ADN de factor de transcripción exógeno) y plantas naturales (progenie de una planta transgénica heterocigótica que hereda la construcción de ADN de factor de transcripción exógeno) se plantan en tierra. Las plantas se riegan bien durante una semana y luego se deja que se sequen durante 4 días. Se selecciona un número igual de plantas transgénicas y naturales basándose en altura igual. Entonces se empieza un ensayo de sequía midiendo las alturas de las plantas y continuando regando diariamente para macetas “húmedas”. Se generan macetas “secas” manteniendo el peso de la maceta seco “promedio” (por ejemplo, aproximadamente 400 g) muy por debajo del de las macetas “húmedas” (por ejemplo, aproximadamente 500 g o más); se añade agua a las macetas “secas” cuando sea necesario para mantener las macetas “secas” a aproximadamente el peso de la maceta “seca” promedio. La altura de las plantas transgénicas y los controles se mide durante nueve días, después de lo cual se reanuda el riego completo para las macetas sin cambios “secas” durante tres días, después de lo cual las alturas se midieron de nuevo. Las plantas recuperadas pueden someterse a una segunda ronda de sequía como se ha descrito anteriormente. Varias líneas de plantas transformadas con secuencias de la invención serán significativamente mayores y más verdes, con menos marchitamiento o desecación, que las plantas de control, particularmente después de que un periodo de deficiencia de agua vaya seguido de riego y un posterior periodo de incubación. A diferencia de las plantas que expresan constitutivamente en exceso las proteínas que confieren elevada tolerancia a la deficiencia de agua, plantas transgénicas que expresan en exceso estas proteínas bajo el control regulador de los promotores inducibles por deficiencia de agua descritos en el presente documento serán morfológicamente y en el desarrollo similares a las plantas de control tales como las plantas naturales o transformadas con un vector “vacío”.

[0146] Se espera que los mismos procedimientos puedan aplicarse para identificar otras secuencias promotoras útiles y valiosas, y las secuencias pueden derivarse de una diversa gama de especies.

LISTADO DE SECUENCIAS

[0147]

<110> Mendel Biotechnology, Inc. REPETTI, Peter P HOLTAN, Hans E KUM MOTO, Roderick W RATCLIFFE, Cl diver J

<120> PROMOTORES INDUCIBLES POR DEFICIENCIA DE AGUA

<130> MBI - 0079P

<160> 74

<170> Patent Inversion 3.2

<210> 1

<211> 766

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<223> SEQ ID NO: 1 Contiene fragmento de promotor de pr AT1G16850, encontrado en acc. de GenBank NC_003070)

<400> 1 <210> 2

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<223> SEQ ID NO: 2 Contiene fragmento de promotor de pr A5G52300, encontrado en acc. de GenBank nº 10 AB019226, GI: 3869065)

<400> 2

<210> 3

<211> 907

<212> ADN 5 <213> Arabidopsis thaliana

<220>

<223> SEQ ID NO: 3 Contiene fragmento de promotor de pr A3G46230, encontrado en acc. de GenBank nº

AL355775, GI: 7798991) 10

<400> 3

15 <210> 4

<211> 780

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

20 <220>

<223> SEQ ID NO: 4 Contiene fragmento de promotor de pr AT1G62690, encontrado en acc. de GenBank AC008016)

<400> 4 <210> 5

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<223> SEQ ID NO: 5 Contiene fragmento de promotor de pr A2G37870, encontrado en acc. de GenBank nº 10 AC007661, GI: 6598780)

<400> 5

<210> 6

<211> 776

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana 20

<220> <223> SEQ ID NO: 6 Contiene fragmento de promotor de pr AT5G43840 o pr G1947,encontrados en acc. de GenBank AB026651, GI: 4757407)

<400> 6

<210> 7

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<223>

SEQ ID NO: 7 Contiene fragmento de promotor de pr A5G66780, encontrado en acc. de GenBank nº 15 AB010700, GI: 2828185)

<400> 7

<210> 8

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<223>

SEQ ID NO: 8 Contiene fragmento de promotor de pr A3G17520, encontrado en acc. de GenBank nº 10 AB022219, GI :7321075)

<400> 8

<210> 9

<211> 936

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<223> SEQ ID NO: 9 Contiene fragmento de promotor de pr A4G09600, encontrado en acc. de GenBank nº AL161831, GI:7321075)

10 <400> 9

<210> 10 15 <211> 1192

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220> 20 <223> Secuencia artificial

<220>

<223> SEQ ID NO: 10 P26849 Vector de combinación de promotor inducible por sequía -G481, comprende la

secuencia promotora del gen inducible por sequía AT1G16850 fusionada con una secuencia codificante de G481 25 que carece de secuencias de UTR, y el plásmido también lleva un marcador de resistencia a kanamicina

<400> 10 <210> 11

<211> 1031 5 <212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia artificial 10

<220>

<223> SEQ ID NO: 11 P26851 Vector de combinación de promotor inducible por sequía - G481, comprende la secuencia promotora del gen inducible por sequía AT5G52300 fusionada con una secuencia codificante de G481 que carece de secuencias de UTR, y el plásmido también lleva un marcador de resistencia a kanamicina

<400> 11 <210> 12

<211> 1333 5 <212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia artificial 10

<220>

<223> SEQ ID NO: 12 P26852 Vector de combinación de promotor inducible por sequía -G481, comprende la secuencia promotora del gen inducible por sequía AT3G46230 fusionada con una secuencia codificante de G481 que carece de secuencias de UTR, y el plásmido también lleva un marcador de resistencia a kanamicina

<400> 12 <210> 13

<211> 1206 5 <212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia artificial 10

<220>

<223> SEQ ID NO: 13 P26850 Vector de combinación de promotor inducible por sequía -G481, comprende la secuencia promotora del gen inducible por sequía pr AT1G62690 fusionada con una secuencia codificante de G481 que carece de secuencias de UTR, y el plásmido también lleva un marcador de resistencia a kanamicina

<400> 13

5 <210> 14

<211> 873

<212> ADN

<213> secuencia artificial

10 <220>

<223> Secuencia artificial

<220>

<223> SEQ ID NO: 14 P26853 Vector de combinación de promotor inducible por sequía -G481, comprende la

15 secuencia promotora del gen inducible por sequía AT2G37870 fusionada con una secuencia codificante de G481 que carece de secuencias de UTR, y el plásmido también lleva un marcador de resistencia a kanamicina

<400> 14 <210> 15

<211> 1202 5 <212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia artificial 10

<220>

<223> SEQ ID NO: 15 P26844 Vector de combinación de promotor inducible por sequía - G481 , comprende la secuencia promotora del gen inducible por sequía AT5G43840 (G1947) fusionada con una secuencia codificante de G481 que carece de secuencias de UTR, y el plásmido también lleva un marcador de resistencia a kanamicina

<400> 15 <210> 16

<211> 1354 5 <212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia artificial 10

<220>

<223> SEQ ID NO: 16 P26847 Vector combinación de promotor inducible por sequía - G481, comprende la secuencia promotora del gen inducible por sequía AT5G66780 fusionada con una secuencia codificante de G481 que carece de secuencias de UTR, y el plásmido también lleva un marcador de resistencia a kanamicina

<400> 16 <210> 17

<213> secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia artificial 10

<220>

<223> SEQ ID NO: 17 P26846 Vector de combinación de promotor inducible por sequía -G481, comprende la secuencia promotora del gen inducible por sequía AT3G17520 fusionada con una secuencia codificante de G481 que carece de secuencias de UTR, y el plásmido al so lleva un marcador de resistencia a kanamicina

<400> 17 <212> ADN

<213> secuencia artificial

<220> 10 <223> Secuencia artificial

<220>

<223> SEQ ID NO: 18 P26845 Vector de combinación de promotor inducible por sequía -G481, comprende la

secuencia promotora del gen inducible por sequía AT4G09600 fusionada con una secuencia codificante de G481 15 que carece de secuencias de UTR, y el plásmido también lleva un marcador de resistencia a kanamicina

<400> 18 <210> 19

<211> 1666 5 <212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia artificial

<220>

<223> SEQ ID NO: 19 P26859 Vector de combinación de promotor inducible por sequía - G1073, comprende la secuencia promotora del gen inducible por sequía AT1G16850 fusionada con una secuencia codificante de G1073 que carece de secuencias de UTR, y el plásmido también lleva un marcador de resistencia a kanamicina

<400> 19

<210> 20

<211> 1505

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia artificial

<220>

10 <223> SEQ ID NO: 20 P26861 Vector de combinación de promotor inducible por sequía - G1073, comprende la secuencia promotora del gen inducible por sequía AT5G52300 fusionada con una secuencia codificante de G1073 que carece de secuencias de UTR, y el plásmido también lleva un marcador de resistencia a kanamicina

<400> 20 <210> 21

<211>

1807 5 <212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia artificial

<220>

<223> SEQ ID NO: 21 P26862 Vector de combinación de promotor inducible por sequía - G1073, comprende la secuencia promotora del gen inducible por sequía AT3G46230 fusionada con una secuencia codificante de G1073 que carece de secuencias de UTR, y el plásmido también lleva un marcador de resistencia a kanamicina

<400> 21

<210> 22

<211>

1680 5 <212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia artificial 10

<220>

<223> SEQ ID NO: 22 P26860 Vector de combinación de promotor inducible por sequía - G1073, comprende la secuencia promotora del gen inducible por sequía AT1G62690 fusionada con una secuencia codificante de G1073 que carece de secuencias de UTR, y el plásmido también lleva un marcador de resistencia a kanamicina

<400> 22 <210> 23

<211> 1347 5 <212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia artificial 5

<220>

<223> SEQ ID NO: 23 P26863 Vector de combinación de promotor inducible por sequía - G1073, comprende la secuencia promotora del gen inducible por sequía AT2G37870 fusionada con una secuencia codificante de G1073 que carece de secuencias de UTR, y el plásmido también lleva un marcador de resistencia a kanamicina

<400> 23

15 <210> 24

<211> 1676

<212> ADN

<213> secuencia artificial

5 <220>

<223> Secuencia artificial

<220>

<223> SEQ ID NO: 24 P26854 Vector de combinación de promotor inducible por sequía - G1073, comprende la

10 secuencia promotora del gen inducible por sequía AT5G43840 (G1947) fusionada con una secuencia codificante de G1073 que carece de secuencias de UTR, y el plásmido también lleva un marcador de resistencia a kanamicina

<400> 24 <210> 25

<211> 1828 5 <212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia artificial 5 <220>

<223> SEQ ID NO: 25 P26857 Vector de combinación de promotor inducible por sequía - G1073, comprende la secuencia promotora del gen inducible por sequía AT5G66780 fusionada con una secuencia codificante de G1073 que carece de secuencias de UTR, y el plásmido también lleva un marcador de resistencia a kanamicina

10 <400> 25 <210> 26

<211> 1360 5 <212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia artificial 10

<220>

<223> SEQ ID NO: 26 P26856 Vector de combinación de promotor inducible por sequía - G1073, comprende la secuencia promotora del gen inducible por sequía AT3G17520 fusionada con una secuencia codificante de G1073 que carece de secuencias de UTR, y el plásmido también lleva un marcador de resistencia a kanamicina

<400> 26 <210> 27

<211> 1836 5 <212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia artificial

<220>

<223> SEQ ID NO: 27 P26855 Vector de combinación de promotor inducible por sequía - G1073, comprende la secuencia promotora del gen inducible por sequía AT4G09600 fusionada con una secuencia codificante de G1073 que carece de secuencias de UTR, y el plásmido también lleva un marcador de resistencia a kanamicina

<400> 27

<210> 28

<211> 1201

<212> ADN 5 <213> secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia artificial

10 <220>

<223> SEQ ID NO: 28 Vector de combinación de promotor inducible por sequía - G47, comprende la secuencia promotora del gen inducible por sequía AT1G16850 fusionada con una secuencia codificante de G47 que carece de secuencias de UTR, y el plásmido también lleva un marcador de resistencia a kanamicina

15 <400> 28 <210> 29

<211> 1040

<212> ADN

<213> secuencia artificial 5

<220>

<223> Secuencia artificial

<220>

10 <223> SEQ ID NO: 29 Vector de combinación de promotor inducible por sequía - G47, comprende la secuencia promotora del gen inducible por sequía AT5G62300 fusionada con una secuencia codificante de G47 que carece de secuencias de UTR, y el plásmido también lleva un marcador de resistencia a kanamicina

<400> 29 15

<210> 30

<211> 1342 20 <212> ADN

<213> secuencia artificial

<220> <223> Secuencia artificial

<220>

<223> SEQ ID NO: 30 Vector de combinación de promotor inducible por sequía - G47, comprende la secuencia

promotora del gen inducible por sequía AT3G46230 fusionada con una secuencia codificante de G47 que carece de 5 secuencias de UTR, y el plásmido también lleva un marcador de resistencia a kanamicina

<400> 30

<210> 31

<211> 1215

<212> ADN

<213> secuencia artificial 15

<220>

<223> Secuencia artificial

<220>

5 <223> SEQ ID NO: 31 Vector de combinación de promotor inducible por sequía - G47, comprende la secuencia promotora del gen inducible por sequía AT1 62690 fusionada con una secuencia codificante de G47 que carece de secuencias de UTR, y el plásmido también lleva un marcador de resistencia a kanamicina

<400> 31 10

<210> 32

<213> secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia artificial <220>

<223> SEQ ID NO: 32 Vector de combinación de promotor inducible por sequía - G47, comprende la secuencia promotora del gen inducible por sequía AT2G37870 fusionada con una secuencia codificante de G47 que carece de secuencias de UTR, y el plásmido también lleva un marcador de resistencia a kanamicina

<400> 32

10 <210> 33

<211> 1211

<212> ADN

<213> secuencia artificial

15 <220>

<223> Secuencia artificial

<220>

<223> SEQ ID NO: 33 P26869 Vector de combinación de promotor inducible por sequía - G47, comprende la

20 secuencia promotora del gen inducible por sequía AT5G43840 (G1947) fusionada con una secuencia codificante de G47 que carece de secuencias de UTR, y el plásmido también lleva un marcador de resistencia a kanamicina

<400> 33 5 <210> 34

<211> 1363

<212> ADN

<213> secuencia artificial

10 <220>

<223> Secuencia artificial

<220>

<223> SEQ ID NO: 34 P26872 Vector de combinación de promotor inducible por sequía - G47, comprende la

15 secuencia promotora del gen inducible por sequía AT5G66780 fusionada con una secuencia codificante de G47 que carece de secuencias de UTR, y el plásmido también lleva un marcador de resistencia a kanamicina

<400> 34 <210> 35

<213> secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia artificial 10

<220>

<223> SEQ ID NO: 35 P26871 Vector de combinación de promotor inducible por sequía - G47, comprende la secuencia promotora del gen inducible por sequía AT3G17520 fusionada con una secuencia codificante de G47 que carece de secuencias de UTR, y el plásmido también lleva un marcador de resistencia a kanamicina

<400> 35

5 <210> 36

<211> 1371

<212> ADN

<213> secuencia artificial

10 <220>

<223> Secuencia artificial

<220>

<223> SEQ ID NO: 36 P26870 Vector de combinación de promotor inducible por sequía - G47, comprende la

15 secuencia promotora del gen inducible por sequía AT4G09600 fusionada con una secuencia codificante de G47 que carece de secuencias de UTR, y el plásmido también lleva un marcador de resistencia a kanamicina; ADN

<400> 36 <210> 37

<211> 1351 5 <212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia artificial 10

<220>

<223> SEQ ID NO: 37 Vector de combinación de promotor inducible por sequía - G1274, comprende la secuencia promotora del gen inducible por sequía AT1G16850 fusionada con una secuencia codificante de G1274 que carece de secuencias de UTR, y el plásmido también lleva un marcador de resistencia a kanamicina

<400> 37 <212> ADN

<213> secuencia artificial

<220> 10 <223> Secuencia artificial

<220>

<223> SEQ ID NO: 38 Vector de combinación de promotor inducible por sequía - G1274, comprende la secuencia

promotora del gen inducible por sequía AT5G62300 fusionada con una secuencia codificante de G1274 que carece 15 de secuencias de UTR, y el plásmido también lleva un marcador de resistencia a kanamicina

<400> 38

<210> 39

<211> 1492

<212> ADN 10 <213> secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia artificial

15 <220>

<223> SEQ ID NO: 39 Vector de combinación de promotor inducible por sequía - G1274, comprende la secuencia promotora del gen inducible por sequía AT3G46230 fusionada con una secuencia codificante de G1274 que carece de secuencias de UTR, y el plásmido también lleva un marcador de resistencia a kanamicina

20 <400> 39 <210> 40

<211> 1365 5 <212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia artificial <220>

<223> SEQ ID NO: 40 Vector de combinación de promotor inducible por sequía - G1274, comprende la secuencia promotora del gen inducible por sequía AT1G52690 fusionada con una secuencia codificante de G1274 que carece de secuencias de UTR, y el plásmido también lleva un marcador de resistencia a kanamicina

<400> 40

10 <210> 41

<211> 1032

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia artificial

<220>

5 <223> SEQ ID NO: 41 Vector de combinación de promotor inducible por sequía - G1274, comprende la secuencia promotora del gen inducible por sequía AT2G37870 fusionada con una secuencia codificante de G1274 que carece de secuencias de UTR, y el plásmido también lleva un marcador de resistencia a kanamicina

<400> 41 10

<210> 42

<211> 1361 15 <212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia artificial

<220>

<223> SEQ ID NO: 42 Vector de combinación de promotor inducible por sequía - G1274, comprende la secuencia promotora del gen inducible por sequía AT5G43840 (G1947) fusionada con una secuencia codificante de G1274 que carece de secuencias de UTR, y el plásmido también lleva un marcador de resistencia a kanamicina

<400> 42

<210> 43

<211> 1513

<212> ADN

<213> secuencia artificial 10

<220>

<223> Secuencia artificial

<220> 15 <223> SEQ ID NO: 43 P26867 Vector de combinación de promotor inducible por sequía - G1274, comprende la secuencia promotora del gen inducible por sequía AT5G66780 fusionada con una secuencia codificante de G1274 que carece de secuencias de UTR, y el plásmido también lleva un marcador de resistencia a kanamicina

<400> 43

<210> 44

<211> 1045

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220> 5 <223> Secuencia artificial

<220>

<223> SEQ ID NO: 44 P26866 Vector de combinación de promotor inducible por sequía - G1274, comprende la

secuencia promotora del gen inducible por sequía AT3G17520 fusionada con una secuencia codificante que G1274 10 carece de secuencias de UTR, y el plásmido también lleva un marcador de resistencia a kanamicina

<400> 44

<210> 45

<211> 1521

<212> ADN

<213> secuencia artificial 20

<220>

<223> Secuencia artificial

<220>

25 <223> SEQ ID NO: 45 P26865 Vector de combinación de promotor inducible por sequía - G1274, comprende la secuencia promotora del gen inducible por sequía AT4G09600 fusionada con una secuencia codificante de G1274

que carece de secuencias de UTR, y el plásmido también lleva un marcador de resistencia a kanamicina

<400> 45

<210> 46

<211> 1186

<212> ADN 10 <213> secuencia artificial <220>

<223> Secuencia artificial

5 <220>

<223> SEQ ID NO: 46 Vector de combinación de promotor inducible por sequía - G1792, comprende la secuencia promotora del gen inducible por sequía AT1G16850 fusionada con una secuencia codificante de G1792 que carece de secuencias de UTR, y el plásmido también lleva un marcador de resistencia a kanamicina

10 <400> 46

<210> 47 15 <211> 1025

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220> 20 <223> Secuencia artificial

<220> <223> SEQ ID NO: 47 Vector de combinación de promotor inducible por sequía - G1792, comprende la secuencia promotora del gen inducible por sequía AT5G62300 fusionada con una secuencia codificante de G1792 que carece de secuencias de UTR, y el plásmido también lleva un marcador de resistencia a kanamicina

5 <400> 47

<210> 48 10 <211> 1327

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220> 15 <223> Secuencia artificial

<220>

<223> SEQ ID NO: 48 Vector de combinación de promotor inducible por sequía - G1792, comprende la secuencia

promotora del gen inducible por sequía AT3G46230 fusionada con una secuencia codificante de G1792 que carece 20 de secuencias de UTR, y el plásmido también lleva un marcador de resistencia a kanamicina

<400> 48 <210> 49

<211> 1200 5 <212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia artificial 10

<220>

<223> SEQ ID NO: 49 Vector de combinación de promotor inducible por sequía - G1792, comprende la secuencia promotora del gen inducible por sequía AT1G52690 fusionada con una secuencia codificante de G1792 que carece de secuencias de UTR, y el plásmido también lleva un marcador de resistencia a kanamicina

<400> 49

5 <210> 50

<211> 867

<212> ADN

<213> secuencia artificial

10 <220>

<223> Secuencia artificial

<220>

<223> SEQ ID NO: 50 Vector de combinación de promotor inducible por sequía - G1792, comprende la secuencia

15 promotora del gen inducible por sequía AT2G37870 fusionada con una secuencia codificante de G1792 que carece de secuencias de UTR, y el plásmido también lleva un marcador de resistencia a kanamicina

<400> 50 <210> 51

<211> 1196 5 <212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia artificial 10

<220>

<223> SEQ ID NO: 51 P26706 Vector de combinación de promotor inducible por sequía - G1792, comprende la secuencia promotora del gen inducible por sequía AT5G43840 (G1947) fusionada con una secuencia codificante de G1792 que carece de secuencias de UTR, y el plásmido también lleva un marcador de resistencia a kanamicina

<400> 51 <210> 52

<211> 1348 5 <212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia artificial 10

<220>

<223> SEQ ID NO: 52 P26691 Vector de combinación de promotor inducible por sequía - G1792, comprende la secuencia promotora del gen inducible por sequía AT5G66780 fusionada con una secuencia codificante de G1792 que carece de secuencias de UTR, y el plásmido también lleva un marcador de resistencia a kanamicina

<400> 52 <210> 53

<213> secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia artificial 10

<220>

<223> SEQ ID NO 53 P26690 Vector de combinación de promotor inducible por sequía - G1792, comprende la secuencia promotora del gen inducible por sequía AT3G17520 fusionada con una secuencia codificante de G1792 que carece de secuencias de UTR, y el plásmido también lleva un marcador de resistencia a kanamicina

<400> 53

5 <210> 54

<211> 1356

<212> ADN

<213> secuencia artificial

10 <220>

<223> Secuencia artificial

<220>

<223> SEQ ID NO 54 P26689 Vector de combinación de promotor inducible por sequía - G1792, comprende la

15 secuencia promotora del gen inducible por sequía AT4G09600 fusionada con una secuencia codificante de G1792 que carece de secuencias de UTR, y el plásmido también lleva un marcador de resistencia a kanamicina

<400> 54 <210> 55

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<223> SEQ ID NO: 55 ADNc de G481 (el codón de iniciación empieza en el nucleótido 103)

<400> 55 <210> 56

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<223> SEQ ID NO: 56 Polipéptido de G481 10

<400> 56 <210> 57

<211> 1327 5 <212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<223>

SEQ ID NO: 57 ADNc de G1073 (el codón de iniciación empieza en el nucleótido 234, o 321 10 para polipéptido truncado)

<400> 57

<210> 58

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<223> SEQ ID NO: 58 Polipéptido de G1073

<400> 58

<210> 59

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<223>

SEQ ID NO: 59 ADNc de G1274 (el codón de iniciación empieza en el nucleótido 1) 10

<400> 59

15 <210> 60

<211> 194

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

20 <220>

<223> SEQ ID NO: 60 Polipéptido de G1274

<400> 60

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220> 10 <223> SEQ ID NO: 61 ADNc de G1792 (el codón de iniciación empieza en el nucleótido 77)

<400> 61

5 <210> 62

<211> 139

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

10 <220>

<223> SEQ ID NO: 62 Polipéptido de G1792

<400> 62

<210> 63

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<223>

SEQ ID NQ: 63 ADNc de G47 (el codón de iniciación empieza en el nucleótido 38) 10

<400> 63

<210> 64

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<223>

SEQ ID NO: 64 Polipéptido de G47 10

<400> 64

<210> 65

<211> 3158

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia artificial

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(10)

<223> n es a, c, g, o t

<220>

<221> misc_feature

<222> (17)..(52)

<223> n es a, c, g, o t

<220>

<223> SEQ ID NO: 65 Vector de expresión pMEN65

<400> 65

<210> 66 <211> 1351

<212> ADN

<213> secuencia artificial

5 <220>

<223> Secuencia artificial

<220>

<223> SEQ ID NO: 66 10

<400> 66

15 <210> 67

<211> 528

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220> 5 <223> SEQ ID NO: 67 ADNc de G2345

<400> 67

<210> 68

<211> 483

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana 15

<220>

<223> SEQ ID NO: 68 ADNc de G485

<400> 68 20

<210> 69

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<223> SEQ ID NO: 69 pares de bases 185- 315 del codón de iniciación de ADNc de G2345

<400> 69

10 <210> 70

<211> 110

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

15 <220>

<223> SEQ ID NO: 70 pares de bases 61- 170 del codón de iniciación de ADNc de G485

<400> 70

<210> 71

<211> 154

<212> ADN 25 <213> secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia artificial

30 <220>

<223> SEQ ID NO: 71 P26884 lleva KanR y una fusión 35S::mi R169d y es una construcción expresada en exceso para ath-mi R169d, uno de los precursores para mi R169 que elige como diana genes del factor de transcripción de clase NF-YA HAP2

35 <400> 71

<210> 72 40 <211> 217

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220> 45 <223> Secuencia artificial <220>

<223> SEQ ID NO: 72 P26885 lleva KanR y una fusión 35S::mi R169d y es una construcción expresada en exceso para ath-mi R169e, uno de los precursores para mi R169 que elige como diana genes del factor de transcripción de clase NF-YA HAP2

<400> 72

10 <210> 73

<211> 167

<212> ADN

<213> secuencia artificial

15 <220>

<223> Secuencia artificial

<220>

<223> SEQ ID NO: 73 P26886 lleva KanR y una fusión 35S:: mi R169d y es una construcción expresada en exceso

20 para ath-mi R169f, uno de los precursores para mi R169 que elige como diana genes del factor de transcripción de clase NF-YA HAP2

<400> 73

<210> 74

<211> 379

<212> ADN 30 <213> secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia artificial

35 <220>

<223> SEQ ID NO: 74 P26887 lleva KanR y una fusión 35S:: mi R169d y es una construcción expresada en exceso para ath-mi R169g, uno de los precursores para mR169 que elige como diana genes del factor de transcripción de clase NF-YA HAP2

40 <400> 74

Claims (11)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un vector de expresión que comprende un promotor inducible por deficiencia de agua que comprende SEQ ID NO: 6 o una parte funcional del mismo, en el que la parte funcional incluye una función de promotor inducible por deficiencia de agua, en el que dicho promotor o parte funcional del mismo está operativamente ligado a y regula la expresión de un polinucleótido que codifica un polipéptido que confiere elevada tolerancia a condiciones de deficiencia de agua.

2. 2.

   El vector de expresión de la Reivindicación 1, en el que polipéptido que confiere elevada tolerancia a condiciones de deficiencia de agua es un factor de transcripción.

3. 3.

   El vector de expresión de la Reivindicación 2, en el que el factor de transcripción está seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 56, 58, 60, 62 y 64.

4. 4.

   El vector de expresión de la Reivindicación 1, en el que el vector de expresión comprende cualquiera de SEQ ID NO: 10 a 54.

5. 5.

   El vector de expresión de la Reivindicación 1, en el que el vector de expresión comprende un sitio de unión de ARN polimerasa localizado 5' con respecto a y operativamente ligado a una secuencia codificante que codifica un polipéptido que confiere elevada tolerancia a condiciones de deficiencia de agua.

6. 6.

   El vector de expresión de la reivindicación 1, en el que el promotor inducible por agua comprende SEQ ID NO:6.

7. 7.

   Una célula de planta huésped que comprende un vector de expresión según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. 8.

   Una planta transgénica que comprende un vector de expresión según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la planta transgénica tiene mayor tolerancia a condiciones de deficiencia de agua que una planta de control.

9. 9.

   La planta transgénica de la Reivindicación 8, en la que el vector de expresión comprende un polinucleótido recombinante que comprende un sitio de unión de ARN polimerasa localizado 5' con respecto a y operativamente ligado a una secuencia codificante que codifica un polipéptido que confiere elevada tolerancia a condiciones de deficiencia de agua.

10. 10.

    Una semilla transgénica producida por la planta transgénica de la Reivindicación 8, en la que la semilla transgénica comprende el vector de expresión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

11. 11.

    Un procedimiento para la producción de una planta transgénica que tiene mayor tolerancia a condiciones de deficiencia de agua que una planta de control, incluyendo el procedimiento las etapas:

    (a)

    generar un vector de expresión según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6; y

    (b)

    transformar una planta diana con el vector de expresión para producir la planta transgénica;

    en el que cuando el polipéptido se expresa en exceso en la planta transgénica, la planta transgénica tiene mayor tolerancia a condiciones de deficiencia de agua que la planta de control.