CN116640200B - 调控MfERF086基因在紫花苜蓿生长发育和/或耐冷性中的应用 - Google Patents

调控MfERF086基因在紫花苜蓿生长发育和/或耐冷性中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域。本发明提供了调控MfERF086基因在紫花苜蓿生长发育和/或耐冷性中的应用。MfERF086基因过量表达使紫花苜蓿株高增加、叶片发育速度加快、叶片增大和耐冷性增强；而MfERF086基因抑制表达则降低紫花苜蓿叶片发育速度，使株高降低，叶片发育减缓且减小，耐冷性降低。本发明提供的黄花苜蓿ERF转录因子MfERF086基因调控制剂在调控紫花苜蓿生长发育和/或耐冷性中的应用为利用基因工程技术初步选育紫花苜蓿新品种提供了新颖实用的方法。

Description

调控MfERF086基因在紫花苜蓿生长发育和/或耐冷性中的 应用
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及调控MfERF086基因在紫花苜蓿生长发育和/或耐冷性中的应用。
背景技术
转录因子(transcription factor，TF)也称反式作用因子，是能够与真核基因启动子区域中的顺式作用元件发生特异性相互作用的DNA结合蛋白，通过他们之间以及与其他相关蛋白质间的相互作用，激活或抑制其靶基因的转录。近年来，相继从高等植物中分离出一系列调控干旱、低温、高盐、激素、病源反应及发育等相关基因表达的转录因子。AP2/EREBP乙烯应答元件结合蛋白转录因子家族是广泛存在于植物中的一个超大转录因子家族，家族成员在植物的生长发育、器官构建、逆境胁迫及激素信号应答中发挥重要调控作用。
抗冻性不仅决定植物的地理分布，而且影响产量，因此植物的抗寒机理已成为人们关注的焦点。植物受到低温后，会有大量基因的表达发生变化以应对低温胁迫带来的伤害。许多研究结果表明，植物非生物胁迫抗性相关的转录因子主要有6类：AP2/EREBP类、MYB/MYC类、NAC类、bZIP类、NF-Y类和WRKY类，其中AP2/EREBP类转录因子的抗寒机理在植物低温转录因子中研究的最为深入。
紫花苜蓿(Medicago sativa L.)蛋白质含量高，维生素种类丰富，所调制的饲料口感极好，为各种家畜所喜食，是我国种植面积最广的人工牧草之一。因此紫花苜蓿的种植对经济、环境和农业的可持续发展均有长远意义。紫花苜蓿传统育种周期长、时间成本和经济成本大，所以近些年对紫花苜蓿的基因功能研究、基因编辑等生物育种研究开展的如火如荼。紫花苜蓿遗传转化技术是近年来的研究热点，其很大程度上影响着植物基因的转化效率。遗传转化方法是关系到植物性状定向改良和基因功能研究的核心技术，能极大加速育种进程和机制挖掘，对植物遗传转化技术进行深入研究能加快对植物基因的改良和促进植物优良性状的繁殖和精确育种。这就对苜蓿相关研究的技术手段提出了更多需求，特别是亟需高效快捷的各类遗传转化体系。
目前改良紫花苜蓿抗冻性新品种的技术缺乏，如果能通过分子遗传学与基因编辑等技术手段改善紫花苜蓿抗冻能力和增加紫花苜蓿的生长速率，将极大促进紫花苜蓿在生产中的应用。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的提供一种ERF转录因子MfERF086基因调控制剂在调控紫花苜蓿生长发育和/或耐冻性中的应用，有利于通过分子遗传学手段实现对紫花苜蓿抗寒和促生。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种黄花苜蓿ERF转录因子MfERF086基因调控制剂在调控紫花苜蓿生长发育和/或耐冷性中的应用，所述MfERF086基因编码的蛋白质包括如下A1～A4中的任一种；
A1、氨基酸序列为SEQ ID NO.2的蛋白质；
A2、将A1经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
A3、与A1或A2所限定的氨基酸序列具有80％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；
A4、在A1～A3中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签后得到的融合蛋白。
优选的，所述黄花苜蓿转录因子MfERF086基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
优选的，所述调控制剂包括MfERF086基因过表达制剂或抑制MfERF086基因表达制剂。
优选的，所述MfERF086基因过表达制剂能够促进紫花苜蓿生长发育和/或提高紫花苜蓿耐冷性。
优选的，所述抑制MfERF086基因表达制剂能够抑制紫花苜蓿生长发育和/或降低紫花苜蓿耐冷性。
本发明提供了一种MfERF086基因过表达制剂，所述MfERF086基因过表达制剂包括MfERF086基因的过表达载体。
本发明提供了一种tasiRNA在抑制MfERF086基因表达中的应用，所述tasiRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示。
本发明提供了一种抑制MfERF086基因表达的碱基片段，所述碱基片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。
本发明提供了一种用于扩增上述技术方案所述碱基片段的引物对，其特征在于，所述引物对包括上游引物MfERF086 RNAi-F和下游引物MfERF086-R；所述上游引物MfERF086 RNAi-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，所述下游引物MfERF086-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明提供了一种抑制MfERF086基因表达的表达载体，所述表达载体包括上述技术方案所述碱基片段。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种黄花苜蓿ERF转录因子MfERF086调控制剂在调控紫花苜蓿生长发育和/或耐冷性中的应用，所述MfERF086蛋白包括如下A1～A4中的任一种；A1、氨基酸序列为SEQ ID NO.2的蛋白质；A2、将A1经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；A3、与A1或A2所限定的氨基酸序列具有80％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；A4、在A1～A3中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签后得到的融合蛋白。
本发明采用转基因技术，将MfERF086基因整合到紫花苜蓿基因组中，初步定向改变紫花苜蓿发育速度、叶片形态特征和耐冷性。在本发明中，MfERF086基因过量表达使紫花苜蓿株高增加、叶片发育速度加快、叶片增大和耐冷性增强；而MfERF086基因抑制表达则降低紫花苜蓿叶片发育速度，使株高降低，叶片发育减缓且减小和耐冷性降低。本发明提供的黄花苜蓿ERF转录因子MfERF086基因调控制剂在调控紫花苜蓿生长发育和/或耐冷性中的应用为利用基因工程技术初步选育紫花苜蓿新品种提供了新颖实用的方法。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为黄花苜蓿中MfERF086在冷冻胁迫条件下的相对表达情况图；
图2为黄花苜蓿中MfERF086在ABA胁迫条件下的相对表达情况图；
图3为MfERF086蛋白亚细胞定位实验中激光共聚焦显微镜观察结果图；
图4为转录激活实验中的图，A为MfERF086全长(a)、N端+ERF结构域(b)、ERF结构域(c)、ERF结构域+C端(d)、C端(e)5个片段图；B为MfERF086基因5种不同目的片段融合表达载体的酵母转化子在不同培养基上的培养结果图；
图5为MfERF086基因引物扩增片段图；
图6为转基因紫花苜蓿和野生型紫花苜蓿中MfERF086基因的两次PCR产物的凝胶电泳结果图；
图7为转基因紫花苜蓿和野生型紫花苜蓿中MfERF086基因的RT-qPCR检测结果图；
图8为MfERF086过表达转基因株系#2和MfERF086抑制表达转基因株系#7以及野生型紫花苜蓿的生长情况图；
图9为野生型植株和转基因植株的株高、分孽数、三叶数和分节数统计结果图；
图10为野生型植株和转基因植株单叶重量、单叶面积和单叶周长统计结果图；
图11为野生型植株和转基因植株单叶长度、单叶宽度和单叶长宽比统计结果图；
图12为耐冷试验过程中野生型植株和转基因植株的生长状态图；
图13为耐冷性试验存活率统计结果图；
图14为耐冷性试验电导率统计结果图；
图15为耐旱试验过程中野生型植株和转基因植株的生长状态图；
图16为耐旱性试验野生型植株和转基因植株存活率结果图；
图17为耐旱性试验野生型植株和转基因生理生化检测结果图。
具体实施方式
本发明提供了黄花苜蓿ERF转录因子MfERF086基因调控制剂在调控紫花苜蓿生长发育和/或耐冷性中的应用，所述MfERF086基因编码的蛋白质包括如下A1～A4中的任一种；
A1、氨基酸序列为SEQ ID NO.2的蛋白质；
A2、将A1经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
A3、与A1或A2所限定的氨基酸序列具有80％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；
A4、在A1～A3中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签后得到的融合蛋白。
在本发明中，所述MfERF086基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体如下：
MEDHQKGKHGKEEKGKEEVRFRGVRRRPWGKYAAEIRDPSKQGTRMWLGTFDTAEEAAR AYDRAAFNLRGHLAILNFPSEYYSKIRGSPPYPPHLAPPSYTTSSSHHASGSSSGPQHRPIFEFECLDDKILEELLGSEEVKKKK。
在本发明中，MfERF086蛋白定位于细胞核中；MfERF086蛋白的C端具有转录激活活性。
在本发明中，所述黄花苜蓿MfERF086基因的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.1所示，具体如下：
5’-ATGGAGGATCACCAGAAGGGAAAGCATGGAAAGGAGGAGAAGGGAAAGGAAGAGG TTCGGTTCCGAGGTGTGAGGAGGAGGCCATGGGGGAAGTACGCGGCGGAGATAAGGGATCCATCTAAGCAAGGGACAAGGATGTGGTTAGGGACATTTGATACGGCTGAAGAAGCAGCAAGAGCTTATGATCGAGCTGCTTTTAATTTGAGGGGTCATCTTGCAATTTTGAATTTTCCTAGTGAGTATTATTCTAAAATAAGAGGGTCACCACCATATCCACCTCATTTAGCACCACCATCCTACACCACTTCATCATCTCATCATGCTAGTGGTAGTTCTTCTGGTCCACAACACAGGCCCATCTTTGAGTTTGAGTGTTTGGATGATAAGATATTGGAGGAACTTCTTGGGTCAGAGGAGGTGAAAAAGAAAAAGTAA-3’。
在本发明中，所述MfERF086基因调控制剂优选包括MfERF086基因过表达制剂或抑制MfERF086基因表达制剂。
在本发明中，所述MfERF086基因过表达制剂能够促进紫花苜蓿生长发育和/或提高紫花苜蓿耐冷性。
在本发明中，所述提高紫花苜蓿耐冷性优选包括提高寒冷条件下紫花苜蓿的存活率和/或能够使寒冷条件下紫花苜蓿的电导率保持较低水平，减小寒冷条件对细胞膜的损伤程度。本发明通过在紫花苜蓿中过表达MfERF086基因，可以提高紫花苜蓿的耐冷性，提高紫花苜蓿在寒冷条件下的存活率，使寒冷条件下紫花苜蓿的电导率保持较低水平，进而减小寒冷条件对细胞膜的损伤程度。
在本发明中，所述促进紫花苜蓿生长发育优选包括促进紫花苜蓿生长速率和/或使紫花苜蓿叶片增大。本发明通过过表达MfERF086基因可以促进紫花苜蓿的生长，使紫花苜蓿株高增加，三叶数增加，叶片宽度增加和叶面积增大。
在本发明中，所述抑制MfERF086基因表达制剂能够抑制紫花苜蓿生长发育和/或降低紫花苜蓿耐冷性。
在本发明中，所述降低紫花苜蓿耐冷性优选包括降低寒冷条件下紫花苜蓿的存活率和/或增加寒冷条件下紫花苜蓿的电导率。本发明通过抑制MfERF086基因表达可以降低紫花苜蓿的耐冷性，降低紫花苜蓿在寒冷条件下的存活率，增加寒冷条件下紫花苜蓿的电导率，进而增加寒冷条件对紫花苜蓿细胞膜的损伤程度。
在本发明中，所述抑制紫花苜蓿生长发育优选包括降低紫花苜蓿生长速率和/或使紫花苜蓿叶片减小。本发明通过抑制MfERF086基因表达可以抑制紫花苜蓿生长，降低紫花苜蓿株高、降低叶片重量、降低叶片长度和降低叶面积。
本发明提供了一种MfERF086基因过表达制剂，包括MfERF086基因过表达载体。
本发明对MfERF086基因过表达载体的制备方法没有特殊限定，采用本领域常规过表达载体的制备方法制备得到的MfERF086基因过表达载体均可。
在本发明中，所述MfERF086基因过表达载体的构建方法优选包括以下步骤：
将带有酶切位点的MfERF086基因克隆入表达载体中，得到MfERF086基因过表达载体。
在本发明中，所述酶切位点优选包括Sac I和Xba I酶切位点；所述表达载体优选包括pCAM1307质粒。本发明对将带有酶切位点的MfERF086基因克隆入表达载体中的方法没有特殊限定，采用本领域常规方法均可。
本发明提供了一种转基因紫花苜蓿的构建方法，包括以下步骤：
将MfERF086基因过表达载体转化工程菌，筛选阳性工程菌；
将阳性工程菌侵染紫花苜蓿叶片，得到转化后的紫花苜蓿叶片；
将转化后的紫花苜蓿叶片进行组织培养，得到MfERF086基因过表达的转基因紫花苜蓿。
在本发明中，所述MfERF086基因过表达载体优选包括重组质粒pCAM1307-OE-MfERF086。在本发明中，所述工程菌优选包括农杆菌EHA105。本发明对所述表达载体转化农杆菌的方法没有特殊限定，采用本领域常规转化方法均可。本发明所述转化方法优选包括液氮速冻和热激；所述液氮速冻的时间优选为2min；所述热激的时间优选为30s。转化完成后，本发明优选筛选阳性菌落，得到阳性农杆菌。本发明筛选阳性菌落的方法优选包括将转化后的农杆菌初代培养后，进行固体培养。本发明进行初代培养的培养基优选为YEB培养基；所述初代培养的温度优选为28℃；所述初代培养的时间优选为4h，所述初代培养优选在190rpm条件下进行。初代培养完成后，本发明优选将所述农杆菌进行固体培养。本发明所述固体培养的培养基优选为含有卡那霉素和利福平的YEB固体培养基；所述YEB固体培养基中卡那霉素的质量浓度优选为50mg/L，利福平的质量浓度优选为75mg/L。本发明所述固体培养的温度优选为28℃，所述固体培养的时间优选为2d。本发明所述固体培养的方式优选为倒置培养。培养完成后，筛选得到的菌落即为阳性菌落；所述阳性菌落即为阳性农杆菌。
得到阳性农杆菌后，本发明将阳性农杆菌侵染紫花苜蓿叶片，得到转化后的紫花苜蓿叶片。
得到阳性农杆菌后，本发明优选将阳性菌落进行扩大培养。本发明扩大培养用培养基优选为YEB培养基。本发明所述扩大培养的温度优选为28℃。本发明优选通过扩大培养得到OD600值为0.6～0.8的农杆菌菌液。得到农杆菌菌液后，本发明优选通过离心，弃上清收集阳性农杆菌菌体。本发明所述离心的转速优选为2400rpm；所述离心的时间优选为15min。得到阳性农杆菌菌体后，本发明优选重悬农杆菌菌体，得到农杆菌侵染液。本发明优选使用含100μmol/L乙酰丁香酮的SH3α液体培养基重悬农杆菌菌体。
得到农杆菌侵染液后，本发明优选通过农杆菌侵染液侵染紫花苜蓿叶片，得到转化后的紫花苜蓿叶片。本发明所述紫花苜蓿叶片优选为中苜一号叶片，更优选为培育4～6周生长状态良好的叶片。本发明优选通过EHA105介导的叶盘法转化紫花苜蓿。在进行转化前，本发明优选将紫花苜蓿叶片依次进行清洗和灭菌，得到预处理的紫花苜蓿叶片。本发明所述清洗优选采用超纯水进行清洗。清洗完成后，本发明优选进行灭菌。本发明所述灭菌优选采用次氯酸漂洗液和Tween-20混合溶液进行。在本发明中，所述次氯酸漂洗液中次氯酸的质量百分含量优选为7％。在本发明中，所述Tween-20和次氯酸漂洗液的体积比优选为1:3000。本发明所述灭菌的时间优选为10～13min。得到预处理的紫花苜蓿叶片后，本发明优选将预处理的紫花苜蓿叶片和农杆菌侵染液进行混合，得到紫花苜蓿侵染体系。得到紫花苜蓿侵染体系后，本发明优选对紫花苜蓿侵染体系进行真空渗透。本发明进行真空渗透的压强优选为0.08～0.09MPa；所述真空渗透的时间优选为10min。真空渗透完成后，本发明优选弃置农杆菌悬液，在灭菌滤纸上吸除叶片表面的农杆菌，得到转化后的紫花苜蓿叶片。
得到转化后的紫花苜蓿叶片后，本发明优选转化后的紫花苜蓿叶片进行组织培养，得到MfERF086基因过表达的转基因紫花苜蓿。
本发明优选在共培养基上对转化后的紫花苜蓿进行暗培养，得到初培养外植体。本发明所述暗培养的温度优选为24℃；所述暗培养的时间优选为24～30h。得到初培养外植体后，本发明优选将初培养外植体移入选择培养基上进行继代培养，得到愈伤组织。本发明所述继代培养的温度优选为24℃；所述继代培养优选每2周继代一次；所述继代培养的时间优选为5～6周。本发明所述继代培养优选培养至愈伤组织形成。本发明所述继代培养过程优选进行暗培养。
得到愈伤组织后，本发明优选将愈伤组织转移至MSBK培养基上进行胚状体培养。本发明所述胚状体培养的时间优选为10～14d。本发明胚状体培养优选培养至出现绿色胚状体；所述胚状体培养的光照强度优选为150μmol/m2/s，所述胚状体培养的温度优选为20℃～24℃，所述胚状体培养的光暗比优选为16h:8h。胚状体培养完成后，得到出现绿色胚状体的愈伤组织。得到绿色胚状体愈伤组织后，本发明优选将绿色胚状体愈伤组织进行芽分化培养。本发明所述芽分化培养优选在SH9培养基中进行。本发明所述芽分化培养的光照强度优选为150μmol/m2/s，所述芽分化培养的温度优选为20℃～24℃，所述芽分化培养的光暗比优选为16h:8h；所述芽分化培养过程中优选每3～4周继代一次；所述芽分化培养的时间优选为6～8周。芽分化培养完成时，得到长出2～3片完全展开的三片叶植株，简称为三片叶植株。得到三片叶植株后，本发明优选将三片叶植株进行生根培养，得到生根幼苗。本发明所述生根培养优选在MSO培养基中进行。本发明所述生根培养的光照强度优选为150μmol/m2/s，所述生根培养的温度优选为20℃～24℃，所述生根培养的光暗比优选为16h:8h，所述生根培养的时间优选为1个月。若生长健壮的苗一个月难以生根，本发明优选在MSO培养基中添加IAA促进生根。在本发明中，所述IAA的添加量优选为1mg/L。
得到生根幼苗后，本发明优选将生根幼苗进行炼苗。本发明所述炼苗优选在蛭石和珍珠岩体积比为1:1的土壤基质中进行。本发明所述炼苗的光照强度优选为150μmol/m2/s；所述炼苗的温度优选为20℃～24℃；所述炼苗的光暗比优选为16h:8h；所述炼苗的时间优选为1～2周。炼苗完成后，本发明优选将幼苗移栽至营养土和蛭石体积比为1:1的基质中进行培养，得到MfERF086基因过表达的转基因紫花苜蓿。
本发明构建得到的转基因紫花苜蓿中通过将MfERF086基因表达载体整合到紫花苜蓿基因组中，初步定向改变紫花苜蓿发育和抗冷性。MfERF086基因过表达使紫花苜蓿耐冷性增强、株高增加，三叶数增加，叶片宽度增加和叶面积增大，为培育高抗、高产、高蛋白的豆科牧草新品种提供新的理论基础和候选基因。
本发明提供了一种tasiRNA在抑制MfERF086基因表达中的应用，所述tasiRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，具体为：5’-TTCAGAGGTGAAGACACACGTA-3’。在本发明中，所述tasiRNA优选与靶基因片段连接后，导入紫花苜蓿中发挥抑制靶基因表达的效果。在本发明中，所述tasiRNA优选连接于靶基因片段的5’端之前；所述靶基因片段优选为靶基因3’端300bp左右的序列。本发明所述tasiRNA除能降低MfERF086基因表达外，还可以对其他基因有干扰表达效果。
本发明提供了一种基于上述技术方案所述tasiRNA得到的降低MfERF086基因表达的碱基片段，所述碱基片段的核苷酸序列优选如SEQ ID NO.16所示。本发明提供的所述碱基片段抑制表达MfERF086基因的效率为60％～80％，有明显的抑制表达作用。
本发明提供了一种用于扩增上述技术方案所述碱基片段的引物对，所述引物对包括上游引物MfERF086 RNAi-F和下游引物MfERF086-R；所述上游引物MfERF086 RNAi-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，具体为：5’-CGAGCTCTTCAGAGGTGAAGACACACGTATGTGGTTAGGGACATTTGATACG-3’，所述下游引物MfERF086-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：5’-GCTCTAGATTACTTTTTCTTTTTCACCTCCTCT-3’。在本发明中，所述碱基片段包括Sac I和XbaI限制性内切酶酶切位点，方便与表达载体连接。
本发明优选以黄花苜蓿cDNA为模板通过MfERF086 RNAi-F和MfERF086-R获得SEQID NO.16所示的碱基片段。在本发明中，所述碱基片段为带有tasiRNA的MfERF086基因的片段。所述碱基片段能够实现降低MfERF086基因的表达。
本发明提供了一种抑制MfERF086基因表达的制剂，所述制剂包括上述技术方案所述碱基片段的表达盒、载体或转基因细胞中的一种或两种以上。
本发明提供了一种抑制MfERF086基因表达的表达载体，所述表达载体包括上述技术方案所述碱基片段。在本发明中，所述表达载体优选包括pCAM1307质粒。
本发明提供了一种基于上述技术方案所述抑制MfERF086基因表达的表达载体构建得到的工程菌。在本发明中，所述工程菌优选包括农杆菌EHA105。
本发明还提供了一种转基因紫花苜蓿的构建方法，包括以下步骤：
将抑制MfERF086基因表达载体转化工程菌，筛选阳性工程菌；
将阳性工程菌侵染紫花苜蓿叶片，得到转化后的紫花苜蓿叶片；
将转化后的紫花苜蓿叶片进行组织培养，得到抑制MfERF086基因表达的转基因紫花苜蓿。
本发明所述构建方法同上，在此不进行赘述。
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
本发明使用的培养基如下：
所述基本培养基包括以下组分：MgSO4·7H2O 185mg/L、KNO32830 mg/L、(NH4)2SO4463mg/L、CaCl2·2H2O 166mg/L、KH2PO4400mg/L、MnSO4·H2O 10mg/L、H3BO35.0mg/L、ZnSO4·7H2O 1.0mg/L、KI 1.0mg/L、Na2MoO4·2H2O 0.1mg/L、CuSO4·5H2O 0.2mg/L、CoCl2·6H2O 0.1mg/L、EDTA-FeNa140mg/L、盐酸硫胺素5.0mg/L、盐酸比哆醇5.0mg/L、烟酸5.0mg/L和肌醇100mg/L；所述基本培养基的pH 5.8～6.0。
所述共培养的培养基除基本培养基外，还含有：蔗糖30g/L、乙酰丁香酮100μmol/L、2,4-D4mg/L、6-BA0.5mg/L和植物凝胶3g/L。
所述愈伤组织培养的培养基(继代培养用培养基)除基本培养基外，还含有：蔗糖30g/L、2,4-D4mg/L、6-BA0.5mg/L、特美汀200mg/L、潮霉素B10mg/L和植物凝胶3g/L。
所述胚状体诱导的培养基(MSBK培养基)以MS培养基为基本培养基，还含有：蔗糖30g/L、激动素1mg/L、6-BA0.5mg/L、特美汀150mg/L、潮霉素B 5mg/L和植物凝胶3g/L，pH5.8～6.0。
所述胚状体分化的培养基(SH9培养基)除基本培养基外，还含有：蔗糖20g/L、特美汀150mg/L、潮霉素B 5mg/L和植物凝胶3g/L，pH 5.8～6.0。
所述生根培养的培养基以MS培养基为基本培养基，还含有：蔗糖10g/L和植物凝胶3g/L，pH5.8～6.0。
SH3α培养基组分如下：N6大量元素100mL；SH微量盐1mL；SH维生素1mL；肌醇100mg；蔗糖30g；10mg/mL 2,4-D 0.4mL；1mg/mL 6-BA0.5mL；100mMAS乙酰丁香酮1mL；400mg/mLTMT 0.5mL；50mg/mL Hyg(潮霉素)200μL；植物凝胶3g，水定容至1L；该培养基的pH为5.8。
N6大量元素：MgSO4·7H2O 1.85g/L、KNO328.3g/L、(NH4)2SO44.63g/L、CaCl2·2H2O2.475g/L、KH2PO44g/L。
SH微量盐：MnSO4·H2O 1g/L、H3BO30.5 g、ZnSO4·7H2O 0.1g、KI 0.1g、Na2MoO4·2H2O 0.01g和H2O 100mL。
SH维生素：烟酸O.5g、盐酸硫胺素B1 0.5g、盐酸吡哆醇B6 0.5g和H2O 100mL。
实施例1
黄花首蓿MfERF086转录因子的获取。
总RNA的提取材料为250mmol/LNaCl盐胁迫处理24h后的黄花首蓿野生型植株茎组织。
总RNA的提取方法：采用液氮研磨法，使用Takara生物公司的Trizol RNA提取试剂提取。
cDNA合成：按照Takara生物公司的反转录试剂盒(6210A)说明书反转录合成cDNA。
以MfERF086-F和MfERF086-R为引物按照GXL DNA Polymerase试剂盒(TAKARA，Code No.R050A)说明书进行RT-qPCR操作，引物信息具体如表1所示。
表1扩增MfERF086基因用引物
引物名称 引物编号 5’-3’
MfERF086-F SEQ ID NO.3 GCGAATTCATGGAGGATCACCAGAAGGG
MfERF086-R SEQ ID NO.4 GCTCTAGATTACTTTTTCTTTTTCACCTCCTCT
PCR反应条件为：预变性95℃，5min；变性98℃，10s；退火50℃，30s；延伸68℃，1min，变性至延伸30个循环；后延伸68℃，10min；4℃保存。
PCR反应结束后，使用生工生物工程股份有限公司的SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收目的片段(产物约450bp)，按照试剂盒说明书的方法进行操作。
将回收得到的目的片段进行测序，将测序结果经过序列比对得到黄花首蓿MfERF086基因CDS序列。MfERF086基因CDS的核苷酸如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQID NO.2所示。
实施例2
黄花首蓿MfERF086基因的表达模式分析
植物材料选择正常生长30d的野生型黄花首蓿。
-8℃冷冻胁迫处理方法为：将黄花首蓿置于-8℃植物低温培养箱中胁迫处理0h、2h、4h、8h、24h、48h。
ABA胁迫处理方法为：将黄花首蓿以100μM ABA溶液胁迫处理0h、2h、4h、8h、24h、48h。
在不同胁迫时间点将黄花首蓿根茎叶组织分离后用锡箔纸包好，标记后(胁迫条件、胁迫时间、组织类型)液氮速冻，于-80℃保存。
将上述胁迫处理条件下的黄花首蓿分别提取RNA，经逆转录获得cDNA，以此cDNA为模板，以MfERF086 DL-F和MfERF086 DL-R为引物，按照TAKARA生物公司荧光定量试剂盒(RR047Q)说明书进行RT-qPCR操作。同时，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因(GenBank登录号GQ398120)作为Q-PCR内参基因。MfERF086 DL-F和MfERF086DL-R引物序列以及内参基因的引物序列如表2所示。
表2引物序列
引物名称 引物编号 5’-3’
MfERF086 DL-F SEQ ID NO.5 GGACATTTGATACGGCTGAA
MfERF086 DL-R SEQ ID NO.6 GGTGGTGACCCTCTTATITTA
Actin-F SEQ ID NO.17 GCTGATAGGATGAGCAAGGAG
Actin-R SEQ ID NO.18 GAGCCTCCAATCCAGCAGACACTAT
通过RT-qPCR结果计算MfERF086相对表达量使用2-Δ△Ct公式方法进行计算。
通过RT-qPCR得到MfERF086在冷冻胁迫条件下的相对表达情况如图1所示。通过RT-qPCR得到MfERF086在ABA胁迫条件下的相对表达情况如图2所示。
由图1和图2可得，发现MfERF086响应冷冻和ABA处理，在茎中表达量显著降低。
实施例3
黄花首蓿MfERF086基因的亚细胞定位分析
1.构建重组质粒pBE-GFP-MfERF086
采用实施例1中的方法获取黄花首蓿的cDNA。
按照全式金生物公司试剂盒(CB101-01)说明书，将MfERF086基因cDNA连接到/>载体。
使用MfERF086 PBE-F和MfERF086 PBE-R引物对进行PCR，获得带有BamH I和Sal I酶切位点的MfERF086全长cDNA。MfERF086 PBE-F和MfERF086 PBE-R引物信息如表3所示。
表3 MfERF086 PBE-F和MfERF086 PBE-R引物信息
引物名称 引物编号 5’-3’
MfERF086 PBE-F SEQ ID NO.7 GACTCTAGAGCAGTCGACGATGGAGGATCACCAGAAGGG
MfERF086 PBE-R SEQ ID NO.8 GGCGACCGGTGGATCCCGCTTTTTCTTTTTCACCTCCTCT
PCR反应体系如表4所示。
表4 PCR反应体系
PCR反应条件为：预变性98℃，5min；变性98℃，10s；退火61℃，30s；延伸68℃，1min，变性至延伸30个循环；后延伸68℃，10min；4℃保存。
PCR反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，通过条带的大小判断得到目的片段。
PCR反应结束后，使用生工生物工程股份有限公司的SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒按照试剂盒说明书的方法回收目的片段(产物约470bp)。
将pBE空载质粒用BamH I和Sal I进行双酶切，酶切体系如表5所示。
表5酶切体系
试剂 用量(μL)
pBE质粒(100ng/μL) 10
10×T Buffer 3
BamH I 1
Sal I 1
ddH2O 补足至20μL
按酶切体系混匀后37℃酶切1h。酶切反应结束后，使用生工生物工程股份有限公司的SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒按照试剂盒说明书的方法回收线性化质粒载体。
使用TaKaRa公司的HD Cloning Kit试剂盒进行目的片段和pBE载体的同源重组连接。将连接产物转化大肠杆菌DH5α，经菌落PCR检测后送测序，对测序验证的阳性克隆扩大培养，提取质粒备用。
2.重组质粒pBE-GFP-MfERF086转化农杆菌GV3101
吸取5μL浓度为100ng/μL的重组质粒pBE-GFP-MfERF086和空载pBE-GFP，加入到50μL农杆菌GV3101感受态细胞中。轻轻混匀后冰上静置5min，液氮5min，转移到37℃水浴热激5min，冰水浴5min，在超净工作台中加入平衡至室温的LB液体培养基700μL，于28℃、200rpm条件下培养2h。
培养完成后，6000rpm离心1min，弃上清500μL，使用移液器吹打剩余液体，以达到重悬浮菌体的目的，方便下一步涂布。吸取80μL剩余液体涂布于含有50mg/L Kan(卡那霉素)、50mg/L genta(庆大霉素)、25mg/L Rif(利福平抗生素)的LB固体培养基上，28℃倒置培养36～48h，直至长出单菌落。
3.注射侵染本式烟草叶片下表皮
挑取阳性农杆菌GV3101单菌落于含Kan、Gent和Rif的YEB液体培养基中，28℃振荡培养24h。
培养完成后，取500μL菌液加至含500μL 1M MES(2-(N-吗啡林)乙磺酸)和5μL200mM AS(乙酰丁香酮，利于农杆菌侵染烟草叶片)的40mL YEB三抗(Kan、Gent和Rif)液体培养基中，28℃振荡培养至OD600值在1.2～1.5之间。
培养完成后，采用离心的方法收集菌体(4℃，8000rpm，离心10min)后加入侵染液(每100mL ddH2O中含1mL 1M MES、1mL 1M MgCl2和100μL 200mM AS)重悬，使OD600值为1.0，黑暗静置4h后注射4周龄烟草叶片下表皮，置于植物组培室培养36h。
4.激光共聚焦显微镜观察叶片荧光
剪取侵染部位的烟草叶片，置于培养皿中，将DAPI滴于叶片上，染色20min后用PBS缓冲液清洗两次，每次20min。将染色后的叶片正面朝上置于载玻片上，用激光共聚焦显微镜观察。
亚细胞定位实验中激光共聚焦显微镜观察结果图如图3所示。
由图3可得，结果显示，与MfERF086融合的GFP的荧光信号与DAPI共定位，表明MfERF086基因定位于细胞核中。
实施例4
黄花首蓿MfERF086基因的转录激活实验分析
采用实施例1中的方法获取黄花首蓿的cDNA。
按照全式金生物公司试剂盒(CB101-01)说明书，将MfERF086基因cDNA连接到/>载体。
使用不同的引物分别获得MfERF086全长(a)、N端+ERF结构域(b)、ERF结构域(c)、ERF结构域+C端(d)、C端(e)5个片段，具有使用的引物信息如表6所示。
表6编码MfERF086全长、N端+ERF结构域、ERF结构域、ERF结构域+C端、C端5个片段的引物对
使用表6所示引物分别进行PCR，分别获得MfERF086全长(a)、N端+ERF结构域(b)、ERF结构域(c)、ERF结构域+C端(d)、C端(e)5个片段。5个片段具体如图4中的A所示。
PCR反应体系如表7所示。
表7 PCR反应体系
PCR反应程序为：预变性98℃，5min；变性98℃，30s；退火60℃，30s；延伸68℃，1min30s，变性至延伸30个循环；后延伸68℃，10min；16℃，10min。
将MfERF086全长(a)、N端+ERF结构域(b)、ERF结构域(c)、ERF结构域+C端(d)、C端(e)5个片段分别插入pGBKT7载体，构建融合表达载体。
构建融合表达载体
(1)PCR反应结束后，使用生工生物工程股份有限公司的SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收目的片段，按照试剂盒说明书的方法进行操作。
(2)将pBE空载质粒用BamH I和Not I进行双酶切，酶切体系如表8所示。
表8酶切体系
试剂 用量(μL)
pGBKT7质粒(100ng/μL) 10
10×K buffer 1
BamHI(15U/μL) 1
Not I(10U/μL) 1
ddH2O 补足至20μL
按酶切体系混匀后37℃酶切1h。酶切反应结束后，使用生工生物工程股份有限公司的SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收线性化质粒载体，按照试剂盒说明书的方法进行操作。
(3)按照目的片段与载体的摩尔比为(3～10)∶1的比例，将上述目的片段基因片段连接至pGBKT7线性化载体上，然后转化至大肠杆菌感受态细胞DH5a，涂板后挑取阳性克隆进行PCR检测。对测序验证的阳性克隆扩大培养，提取质粒备用。
将5个融合表达载体分别转入AH109酵母，5种融合表达载体的酵母转化子分别培养于SD/-Trp培养基(酵母缺陷型培养基，SD培养基中缺少色氨酸)和添加X-α-gal的SD/-Trp/-His/-Ade(SD培养基中缺少色氨酸、组氨酸、腺嘌呤)培养基中。
5种融合表达载体的酵母转化子在不同培养基上的培养结果如图4中的B所示。
由图4可得，5种融合表达载体的酵母转化子在SD/-Trp培养基上生长良好，而在添加X-α-gal的SD/-Trp/-His/-Ade培养基上仅有a和e观察到蓝色的酵母菌落，表明β-半乳糖苷酶报告基因已被转录激活，表现出良好的活性。上述结果证明MfERF086蛋白具有转录激活活性，且转录激活域位于C端。
实施例5
过表达MfERF086和抑制表达MfERF086转基因紫花首蓿的获取
1.过表达载体pCAM1307-OE-MfERF086和抑制表达载体pCAM1307-RNAi-MfERF086的构建采用实施例1中的方法获取黄花首蓿的cDNA。
使用MfERF086-F和MfERF086-R获得带有Sac I和Xba I酶切位点的OE-MfERF086全长cDNA，PCR反应体系和PCR条件同实施例3。MfERF086-F和MfERF086-R引物对信息如表9所示。
使用MfERF086 RNAi-F和MfERF086-R进行PCR(引物扩增片段如图5)，获得带有SacI和Xba I酶切位点的RNAi-MfERF086全长cDNA，PCR反应体系和PCR条件同实施例3。MfERF086 RNAi-F和MfERF086 R引物对信息如表9所示，扩增得到的目的片段如SEQ IDNO.16所示。
表9引物信息
PCR反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，通过条带的大小判断得到目的片段。
PCR反应结束后，使用生工生物工程股份有限公司的SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收目的片段(产物约330bp)，按照试剂盒说明书的方法进行操作。
用Sac I和Xba I双酶切空载质粒pCAM1307(以下简称p1307)，酶切体系如表10所示。
表10质粒酶切体系
试剂 用量(μL)
p1307质粒(100ng/μL) 10
10×M Buffer 2
Sac I 1
Xba I 1
ddH2O 补足至20μL
按酶切体系混匀后37℃酶切1h。酶切反应结束后，使用生工生物工程股份有限公司的SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒回收线性化质粒载体，按照试剂盒说明书的方法进行操作。
按照目的片段与载体的摩尔比为(3～10)∶1的比例，分别将目的片段OE-MfERF086和RNAi-MfERF086分别连接至p1307线性化载体上，分别得到过表达载体pCAM1307-OE-MfERF086和抑制表达载体pCAM1307-RNAi-MfERF086，然后分别将过表达载体pCAM1307-OE-MfERF086和抑制表达载体pCAM1307-RNAi-MfERF086转化至大肠杆菌感受态细胞DH5 a，涂板后挑取阳性克隆进行PCR检测。对测序验证的阳性克隆扩大培养，提取质粒备用。
2.过表达载体pCAM1307-OE-MfERF086和抑制表达载体pCAM1307-RNAi-MfERF086转化农杆菌EHA105
分别吸取5μL浓度为100ng/μL的过表达载体pCAM1307-OE-MfERF086和抑制表达载体pCAM1307-RNAi-MfERF086分别加入到50μL EHA105感受态中。液氮速冻2min，42℃热激30s，加入600μL YEB液体培养基，28℃，190rpm培养4h。
培养完成后，取80μL菌液涂布于含卡那霉素(50mg/L)和利福平(75mg/L)的YEB固体培养基上，28℃，倒置培养2d。
培养完成后筛选阳性菌落。选择阳性单菌落扩大培养至OD600为0.6～0.8，室温下2400rpm离心农杆菌菌液15min，弃上清，悬浮菌体，使OD600达到0.2～0.3，制成侵染液，分别得到过表达农杆菌EHA105侵染液(含有过表达载体pCAM1307-OE-MfERF086)和抑制表达农杆菌EHA105侵染液(含有抑制表达载体pCAM1307-RNAi-MfERF086)，备用。
3.农杆菌EHA105介导的叶盘法转化紫花首蓿
植物材料选择紫花首蓿中首一号，侵染材料选择培育四至六周生长状态良好的紫花首蓿叶片。
通过EHA105介导的叶盘法转化紫花首蓿：
将侵染材料使用超纯水清洗后，加入适量的次氯酸漂洗液和Tween-20混合溶液(混合溶液中，Tween-20和次氯酸漂洗液的体积比为1∶3000，次氯酸漂洗液次氯酸的质量百分含量为7％，次氯酸漂洗液购自于淘宝网，杀菌99.99％进口高乐氏1L*2瓶消毒液家用室内衣物次氯酸消毒漂白水)，使混合溶液没过叶片，除菌10～13min。
将步骤2中制备好的侵染液(过表达农杆菌EHA105侵染液和抑制表达农杆菌EHA105侵染液)分别与除菌后的三叶混合，0.08～0.09Mpa真空渗透叶片10min，室温超声(40kHz)处理4～5min，再次0.08～0.09Mpa真空渗透叶片10min。
真空渗透完成后，弃置农杆菌悬液，在灭菌滤纸上吸除叶片表面的农杆菌，将经上述处理的三叶铺于共培养基上，暗培养24～30h。将外植体移入选择培养基上进行愈伤组织的诱导培养，每2周继代一次，愈伤组织培育需5～6周。
将生长状态良好的愈伤组织转移到MSBK培养基上培养10～14d，直到出现绿色胚状体。
将有绿色胚状体的愈伤组织移入SH9培养基中进行芽分化。每3～4周继代一次，直到芽长大，通常在此培养基上芽长大需6～8周。当芽长出2～3个完全展开的三片叶时，移入MSO培养基中进行生根培养(若生长健壮的苗一个月内难以生根，则添加1mg/L IAA)。
将生根的植株移栽到蛭石和珍珠岩体积比为1∶1的基质中进行炼苗。存活的植株转移到营养土和蛭石体积比为1∶1的基质中进行培养。分别得到过表达MfERF086基因转基因紫花首蓿和抑制表达MfERF086基因转基因紫花首蓿。
4.转基因紫花首蓿的检测
采用PCR法和Q-PCR法对转基因株系(过表达MfERF086基因转基因紫花首蓿和抑制表达MfERF086基因转基因紫花首蓿)进行验证。
该步骤中采用野生型紫花首蓿植株作对照，实验材料为正常生长30d野生型“中首一号”紫花首蓿的叶片组织，处理及检测方法同转基因植株。
采用CTAB法获取成活30d的转基因植株叶片和野生植株叶片的DNA进行两次PCR鉴定。
第一次PCR使用MfERF086-F和3×Flag-R引物进行PCR(引物扩增片段如图5所示)。
第二次PCR使用MfERF086 RNAi-F和3×Flag-R进行PCR(引物扩增片段如图5所示)。
两次PCR引物信息如表11所示。
表11引物信息
PCR反应体系如表12所示
表12 PCR反应体系
试剂名称 用量(μL)
10×Buffer 2.5
dNTPs(2.5mM each) 2.0
MfERF086 RNAi-F 3.0
3×flag-R 3.0
DNA 2
rTaqDNA Polymerase(5U/μL) 0.125
ddH2O 12.375
Total 25
PCR反应条件为：预变性98℃，5min；变性98℃，10s；退火58℃，30s；延伸68℃，1min，变性至延伸30个循环；后延伸68℃，10min；4℃保存。
PCR反应完成，得到PCR产物后，采用琼脂糖凝胶电泳通过检测是否有目的条带产生和目的条带大小，判断阳性株系。
两次PCR产物凝胶电泳图如图6所示。
由图6可得，使用MfERF086-F和3×flag-R引物，以MfERF086转基因植株DNA为模板做PCR检测，MfERF086 RNAi株系无产物，MfERF086 OE株系得到500bp左右产物；使用MfERF086 RNAi-F和3×Flag-R引物。以MfERF086转基因植株DNA为模板做PCR检测，MfERF086 RNAi株系和MfERF086 OE株系得到350bp左右产物。PCR结果表明得到4株抑制表达转基因阳性植株和3株过表达转基因阳性植株。
分别对过表达MfERF086基因转基因紫花首蓿和抑制表达MfERF086基因转基因紫花首蓿的叶片提取RNA并反转录为cDNA，然后采用荧光定量RT-qPCR计算各株系MfERF086的相对表达量。同时，提取同一生长时期的野生型紫花首蓿RNA并反转录为cDNA，进行荧光定量RT-qPCR，计算MfERF086的相对表达量作为对照组。
进行RT-qPCR以MfERF086 DL-F和MfERF086 DL-R为引物，按照TAKARA生物公司荧光定量试剂盒(RR047Q)说明书操作。MfERF086 DL-F和MfERF086 DL-R引物信息详见表2。
通过RT-qPCR结果计算MfERF086相对表达量的方法和内参基因同实施例2。
转基因紫花首蓿和野生型紫花首蓿中MfERF086基因的RT-qPCR检测结果如表13和图7所示。
表13转基因紫花首蓿和野生型紫花首蓿中MfERF086基因的RT-qPCR检测结果
注：WT为野生型。
由表13和图7可得，与野生型(WT)相比，MfERF086过表达转基因株系表达量显著升高，抑制表达MfERF086基因转基因株系表达量显著降低。上述结果证明MfERF086基因已经转入紫花首蓿基因组中并得到过量或抑制表达的结果。结合定量结果，MfERF086抑制表达转基因株系#1、#4、#5、#7的抑制表达效果最好，后续实验选择株系#1、#5、#7进行；MfERF086过表达转基因株系#1、#2、#5的过表达效果最好，后续实验选择株系#1、#2、#5进行。
实施例6
过表达和抑制表达转基因株系的发育表型和耐冷性实验及干旱胁迫实验
(1)转基因紫花首蓿的扦插
在实施例5的基础上，选取MfERF086过表达转基因株系#2和MfERF086抑制表达转基因株系#7且生长状态良好的转基因植株茎叶，分别斜口剪下长约7cm的枝条，底部切口浸入生根粉(Solarbio，货号R8240)溶液(1g/L)中10min，插入浇透的蛭石中，仅留叶节处在地表。2周左右长出白而状的根，移栽于蛭石与营养土比值为3：2(v/v)的基质中，野生型紫花首蓿做同批扦插，作为对照组试验。每组试验样本数为≥30。
(2)抑制表达转基因株系的发育表型
选择在蛭石与营养土比值为3∶2(v/v)基质中生长30d的野生型植株和转基因植株进行发育表型的测量、统计和分析。
MfERF086过表达转基因株系#2和MfERF086抑制表达转基因株系#7以及野生型紫花首蓿的生长情况如图8所示。
野生型植株和转基因植株发育表型统计结果如表14和表15和图9～图11所示。其中野生型植株和转基因植株的株高、分孽数、三叶数和分节数如表14和图9所示。野生型植株和转基因植株单叶重量、单叶面积和单叶周长统计结果如表15和图10所示。野生型植株和转基因植株单叶长度、单叶宽度和单叶长宽比如表15和图11所示。
表14野生型植株和转基因植株的株高、分孽数、三叶数和分节数
组 分节数 分蘖数 株高 三叶数
WT 11.96 1.595 20.05 20.81
MfERF086 OE#2 10.68 1.42 24.2 23.49
MfERF086 RNAi#7 9.823 1.506 13.74 15.65
表15野生型植株和转基因植株单叶情况统计结果
在之前的研究中，将MfERF086基因于截型首蓿根组织中过表达或者在截型首蓿根组织中抑制表达时，未观察到截型首蓿的株型发育和叶型发育有显著性变化，而本发明中将MfERF086基因于紫花首蓿中过表达或者抑制表达对紫花首蓿的茎叶生长产生了显著的规律性的影响。由表14和表15和图8～图11可得，相对于对照(WT)植株，过表达植株株高增加，叶片宽度增加，叶面积增大；抑制表达植株株高降低，叶片重量降低，叶片长度降低，叶面积降低。
(3)过表达和抑制表达转基因株系的耐冷性实验
将在蛭石与营养土体积比为3：2的培养基质中生长30d的野生型植株和MfERF086过表达转基因株系#2和MfERF086抑制表达转基因株系#7放置在低温培养箱中，程序设为：0℃1h、-1℃1h、-2℃1h、-3℃1h、-4℃1h、-5℃1h、-6℃1h、-7℃1h、-8℃1h、-9℃1h.4℃过夜。从-4℃处理1h后开始取出部分植株立即置于4℃植物培养箱过夜培养，每降低一度取出部分植物材料立即置于4℃植物培养箱过夜培养，第二天将所有植物材料放至室温条件下恢复3d，恢复3d后计算实验组和对照组紫花首蓿存活率，检测比较实验前后实验组和对照组紫花首蓿电导率变化。CK对照组在相同试验条件下于常温条件进行培养。
电导率的测定方法为：i.将待测叶片置于含有25mL超纯水的50mL离心管中；ii.将离心管放入真空泵，抽真空(＜0.09Mpa)15min，取出离心管，放于摇床中，室温230rpm振荡平衡1h；iii.用电导率测定仪测定离心管中液体的电导率，记下初始数值S1；iv.将含有样品的离心管置于沸水浴中煮15min后，取出离心管，放于摇床中，室温230rpm振荡平衡1h，待管内液体温度降至室温；v.测定离心管中液体的电导率，记录数值为S2；vi.并同时测定超纯水的电导率，记录数值为S0；vii.根据每个样品的S1、S2和超纯水的电导率S0计算所测样品叶片的相对电导率，电导率的计算公式为：
相对电导率＝(S1-S0)/(S2-S0)。
野生型植株和MfERF086过表达转基因株系#2和MfERF086抑制表达转基因株系#7的耐冷性试验结果如表16和表17和图12～图14所示。其中图12为耐冷试验过程中野生型植株和转基因植株的生长状态。耐冷性试验存活率如表16和图13所示。耐冷性试验电导率统计结果如表17和图14所示。
表16野生型植物和转基因株系的耐冷性存活率统计结果
存活率 CK -4 -5 -6 -7 -8 -9
WT 100％ 100％ 83.33％ 61.54％ 14.29％ 0％ 0％
MfERF086 OE#2 100％ 100％ 100％ 73.33％ 71.43％ 23.08％ 0％
MfERF086 RNAi#7 100％ 100％ 100％ 57.14％ 14.29％ 7.69％ 0％
表17野生型植物和转基因株系的耐冷性电导率统计结果
电导率 CK -4 -5 -6 -7 -8 -9
WT 9.23％ 5.50％ 10.34％ 6.31％ 63％ 98.91％ 78.91％
MfERF086 OE#2 2.70％ 2.58％ 3.54％ 4.78％ 64.58％ 72.22％ 66.57％
MfERF086 RNAi#7 7.93％ 9.84％ 59.96％ 71.45％ 69.42％ 82.86％ 82.86％
由表16和表17和图12～图14可得，与野生型WT相比，过表达MfERF086转基因株系存活率更高，细胞膜通透性更好，受损伤更低，明显更耐冷胁迫；而抑制表达MfERF086株系对低温更敏感，存活率更低，细胞膜受损伤严重。上述结果表明，过表达MfERF086基因可以显著提高紫花首蓿耐冷性，抑制表达MfERF086基因使紫花首蓿对低温更敏感，MfERF086转录因子在紫花首蓿冷应答中起积极作用。
(4)过表达和抑制表达转基因株系的干旱胁迫实验
将在蛭石与营养土体积比为3∶2的培养基质中生长30d的野生型植株和MfERF086过表达转基因株系#2、#5和MfERF086抑制表达转基因株系#5、#7浇透，开始进行耐旱性实验，停止浇水3周，复水1周。复水完成后计算实验组和对照组紫花首蓿存活率，检测比较实验前后实验组和对照组紫花首蓿的生理生化指标变化。
生理生化指标检测使用苏州科铭生物技术有限公司试剂盒进行。
野生型植株和MfERF086过表达转基因株系#2、#5和MfERF086抑制表达转基因株系#5、#7耐旱性试验结果如图15～图17所示。其中图15为耐旱试验过程中野生型植株和转基因植株的生长状态图，图15植株从左至右依次为野生型植株，MfERF086过表达转基因株系#2，MfERF086过表达转基因株系#5，MfERF086抑制表达转基因株系#5，MfERF086抑制表达转基因株系#7。表18和图16为干旱胁迫实验中野生型植株和转基因植株存活率结果图。表19和图17为干旱胁迫实验中野生型植株和转基因植株生理生化检测结果图。
表18干旱胁迫实验中野生型植株和转基因植株存活率
表19干旱胁迫实验中野生型植株和转基因植株生理生化检测结果
由表18～表19和图15～17可得，MfERF086的过表达或者抑制表达对干旱胁迫无明显响应。
对比例1
在发明人之前的研究中，使用发根农杆菌Arqua1介导的毛根转化法在截形首蓿根组织中特异性过表达或者抑制表达了MfERF086基因(付佳宾.野生黄花首蓿ERF家族成员MfERF026和MfERF086基因的克隆及初步功能研究『D].内蒙古大学，2019)。根据该文献中的记载可知，各试验组中截型首蓿进行毛根转化时，均留取3mm的毛根进行毛根转化。同时，对照组也留取3mm根长的毛根。毛根转化后，将各试验组截型首蓿和对照组截型首蓿在相同条件下常温培养14d后，再进行-8℃胁迫和ABA胁迫处理。其中，进行不同的胁迫前各试验组截型首蓿和对照组截型首蓿在相同条件下常温培养14d后，各试验组和对照组对应的截型首蓿的根长如表20所示。
表20各试验组和对照组培养14d后对应的截型首蓿的根长(均值)
组 MfERF086-PKGWRR-RNAi MfERF086-PKGWRR-CK MfERF086-PKGWRR-OE
胁迫前根长-8℃(cm) 1.802 1.615 1.027
胁迫前根长ABA(cm) 1.805 1.831 2.253
在对瞬时表达转基因截形首蓿表型分析时未观察到截形首蓿的株型发育和叶型发育有显著性变化或差异。由表20可得，在-8℃胁迫前，相比于对照组，过表达MfERF086基因截形首蓿根长显著降低；在ABA胁迫前，相比于对照组，过表达或者抑制表达MfERF086基因截形首蓿根长无显著变化，表明MfERF086基因的过表达或者抑制表达对截形首蓿根生长无显著或规律性的影响。
毛根转化法有弊端，由于截形首蓿根系不发达，利用毛根转化法转入截形首蓿根组织时，所获得的转基因组织量较少，对于部分实验和指标检测造成了一定的困难。另外，毛根转化法只能研究基因在转基因当代根组织中的性状，仅仅利用基因的瞬时表达来研究植物的抗逆性远远不够，若想更深层次的研究基因的功能，还需要利用稳定遗传转化法将目的基因转化至植物体内以研究目的基因的作用，建立稳定的植物遗传体系对提高植物的抗性至关重要。
综上，本发明提供了一种黄花首蓿ERF转录因子MfERF086基因调控制剂在调控紫花首蓿生长发育和/或耐冷性中的应用。在本发明中，MfERF086基因过量表达使紫花苜蓿株高增加、叶片发育速度加快、叶片增大、耐冷性增强；而MfERF086基因抑制表达则降低紫花苜蓿叶片发育速度，使株高降低，叶片发育减缓且减小，耐冷性降低。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (9)

1.黄花苜蓿ERF转录因子MfERF086基因调控制剂在调控紫花苜蓿生长发育和/或耐冷性中的应用，所述MfERF086基因编码氨基酸序列为 SEQ ID NO.2的蛋白质；调控紫花苜蓿生长发育包括调控紫花苜蓿的株高、三叶数和叶面积中的一种或两种以上；
所述调控制剂为MfERF086基因过表达制剂或抑制MfERF086基因表达制剂。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述MfERF086基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述MfERF086基因过表达制剂能够促进紫花苜蓿生长发育和/或提高紫花苜蓿耐冷性；调控紫花苜蓿生长发育包括增加紫花苜蓿的株高、三叶数和叶面积中的一种或两种以上。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抑制MfERF086基因表达制剂能够抑制紫花苜蓿生长发育和/或降低紫花苜蓿耐冷性；调控紫花苜蓿生长发育包括降低紫花苜蓿的株高、三叶数和叶面积中的一种或两种以上。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述MfERF086基因过表达制剂包括MfERF086基因的过表达载体；所述过表达载体包括pCAM1307-OE-MfERF086。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，抑制MfERF086基因表达制剂包括tasiRNA；所述tasiRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，抑制MfERF086基因表达制剂包括抑制MfERF086基因表达的碱基片段，所述碱基片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，用于扩增所述碱基片段的引物对包括上游引物MfERF086 RNAi-F和下游引物MfERF086 -R；所述上游引物MfERF086 RNAi-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示，所述下游引物MfERF086-R的核苷酸序列如 SEQ ID NO.4所示。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，抑制MfERF086基因表达制剂包括抑制MfERF086基因表达的表达载体，所述表达载体包括所述碱基片段。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101652059A (zh) * 2007-02-08 2010-02-17 孟德尔生物技术公司 缺水诱导型启动子
CN103740731A (zh) * 2013-12-23 2014-04-23 申玉华 紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC3及其应用
CN105254726A (zh) * 2015-10-26 2016-01-20 中国农业科学院生物技术研究所 与植物抗逆相关的erf类转录因子及其编码基因和应用
CN114561426A (zh) * 2022-03-22 2022-05-31 内蒙古大学 一种苜蓿的遗传转化方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101652059A (zh) * 2007-02-08 2010-02-17 孟德尔生物技术公司 缺水诱导型启动子
CN103740731A (zh) * 2013-12-23 2014-04-23 申玉华 紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC3及其应用
CN105254726A (zh) * 2015-10-26 2016-01-20 中国农业科学院生物技术研究所 与植物抗逆相关的erf类转录因子及其编码基因和应用
CN114561426A (zh) * 2022-03-22 2022-05-31 内蒙古大学 一种苜蓿的遗传转化方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Medicago falcata ERF086 (ERF086) mRNA, complete cds;GenBank: MH796792.1;GenBank;全文 *
Stars and Symbiosis: MicroRNA- and MicroRNA*-Mediated Transcript Cleavage Involved in Arbuscular Mycorrhizal Symbiosis;Emanuel A. Devers 等;Plant Physiology;第156卷(第4期);1990-2010 *
付佳宾.野生黄花苜蓿ERF家族成员MfERF026 和MfERF086基因的克隆及初步功能研究.中国优秀硕士学位论文全文 数据库农业科技辑.2019,D047-157. *
野生黄花苜蓿ERF家族成员MfERF026 和MfERF086基因的克隆及初步功能研究;付佳宾;中国优秀硕士学位论文全文 数据库农业科技辑;D047-157 *

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