CN103740731A - 紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC3及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC3及其应用。本发明应用RT-PCR技术从紫花苜蓿基因组中克隆并鉴定了一个新的NAC家族相关基因，命名为MsNAC3，其核苷酸序列如SEQ ID No.11所示，并构建了含有加强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因的融合表达载体。本发明应用荧光定量PCR技术分析了MsNAC3基因在紫花苜蓿中的表达模式，以及该基因与逆境胁迫（冷害，盐害，干旱）之间的关系，发现该基因在烟草中过表达可提高转基因烟草植株的抗寒、抗旱和耐盐性，该基因可用于其他单双子叶植物的遗传转化，提高其抗逆性。

Description

紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC3及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC3及其应用。

背景技术

NAC转录因子(包括NAM、ATAF1/2和CUC2)是植物特有的一种具有多种调控作用的转录因子，广泛存在与陆生植物中，这类转录因子的主要结构特点是N端为保守的大约150个氨基酸残基的NAC结构域，可以结合DNA和其他蛋白，可以分成从A～E5个保守区；C端则为高度多样性的转录激活调控区，富含丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、谷氨酸等，研究发现有些NAC蛋白的C-端具有蛋白结合活性。目前已有研究表明NAC家族的一些成员在逆境应答网络中起作用。拟南芥中ANAC019、ANAC055和ANAC072受到干旱、高盐以及脱落酸(ABA)的诱导表达，它们能显著提高植株的耐旱能力(Tran et al.,2004)。拟南芥LOV1基因能增强植株的抗冻能力(Yoo et al.,2007)。来自水稻的SNAC1/2(stress-responsive NAC2)基因受到干旱、高盐、低温、伤以及ABA的诱导表达，其过表达植株耐冷、抗盐并能抵御干旱(Hu et al.,2008)。过量表达OsNAC6基因的水稻虽然生长慢、产量低，但却显示出对干旱、高盐以及枯萎病的较强抗性(Nakashimaet al.,2007)。尽管NAC基因的功能还有待深入研究，但它们在植物遗传工程方面已展现出了巨大的应用潜力。

发明内容

本发明的目的是提供紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC3及其应用。

本发明提供紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC3，其具有：

1）SEQ ID No.11所示的核苷酸序列；或

2）SEQ ID No.11所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸；或

3）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

本发明提供了含有上述基因MsNAC3的表达载体。

在本发明的一个实施例中，得到的含有基因MsNAC3的表达载体为pBIGFP-MsNAC3。

该表达载体的构建方法为：以紫花苜蓿叶的总RNA反转录得到的cDNA为模板，进行PCR反应，上游引物序列如SEQ ID NO.7所示，下游引物序列如SEQ ID NO.8所示；

将RT-PCR扩增产物回收后连接在pMD18-T载体上，连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株，选取阳性克隆进行测序，用XbaI和KpnI进行双酶切，回收目的片段，连接到含有eGFP植物表达载体pBIGFP的XbaI和KpnI位点中，构建得到pBIGFP-MsNAC3。

含有上述表达载体的宿主细胞也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了含有基因MsNAC3的转化植物细胞。

本发明提供了MsNAC3基因在制备转基因植物中的应用。

优选地，所述的植物为拟南芥、烟草、洋葱、水稻、小麦、玉米、苜蓿、大豆或棉花。

本发明提供了MsNAC3基因在提高植物抗逆性方面的应用。

所述的抗逆性是指抗寒、抗旱或耐盐性。

本发明还提供了克隆紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC3的方法，包括以下步骤：

（1）以紫花苜蓿总RNA为模板，反转录合成cDNA第一链；

（2）以步骤（1）的cDNA为模板进行PCR，回收产物，测序正确的为紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC3。

其中，步骤（1）将紫花苜蓿幼苗放于4℃进行冷胁迫处理之后，取提取紫花苜蓿总RNA，以总RNA为模板，反转合成cDNA第一链。

其中，步骤（2）的PCR方法中，所用引物序列中上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，下游序列如SEQ ID NO.2所示。

步骤（2）的PCR反应程序为94℃3min；94℃10s，55℃20s，72℃1min，31个循环；72℃10min。

步骤（2）中，回收扩增产物并将其连接在pMD18-T载体上进行测序。最后用DNAMAN5.2软件分析，MsNAC3基因长度为1041bp，编码331aa。将这个序列输入NCBIblastp中发现，这个基因编码的氨基酸序列与其他NAC家族基因结构高度相似，其N端含有NAC保守结构域，包括A、B、C、D、E5个保守的亚结构域，蛋白C端高度变异。为进一步分析该基因的结构，应用在线软件SOPMA来推测其蛋白的二级结构，结果表明这种蛋白是以无规则卷曲为主，同时含有18.43%的α-螺旋，3.02%的β-转角和14.20%的延伸链等结构。应用ProtScale在线软件来预测其蛋白氨基酸序列的疏水性/亲水性，结果表明，该蛋白为亲水性蛋白。这些数据表明，该基因是一个新鉴定的NAC家族的基因，本发明将其命名为MsNAC3。

本发明具有下列优点及有益效果：

本发明提供了紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC3（核苷酸序列如SEQ ID No.11所示）及其在作物育种中的应用。该基因不仅受低温和高盐诱导高表达，而且还受干旱和ABA胁迫诱导表达。洋葱表皮亚细胞定位研究表明MsNAC3为核定位基因。先前报道的抗逆基因在功能方面多数具有单一性，而研究发现本发明MsNAC3基因在提高转基因烟草植株的抗寒、抗旱和耐盐性等方面均据有较明显的功效。该基因可用于其他单双子叶植物的遗传转化，显著提高其抗逆性。

附图说明

图1为RT-PCR方法获得MsNAC3的电泳图片，其中M为2000bpMarker，1、2为PCR产物。

图2为融合表达载体pBIGFP-MsNAC3结构示意图。

图3为MsNAC3在胁迫诱导后的相对表达。其中，A图为250mMNaCl、10%PEG6000、100μmol·L^-1ABA和4℃胁迫处理下MsNAC3在叶片中的相对表达量。B图为250mM NaCl、10%PEG6000、100μmol·L^-1ABA和4℃胁迫处理下MsNAC3在根中的相对表达量。

图4为MsNAC3基因亚细胞定位照片。其中，A：含MsNAC3-GFP融合基因的转基因烟草在白光下的图片；B：含MsNAC3-GFP融合基因的转基因烟草在紫外光下的图片；C：对照组只含GFP绿色荧光蛋白基因的转基因烟草在白光下的图片；D：对照组只含GFP绿色荧光蛋白基因的转基因烟草在紫外光下的图片。

图5为逆境胁迫下转MsNAC3基因烟草生长情况，250mM NaCl处理20d后，转基因烟草长势良好，而野生型烟草叶片几乎全部失绿，变为淡黄色。

图6为逆境胁迫下转MsNAC3基因烟草生长情况，10%PEG处理20d后，转基因烟草长势良好，而野生型烟草叶片几乎全部变为水渍状。

图7为逆境胁迫下转MsNAC3基因烟草生长情况，4℃处理6d后再进行恢复培养10d后，转基因烟草植株叶片要明显大于野生型，根系也比野生型发达。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。

实施例1紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC3的获得

1、基因克隆

本发明根据紫花苜蓿MsNAC1（JN099384）序列设计同源引物：

上游引物：5′－ATGGAAAGAACTCACTTCAATATC－3′（SEQ IDNO.1）

下游引物：5′－GAAAAGGTTTTGGGCAAGTAC－3′（SEQ IDNO.2）

实验前4h将苜蓿幼苗放在4℃进行冷胁迫处理。取幼嫩紫花苜蓿叶片，提取总RNA，总RNA的提取用的是TaKaRa RNAiso Plus，然后以紫花苜蓿总RNA为模板，以Oligod（T）为引物进行反转录反应，反应体系如下：

反应程序为：42℃60min，70℃15min，反应产物保存于－20℃备用。

以上述cDNA为模板进行PCR，反应体系如下：

PCR反应程序为94℃3min，（94℃10s，55℃20s，72℃1min）31个循环，72℃10min。RT-PCR结果见图1。

将上述RT-PCR扩增产物用Takara DNA凝胶回收试剂盒进行回收，回收产物连接在pMD18-T载体上，操作步骤按Takara pMD18-T说明书进行。连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株，在含有100mg/L氨苄青霉素的LB培养基上培养，挑取单克隆菌落，用Takara质粒提取试剂盒提取质粒，用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定后，选取阳性克隆进行测序，测序由北京英俊生物公司完成。

最后用DNAMAN5.2软件分析，核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，将该序列输入NCBI blastp中发现，该基因编码的氨基酸序列（SEQID NO.12所示）与其他NAC家族基因结构高度相似，其N端含有NAC保守结构域，包括A、B、C、D、E5个保守的亚结构域，蛋白C端高度变异。为进一步分析该基因的结构，应用在线软件SOPMA来推测其蛋白的二级结构，结果表明这种蛋白是以无规则卷曲为主，同时含有18.43%的α-螺旋，3.02%的β-转角和14.20%的延伸链等结构。应用ProtScale在线软件来预测其蛋白氨基酸序列的疏水性/亲水性，结果表明，该蛋白为亲水性蛋白。这些数据表明，该基因是一个新鉴定的NAC家族的基因，并将其命名为MsNAC3。至此，完成了紫花苜蓿NAC转录因子基因MsNAC3的克隆。

实施例2实时荧光定量PCR检测MsNAC3基因在逆境胁迫条件下在紫花苜蓿中的表达特性

挑选饱满的紫花苜蓿种子播种于MS固体培养基上，置于光照培养箱中培养，光照周期16h/d。然后将生长两周的幼苗转入分别含有250mmol·L^-1NaCl、10%PEG6000、100μmol·L^-1脱落酸（ABA）MS液体培养基中进行胁迫处理，冷害处理则是在4℃冰箱中进行。NaCl、PEG6000、ABA和4℃的处理时间为1、2、4、8、12和24h，以未作处理的为对照，处理完成后分别提取各处理的叶片和根的总RNA，并保存于-70℃冰箱备用。

根据MsNAC3的全长cDNA序列设计荧光定量表达引物：

上游引物：5′-TGTTGATGCCACTCTGAACAC-3′（SEQ IDNO.3）

下游引物：5′-AGACATTCGTCTCGTGCTACC-3′（SEQ IDNO.4）

以紫花苜蓿Actin基因（EU664318）做为内参基因，设计内参基因引物：

上游引物：5′-CAGGTCGTGATCTCACAGACG-3′（SEQ IDNO.5）

下游引物：5′-TCTTCTCAACAGCTGAGCTCG-3′（SEQ IDNO.6）

用SYBR Green I法对不同胁迫处理时间点的样品进行实时Real-Time PCR定量分析，反应体系为：SYBR Green Real-time PCRMaster Mix(2x)12.5μL，PCR Forward Primer(10μM)0.5μL，PCRReverse Primer(10μM)0.5μL，cDNA模板2.5μL，加入ddH₂O补足到25μL。所用仪器为ABI7500Real-Time PCR仪。反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火35s，72℃延伸35s，40个循环，最后添加熔解曲线，相对表达量的计算采用2^-△△Ct法。

结果参见图3。在本实验设定的处理时间范围内，MsNAC3在冷胁迫下诱导效果最明显，12h时在根中的表达量达到最高峰，为对照的5.579倍（图3中的B图）。在叶片中的表达是在24h时达到最大，为对照的3.16倍（图3中的A图）；PEG胁迫下，24h时MsNAC3表达量在根中达到最高峰，为对照的4.141倍（图3中的B图）。在叶片中的表达量在2h时达到最高，为对照的1.171倍（图3中的A图）；在ABA诱导下，1h时MsNAC3表达量在根中达到最高峰，为对照的1.248倍，随后逐渐降低。在叶片中的表达量在24h时达到最高，为对照组的1.102倍；MsNAC3在250mM NaCl胁迫下，在4h时在根中的表达量最高，为对照的3.117倍（图3中的B图），在叶片中的表达量在4h时达到最高，为对照组的1.117倍（图3中的A图）。定量分析结果表明，该基因在逆境胁迫下上调表达。

实施例3MsNAC3基因的亚细胞定位

为进一步研究MsNAC3蛋白的作用机制，构建与报告基因EGFP融合表达的细胞定位检测载体，结合农杆菌介导的瞬时表达技术以及激光共聚焦检测技术，明确MsNAC3蛋白的亚细胞定位。

以MsNAC3完整开放读码框的序列为基础设计引物：

上游引物：5′-TCTAGAATGGAAAGAACTCACTTCAATATC-3′（SEQ ID NO.7）

下游引物：5′-GGTACCGAAAAGGTTTTGGGCAAGTAC-3′（SEQ ID NO.8）

以紫花苜蓿叶的总RNA反转的cDNA为模板，进行PCR反应。扩增产物回收连接在pMD18-T载体上进行测序。选取测序完全正确的阳性单菌落提取质粒，用限制性内切酶XbaⅠ和KpnⅠ进行双酶切，回收目的片段，然后将其连接在含有eGFP植物表达载体pBIGFP上，构建pBIGFP-MsNAC3融合表达载体。该载体结构图见图2。

然后，将构建好的载体转化农杆菌LBA44004，挑取阳性转化子转化洋葱表皮，然后在荧光显微镜下观察并拍照，以不含MsNAC3的载体pBIGFP为对照。结果见图4。其中，转pBIGFP-MsNAC3的洋葱表皮细胞，在紫外光下只有在细胞核中可以观察到GFP绿色荧光信号（图4中的B图），图4中的A图为转pBIGFP-MsNAC3的洋葱表皮细胞在白光下的照片；而对照组，转pBIGFP的洋葱表皮细胞的细胞核内和细胞质中都可以观察到清晰的GFP的绿色荧光信号（图4中的D图），图4中的C图为转pBIGFP的洋葱表皮细胞在白光下的照片。结果表明MsNAC3基因为核定位基因。

实施例4紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC3转化烟草

用电击法将质粒pBIGFP-MsNAC3转到农杆菌LBA4404中，然后用农杆菌侵染烟草叶盘，叶盘在含有卡那霉素筛选培养基（MS+0.5mg/L BA+0.01mg/L IAA+Kana50mg/L）的选择下，成功的诱导和筛选出抗性小芽，将抗性小芽转入生根培养基（1/2MS+0.5mg/LIBA+Kana50mg/L）中诱导出茁壮的根，然后移入花盆中炼苗。

随机选取10株转基因烟草，提取DNA进行PCR检测，以野生型烟草为对照。根据与目的基因MsNAC3并联的抗性筛选基因NPTII设计PCR检测引物：

上游引物：5'-AACAGACAATCGGCTGCTCT-3'（SEQ ID NO.9）

下游引物：5'-CCACCATGATATTCGGCA AGCA-3'（SEQ IDNO.10）。

25μl PCR反应体系：烟草基因组DNA1μl；上、下游引物（10μM）各0.5μl；10×PCR buffer2.5μl；LA Taq(5U/μl)0.25μl；dNTP(2.5mM each)1μl；ddH₂O19.25μl。

PCR反应程序为，94℃预变性3min，94℃10s，53℃20s，72℃1min，共31个循环。

PCR扩增出550bp的片段。PCR结果初步表明，这10株转化植株全部是PCR阳性材料，这初步证明了外源基因MsNAC3已经整合到烟草基因组中。

实施例5紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC3转化烟草阳性植株的功能分析

待实施例4获得的阳性转基因烟草开花结实后，收集T1代转基因种子进行胁迫实验。

将转基因烟草种子和野生型烟草种子同时播种在MS0培养基上进行发芽，待幼芽萌发20d后，将幼芽分别移栽至分别含有250mMNaCl和10%PEG的MS培养基中，20d后记录结果。冷害处理时将发芽后30d的烟草幼苗放置在4℃冰箱中，冷处理6d后再进行恢复处理10d，然后记录结果。

（1）250mM NaCl处理20d后，转基因烟草长势良好，而野生型烟草叶片几乎全部失绿，变为淡黄色，结果见图5。（耐盐性反映）

（2）10%PEG处理20d后，转基因烟草长势良好，而野生型烟草叶片几乎全部变为水渍状，结果见图6。（抗旱性反映）

（3）4℃处理6d后再进行恢复培养10d后，转基因烟草植株叶片要明显大于野生型，而且，根系也比野生型发达，结果见图7。（抗寒冷反映）

上述结果证明，来源于紫花苜蓿NAC转录因子基因（MsNAC3）是一个有效的的逆境相关基因，能够应用于培育转基因抗逆植物的操作中，可显著提高植物的抗逆性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种紫花苜蓿逆境响应基因，其为MsNAC3，具有：

1）SEQ ID No.11所示的核苷酸序列；或

2）SEQ ID No.11所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸；或

3）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

2.含有权利要求1所述基因的表达载体。

3.如权利要求2所述的表达载体，其为pBIGFP-MsNAC3。

4.权利要求3所述的表达载体的构建方法，其特征在于，以紫花苜蓿叶的总RNA反转录得到的cDNA为模板，进行PCR反应，上游引物序列如SEQ ID NO.7所示，下游引物序列如SEQ ID NO.8所示；

将RT-PCR扩增产物回收后连接在pMD18-T载体上，连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株，选取阳性克隆进行测序，用XbaI和KpnI进行双酶切，回收目的片段，连接到含有eGFP植物表达载体pBIGFP的XbaI和KpnI位点中，构建得到pBIGFP-MsNAC3。

5.含有权利要求2或3所述载体的宿主细胞。

6.权利要求1所述的基因在制备转基因植物中的应用。

7.权利要求1所述的基因在提高植物抗逆性方面的应用。

8.一种获得权利要求1所述紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC3的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）以紫花苜蓿总RNA为模板，反转录合成cDNA第一链；

（2）以步骤（1）的cDNA为模板进行PCR，回收产物，测序正确的为紫花苜蓿逆境响应基因MsNAC3。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤（1）将紫花苜蓿幼苗放于4℃进行冷胁迫处理之后，取提取紫花苜蓿总RNA，以总RNA为模板，反转合成cDNA第一链。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤（2）的PCR方法中，所用引物序列中上游引物序列如SEQ ID NO.1所示，下游序列如SEQ ID NO.2所示。

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