CN106434658A

CN106434658A - 水稻mir528基因启动子及其应用

Info

Publication number: CN106434658A
Application number: CN201610841536.5A
Authority: CN
Inventors: 刘庆坡; 胡海超; 张恒木
Original assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Current assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Priority date: 2016-09-22
Filing date: 2016-09-22
Publication date: 2017-02-22

Abstract

本发明提供了一种水稻MIR528基因启动子及其应用，该启动子分离自粳稻日本晴，其序列含有多个逆境胁迫应答及植物生长发育相关调控元件。转基因证明，其为广谱性表达启动子；正常条件下其在水稻茎干中的表达活性优于35S启动子；而且其在水稻根系和叶片中可被亚砷酸盐显著诱导表达。本发明利用转基因技术验证了水稻MIR528基因启动子参与应答逆境胁迫的生物学功能，为植物抗逆基因工程研究提供了新的高效、广谱且环境诱导型启动子元件，为进一步解析植物响应逆境胁迫分子机制及抗逆育种应用了奠定基础。

Description

水稻MIR528基因启动子及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学、基因工程技术领域，尤其是一种水稻MIR528基因启动子及其应用。

背景技术

在自然界，由于植物的不动性，其比动物更易遭受外界逆境因子胁迫。但是，植物可通过调节其基因组中不同类型基因的有序时空表达进而触发或启动其自身防御反应机制以应对各种胁迫。大量研究已证明，植物基因表达调控中，启动子具有中心地位，它决定着基因转录的方向和效率。

miRNA是生物体内源产生的一类长度约20-24bp的非编码小RNA，其通过序列互补配对方式在转录后水平上调控靶基因的表达。研究发现，一种miRNA往往可调控多个靶基因表达，因而在植物生长发育以及应答外界逆境胁迫等过程中发挥着重要作用。目前，通过转基因等手段揭示miRNA生物学功能的研究取得一定进展，然而有关植物miRNA上游表达调控机制方面的报道鲜见。我们知道，miRNA尽管不编码蛋白质，但它与蛋白编码基因一样具有自身的启动子；其启动子上顺式作用元件的类型和数量决定着它的时空表达模式。因此，miRNA基因启动子的克隆和功能解析，对于深入探究植物生长发育过程、植物与环境互作机制以及转基因利用等具有重要理论和实践指导意义。

砷是重要的环境污染物及人类I级致癌物。水稻是重要的粮食作物。但与小麦和玉米等旱粮作物相比，水稻可高效从土壤中吸收、转移与积累砷。因此，提高水稻对砷的耐受性、减少对砷的吸收是解决水稻砷污染的有效途径。我们发现，在耐砷水稻日本晴中过量表达miR528后可导致其对亚砷酸盐的耐性极显著下降，而将其抑制表达后转基因植株对砷的耐性得到明显恢复。另外我们发现，miR528过表达转基因水稻对高盐及干旱的耐受性亦显著降低。这表明，miR528与其靶基因互作在水稻应答亚砷酸盐、高盐及干旱等胁迫中起着重要调控作用。因此，利用基因工程手段解决水稻砷污染等逆境胁迫问题具有重要现实意义。然而，目前对MIR528基因自身转录调控的分子机制尚不清楚。

本发明从粳稻品种日本晴基因组中克隆得到MIR528基因启动子，通过构建全长、分段缺失启动子融合GUS表达载体并转基因证实，该启动子有活性且可受到亚砷酸盐诱导表达；其为广谱性表达，它在茎秆中的表达活性甚至优于目前流行的35S启动子。这为进一步研究植物应答逆境胁迫的分子机制及该启动子的转基因利用奠定了基础。

发明内容

本发明要解决上述现有技术的缺点，提供一种水稻MIR528基因启动子及其应用。该启动子具有典型的启动子序列特征，含有与胁迫相关的转录因子的结合位点。在水稻中，MIR528基因受到该启动子的调控，参与亚砷酸盐、盐害及干旱胁迫等逆境转导途径。

本发明的水稻MIR528基因启动子，其具有：(a)序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；或(b)SEQ ID No.1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸且同等功能的由(a)衍生的核苷酸序列；或(c)与SEQ ID No.1所示核苷酸序列具有90％以上同源性的DNA序列；或(d)在高严谨条件下可以与SEQ ID No.1所示核苷酸序列杂交的序列。上述启动子是水稻特有的，它具有明显启动子序列特征，其具有多个TATA-box和CAAT-box等。通过转基因证明其能够驱动GUS基因表达，为有活性的广谱性表达启动子。

本发明还提供含有所述启动子的表达载体、宿主菌以及含有所述启动子的转化水稻的种子。

本发明还提供水稻MIR528基因启动子在植物中调控下游基因表达中的应用，其研究步骤为：启动子片段的克隆、植物表达载体的构建、转化植物、阳性转基因植株鉴定、GUS染色观察、GUS活性检测、GUS基因定量表达分析，所述的转化植物的方法是农杆菌介导法，优选下游基因为GUS基因。

本发明还提供水稻MIR528基因启动子在调控植物耐逆性中的应用。其中，所述的植物耐逆性是指植物耐砷、耐盐和耐干旱等耐受逆境胁迫的能力，优选为启动子在应答亚砷酸盐胁迫中的应用。

发明有益的效果是：本发明中克隆的水稻MIR528基因启动子是水稻特有的、全新的、可被亚砷酸盐诱导表达的启动子；上述启动子是一个高效、广谱表达启动子，其在水稻茎秆中的调控活性优于时下流行的35S启动子。克隆并利用转基因解析上述启动子的功能，有助于深入探析其转录调控机制以及在水稻响应逆境胁迫中的作用。另外，该启动子广谱、高效表达特性亦有望将其开发为高效驱动基因表达的新表达元件，为其在植物基因工程研究中的利用奠定基础。

附图说明

图1 MIR528基因启动子的PCR克隆结果；

图2 MIR528全长和分段缺失启动子分布；

图3 MIR528基因分段缺失启动子的PCR克隆结果；

图4全长启动子转基因植株不同组织器官的GUS组织化学分析；

图5全长启动子转基因植株不同组织器官GUS基因的定量表达分析；

图6各分段缺失启动子转基因植株不同组织器官的GUS组织化学分析；

图7各转基因植株在25μM亚砷酸盐胁迫处理3天时不同组织器官的GUS组织化学分析；

图8各转基因植株在25μM亚砷酸盐胁迫处理3天时不同组织器官的GUS基因的定量表达分析；

图9在CaMV35::GUS和pQ528Q::GUS转基因植株不同组织器官中GUS酶活性的比较分析。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步说明：

以下实施例中所采用的实验材料主要包括：(a)植物材料：粳稻品种日本晴(Oryzasativa L.japonica)；(b)菌株和载体：大肠埃希氏菌菌株DH5α、农杆菌菌株EHA105均为市售商品；载体pGEM-T购自Promega公司；表达载体pCX-GUS-P由浙江省农科院病毒与生物技术研究所张恒木课题组提供；(c)酶和化学试剂：限制性内切酶XcmI购自NEB公司；ExTaq购自TaKaRa公司；cDNA反转录试剂盒ReverTra Ace qPCR RT Kit、定量表达分析试剂盒购自TOYOBO公司；DNA Marker购自北京全式金公司；T4DNA Ligase、凝胶回收试剂盒购自Promega公司；质粒提取试剂盒购自康为试剂有限公司；Trizol购自Invitrogen公司；CTAB等其他常规生化试剂购自杭州奥谦生物科技有限公司。

以下实施例中，PCR引物合成和DNA测序工作均由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。以下实施例中所述的ABI7900实时荧光定量PCR仪购自Applied Biosystems公司；体式显微镜AF6000购自莱卡公司；酶标仪SpectraMax M5购置Molecular Devices公司。以下实施例中未注明具体的实验方法，均可按照常规方法或按照制造厂商的使用说明进行。

实施例1：水稻MIR528基因启动子的克隆

1.1实验方法

1.1.1MIR528基因启动子的预测

根据MSU v7数据库中水稻基因组注释信息，编写PERL程序提取MIR528前体序列上游2Kb核苷酸序列。利用Promoter v2.0、TSSP等启动子在线预测工具对相应核苷酸片段进行分析，以明确其是否为可靠的启动子序列。

1.1.2MIR528基因启动子的克隆与生物信息学分析

采用CTAB法提取水稻基因组DNA。根据预测的MIR528启动子序列设计特异引物(Forward：5’-TCA TCT CAA ACT GTC ATA GAC C-3’，Reverse：5’-GTC GCT GCT ACA GCCAAA AAG-3’)，以基因组DNA为模板进行PCR扩增，并对扩增产物进行测序验证。采用PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html)对启动子的顺式作用元件进行预测和分析。

1.2结果分析

1.2.1MIR528基因全长启动子的克隆

通过分析MIR528前体与其上游蛋白编码基因的基因间隔区长度、与已发表cDNA序列的同源比对以及多个启动子预测软件的分析结果，我们将MIR528前体上游1751bp序列确定为其启动子。在此基础上，利用设计的正反向特异引物进行PCR扩增，经电泳检测，扩增出的片段大小与预期结果吻合(图1)。将扩增片段回收连接到pGEM-T载体上后，转化大肠埃希氏菌，然后涂到含有Amp的LB培养基上，再经PCR检测，最后挑取正确的单克隆进行测序，得到长度1751bp的核苷酸序列(SEQ ID No.1)。

1.2.2MIR528基因启动子序列顺式作用元件预测与分析

将启动子全长序列输入PLACE对启动子的顺式作用元件进行预测和分析，发现该序列中存在大量调控元件，比如核心启动子元件TATA-box、多个启动子和增强子区常见顺式元件CAAT-box，多种胁迫应答元件，比如14个铜响应元件、2个干旱与2个热激应答元件。此外，还包含多个生长发育相关的调控元件，如花粉晚期基因启动子元件、储藏蛋白mapA的E-box花粉晚期基因启动子元件等。该序列的主要调控元件见表1。这从生物信息学水平上验证了克隆到的水稻MIR528基因启动子具有启动子的基本序列特征，并且具有响应多种逆境胁迫的能力。

表1水稻MIR528启动子序列含有的主要顺式作用元件

实施例2：水稻MIR528基因启动子及分段缺失启动子重组载体的构建及遗传转化

2.1实验方法

2.1.1MIR528全长启动子及分段缺失启动子重组载体的构建

根据PLACE预测的启动子序列顺式作用元件的类型、数量及分布特点，将其分为4个不同长度的启动子片段(图2)：(1)Q528Q：全长启动子序列(1751bp)；(2)Q528B：自启动子5’端第1位至第900位碱基(900bp)；(3)Q528C：自启动子5’端第451位至第1751位碱基(1301bp)；(4)Q528D：自启动子5’端第901位至1751位碱基(851bp)。设计序列特异引物，对Q528B(Forward:5’-TCA TCT CAA ACT GTC ATA GAC C-3’，Reverse:5’-ATA CAA TAA ATGTGA GCA TTA CAG-3’)、Q528C(Forward:5’-CTT TGA TGACAT TTT CAA CAT TAC-3’，Reverse:5’-GTC GCT GCT ACAGCC AAAAAG-3’)和Q528D(Forward:5’-TCT TAC TAAACC CACTTT TAT AAA T-3’，Reverse:5’-GTC GCT GCT ACA GCC AAA AAG-3’)等缺失启动子片段进行PCR扩增。然后，分别以Q528Q-pGEM-T、Q528B-pGEM-T、Q528C-pGEM-T和Q528D-pGEM-T质粒为模板，使用ExTaq酶对各启动子片段进行克隆，同时使用XcmI对pCX-GUS-P表达载体进行酶切处理，将条带大小正确的各启动子片段回收后与酶切处理含GUS基因的表达载体pCX-GUS-P进行连接，然后转化大肠杆菌DH5α，涂布到含有Kan的LB的培养基上，利用PCR反应对连接到pCX-GUS-P载体目的片段进行检测，选择检测正确的单克隆进行测序，对构建成功的载体进行质粒抽取和保存。

2.1.2MIR528启动子片段的遗传转化

采用农杆菌介导法对全长启动子及分段缺失启动子进行转化水稻品种日本晴：通过电击法将构建成功的启动子表达载体转化到农杆菌EHA105，并通过PCR对转化后的农杆菌进行检测，选择正确的单菌落进行摇菌培养。选择日本晴胚经诱导产生的愈伤组织作为转化受体，利用电击转化成功的根癌农杆菌EHA105侵染5min，共培养后使用潮霉素(50mg/L)和羧苄青霉素(250mg/L)进行两次筛选得到抗性愈伤组织，然后经过分化、生根和移栽得到转基因幼苗。

2.2结果分析

利用设计的各对启动子片段特异引物进行PCR扩增，发现扩增产物大小与预期一致(图3)。随后将扩增产物回收并融合GUS后，采用农杆菌介导法获得全长启动子及分段缺失启动子的转基因植株。利用载体引物(Forward：5’-AGG CGA TTA AGT TGG GTA ACG-3’，Reverse：5’-ATT CCA CAC AGT TTT CGC GAT CC-3’)对转基因水稻幼苗进行阳性检测，分别得到移栽存活的T₀代阳性转化植株45、50、38和58株。

实施例3：水稻MIR528基因启动子驱动下游GUS基因的表达

3.1实验方法

3.1.1转基因植株GUS组织化学染色

对野生型对照(WT)和转基因植株的根系、茎干和叶片等组织进行GUS组织化学染色：将相应试材置于X-GLUC染液中，37℃放置过夜。使用75％的酒精对染色后含叶绿素的组织进行脱色，至阴性对照呈现白色时，使用体式显微镜对染色的组织进行拍照。

3.1.2GUS基因的定量表达分析

采用Trizol法提取21天龄的WT及各转基因幼苗根系、茎干、叶片总RNA；使用反转录试剂盒ReverTra Ace qPCR RT Kit将提取的总RNA反转录成cDNA，然后将其稀释10倍后用作模板。在ABI7900实时荧光定量PCR仪上进行定量RT-PCR扩增。反应体系包括2×SYBRGreen Realtime PCR Master Mix 5μL，P-F 0.3μL，P-R 0.3μL，cDNA 1μL，ddH2O 3.4μL。PCR扩增条件为：95℃预变性5min，95℃变性15s，60℃(退火和延伸)1min，40个循环。每个实验重复3次。以Actin为内参，采用2^-ΔΔCT法估测GUS基因的相对表达量。

3.1.3转基因材料的亚砷酸盐胁迫处理

选择健康饱满的供试材料种子若干，用0.5％的次氯酸钠溶液消毒15min，用蒸馏水冲洗3-5次后在蒸馏水中浸泡过夜。然后将其移至发芽盒中，使用0.5％氯化钙溶液催芽。当苗子长至约4-5cm高时，将其固定到含有2L营养液的塑料容器内继续培养。每个容器中放置8棵苗。每3天更换一次营养液。上述实验在16小时光照(30℃)、8小时黑暗(20℃)以及75％湿度的智能培养箱中进行。

营养液配方：0.274mM MgSO₄，0.091mM KNO₃，0.5μM MnCl₂，0.183mM Ca(NO₃)₂，0.1mM KH₂PO₄，0.4μM ZnSO₄，0.183mM(NH₄)₂SO₄，0.2μM CuSO₄，3μM H₃BO₃，0.1μM(NH₄)₆Mo₇O₂₄，40μM NaFe(III)-EDTA，2mM 2-吗啉磺酸(MES)。使用NaOH和HCl调节营养液pH值至5.5左右。

待供试材料在智能培养箱中培养21d后，在营养液中加入25μM亚砷酸盐胁迫处理3d。处理结束后，及时收获供试材料根系、茎干和叶片，置于–80℃冰箱备用。

3.2结果分析

3.2.1MIR528基因启动子在正常生长条件下的表达活性分析

在正常生长条件下，分别对21天龄WT和MIR528全长启动子转基因幼苗(pQ528Q::GUS)的根系、茎干、叶片、雄蕊和颖壳进行GUS组织化学染色。我们发现，与WT相比，在转基因植株的各个组织中均检测到GUS活性，这从实验水平上证明该启动子为有活性的广谱性表达启动子(图4)。但是，对GUS基因在各供试材料根系、茎干和叶片中的定量RT-PCR分析显示，该启动子在叶片和茎干部位要高于其在根系中的表达活性(图5)。

进一步对获得的各分段缺失启动子的阳性转基因植株进行GUS组织化学染色，发现在pQ528C::GUS和pQ528D::GUS转化植株的根系、茎干、叶片、雄蕊和颖壳等组织器官中均检测到GUS活性，但在pQ528B::GUS与WT的各个组织中并未检测到(图6)。因为Q528C和Q528D在各检测组织器官中均检测到GUS活性且表达量与Q528Q相当，表明其具有全长启动子的功能。然而，Q528B不能驱动GUS基因正常表达，表明该启动子片段中缺少转录起始的重要元件。另外，定量RT-PCR结果显示，Q528C和Q528D在叶片中的表达量亦高于其在根系和茎干中的表达水平，但Q528D在叶片中的上调幅度比较显著(图5)。综合上述结果，认定Q528D应为水稻MIR528基因启动子的重要功能区域。

3.2.2MIR528基因启动子在亚砷酸盐胁迫下的表达活性分析

我们发现，在25μM亚砷酸盐处理3d时，各转基因材料根系和叶片中的GUS染色程度明显加深；然而，在茎干中GUS基因的表达活性均受到抑制，但是其在pQ528C::GUS中的受抑制程度相对较弱(图7)。

为进一步验证上述推测，我们采用定量RT-PCR分析了GUS基因在正常及砷胁迫下其在不同供试材料根系、茎干和叶片中的表达水平。我们发现，在亚砷酸盐胁迫下，各转基因材料根系和叶片中的GUS表达量均较正常条件下显著上升，而其在pQ528Q::GUS和pQ528D::GUS根系和叶片中的上调程度高于pQ528C::GUS。但是，各转基因材料茎干中GUS基因的表达量均受到明显抑制：与pQ528Q::GUS和pQ528D::GUS相比，pQ528C::GUS中GUS基因表达受到的抑制程度相对较低(图8)。

实施例4：水稻MIR528基因启动子与35S启动子的活性比较

4.1实验方法

4.1.1转基因植株GUS酶活性检测

称取0.1g待检测材料，充分研磨后加入600μL GUS酶提取液(50mM NaH₂PO₄，50mMNa₂HPO₄，10mM Na₂EDTA(pH＝8.0)，0.1％Triton-100，20％甲醇，0.1％β-巯基乙醇)，充分混匀，4℃13000rpm离心10min，取上清置于新的离心管中备用。将配制好的1mM 4-MU溶液逐步稀释成12个梯度，在激发波长365nm，发射波长455nm处测定其荧光值制作标准曲线。

取50μL含GUS酶的上清液，加入450μL在37℃预热的检测液(0.2M MUG，其它同GUS酶提取液)，迅速充分混匀后，取出50μL加入到950μL的终止反应液中，将其作为该酶促反应的0点。之后分别在10、20、30、40、50以及60min时取50μL加入到950μL的终止反应液中，使用Molecular Devices公司的SpectraMax M5酶标仪在激发波长365nm，发射波长455nm处测定其荧光值。

采用Bradford法测定各样品的蛋白浓度。将4μg/μL的牛血清蛋白(BSA)逐步稀释成12个浓度梯度，然后各取5μL的各待测样品提取液、空白对照以及12个BSA标准品加入195μL考马斯亮蓝，在595nm处测定其吸光值。然后，采用下述公式来评价GUS酶活性：

4.2结果分析

为评估MIR528基因启动子在水稻根系、茎干和叶片中驱动GUS基因表达活性强弱，我们分析和比较了pQ528Q::GUS和烟草花叶病毒CaMV35S::GUS转基因植株上述组织器官中GUS酶活性。我们发现，与CaMV35S::GUS相比，pQ528Q::GUS根系和叶片中的GUS酶活性显著较低，但是，其在茎干中的活性却明显优于CaMV35S(图9)。

除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

Claims

1.一种水稻MIR528基因启动子，其特征是：其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种表达载体，其特征是：含有权利要求1所述的启动子。

3.一种宿主菌，其特征是：含有权利要求2所述的表达载体。

4.根据权利要求1所述的启动子在调控下游基因表达中的应用，其特征是：下游基因为GUS基因。

5.根据权利要求1所述的启动子在应答亚砷酸盐胁迫中的应用。