CN105002187B - 一种NAC转录因子HbNAM及其编码基因 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种NAC转录因子HbNAM及其编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明还提供了一种NAC转录因子，由SEQ ID NO：1所示核苷酸序列编码而成。本发明从巴西橡胶树中分离得到一个新的NAC转录因子HbNAM，对NAC转录因子在巴西橡胶树中功能的进一步研究具有重要意义，且试验证实HbNAM在叶中的表达量高于其他部位，受割胶、茉莉酸(JA)和乙烯(ET)处理以及低温胁迫调控，可提高转基因酵母细胞对低温胁迫的耐受力,并反向调控转基因酵母细胞对干旱胁迫的耐受力，可用于在植物的抗逆基因工程的研究，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明涉及一种NAC转录因子HbNAM及其编码基因。
背景技术
植物特异的NAC(NAM，ATAF1/2和CUC)转录因子(transcription factor，TF)是目前发现最大的转录因子家族之一，通过对全基因组数据分析在模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana(L.)中发现有135个NAC基因，水稻(Oryza sativa L.)中发现149个，番茄(Solanumlycopersicum L.)中发现104个，玉米(Zea mays L.)中发现152个。NAC转录因子名称来源于no apical meristem(NAM)，ATAF1/2和cup-shaped cotyledon(CUC)这三个具有相似DNA结合域(DNA-binding doman)的蛋白。NAC转录因子家族的主要特征是在N-末端具有一个高度保守的DNA结合域(NAC domain)和作为转录激活区或抑制区发挥功能的复杂多变C-末端。NAC domain由约160个氨基酸残基组成，根据基序分布，又可以将其划分为5个亚结构域(A-E)，A亚结构域可能参与了同源和异源三聚体的形成，而B和E亚结构域可能与NAC蛋白的功能多样性有关，其中C和D亚结构域与DNA结合相关。
NAC转录因子广泛参与了植物的细胞凋亡，胚的发育，种子萌发，衰老，木材的形成等生长发育过程过程。越来越多的证据表明，NAC转录因子还参与植物包括干旱，盐胁迫，低温和病原菌的多种生物和非生物胁迫应答过程。南荻(Miscanthuslutarioriparius L.)NAC基因MlNAC5在拟南芥中过量表达后通过调控胁迫相关标记基因的表达显著提高了拟南芥的抗旱和耐寒性。研究发现，应激反应NAC转录因子(stress-responsive NAC)SlNAC4可以诱导应激相关基因的表达从而调控番茄对盐和干旱胁迫的耐受性。随着研究的深入和转基因技术的提高，越来越多的NAC转录因子基因被用于提高作物耐受逆境胁迫能力和品质改良。
胶乳是巴西橡胶树的主要次生代谢物质，也是天然橡胶的主要来源。目前，已从巴西橡胶树中克隆到了部分NAC转录因子，但其具体功能有待于进一步研究。本研究基于转录组和基因组数据，对HbNAM的完整读码框(ORF)进行了克隆和生物信息学分析，同时利用酵母表达系统对该转录因子的转录激活活性进行验证，并通过实时荧光定量PCR技术(Realtime-PCR)分析了该基因的组织表达特性以及割胶、外源激素茉莉酸(jasmonic acid,JA)和乙烯利(ethephon,ET)处理以及低温胁迫对基因表达的影响，为进一步阐明巴西橡胶树HbNAM转录因子基因在植物生长发育和胁迫应答中的功能提供了研究基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从巴西橡胶树中克隆的新的NAC转录因子HbNAM，本发明还提供了该NAC转录因子的编码基因，以实现NAC转录因子在植物的生长发育和胁迫应答中的功能的进一步研究。
本发明的第一个方面是提供一种NAC转录因子HbNAM的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明的第二个方面是提供一种NAC转录因子HbNAM，由SEQ ID NO：1所示核苷酸序列编码而成。
本发明的第三个方面是提供含有本发明第一个方面所述的编码基因的表达载体。
本发明的第四个方面是提供含有本发明第一个方面所述的编码基因的细胞系。
本发明的第五个方面是提供含有本发明第一个方面所述的编码基因的宿主菌。
本发明的第六个方面是提供本发明第一个方面所述的编码基因在提高宿主菌耐寒性中的应用。
本发明的第七个方面是提供本发明第一个方面所述的编码基因在提高植物抗寒性中的应用。
本发明从巴西橡胶树中分离得到NAC转录因子HbNAM，对NAC转录因子在巴西橡胶树中功能的进一步研究具有重要意义。试验证实HbNAM在叶中的表达量高于其他部位，受割胶、茉莉酸(JA)和乙烯(ET)处理以及低温胁迫调控，可提高转基因酵母对低温胁迫的耐受力,并反向调控转基因酵母细胞对干旱胁迫的耐受力，可用于植物的抗逆基因工程的研究，具有较好的应用前景。
附图说明
图1为HbNAM基因的核苷酸序列和氨基酸序列，其中，下划线部分为NAC domain；*为终止密码子；
图2为HbNAM的系统发育树，其中，左边数字表示bootstrap value，括号中为氨基酸序列登录号，框中标示为HbNAM；
图3为HbNAM与其它植物NAC蛋白的氨基酸序列比对，其中下划线表示NAC domain中的5个保守亚结构域A～E；*表示NAM亚家族的保守基序；
图4为HbNAC转录因子保守域的分析，其中，(A)HbNAC转录因子保守域示意图，(B)HbNAC转录因子保守域氨基酸序列信息；
图5为HbNAM的转录激活实验，其中A.载体构建示意图；B.HbNAM的转录激活功能分析；
图6为HbNAM的表达分析；
图7为转基因酵母细胞的抗逆性的影响结果。
具体实施方式
下面参照附图，结合具体的实施例对本发明做进一步的说明，以更好地理解本发明。
1材料与方法
1.1材料
本研究所用巴西橡胶树均来自中国热带农业科学院试验农场。材料处理：(1)采集正常割胶的热研7-33-97橡胶树的不同组织，如叶片、雄花和雌花、树皮和胶乳，液氮冻存备用。(2)割胶处理，选用未开割热研7-33-97橡胶树，按照1/2树围，3天1刀的正常大田割制，用液氮采集第1刀、第4刀和第7刀胶乳冻存备用。(3)外源激素JA和ET处理，处理方法参照康桂娟等[26-27]。(4)低温胁迫处理：取低温敏感无性系热垦501和耐寒无性系93-114芽接苗于4℃培养箱低温培养，处理2、4、6和8h时分别用液氮采集叶片用于提取总RNA。每种实验处理均设置三个重复，每个重复包括6棵树。
1.2方法
1.2.1总RNA的提取和cDNA合成
巴西橡胶树不同组织总RNA的提取方法参照An等[28]。利用Fermentas公司的RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒合成cDNA。
1.2.2 HbNAM基因的克隆与生物信息学分析
依据本课题组前期从巴西橡胶树转录组中发现的一段具有NAC domain的EST序列，对该EST序列进行克隆测序验证并利用此段序列搜索基因组。利用SoftBerry-FGENESH网站对搜索结果进行基因预测分析得到该NAC转录因子的ORF序列，并将该NAC转录因子命名为HbNAM。根据基因预测结果设计一对特异引物HbNAMF和HbNAMR(表1)，以巴西橡胶树胶乳cDNA为模板对HbNAM基因的ORF全长进行克隆验证。PCR反应条件为95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，34个循环。扩增产物经凝胶电泳回收后连接pMD-18T Vector转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取阳性克隆测序。
表1本文所用引物序列
Table 1 Primersequences used in this paper
利用GSDS(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php)进行基因内含子和外显子分析，将外显子序列拼接得到的ORF输入NCBI数据库中的ORF finder进行验证和blast比对。利用InterProScan5软件(http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan5/)和MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)预测保守功能域，并利用DNAMAN(v 5.10)和MEGA5.05(http://www.megasoftware.net/index.php)进行多重比对分析并构建系统发育树。
1.2.3 HbNAM转录激活功能分析
根据保守功能域预测结果，设计引物(表1)将HbNAM完整ORF序列(HbNAM-F)，N端NAC domain(HbNAM-N)和NAC domain以外的C端序列(HbNAM-C)构建到酵母载体pGBKT7中的GAL4DNA binding domain(GAL4-BD)(图4,A)，转化酵母菌株Y2HGold。PCR鉴定阳性克隆并将其与pGBKT7空载接种到SD/-Trp，SD/-Ade/-His/-Trp和SD/-Ade/-His/-Trp/X-α-gal(终浓度40μg/ml)三种不同缺陷型培养基上，28℃倒置培养3d，通过阳性克隆在不同培养基上的生长情况，确认HbNAM编码蛋白的转录激活活性。
1.2.4 HbNAM基因的表达特性分析
以Hb18SrRNA作为内参基因，序列参照康桂娟等[26-27]。利用大连宝生物公司(TaKaRa)的SYBR Premix Ex TaqTM II(Perfect Real Time)实时荧光定量PCR试剂盒和伯乐公司(BIO-RAD)的CFX96Real-Time System荧光定量PCR仪分析HbNAM基因在巴西橡胶树的不同组织表达情况，以及割胶，外源激素JA，ET和4℃低温胁迫处理对HbNAM基因表达的影响，所用荧光定量引物见表1。每个处理设置3个重复。采用2-△△C(T)方法和Excel 2007进行数据分析和图表绘制。
1.2.5酵母胁迫试验
将HbNAM基因构建到酵母表达载体PDR196中，转化酵母菌株W303，挑选阳性克隆加入到SD/-Ura液体培养基中，30℃，220rpm摇动培养过夜，调整至OD600＝1.0，取1ml，短暂离心30s，弃去上清，分别加入8M山梨醇(模拟干旱)和5M NaCl溶液，4℃处理24h(hour)后，依次稀释10倍，100倍，1000倍，分别取5ul点在SD/-Ura平板上，待吸收完全后30℃培养箱中培养3d(day)。另各取1ml依次稀释10倍，100倍，1000倍，分别取5ul点在SD/-Ura平板上,4℃处理4w(week)后30℃培养箱中恢复培养3d，以正常培养作为对照，比较转PDR196-HbNAM和PDR196空载体质粒的酵母菌株的生长情况。
2结果与分析
2.1 HbNAM的克隆与生物信息学分析
基于本课题组转录组测序结果和巴西橡胶树基因组数据，设计特异引物对HbNAM的完整读码框(ORF)进行了克隆分析。结果显示，巴西橡胶树HbNAM基因的ORF为1077bp，其脱氧核苷酸序列如序列表1所示；编码358个氨基酸，其氨基酸序列如序列表2所示，预测蛋白分子量40.062kD。InterProScan5软件分析结果显示在第12～167位氨基酸之间存在一个保守结构域NAC domain(图1)。
根据Ooka[9]对拟南芥和水稻NAC转录因子的归类方法，用Neighbor-jointing法对HbNAM与13个分属于不同亚族的其他植物NAC转录因子和5个已报道的巴西橡胶树HbNAC进行系统发育分析显示HbNAM与拟南芥NAM和CUC亚族关系较近，属于NAM亚族(图2)。根据NCBIblast结果，对HbNAM和同属于NAM亚族的大豆GmNAC5(Glycine max，AAX85982)，玫瑰RhNAC2(Rosa hybrid，AFQ21786)，麻风树JcNAC002(Jatrophacurcas，AGL39658)，苎麻BnNAC32(Boehmerianivea，AIA57536)，湖北海棠MhNAC57(Malushupehensis，AGS08763)蛋白序列进行多重比对。比对分析结果(图3)显示这些NAC转录因子蛋白的NACdomain非常保守，还可以进一步划分为5个(A～E)亚结构域，在差异较大的C-末端，HbNAM蛋白序列中也同样存在NAM亚族特有的保守基序“LPPLxD”。
利用MEME(版本4.10.1)对HbNAM和已报道的巴西橡胶树NAC转录因子[23-27]进行motif比对分析，结果(图4)显示，虽然HbNAM其他HbNAC转录因子在氨基酸序列和长度上存在较大差异，在相对保守的N-末端具有5个相同的motif,分别代表了NAC domain的5个亚结构域。
2.2 HbNAM在酵母中的转录激活功能分析
为了检测HbNAM转录激活活性以及转录激活域的位置，将pGBKT7-HbNAM-F(1-358)、pGBKT7-HbNAM-N(1-167)、pGBKT7-HbNAM-C(168-358)(图5，A)融合表达蛋白以及pGBKT7空载对照分别接种到三种不同的缺陷型培养基上。培养结果(图5，B)显示，全部转化子在SD/-Trp培养基上均能正常生长，而只有pGBKT7-HbNAM-F和pGBKT7-HbNAM-C能在SD/-Ade/-His/-Trp培养基上正常生长，在X-α-gal存在时呈现蓝色。这说明HbNAM编码的NAC转录因子蛋白能够与pGBKT7载体中的GAL4-DB结合激活下游报告基因转录，具有转录激活功能，转录激活域在C末端(图5，B)。
2.3 HbNAM基因的表达分析
利用Real-time PCR技术分析巴西橡胶树HbNAM基因在不同组织和处理中的表达特性，结果显示，该基因在不同的组织样品，如雄花、雌花、叶片、胶乳和树皮中均表达，叶片中表达量最高，其次是雄花，胶乳中的表达量较低，叶片中的表达量是胶乳的20余倍(图6,A)。割胶对未开割巴西橡胶树树胶乳中HbNAM基因的表达也有影响，随着割胶刀次增加呈下降趋势(图6,B)。外源激素ET或JA处理后HbNAM基因的表达先下降后上升，在ET处理36h后达到最低，随之开始升高，而JA在处理8h后表达量达到最低，随后开始升高(图6,C)。4℃低温胁对耐寒无性系93-114中HbNAM基因的表达无明显影响，而诱导敏感无性系热垦501中HbNAM基因的表达，在4℃低温处理4h后表达量最高(图6,D)。
2.4酵母胁迫试验
结果如图7显示，PDR196-HbNAM转基因酵母在4℃低温处理4w后重组酵母菌株的生长情况优于PDR196空载；而8M山梨醇模拟干旱处理后存活率明显低于PDR196空载对照；5MNaCl溶液处理后重组酵母菌株存活率与PDR196空载对照相当，结果表明HbNAM基因在酵母中的表达，提高了转基因酵母细胞对低温胁迫的耐受力，反向降低了酵母细胞对干旱胁迫的抵抗能力，而对高盐胁迫的抵抗能力无明显影响。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
Claims (5)
1.一种NAC转录因子HbNAM的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种NAC转录因子HbNAM，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.含有权利要求1所述的编码基因的表达载体。
4.含有权利要求1所述的编码基因的宿主菌。
5.一种权利要求1所述编码基因在提高宿主菌抗寒性中的应用。
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