CN102050870A - 胡杨scl7基因的鉴定及其功能研究 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了胡杨(Populus euphratica Olive)SCL类耐寒和耐旱转录因子及其编码基因与应用，目的是提供胡杨的SCL类转录因子及其编码基因，该转录因子在植物抗寒、抗旱和抗盐中有调控作用，本发明提供的SCL类转录因子命名为PeSCL7，具有与序列表2的氨基酸序列或将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。抗逆转录因子PeSCL7的编码基因，是下列核苷酸序列之一：1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。本发明的PeSCL7基因在培育抗寒、抗旱和抗盐植物品种中具有重要作用。
Description
技术领域
本发明涉及胡杨(Populus euphratica olive)的PeSCL7基因的鉴定，数据库分析，其植物表达载体的构建及该基因的应用。
技术背景
胡杨(Populus euphratica olive)是唯一能在干旱盐碱和温差剧烈变化的干旱沙漠地区生长的乔木建群树种。作为天然的抗逆性极强的典型植物，胡杨已引起国际学术界的重视。研究、开发和利用胡杨抗逆性基因资源，对于深入林木抗逆性机理以及定向培育抗逆林木新品种具有重要的价值。生物体的细胞能够对外界环境条件的变化做出相应的反应，在植物中，GRAS家族中的SCL类转录因子能够接受环境胁迫信号，启动一系列胁迫应答基因的表达，从而增强植物对逆境的耐受力。
发明内容
本发明的目的是提供胡杨中的一种与抗逆性相关的SCL类转录因子及其编码基因，该转录因子首次在胡杨中克隆，在抗盐和抗旱反应中具有调控作用。本发明所提供的SCL类转录因子来源于胡杨，命名为PeSCL7，是具有与序列表2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将序列表2氨基酸残基序列经过一个或者几个氨基酸残基的取代、缺失或者添加且具有与序列的氨基酸残基序列相同活性的由序列衍生的蛋白质。
序列表中序列氨基酸残基序列是由587个氨基酸残基组成的蛋白质，，其保守的VHIID，PFYRE和SAW结构域序列为序列表2中下划线为虚线的部分。
抗逆转录因子PeSCL7的编码基因，是下列核苷酸序列之一：
1)序列表中序列1的DNA序列。
2)与序列中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
序列表中序列1的DNA序列由1764个碱基组成，为该基因的开放读码框序列，含有保守的VHIID，PFYRE和SAW结构域序列，其表达受到低温、赤霉素、干旱和高盐的诱导。
本发明所提供的编码转录因子PeSCL7的基因，使用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的表达载体(包括双元农杆菌载体以及用于单子叶植物微弹轰击的载体)转化植株，可获得对低温和干旱胁迫抗性增强的转基因植株。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种强启动子或诱导型启动子。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，可以使用增强子，但是必须与编码序列的阅读框相同，要保证整个序列的翻译。
为了便于对转基因植物细胞或植株进行鉴定及筛选，可以在构建载体时对载体进行加工，例如加入可选择性标记，通常使用的可选择性标记可以是编码对抗生素(包括庆大霉素、卡那霉素、潮霉素)抗性酶的基因，也可以是GUS、GFP等可以产生颜色变化的酶或发光化合物的基因等。
携带有本发明的PeSCL7基因的表达载体可以通过多种方法转化植物宿主，以培育抗寒或抗旱的植物品种，例如Ti质粒、Ri质粒、电穿孔、微注射、植物病毒载体、直接DNA转化或植物病毒载体等，所转化的植物宿主可以是单子叶植物也可以是双子叶植物。
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明
附图说明
图1是通过RT-PCR技术克隆得到的基因全长电泳图，图中M为markerD2000，1为基因PeSCL7；
图2为PeSCL7基因在赤霉素条件下实时荧光定量PCR和RT-PCR检测结果；
图3为PeSCL7基因在干旱条件下实时荧光定量PCR和RT-PCR检测结果；
图4为PeSCL7基因在高盐条件下实时荧光定量PCR和RT-PCR检测结果；
图5为PeSCL7基因在低温条件下实时荧光定量PCR和RT-PCR检测结果。
具体实施方式
实施例1，胡杨总DNA的提取
用CTAB(萨姆布鲁克，分子克隆实验指南，第三版)的方法从干旱处理的胡杨中提取总DNA。
实施例2，PeSCL7开读框的克隆
总用引物PS1(GGTCCTGAGATCGAGAATATG)和PS2(GCGAAACGCTACAAAGATGTC)对提取的胡杨DNA进行PCR。PCR程序为：(1)94℃，变性5分钟。(2)PCR扩增，30个循环：94℃，变性45秒；55℃退火45秒；72℃，延伸45秒；(3)72℃，延伸10分钟。将PCR产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳分离，然后用天根(Tiangen)的琼脂糖DNA分离试剂盒回收目的片断并与TaKaRa公司的pMD18-T载体进行连接，连接的反应体系为：目的片断4μl，1μl pMD18-T vector，5μlLigationMix，(60ng/μl)，于16℃过夜连接，再将连接产物转化感受态的大肠杆菌TOP10，用PCR的方法检测阳性菌株，最后取转化成功的菌株在奥科进行DNA序列测定。
实施例3，胡杨总RNA的提取及PeSCL7cDNA序列的克隆
用CTAB(萨姆布鲁克，分子克隆实验指南，第三版)的方法从高盐处理的 胡杨中提取总RNA，总RNA用逆转录酶反转录合成cDNA，然后用引物PS1(GGTCCTGAGATCGAGAATATG)和PS2(GCGAAACGCTACAAAGATGTC)对该cDNA进行PCR。PCR程序为：(1)94℃，变性5分钟。(2)PCR扩增，30个循环：94℃，变性45秒；55℃退火45秒；72℃，延伸45秒；(3)72℃，延伸10分钟。将PCR产物用琼脂糖进行电泳分离，然后用天根(Tiangen)的琼脂糖DNA分离试剂盒回收目的片断并与pGM-T Easy载体进行连接，连接的反应体系为：目的片断7μl，1μl 10×连接酶缓冲液，1μl pGM-T Easy Vector(60ng/μl)，1μl的T4DNA连接酶，于16℃连接过夜。再将连接产物转化进感受态的大肠杆菌Top10，最后取转化成功的菌株在奥科公司进行序列测定，测定结果和其DNA序列相比得知PeSCL7不含内含子。
实施例4，胡杨PeSCL7基因在逆境中的表达特性
对于从新疆取得的两年生胡杨植株，分别进行低温处理(4℃)或干旱处理、盐处理，根据实验设计的时间取叶片，经液氮速冻，提取RNA作实时荧光定量PCR和RT-PCR分析，RT-PCR反应以胡杨的Actin为对照，以控制PCR反应中模板cDNA的浓度一致，结果如图2，3，4，5所示。
实施例5、胡杨PeSCL7基因表达载体的构建
用两头加有Bgl II和Spe I酶切位点接头的引物从含有其cDNA序列的克隆载体上进行PCR，得到的产物连接到克隆载体上，菌落鉴定后将得到的阳性克隆摇菌、提质粒，并用Bgl II和Spe I酶切3小时，同时提取pcambia1304质粒，也用Bgl II和Spe I酶切3小时将得到的酶切产物用天根(Tiangen)的连接酶16℃过夜连接，分别转化大肠杆菌Top10，得到的阳性产物进一步转化农杆菌LBA4404。
序列表
序列表1 ATGGCATATATGTGTGCAGATAGCGGAAATCTAATGGCAATAGCCCAACAAGTTATTAAG
序列表2 M A Y M C A D S G N L M A I A Q Q V I K
61 CAAAAACAACAACAAGAACAACAGCAACAACAAAGCCACCACCCCCAGCAACAATTTCTT
21 Q K Q Q Q E Q Q Q Q Q S H H P Q Q Q F L
121 GGCCTAAACCCTTTTTCTTTAAATCCTTGGCCAAGTACTACAATGTCTGCTAACCCAAAC
41 G L N P F S L N P W P S T T M S A N P N
181 TTGGGTTATGGGCTCTCGGGCCCGGCTGCCTTCTCTGACCCGTTTCAGAGTGGACCAGAT
61 L G Y G L S G P A A F S D P F Q S G P D
241 ACAGGTGATCCACCCGGGTTTAGTTTCTCGAATATGGAGCACCAGCACTCGGGCGGGTTT
81 T G D P P G F S F S N M E H Q H S G G F
301 CGCTTTCCTGATTTTACTGGAGCTGGCGGTGAGTTTGACTCTGATGAGTGGATGGATAGT
101 R F P D F T G A G G E F D S D E W M D S
361 TTGATGAACGGTGGAGATTCGACGGATAGTTCTAATCTTCCTTCTGGTTGTGACGCGTGG
121 L M N G G D S T D S S N L P S G C D A W
421 CAAAACAATGCTGATTTCGGCATTTACCCGTCTGATCCATTTAACACTAGCCCCAGTCGA
141 Q N N A D F G I Y P S D P F N T S P S R
481 CTCACTGTCGGCTGCTCTCCACCGTCCGATCTTAACCGGGTTATCTCTGACTCGCTCTGG
161 L T V G C S P P S D L N R V I S D S L W
541 GCTGACCCATCTCCTCAAGAAATCAAGCCCAAAACATCGCCTCCACAACAGCCTCCGCCA
181 A D P S P Q E I K P K T S P P Q Q P P P
601 ACAGCAAAAAACGAAGTCGTCGTTGGGTCTAAAGAAGTAGTAGAGTTATCTTCGTCGCCG
201 T A K N E V V V G S K E V V E L S S S P
661 GTTTTGAAAGCATTTGTTGAGTGTGCTCAACTTGTCGAGTCCAAAGTTGATCAAGCTGTG
221 V L K A F V E C A Q L V E S K V D Q A V
721 AAATCATTGATTAAGTTGAAGGAATCGGTGAGTGAGAACGGTGATCCAGGTGAGCGCGTT
241 K S L I K L K E S V S E N G D P G E R V
781 GGTTTCTACTTCGTTCAAGGATTATGCAGAAGAGTTGCTGTAGGAGAGCTTGATGACTTG
261 G F Y F V Q G L C R R V A V G E L D D L
841 AAAAACTTTCATCAGACAACAAGTGAAGAGTTCACTTTGTCTTACAAAGCTTTGAATGAT
281 K N F H Q T T S E E F T L S Y K A L N D
901 GCTTGTCCTTATTCAAAGTTTGCTCATTTGACAGCAAATCAAGCAATTCTTGAAGCGACC
301 A C P Y S K F A H L T A N Q A I L E A T
961 GAGAAAGCAAGCAAGATTCACATAGTTGATTTTGGTATCGTTCAAGGAATTCAATGGGCT
321 E K A S K 
F G I V Q G I Q W A
1021 GCTCTTTTACAAGCTTTAGCTACACGTTCAGCTGGAAAACCTGTTAGAATCCGAATCTCA
341 A L L Q A L A T R S A G K P V R I R I S
1081 GGTATACCTGCTCCAGTTCTTGGTAAGAACCCAGCTGCTTCTCTCTTAGCTACTGGTAAT
361 G I P A P V L G K N P A A S L L A T G N
1141 AGGCTACTTGATTTTGCAAAGCTTCTTGATTTGAATTTTGAGTTTGAGCCTATTCTGACT
381 R L L D F A K L L D L N F E F E P I L T
1201 CCAATTCAGGAGTTAAATGAATCTTGTTTTCGGGTTGAGCCGGATGAGGTTTTGGCTGTC
401 P I Q E L N E S 
P D E V L A V
1261 AATTTCATGCTTCAGTTGTATAATTTGTTGGGTGAGACCCCAGGAGCCGTGGAAACCGCT
421 N F M L Q L Y N L L G E T P G A V E T A
1321 TTAAAGATGGCTAAATCGTTGAACCCGAGAATTGTTACTCTTGGTGAATATGAAGTTAGT
441 L K M A K S L N P R I V T L G E Y E V S
1381 TTGAACCGGGTCGGGTACTTGACCCGGTTTAAGAACGCTTTGAGATACTACACTGCTGTT
461 L N R V G Y L T R F K N A L R Y Y T A V
1441 TTTGAGTCTCTTGATCCTAACATGAGTAGAGACTCACAAGAGAGGCTTCAGGTTGAGAGA
481 F E S L D P N M S R D S Q E R L Q V E R
1501 TTGTTATTGGGTCGTAGAATTTCTGGTGTTCTAGGGCCAGATGGGATTAGAAGGGAGAGG
501 L L L G R R I S G V L G P D G I R R E R
1561 ATGGAGAATAAAGAGCAATGGAGGGTTTTAATGGAAAGCTCAGGTTTCGAATCGGTTTCG
521 M E N K E Q W R V L M E S S G F E S V S
1621 CTTAGCCATTATGCAATGAGTCAGGCTAAAATACTTTTATGGAATTACAATTACAGTACT
541 L S H Y A M S Q A K I L L W N Y N Y S T
1681 TTGTATTCTCTTGATGATTCTCAACCTGCGTTCTTAACTTTAGCCTGGAATGAGGTGCCA
561 L Y S L D D S Q P A F L T L A W N E V P
1741 CTACTCACAGTTTCGTCATGGCGA
581 L L T V 
R
Claims (8)
1.胡杨的SCL类转录因子PeSCL7，它具有与序列表中序列2的氨基酸残基序列获将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的转录因子，其特征在于：它具有序列表中序列2的氨基酸残基序列。
3.胡杨SCL类转录因子PeSCL7的编码基因，它是下列核苷酸序列之一：
1)序列表中序列1的DNA序列
2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于：所述胡杨SCL类转录因子PeSCL7的编码基因是序列表中序列1的DNA序列。
5.权利要求4所述的基因，其开放阅读框是自5’端第1到第1761位碱基。
6.含有权利要求3所述的基因的表达载体。
7.含有权利要求3所述的基因的细胞系
8.权利要求3所述的基因在培育抗寒、抗旱和抗盐植物中的应用。
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|---|---|---|---|---|
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| CN103898223A (zh) * | 2014-04-08 | 2014-07-02 | 北京林业大学 | 一种使用多内参基因组合研究胡杨基因的方法 |
| CN112626082A (zh) * | 2020-12-28 | 2021-04-09 | 山东农业大学 | 玉米基因ZmSCL14在调控植物根部发育中的应用 |
| CN116004649A (zh) * | 2022-08-17 | 2023-04-25 | 西南大学 | 水稻基因ftd1及其突变体与应用 |
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| PB01 | Publication | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
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