CN116004649A - 水稻基因ftd1及其突变体与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了水稻基因FTD1及其突变体与应用。本发明分离克隆了与水稻株型和分蘖数相关的基因FTD1，其CDS序列如SEQ ID No.1所示，编码蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。在少蘖矮化突变体ftd1中，该基因在FTD1的编码框发生了一个碱基A的插入，致使移码突变，导致编码蛋白提前终止，其突变体的CDS序列如SEQ ID No.3所示，编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。本发明通过基因敲除实验和过表达实验在水稻中验证了基因FTD1的功能，敲除该基因可导致水稻分蘖数明显数减少，过表达该基因可导致水稻分蘖数明显增加。该基因可应用于水稻株型和分蘖性状的改良，为水稻育种提供了新的基因资源。另外，水稻基因FTD1及其突变体还对水稻分蘖性状和株型的调控机制研究具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明属于基因工程和水稻遗传育种技术领域，具体涉及水稻基因FTD1及其突变体与应用。
背景技术
众所周知，水稻的产量关乎着全世界的粮食安全问题。社会环境因素的恶化和有效耕作面积的锐减，都加速了对水稻高产育种的迫切需求。水稻理想株型如株高和分蘖是水稻高产育种的基础，是育种家们的重点研究方向。虽然近几十年对株高和分蘖的基础研究取得了一定程度上的突破，但很多具体机制尚不清楚，目前应用的株高和分蘖基因资源仍然非常狭窄。因此，对水稻株高和分蘖基因进行研究，挖掘新的株高和分蘖基因资源仍然是水稻遗传育种研究中的一个重要方向，其具有重要的实际应用价值，可有助于进一步理解水稻株高和分蘖的调控机制，对开发出高产量高品质的水稻具有重要的意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种水稻基因FTD1及其突变体与应用。
本发明构思如下：发明人从甲磺酸乙酯(EMS)诱变的籼型水稻1B中鉴定出一个新的突变体ftd1。ftd1突变体在全生育期均矮于野生型，且其穗长和各节间长度也较于野生型显著变短，细胞学分析发现，ftd1突变体叶鞘细胞长度较野生型缩短了11.51％，茎秆细胞的宽度和长度较野生型分别缩短了42.63％和47.45％，说明细胞变短是ftd1突变体矮化的原因。此外，ftd1的分蘖数比野生型少，导致了成熟期ftd1有效穗数比野生型减少了30％。对分蘖芽的石蜡切片进行观察发现，ftd1突变体分蘖芽的数量与野生型一致，但其分蘖芽的长度显著短于野生型，证明是ftd1分蘖芽伸长受阻导致分蘖减少。再者，苗期和成熟期ftd1突变体的叶夹角相较于野生型明显变小，进一步的BR响应实验和胚芽鞘暗处理实验发现ftd1突变体对外源的油菜素内酯(BL)和油菜素内酯抑制剂(BZR)敏感性降低，说明ftd1是一个油菜素内酯不敏感型突变体。对其进行遗传分析，结果表明，突变体ftd1的表型受隐性单基因控制(命名为FTD1)。进一步地，发明人从水稻中分离克隆出了该FTD1基因，其编码一个具有转录激活活性的GRAS转录因子，ftd1突变体在FTD1的编码框发生了一个碱基A的插入，致使移码突变，导致编码蛋白提前终止。进一步将野生型的FTD1全长序列，包括上游启动子区域，整个编码框区域以及下游区域，转化至ftd1突变体，对获得的阳性互补转基因植株进行表型观察发现其株高和分蘖均得到恢复，对阳性转基因植株测序发现，在碱基A插入位点开始出现碱基杂合形式。进一步利用CRISPR/Cas9技术在粳稻品种“中花11”中对FTD1进行基因敲除，结果发现Cas9敲除株系的分蘖数极显著减少，株高也明显降低；在中花11中超表达FTD1基因，转基因植株的分蘖数极显著增加，但株高变化不显著，表明FTD1负责突变体ftd1少蘖表型，且对水稻分蘖数存在正调控作用。
为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案：
1.本发明提供了水稻基因FTD1、水稻基因FTD1序列的互补序列、水稻基因FTD1序列的反向序列、或含有水稻基因FTD1、水稻基因FTD1序列的互补序列、水稻基因FTD1序列的反向序列的生物材料的以下任一应用：
(1)控制水稻分蘖数；
(2)控制水稻株型；
(3)用于水稻品种改良；
(4)用于制备转基因水稻；
其中，水稻基因FTD1的CDS序列如SEQ ID No.1所示，编码蛋白的氨基酸序列如SEQID No.2所示；所述生物材料为重组表达DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。
2.本发明提供了一种减少水稻分蘖数的方法，包括：利用基因工程手段，敲除水稻中的基因FTD1；所述基因FTD1的CDS序列如SEQ ID No.1所示，编码蛋白的氨基酸序列如SEQID No.2所示。
优选的，所述方法包括：利用CRISPR/Cas9技术和转基因技术对水稻中的FTD1基因进行敲除。
3.本发明提供了一种增加水稻分蘖数的方法，包括：利用基因工程手段，过表达水稻中的基因FTD1；所述基因FTD1的CDS序列如SEQ ID No.1所示，编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
4.本发明还提供了上述减少水稻分蘖数的方法或增加水稻分蘖数的方法在水稻育种中的应用。
5.本发明还提供了水稻基因FTD1的突变体，突变体的CDS序列如SEQ ID No.3所示，编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
6.本发明还提供了水稻基因FTD1的突变体、水稻基因FTD1的突变体序列的互补序列、水稻基因FTD1的突变体序列的反向序列、或含有水稻基因FTD1的突变体、水稻基因FTD1的突变体序列的互补序列、水稻基因FTD1的突变体序列的反向序列的生物材料的以下任一应用：
(1)控制水稻分蘖数；
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其中，水稻基因FTD1突变体的CDS序列如SEQ ID No.3所示，编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；所述生物材料为重组表达DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。
本发明的有益效果在于：本发明分离克隆了与水稻株型和分蘖数相关的基因FTD1，并通过基因敲除实验和过表达实验在水稻中验证了基因FTD1的功能，敲除该基因可导致水稻分蘖数明显数减少，过表达该基因可导致水稻分蘖数明显增加。该基因可应用于水稻株型和分蘖性状的改良，为水稻育种提供了新的基因资源。另外，本发明公开的水稻基因FTD1及其突变体还对水稻分蘖性状和株型的调控机制研究具有重要的意义，对于深入了解水稻分蘖和株型调节机制起着至关重要的作用。
附图说明
图1为野生型和ftd1突变体的表型鉴定结果，其中，A，B：成熟期野生型(WT)和ftd1突变体植株，标尺＝15cm；C：野生型和ftd1突变体叶夹角，标尺＝5cm；D，E：野生型(左)和ftd1突变体(右)各节间和穗的表型及其长度统计；F，G：野生型和ftd1突变体叶鞘细胞的扫描电镜图及其长度统计，标尺＝20μm；H，I，J：野生型和ftd1突变体茎秆细胞的纵切图及其宽度和长度统计，标尺＝200μm；**：P<0.01；*：P<0.05。
图2为野生型和ftd1突变体的分蘖表型结果，其中，A：2个月的野生型和ftd1突变体苗期植株，标尺＝10cm；B：成熟期的野生型和ftd1突变体，标尺＝15cm；C：苗期野生型和ftd1突变体分蘖芽的发育情况，标尺＝1mm；D：成熟期野生型和ftd1突变体分蘖数的统计；E：苗期野生型和ftd1突变体分蘖芽纵切；F：E黑框部分的放大图，标尺＝5mm；G：E白框部分的放大图，标尺＝5mm；H：E红框部分的放大图，标尺＝5mm；**：P<0.01。
图3为野生型和ftd1突变体的BR响应实验，其中，A：黑暗条件下用1μM BL(油菜素内酯)和10μM BRZ(BR抑制剂)处理野生型和ftd1突变体，标尺＝2cm；B：统计胚芽鞘暗处理后野生型和突变体在自然条件下，外源施加BL和外源施加BRZ条件下其胚芽鞘的长度；C：分别用0，0.01，0.1，1，10μM BL离体处理野生型和ftd1突变体三叶一心时期的叶鞘连接处，标尺＝3cm；D：统计BL离体处理后野生型和ftd1突变体的叶夹角度数。
图4为FTD1的互补验证结果，其中，A:FTD1基因定位；B：野生型和ftd1突变体在突变位点处插入了一个A碱基；C：成熟期野生型，突变体ftd1以及FTD1互补转基因植株，标尺＝20cm；D：FTD1互补转基因植株在突变位点处的测序峰值图。
图5为FTD1基因敲除和超表达验证；其中，A：FTD1基因CRISPR/Cas9敲除位点，碱基A(下划线)插入，导致提前终止；B：FTD1基因过表达路线；C：中花11、FTD1基因敲除植株、FTD1基因过表达植株，标尺＝20cm。
图6为FTD1表达模式分析，其中，A-F：FTD1::GUS转基因植株分别在根(A)、茎(B，D)、小穗(C)、叶(E)、分蘖芽(F)的GUS染色情况，标尺＝500μm；f：为F的放大图，标尺＝500μm；G：FTD1在根、幼茎、分蘖芽、叶、叶鞘、叶枕、茎、穗茎、穗的RT-PCR和qRT-PCR分析；I-L：苗期ftd1分蘖芽，标尺＝2mm；j-l：分别为J-L的放大图，标尺＝2mm。
图7为FTD1的亚细胞定位，其中，A:水稻原生质体中FTD1-GFP融合蛋白的亚细胞定位，标尺＝5μm；B：本氏烟草中FTD1-GFP融合蛋白的亚细胞定位，标尺＝10μm。
图8为FTD1的系统进化树分析。
图9为FTD1转录激活区域的鉴定，其中，A：FTD1的结构域模式图；B：FTD1的酵母自激活验证；C：双荧光素酶活性检测实验的载体构建模式图；D：不同载体的相对荧光素酶活性。
图10为FTD1与MOC1互作，其中，A：成熟期的野生型和ftd1突变体，标尺＝15cm；B：FTD1和MOC1在野生型和突变体中的表达情况；C：不同截短形式的FTD1结构域与MOC1的相互作用；**：P<0.01。
图11为FTD1和MOC1互作的BiFC验证。
图12为FTD1和MOC1对彼此转录活性的影响；其中，A：双荧光素酶报告系统(DLTTM)所用载体示意图；B：DLTTM检测系统分析表明FTD1与MOC1的互作不影响。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
实施例1突变体的发现和表型鉴定
发明人从甲磺酸乙酯(EMS)诱变的籼型水稻1B中鉴定出一个新的突变体ftd1。
田间自然条件培育下，ftd1突变体在整个生育期均表现出矮化表型，成熟期ftd1突变体的叶夹角变小，且其倒一至倒四节间以及穗长均显著或极显著短于野生型(图1A-B；C-E)。统计叶鞘薄壁细胞长度，发现ftd1突变体的叶鞘薄壁细胞长度相较于野生型缩短了11.51％(图1F-G)。石蜡切片观察发现，ftd1突变体的茎秆细胞宽度相较于野生型缩短了42.63％，细胞长度相较于野生型缩短了47.45％(图1H-J)，表明ftd1突变体矮化表型是由于细胞变小导致的。
田间调查发现，ftd1突变体在分蘖期和成熟期都表现出分蘖减少的性状(图2A-B)。成熟期统计野生型和ftd1突变体的有效穗数，发现野生型的有效穗数是ftd1的1.76倍(图2D)。观察田间自然生长一个月的野生型和ftd1突变体的分蘖芽，ftd1突变体分蘖芽的数量无明显变化，但其长度明显比野生型要短(图2C)。石蜡切片进一步观察野生型和ftd1突变体的分蘖芽情况，发现野生型第一分蘖芽的发育明显快于ftd1突变体(图2E，F)，野生型第二和第三分蘖芽的发育基本和突变体保持一致(图2G,H)，表明ftd1突变体分蘖减少是由于分蘖芽的伸长受阻所导致。
除了矮化和分蘖减少表型，ftd1突变体还表现出叶夹角变小(图1C)，暗示着该突变体可能与植物激素油菜素内酯(BR)相关。为验证这一猜想，首先进行胚芽鞘暗处理实验，结果发现外源添加1μM BL后，野生型的胚芽鞘明显伸长，但ftd1突变体的胚芽鞘长度与未处理前并没有发生太大的变化，在外源施加10μM BRZ(BR抑制剂)后，野生型的胚芽鞘长度明显变短，而ftd1突变体的胚芽鞘长度受抑制程度弱于野生型(图3A-B)。对野生型和ftd1突变体三叶一心时期的叶鞘连接处进行离体培养发现，在0，0.01，0.1，1，10μMBL营养液中处理两天后，ftd1突变体的叶夹角并不随浓度的变化而变化，而野生型随着BL浓度的增强表现出叶夹角逐渐增大的表型(图3C-D)。这些结果表明，ftd1突变体是一个BR不敏感型突变体。
实施例2 FTD1基因的图位克隆
遗传分析表明ftd1的突变表型受单隐性核基因调控，利用325株ftd1/缙恢10号的F2隐性定位群体，最终将调控基因FTD1定位在第3染色体86.9kb的物理范围内(图4A)。对定位区间内的注释基因进行测序，结果发现ftd1突变体在LOC_Os03g51330的编码框发生了一个碱基A的插入，致使移码突变，导致编码蛋白提前终止，初步确定为FTD1目的基因(图4B)。为了进一步确定FTD1基因，发明人将野生型的FTD1全长序列，包括上游启动子区域，整个编码框区域以及下游区域，转化至ftd1突变体。对获得的阳性互补转基因植株进行表型观察发现其株高和分蘖均得到恢复(图4C)。对阳性转基因植株测序发现，在碱基A插入位点开始出现碱基杂合形式(图4D)。发明人利用CRISPR/Cas9技术和转基因技术在粳稻品种“中花11”中对LOC_Os03g51330进行基因敲除和超表达(图5A-B)。结果发现，与中花11相比，FTD1的Cas9敲除转株系分蘖明显减少，株高也明显降低，FTD1超表达转基因植株的分蘖则显著增加(图5C)，但株高变化不显著。这些结果证实LOC_Os03g51330是FTD1基因。
实施例3 FTD1的表达模式及亚细胞定位
1、FTD1的时空表达模式分析
取野生型的根、幼茎、分蘖芽、叶、叶鞘、叶枕、茎、穗茎和穗等组织部位的mRNA进行RT-PCR和qRT-PCR分析，发现FTD1在各检测部位均有表达，且在分蘖芽和茎的表达最强(图6G-H)。进一步通过启动子+GUS阳性转基因来检测FTD1的表达区域，对阳性转基因植株GUS染色后发现在根、茎、分蘖芽、叶、小穗等检测部位均能观察到GUS信号(图6A-F)，与半定量、定量结果一致。原位杂交后发现，FTD1在分蘖芽处表达强烈，分别在第一、第二、第三分蘖芽处检测到FTD1的表达信号(图6I-L)。
2、FTD1的亚细胞定位
为进一步研究FTD1在细胞中的定位情况，将FTD1的编码框序列融合在含有绿色荧光(GFP)蛋白的PAN580载体中，并将载体转入至水稻原生质体瞬时表达。结果显示FTD1-GFP融合蛋白的能够与之前报道的核定位蛋白Ghd7共定位在细胞核内(图7A)。而后又将FTD1与植物表达载体pCAMBIA1301-s65T-2上GFP蛋白融合，用农杆菌转化法侵染烟草嫩叶。观察发现，FTD1-GFP融合蛋白的定位信号与DAPI一致(图7B)。证明FTD1定位在细胞核中。
实施例4 FTD1的生物信息学分析
FTD1/LOC_Os03g51330编码GRAS家族转录因子OsGRAS19(Chen et al.2013)。因此进行系统进化树分析，发现拟南芥和水稻中的GRAS家族成员并没有严格地分成两大类(图8)，暗示着GRAS蛋白在进化过程中并不保守，存在功能多样性。截止目前，水稻中有多个GRAS成员被克隆，包括MOC1、DLT、OsSLR1、OsGRAS23、DHD1、OsNSP1、OsNSP2和OsSHR1。系统进化结果显示，FTD1与水稻中已被报道跟分蘖发育相关蛋白MOC1在同一个分支，暗示它们在功能上具有一致性，推测FTD1也可能参与水稻分蘖发育。
实施例5 FTD1的转录激活活性鉴定
FTD1是一个GRAS家族的转录因子，主要由两个结构域组成，N端的结构域和C端的GRAS保守结构域(图9A)。在水稻中一些已知的GRAS家族蛋白成员并没有转录活性，比如MOC1、DLT。为探究FTD1转录活性，发明人首先利用酵母体系进行FTD1自激活验证。首先将整个FTD1编码框序列连接到酵母表达载体pGBKT7中，构建FTD1-BD载体。酵母实验发现，含有FTD1-BD质粒的酵母Y2H菌株能够在缺陷性培养基正常生长(图9B)，证明FTD1具有转录激活活性。为鉴定FTD1转录激活区域，分别构建了FTD1-N-BD和FTD1-GRAS-BD载体。酵母实验发现，含有FTD1-N-BD的菌株能够在缺陷性培养基生长，而含有FTD1-GRAS-BD的菌株则无法生长，证明FTD1的转录激活活性位于其N端结构域(图9B)。
发明人又在水稻原生质体中验证FTD1转录激活活性。将FTD1的全长、N端结构域和GRAS端结构域分别连接在GAL4BD的载体上(图9C)，并转化至水稻原生质体中瞬时表达。结果发现发现其N端结构域能够强烈地激活荧光素酶报告基因的表达，其荧光信号是FTD1和FTD1-GRAS的5.32倍和12.98倍(图9D)。由此证实了FTD1具有转录激活活性，且其转录活性区域在N端结构域。
实施例6 FTD1与MOC1的功能研究
ftd1突变体表现为少分蘖(图2；图10A)。定量结果发现与野生型相比，ftd1突变体中FTD1和MOC1的表达量均降低(图10B)。而且FTD1和MOC1编码的蛋白属于GRAS同一亚家族(图8)，暗示这两个蛋白之间可能存在关联性。为证明这一猜想，发明人首先通过酵母双杂交实验验证FTD1与MOC1的互作。酵母双杂交结果显示FTD1能够与MOC1相互作用(图10C)。发明人又设计了BiFC实验对FTD1与MOC1的互作进行验证。实验发现FTD1-cYFP和MOC1-nYFP的融合蛋白能够被共聚焦荧光显微镜检测到YFP信号，并且其YFP信号与DAPI信号一致，而FTD1-cYFP与nYFP以及cYFP与MOC1-nYFP的组合均无法检测到YFP信号，证明了FTD1能够与MOC1互作，且其互作区域在细胞核中(图11)。为验证FTD1与MOC1互作的结构域，利用FTD1不同截短形式的FTD1-AD载体与MOC1的互作进行鉴定。结果发现除了FTD1-GRAS-AD不能与MOC1-BD互作，其余截短形式均能够与MOC1-BD互作(图10C)，表明FTD1的N端结构域是与MOC1相互作用的关键结构域。
由于FTD1与MOC1的互作发生在其N端结构域，而FTD1的N端结构域具有转录激活活性(图9D)，且MOC1并没有转录激活活性。发明人利用双荧光素酶报告系统检测FTD1与MOC1的相互作用是否会改变彼此的转录活性。发明人在水稻原生质体中共表达MOC1和不同的GAL4BD-FTD1，结果发现，MOC1的有无并不影响报告基因的表达。而共表达FTD1和GAL4BD-MOC1也不影响报告基因的表达，表明FTD1与MOC1的相互作用并不能改变彼此蛋白的转录活性(图12A-B)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所有的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.水稻基因FTD1、水稻基因FTD1序列的互补序列、水稻基因FTD1序列的反向序列、或含有水稻基因FTD1、水稻基因FTD1序列的互补序列、水稻基因FTD1序列的反向序列的生物材料的以下任一应用：
(1)控制水稻分蘖数；
(2)控制水稻株型；
(3)用于水稻品种改良；
(4)用于制备转基因水稻；
其中，水稻基因FTD1的CDS序列如SEQ ID No.1所示，编码蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示；所述生物材料为重组表达DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。
2.减少水稻分蘖数的方法，包括：利用基因工程手段，敲除水稻中的基因FTD1；所述基因FTD1的CDS序列如SEQ ID No.1所示，编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.根据权利要求2所述的减少水稻分蘖数的方法，其特征在于，所述方法包括：利用CRISPR/Cas9技术和转基因技术对水稻中的FTD1基因进行敲除。
4.增加水稻分蘖数的方法，包括：利用基因工程手段，过表达水稻中的基因FTD1；所述基因FTD1的CDS序列如SEQ ID No.1所示，编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
5.权利要求2-3任一项所述减少水稻分蘖数的方法、或权利4所述增加水稻分蘖数的方法在水稻育种中的应用。
6.水稻基因FTD1的突变体，其CDS序列如SEQ ID No.3所示，编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
7.水稻基因FTD1的突变体、水稻基因FTD1的突变体序列的互补序列、水稻基因FTD1的突变体序列的反向序列、或含有水稻基因FTD1的突变体、水稻基因FTD1的突变体序列的互补序列、水稻基因FTD1的突变体序列的反向序列的生物材料的以下任一应用：
(1)控制水稻分蘖数；
(2)控制水稻株型；
(3)用于水稻品种改良；
(4)用于制备转基因水稻；
其中，水稻基因FTD1突变体的CDS序列如SEQ ID No.3所示，编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示；所述生物材料为重组表达DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。
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