CN117511955A - 紫花苜蓿类钙调蛋白cml16基因及其应用 - Google Patents

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CN117511955A CN202311240404.3A CN202311240404A CN117511955A CN 117511955 A CN117511955 A CN 117511955A CN 202311240404 A CN202311240404 A CN 202311240404A CN 117511955 A CN117511955 A CN 117511955A
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Abstract

本发明公开了紫花苜蓿类钙调蛋白CML16基因及其应用，该钙调蛋白CML16基因的核苷酸序列为如下(1)或(2)：(1)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；(2)与(1)所述的核苷酸序列具有90％以上的同源性且具有同等功能的核苷酸序列。本发明提供了利用MsCML16基因培育耐寒性和耐盐性植物的方法，将该基因在紫花苜蓿中过量表达后，提高了转基因苜蓿的耐寒性和耐盐性；同时，将该基因在紫花苜蓿中干扰后，降低了转基因苜蓿的耐寒性和耐盐性。

Description

紫花苜蓿类钙调蛋白CML16基因及其应用
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及紫花苜蓿类钙调蛋白CML16基因及其应用。
背景技术
在植物的生长发育过程中，往往会遭受到来自外界环境的不利影响，这些影响统称为逆境胁迫。逆境胁迫进一步划分又可分为生物胁迫和非生物胁迫，其中生物胁迫主要包括病原微生物和昆虫的伤害，而非生物胁迫主要包括低温、高温、盐碱和干旱造成的伤害。随着全球气候变化，低温已经成为最严重的逆境胁迫之一，它严重影响着农作物的生长发育，对粮食产量和牧草资源都带来了巨大的打击。土壤盐渍化和耕地次生盐渍化是威胁全球生态环境的世界性难题，全球约20％的耕地面积受到不同程度的盐渍化影响，且呈现逐年增加的趋势(Teakle and Tyerman.,2010)。培育耐逆的植物品种是种植业的主要目标之一。因此，从耐逆性强的植物中分离耐性基因是十分必要的。
Ca2+参与植物信号转导的多个过程，在植物生长发育中发挥重要作用，还参与植物对冷信号的感知。植物细胞中包含4种Ca2+结合蛋白，钙调素(Calmodulin，CaMs)、类钙调素蛋白(Calmodulin-like protein，CMLs)、Ca2+依赖蛋白激酶(Ca2+-dependent proteinkinases，CDPKs)、类钙调磷酸酶B蛋白(Calcineurin B like protein，CBLs)及类钙调磷酸酶B亚基互作蛋白激酶(CBL-interaction proteins，CIPKs)。大部分的Ca2+结合蛋白具有典型的EF-hands结构域(Day et al.,2002)，它们在植物体中发挥的作用大多数以Ca2+依赖的形式与下游响应因子结合来实现的(Hrabak et al.,2003；Ranty et al.,2006；Weinl andKudla,2009)。诸多文献报道CMLs在植物生长发育，胁迫响应和激素信号转导方面发挥着重要作用。
在拟南芥(Arabidopsis thaliana)和苜蓿(Medicago truncatula)基因组中已鉴定出50个CML(Sun et al.,2020)。在拟南芥中，CML8、CML9、CML11、CML24、CML41和CML43参与植物对细菌的免疫反应(Chiasson et al.,2005；Ma et al.,2008；Leba et al.,2012；Cheng et al.,2016；Xu et al.,2017；Zhu et al.,2017)；CML9,CML20,CML37和CML42响应非生物胁迫，正调控或负调控干旱或盐响应(Magnan et al.,2008；Vadassery et al.,2012；Scholzet al.,2015；Wu et al.,2017；Zhu et al.,2022)；CML24,CML25,CML36和CML39参与开花、花粉萌发、花粉管伸长、种子发育和萌发的调控(Yang et al.,2014；Wanget al.,2015；Astegno et al.,2017；Midhat et al.,2018)；CML18与液泡Na+/H+反转运蛋白AtNHX1发生相互作用，参与盐胁迫信号传导(Yamaguchi et al.,2005)。蒺藜苜蓿MtCML42可以通过正向调控CBF通路基因和促进棉子糖积累来响应冷胁迫(Sun et al.,2021)；紫花苜蓿MsCML10通过活化MsGSTU8和MsFBA6，进而维持低温下ROS稳态，促进糖的积累从而调控耐寒性(Yu et al.,2022)。此外，在大豆、水稻、棉花和小麦等其他物种中，CMLs在胁迫响应中研究也取得了一些进展。过表达野生大豆GsCML27能够提高转基因种子萌发率和生长初期对碳酸氢盐胁迫的耐受性，但降低了对盐和渗透胁迫的耐受性(Chen etal.,2015)。水稻OsERF48能够被干旱胁迫诱导，过表达OsERF48提高了水稻营养阶段的耐旱性。棉花GhMYB108通过与GhCML11相互作用，参与对黄萎病菌(V.dahlia)的防御，并形成正反馈回路来调控GhCML11的转录(Cheng et al.,2016)。小麦过表达TaCML20提高转基因小麦植株中WSC浓度，节间的蔗糖-1-果糖基转移酶基因(Sucrose-1-fructosyltransferase，1-SST)转录水平显著提高；还有研究表明TaCML20的转录水平在干旱胁迫下显著提高，可能在干旱胁迫中发挥作用(Kalaipandian et al.,2019)。
苜蓿是重要的豆科牧草，具有生物量高、营养品质好、栽培范围广等特点。然而低温或盐胁迫严重限制了苜蓿的生长发育和地理分布，并降低了产量。因此，挖掘调控紫花苜蓿耐寒耐盐相关基因，可为紫花苜蓿耐寒分子育种提供目的基因。
发明内容
为克服现有技术的缺点和不足，本发明的首要目的是提供一种提高植物抗逆性的紫花苜蓿类钙调蛋白CML16基因。
本发明的另一目的在于提供上述紫花苜蓿类钙调蛋白CML16基因编码的蛋白。
本发明的再一目的在于提供上述紫花苜蓿类钙调蛋白CML16基因的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种紫花苜蓿类钙调蛋白CML16基因，该钙调蛋白CML16基因的核苷酸序列为如下(1)或(2)：
(1)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
(2)与(1)所述的核苷酸序列具有90％以上的同源性且具有同等功能的核苷酸序列。
如上所述紫花苜蓿类钙调蛋白CML16基因编码的蛋白，该蛋白的氨基酸序列为如下(a)或(b)：
(a)如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
(b)由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸而形成的具有同等功能的序列。
含有上述的紫花苜蓿类钙调蛋白CML16基因或沉默或干扰上述紫花苜蓿类钙调蛋白CML16基因的生物材料，该生物材料为重组载体、表达盒、细胞系和宿主菌中的至少一种。
上述的紫花苜蓿类钙调蛋白CML16基因，上述的紫花苜蓿类钙调蛋白CML16，或者上述的生物材料在提高植物抗逆性或培育抗逆性提高的转基因植物中的应用。
上述的应用，具体为在目标植物中过表达所述的紫花苜蓿类钙调蛋白CML16基因提高植物的抗逆性。
一种提高植物抗逆性的方法，在目标植物中过表达所述的紫花苜蓿类钙调蛋白CML16基因提高植物的抗逆性。
作为一种优选技术方案，在目标植物中过表达所述的紫花苜蓿类钙调蛋白CML16基因的过程为：构建如上所述紫花苜蓿类钙调蛋白CML16基因的过表达载体，通过农杆菌介导法将所述的过表达载体转入到目标植物中得到抗逆性提高的转基因植株。
上述的植物为单子叶植物或双子叶植物，例如紫花苜蓿，但不限于此。
上述的抗逆性为耐寒性或/和耐盐性。
研究过程中，技术人员分别采用pCAMBIA3301和pFGC5941构建过表达载体35S::MsCML16和干扰载体MsCML16-RNAi，筛选压均为草丁膦。选择扦插8-12周的紫花苜蓿成熟叶片进行遗传转化，依次进行侵染、共培养、愈伤组织的诱导、愈伤组织再生和再生苗生根等过程获得转基因紫花苜蓿。
含有紫花苜蓿类钙调蛋白CML16基因的重组载体为重组表达载体，该重组表达载体是通过将上述紫花苜蓿类钙调蛋白CML16基因的核苷酸序列与植物表达载体连接得到的；所述的植物过表达载体优选为pCAMBIA3301。
制备干扰紫花苜蓿类钙调蛋白CML16基因表达的干扰载体，所采用的载体优选为pFGC5941；
本发明的具体实施方式中，含有紫花苜蓿类钙调蛋白CML16基因(MsCML16)的重组表达载体的制备方法，包含以下步骤：
(1)引物设计
引物⑴为MsCML16扩增上游引物Y3600：
5’-ATGAAGAACGCGGGATTCGAG-3’；
引物⑵为MsCML16扩增下游引物Y3601：
5’-TCACTGCATCATTACTGTGAATTCATC-3’；
引物⑶为引入Nco I酶切位点的上游引物Y3602：
5’-GGGGACTCTTGACCATGGCAATGAAGAACGCGGGATTCGAG-3’；
引物⑷为引入BstE II酶切位点的下游引物Y3603：
5’-GAAATTCGAGCTGGTCACCTCACTGCATCATTACTGTGAATTCATC-3’；
引物⑸为引入Asc I酶切位点的上游引物Y3604：
5’-ACCATGGGGCGCGCC ATGAAGAACGCGGGATTCGAG-3’；
引物⑹为引入Asc I酶切位点的下游引物Y3605：
5’-TCATCGATTGGGCGCGCCCTTTTGTTCCTCTCCACCTTC-3’；
引物⑺为引入Xba I酶切位点的上游引物Y3606：
5’-CTTAATTAACTCTCTAGAATGAAGAACGCGGGATTCGAG-3’；
引物⑻为引入BamH I酶切位点的下游引物Y3607：
5’-TTGCAGGTATTTGGATCCCTTTTGTTCCTCTCCACCTTC-3’；
引物⑼为引入Xba I酶切位点的上游引物Y3608：
5’-TCCGGAGCTAGCTCTAGAATGAAGAACGCGGGATTCGAG-3’；
引物⑽为引入BamH I酶切位点的下游引物Y3609：
5’-CTTGCTCACCATGGATCCCTGCATCATTACTGTGAATTCATC-3’；
引物⑾为MsCML16上游启动子扩增上游引物Y3800：
5’-CATGCAATTTGATCACCGGTT-3’；
引物⑿为MsCML16上游启动子扩增下游引物Y3801：
5’-CTTTTATAATATAGTTGTGTGTAAAT-3’；
引物⒀为引入EcoR I酶切位点的上游引物Y3803：
5’-ACCCGGGGATCCTCTAGACATGCAATTT-3’；
引物⒁为引入Nco I酶切位点的下游引物Y3804：
5’-CCCTCAGATCTACCATGGCTTTTATAAT-3’；
(2)MsCML16基因片段的获得：
以紫花苜蓿的cDNA为模板，使用引物⑴和引物⑵扩增MsCML16基因片段，并以此为模板连接同源臂，克隆获得pCAMBIA3301-MsCML16同源臂片段和干扰正义链MsCML16-RNAi-1和反义链MsCML16-RNAi-2同源臂片段；
(3)含有MsCML16基因的重组表达载体pCAMBIA3301-MsCML16和pFGC5941-MsCML16的构建：
以MsCML16基因片段为模板，使用引物⑶和引物⑷使MsCML16基因片段引入Nco I和BstE II两个酶切位点，并与植物表达载体pCAMBIA3301连接，进而构建获得含有MsCML16基因的重组表达载体pCAMBIA3301-MsCML16；
以MsCML16基因片段为模板，使用引物⑸和引物⑹使MsCML16基因片段引入Asc I酶切位点，并与植物表达载体pFGC5941连接，获得干扰正义链载体，以此载体为模板，使用Xba I和BamH I进行双酶切获得载体大片段，使用引物⑺和引物⑻使MsCML16基因片段引入Xba I和BamH I酶切位点，与双酶切载体大片段连接，进而构建获得pFGC5941-MsCML16干扰载体；
含有MsCML16基因的重组表达载体pCAMBIA3301-MsCML16的转基因植株和pFGC5941-MsCML16干扰载体的转基因植株是通过将上述重组表达载体或干扰载体转化紫花苜蓿叶片组织，并将转化的植物组织培养得到的。
所述的植物优选为紫花苜蓿；
所述表达紫花苜蓿MsCML16的转基因植株的制备方法，包含如下步骤：
(1)用电击转化的方法将重组表达载体pCAMBIA3301-MsCML16和干扰载体pFGC5941-MsCML16导入根瘤农杆菌EHA105中，分别获得含有重组表达载体pCAMBIA3301-MsCML16和干扰载体pFGC5941-MsCML16的农杆菌阳性菌落；
(2)将活化的含有重组表达载体pCAMBIA3301-MsCML16和干扰载体pFGC5941-MsCML16的农杆菌EHA105浸染紫花苜蓿的叶片，经共培养和草丁膦抗性筛选，获得转基因紫花苜蓿。
本发明从紫花苜蓿中克隆了紫花苜蓿类钙调蛋白CML16的cDNA序列MsCML16，并将获得的MsCML16基因与植物表达载体连接，构建了重组过表达载体和干扰载体，用构建的重组表达载体和干扰载体转化紫花苜蓿植物叶片，然后培育成转基因植株。MsCML16基因受低温胁迫和盐胁迫的诱导；MsCML16定位于细胞核和细胞质中；MsCML16在拟南芥叶片、根、花药、柱头均有GUS活性，这与在紫花苜蓿中检测到的MsCML16表达结果基本一致；本发明提供了利用MsCML16基因培育耐寒植物的方法，将该基因在紫花苜蓿中过量表达后，提高了转基因苜蓿的耐寒性和耐盐性；同时，将该基因在紫花苜蓿中干扰后，降低了转基因苜蓿的耐寒性和耐盐性。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明从紫花苜蓿中克隆了MsCML16的cDNA序列，该MsCML16基因的表达受低温和盐胁迫的诱导。
(2)本发明将获得的MsCML16蛋白进行亚细胞定位分析，其定位于细胞核、细胞质中。
(3)本发明将获得的MsCML16基因与植物表达载体连接，构建了适合于苜蓿的重组表达载体，并转化紫花苜蓿，过表达MsCML16的转基因紫花苜蓿明显提高了耐寒性，RNAi植株明显降低耐寒性。
(4)本发明将获得的MsCML16基因与植物表达载体连接，并转化紫花苜蓿，过表达MsCML16的转基因紫花苜蓿明显提高了耐盐性，RNAi植株明显降低耐盐性。
(5)本发明提供了利用MsCML16基因培育耐逆境植物的方法。
附图说明
图1是重组表达载体pCAMBIA3301-MsCML16的表达框示意图。
图2是MsCML16基因开放阅读框序列的PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图；
其中，M是标准DNA分子；泳道1、3是MsCML16基因的扩增片段。
图3是重组表达载体pCAMBIA3301-MsCML16的PCR鉴定琼脂糖凝胶电泳图；
其中，M是标准DNA分子；泳道2、3、5、6、8、9是阳性重组子；泳道1、4、7是阴性重组子。
图4是重组表达载体pFGC5941-MsCML16的PCR鉴定琼脂糖凝胶电泳图；
其中，M是标准DNA分子；泳道1、2是阳性重组子。
图5是MsCML16的亚细胞定位。
图6是低温诱导MsCML16基因表达的结果分析柱状图；
其中，表示低温对MsCML16基因转录的影响；柱上方的字母a、b和c表示不同处理之间的差异显著(P≤0.05)，即数据柱上方字母相同时表示没有显著差异，数据柱上方字母不同时表示差异显著。
图7是盐胁迫诱导MsCML16基因表达的结果分析柱状图。
图8是MsCML16基因启动子序列的PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图：
其中，M是标准DNA分子；泳道7、8是MsCML16基因启动子序列的扩增片段。
图9是载体pFGC5941-P:MsCML16的PCR鉴定琼脂糖凝胶电泳图；
其中，M是标准DNA分子；泳道1、2是阳性重组子。
图10是MsCML16基因的组织特异性表达分析；
其中，A图表示对MsCML16基因在紫花苜蓿不同组织中的表达情况；柱上方的字母a、b和c表示不同处理之间的差异显著(P≤0.05)，即数据柱上方字母相同时表示没有显著差异，数据柱上方字母不同时表示差异显著。B图表示MsCML16的启动子驱动GUS的转基因拟南芥里的GUS活性。
图11是导入MsCML16基因的过表达转基因苜蓿的实时荧光定量PCR鉴定结果图；
其中，WT表示野生型；OE表示阳性株系。
图12是导入MsCML16基因的干扰转基因紫花苜蓿的实时荧光定量PCR鉴定结果图；
其中，WT表示野生型；RNAi表示阳性株系。
图13是导入MsCML16基因的转基因苜蓿抗寒性检测结果分析图；
其中，(A)是低温处理后转基因株系的半致死温度；(B)是冻处理后转基因株系的存活率；柱上方的字母a、b和c表示不同材料之间的差异显著(P﹤0.05)。
图14是导入MsCML16基因的转基因苜蓿耐盐性检测结果分析图；
其中，(A)是盐处理后转基因株系的存活率；柱上方的字母a、b和c表示不同材料之间的差异显著(P﹤0.05)。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
保定紫花苜蓿(alfalfa)为本实验室所有。
根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105：购自北京天恩泽基因科技有限公司。pCAMBIA3301过表达载体thermos为本实验室保存。pFGC5941干扰载体：为本实验室保存。大肠杆菌DH5α：购自上海超研生物科技有限公司。以上生物材料均为本领域技术人员公知的常规生物材料。
实施例1 MsCML16基因的克隆
一、紫花苜蓿cDNA模板制备
紫花苜蓿品种为保定紫花苜蓿，将紫花苜蓿播种在含有混合营养土(泥炭土：珍珠岩＝3:1:1(v/v)的)、直径为15cm的塑料盆中，于温室内(25℃)自然光照下培养。紫花苜蓿材料生长40d后，剪取紫花苜蓿的成熟叶片，用Trizol方法提取总RNA，用逆转录酶试剂盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Erase(TaKaRa公司)进行反转录，获得cDNA模板，-20℃保存备用。
二、扩增MsCML16基因引物
根据紫花苜蓿新疆大叶的基因组数据库CML16基因的cDNA序列，设计扩增紫花苜蓿MsCML16的cDNA开放阅读框(由Tsingk合成)的引物。
引物⑴为扩增MsCML16的上游引物为Y3600，序列为：
5’-ATGAAGAACGCGGGATTCGAG-3’；
引物⑵为扩增MsCML16的下游引物为Y3601，序列为：
5’-TCACTGCATCATTACTGTGAATTCATC-3’。
三、扩增获得MsCML16基因并构建载体
用上述步骤一制备的模板和步骤二设计的引物进行PCR扩增：
PCR反应体系(50μL)：KOD FX聚合酶(TOYOBO公司，1U·μL-1)1μL，2×PCR bufferfor KOD FX 25μL，dNTPs(2mmol·L-1)10μL，上游引物(0.3μmol·L-1)1.5μL，下游引物(0.3μmol·L-1)1.5μL，反转录第一链cDNA 1μL，用去离子补足至50μL；
PCR反应程序：94℃ 2min；98℃ 0.1min，68℃ 1min，35个循环；72℃ 10min；扩增产物以质量分数为0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测；
获得一条长约420bp的序列(图2)，将获得的PCR产物用DNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)回收。
实施例2过表达载体pCAMBIA3301-MsCML16和干扰载体pFGC5941-MsCML16的构建
一、过表达载体pCAMBIA3301-MsCML16的构建
根据实施例1获得的MsCML16开放阅读框序列，设计带有Nco I和BstE II酶切位点的扩增引物：
引物⑶为引入Nco I酶切位点的上游引物Y3602：
5’-GGGGACTCTTGACCATGGCAATGAAGAACGCGGGATTCGAG-3’；
引物⑷为引入BstE II酶切位点的下游引物Y3603：
5’-GAAATTCGAGCTGGTCACCTCACTGCATCATTACTGTGAATTCATC-3’；
将PCR回收片段进行同源臂扩增和载体连接，pCAMBIA3301表达载体分别用限制性内切酶Nco I(TaKaRa公司)和BstE II(TaKaRa公司)双酶切，将回收MsCML16基因同源臂扩增目的片段和酶切后载体大片段，采用Clon Express II重组反应液按摩尔比1：2的比例进行连接，反应体系如下：5×CE II Buffer 4μL，Exnase II 2ΜL，回收的目的片段0.06pmol，补水到20μL，37℃连接30min，置于冰上冷却后获得连接产物；
大肠杆菌感受态细胞的制备：用接种环取保存于-80℃超低温冰箱的大肠杆菌DH5α菌液，在LB固体培养基上划板，于37℃培养箱内培养过夜；挑取大肠杆菌DH5α单菌落接种于1mL的LB液体培养基中，在37℃恒温摇床上以200rpm振荡培养约6h，接种于200mL LB液体培养基中，于37℃恒温摇床上以200rpm振荡培养至OD550nm＝0.6；以2500rpm离心10min收集菌体，加入预冷的体积分数为50％的甘油(甘油：LB液体培养基)洗涤，离心收集细菌；重复用预冷的体积分数为10％的甘油(甘油：LB液体培养基)洗涤，离心收集细菌，最后将细菌分装，于-80℃保存备用；
连接产物热激转化大肠杆菌：将连接产物加入至100μL DH5α感受态细胞中，冰中放置30min；42℃热激45s后，冰中放置2min；热激后的菌体转入1mL LB液体中，于37℃恒温摇床上以200rpm振荡培养1h。取100μL菌液涂布于LB固体(含200μg/mL Kan)培养基上，于37℃培养箱内倒置培养过夜。
重组质粒pCAMBIA3301-MsCML16的筛选、纯化及测序：挑取白色菌落，做菌落PCR检测。挑取PCR阳性菌落，接种于2mL含200μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃恒温摇床上以200rpm振荡培养过夜；吸取2mL菌液，用质粒DNA纯化试剂盒(Qiagen公司)提质粒，4℃保存备用。纯化的重组质粒命名为pCAMBIA3301-MsCML16。
通过PCR检测，以pCAMBIA3301-MsCML16质粒为模板，用引物⑶和引物⑷扩增出大小正确的片段，条带大小为420bp左右，结果表明重组载体上含有MsCML16基因(图3)。进一步对插入片段测序，结果表明插入片段的序列与MsCML16编码区的序列完全一致，并且插入片段两端的酶切位点也完全正确，从而证明成功构建了重组表达载体pCAMBIA3301-MsCML16，该重组表达载体的表达框示意图如图1。
二、干扰载体pFGC5941-MsCML16的构建
根据实施例1获得的MsCML16开放阅读框序列，选取约200bp大小的条带，设计带有Asc I(TaKaRa公司)酶切位点的扩增引物进行PCR扩增，获得正义链同源臂，同时将载体pFGC5941使用Asc I(TaKaRa公司)单酶切，对PCR产物和酶切产物回收后采用同源重组的方法进行目的片段与载体片段连接。
引物⑸为引入Asc I酶切位点的上游引物Y3604：
5’-ACCATGGGGCGCGCC ATGAAGAACGCGGGATTCGAG-3’；
引物⑹为引入Asc I酶切位点的下游引物Y3605：
5’-TCATCGATTGGGCGCGCCCTTTTGTTCCTCTCCACCTTC-3’；
回收方法、同源重组方法、质粒转化大肠杆菌方法同上述方法一致。
通过PCR检测，以pFGC5941-MsCML16-1质粒为模板，用引物⑸和引物⑹扩增出大小正确的片段，条带大小为200bp左右，结果表明重组载体上含有200bp大小的MsCML16基因。进一步对插入片段测序，结果表明插入片段的序列与MsCML16编码区的序列完全一致，并且插入片段两端的酶切位点也完全正确，从而证明成功构建了含有正义链片段的正确载体质粒，命名为pFGC5941-MsCML16-1。
根据干扰载体的连接规则和方法进一步设计带有Xba I(TaKaRa公司)和BamH I(TaKaRa公司)双酶切位点扩增，以实施例1获得的MsCML16的基因片段为模板进行PCR扩增，获得反义链同源臂，同时将上述步骤获得的pFGC5941-MsCML16-1载体使用Xba I(TaKaRa公司)和BamH I(TaKaRa公司)双酶切，对PCR产物和酶切产物回收后采用同源重组的方法进行目的片段与载体片段连接。
引物⑺为引入Xba I酶切位点的下游引物Y3606：
5’-CTTAATTAACTCTCTAGAATGAAGAACGCGGGATTCGAG-3’；
引物⑻为引入BamH I酶切位点的下游引物Y3607：
5’-TTGCAGGTATTTGGATCCCTTTTGTTCCTCTCCACCTTC-3’；
回收方法、同源重组方法、质粒转化大肠杆菌方法同上述方法一致。
通过PCR检测，以上述质粒为模板，用引物⑺和引物⑻扩增出大小正确的片段，条带大小为200bp左右，结果表明重组载体上含有200bp大小的MsCML16基因。进一步对插入片段测序，结果表明插入片段的序列与MsCML16编码区的序列完全一致，并且插入片段两端的酶切位点也完全正确，从而证明成功构建了含有正、反义链片段，形成发夹结构的正确干扰载体质粒，命名为pFGC5941-MsCML16(图4)。
实施例3 MsCML16的亚细胞定位
根据已经扩增获得MsCML16的CDS序列，将去掉终止密码子的MsCML16的CDS序列构建到pCAMBIA1305.1载体上，将MsCML16序列与GFP融合，并进行本氏烟草(N.benthamiana)的农杆菌转化，在烟草中瞬时表达，具体操作步骤如下：
引物⑼为引入Xba I酶切位点的下游引物Y3608：
5’-TCCGGAGCTAGCTCTAGAATGAAGAACGCGGGATTCGAG-3’；
引物⑽为引入BamH I酶切位点的下游引物Y3609：
5’-CTTGCTCACCATGGATCCCTGCATCATTACTGTGAATTCATC-3’；
(1)将新活化的含有MsCML16-GFP表达载体的农杆菌单克隆接种到含有Rif和Kan的YEP培养基，在摇床上(28℃)以200rpm震荡培养过夜；
(2)当菌液OD600nm＝0.6-0.8时，以5000rpm离心10min，收集菌体沉淀；
(3)用工作液(10mM MgCl2，10mM MES，200μM乙酰丁香酮)重悬菌液，调至OD600nm＝0.1，将不同组合的菌液等体积混合后备用；
(4)用注射器在1月龄本氏烟草叶片背面轻柔注射。将植株置于生长室中，25℃生长48-72h，用激光共聚焦扫描显微镜(Zeiss LSM800,Germany)观察转化后的叶片并拍照。
MsCML16-GFP荧光在细胞质和细胞核中均可观察到，并与细胞核Marker蛋白的mCherry的荧光重叠，而转化对照载体的GFP荧光在整个细胞中都可以观察到。结果表明，MsCML16定位于细胞质和细胞核中(图5)。
实施例4 MsCML16受低温诱导的表达分析
一、获得低温条件下的紫花苜蓿cDNA模板
选取温室自然光照下生长40d的紫花苜蓿幼苗，置于人工气候箱中进行低温(5℃)处理，分别于0h、2h、6h和12h后剪取叶片，用2ml离心管装好后投于液氮迅速冷冻，于-80℃冰箱中保存备用。
将以上存放于-80℃冰箱中保存备用的样品取出，加入液氮磨碎样品，用TRE-Trizol试剂(TaKaRa公司)提取叶片的总RNA，采用反转录试剂盒Prime Script RT reagentKit with gDNA Erase(TAKaRa公司)进行反转录反应，制备cDNA模板。
二、设计特异检测引物
在https://sg.idtdna.com/scitools/Applications/RealTimePCR/网站分析MsCML16基因cDNA的序列，设计实时荧光定量PCR的引物：
MsCML16基因的上游引物Y2213：5’-AGACAAAGGCTGGGAGTAATG-3’；
MsCML16基因的下游引物Y2214：5’-CTCCACCTTCCTCCATCAAAG-3’；
Actin基因的上游引物Y3213：5’-CCCACTGGATGTCTGTAGGTT-3’；
Actin基因的下游引物Y3214：5’-AGAATTAAGTAGCAGCGCAAA-3’；
三、MsCML16基因表达的实时荧光定量PCR检测
将步骤一制备的模板cDNA稀释30倍，用于实时荧光定量PCR的模板，反应体系为10μL：ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(2×)5μL，上游和下游引物(10μM)各0.2μL，cDNA模板4μL，无菌水0.6μL；使用仪器为TaKaRa公司生产的Thermal Cycler DiceTM RealTime System，PCR反应条件设置为：95℃ 30s；94℃ 10s，60℃ 60s，40个循环；以不加cDNA模板作为阴性对照，每个样品设置3个重复，以持家基因Actin作为内参基因；反应结束后，进行溶解曲线分析，PCR扩增效率在95％以上，计算基因的相对表达量；
实时荧光定量PCR的结果显示，MsCML16在低温处理12h时开始受到诱导，表达量显著升高，说明低温诱导MsCML16基因的表达(图6)。
实施例5
一、获得盐胁迫条件下的紫花苜蓿cDNA模板
选取温室自然光照下生长40d的紫花苜蓿幼苗，置于人工气候箱中进行盐处理，分别于0h、2h、6h、12h和24h后剪取叶片，用2ml离心管装好后投于液氮迅速冷冻，于-80℃冰箱中保存备用。
将以上存放于-80℃冰箱中保存备用的样品取出，加入液氮磨碎样品，用TRE-Trizol试剂(TaKaRa公司)提取叶片的总RNA，采用反转录试剂盒Prime Script RT reagentKit with gDNA Erase(TAKaRa公司)进行反转录反应，制备cDNA模板。
二、设计特异检测引物
在https://sg.idtdna.com/scitools/Applications/RealTimePCR/网站分析MsCML16基因cDNA的序列，设计实时荧光定量PCR的引物：
MsCML16基因的上游引物Y2213：5’-AGACAAAGGCTGGGAGTAATG-3’；
MsCML16基因的下游引物Y2214：5’-CTCCACCTTCCTCCATCAAAG-3’；
Actin基因的上游引物Y3213：5’-CCCACTGGATGTCTGTAGGTT-3’；
Actin基因的下游引物Y3214：5’-AGAATTAAGTAGCAGCGCAAA-3’；
三、MsCML16基因表达的实时荧光定量PCR检测
将步骤一制备的模板cDNA稀释30倍，用于实时荧光定量PCR的模板，反应体系为10μL：ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(2×)5μL，上游和下游引物(10μM)各0.2μL，cDNA模板4μL，无菌水0.6μL；使用仪器为TaKaRa公司生产的Thermal Cycler DiceTM RealTime System，PCR反应条件设置为：95℃ 30s；94℃ 10s，60℃ 60s，40个循环；以不加cDNA模板作为阴性对照，每个样品设置3个重复，以持家基因Actin作为内参基因；反应结束后，进行溶解曲线分析，PCR扩增效率在95％以上，计算基因的相对表达量；
实时荧光定量PCR的结果显示，MsCML16在盐处理2h时开始受到诱导，表达量显著升高，说明盐胁迫诱导MsCML16基因的表达(图7)。
实施例6 MsCML16的组织特异性表达分析
一、MsCML16基因启动子片段的获得
首先通过TBtools软件获得MsCML16上游启动子长约1392bp的序列，以此序列设计扩增启动子的上游引物⑾和下游引物⑿，以新疆大叶的DNA为模板，使用高保真酶(KOD)进行PCR扩增。
引物⑾为MsCML16上游启动子扩增上游引物Y3800：
5’-CATGCAATTTGATCACCGGTT-3’；
引物⑿为MsCML16上游启动子扩增下游引物Y3801：
5’-CTTTTATAATATAGTTGTGTGTAAAT-3’；
PCR反应体系：KOD FX聚合酶(TOYOBO公司，1U·μL-1)1μL，2×PCR buffer for KODFX 25μL，dNTPs(2mmol·L-1)10μL，上游引物(0.3μmol·L-1)1.5μL，下游引物(0.3μmol·L-1)1.5μL，新疆大叶DNA1μL，用去离子补足至50μL；
PCR反应程序：PCR反应程序：94℃ 2min；98℃ 0.1min，68℃ 1min，35个循环；72℃10min；扩增产物以质量分数为0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测(图8)；
获得一条长约MsCML16上游1392bp的序列(图8)，将获得的PCR产物用DNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)回收。
所述的紫花苜蓿类钙调蛋白CML16启动子序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。PMsCML16:GUS表达载体构建
根据步骤一获得的MsCML16上游的启动子序列，设计带有EcoR I和Nco I酶切位点进行同源臂扩增；同时，pFGC5941表达载体分别用限制性内切酶EcoR I(TaKaRa公司)和NcoI(TaKaRa公司)双酶切，将回收的P:MsCML16启动子同源臂扩增目的片段和酶切后载体大片段，采用Clon Express II重组反应液按摩尔比1：2的比例进行连接，反应体系如下：5×CEII Buffer 4μL，Exnase II 2ΜL，回收的目的片段0.06pmol，补去离子水到20μL，37℃连接30min，置于冰上冷却后获得连接产物，重组反应液转化DH5ɑ，挑取单克隆送测序，将测序正确的菌液和质粒保存(图9)。进一步用电击转化的方法将重组表达载pFGC5941-P:MsCML16导入根瘤农杆菌EHA105中。
引物⒀为引入EcoR I酶切位点的上游引物Y3803：
5’-ACCCGGGGATCCTCTAGACATGCAATTT-3’；
引物⒁为引入Nco I酶切位点的下游引物Y3804：
5’-CCCTCAGATCTACCATGGCTTTTATAAT-3’；
三、获得以MsCML16启动子驱动GUS的转基因拟南芥的遗传转化
(1)将保存的农杆菌EHA105划线到含卡那霉素和利福平抗性的YEP培养基上，28℃培养2d；挑取单菌落，加入YEP液体培养基中，28℃，200rpm摇菌。转化前1d，按1：50比例将菌液加到50mL YEP液体培养基，28℃，200rpm，暗培养至OD600nm＝0.6-0.8。
(2)4℃，5000rpm离心15min，去上清。
(3)用5％(g/100ml)的蔗糖溶液(含有0.03％silwetl-77，v/v)重悬沉淀使OD600nm＝0.6-0.8，蔗糖溶液需要现用现配，无需灭菌。
(4)将生长状态良好的拟南芥花蕾浸没在重悬液中，同时轻轻旋转拟南芥植株，此步骤应尽量避免转化溶液进入基质，防止对拟南芥根系造成损伤。
(5)用保鲜膜套住植株以保持湿润状态，将植株置于暗处培养12h后恢复正常生长条件。
(6)使用草丁膦筛选和PCR鉴定获得纯合MsCML16启动子转基因拟南芥。
四、获得纯合MsCML16启动子转基因拟南芥进行GUS染色
GUS染色的配制：
(1)X-Gluc母液(20mM)：X-Gluc粉末用N-N-二甲基酰胺(DMF)溶解，每管100μL，-20℃保存待用；
(2)X-Gluc基液(50mM PBS，pH 7.0)：将0.78g NaH2PO4、16.5mg K3[Fe(CN)6](铁氰化钾)、1.79g Na2HPO4、100uL Triton-100、0.372g Na2EDTA、21.1mgK4[Fe(CN)6](亚铁氰化钾)和80mL加入到烧杯中混匀，用量筒加蒸馏水定容至100mL，4℃保存待用；
(3)染色液的配制：50uL X-Gluc母液+450uL X-Gluc基液(现配现用)。在GUS染色液中放入转基因拟南芥的幼苗、茎、叶、花、果荚，抽真空10min。置于37℃避光染色2-24h至颜色出现变化后倒掉染色液，用70％乙醇进行脱色3-5次，使用体式显微镜进行拍照。
以蒺藜苜蓿Actin基因作为内参，对MsCML16基因在紫花苜蓿不同组织中的表达进行定量PCR检测。定量结果显示MsCML16在紫花苜蓿茎中表达最低，在根中检测到较高表达。与此同时，在花和叶中存在一定水平的表达，MsCML16在紫花苜蓿中整体呈现组成型表达分布(图10A)。与此同时，获得了以MsCML16启动子驱动GUS的转基因拟南芥纯合株系，GUS染色结果表明，在幼苗的根部有较高的GUS活性，在成熟植株的叶脉、茎和成熟花的花药均也存在GUS活性,而在其他组织中表达较弱，这些结果表明MsCML16主要在植物花，叶片和根部表达(图10B)。
实施例7转基因苜蓿的产生及分子检测
一、转基因苜蓿的产生
1、将重组表达载体pCAMBIA3301-MsCML16、干扰载体pFGC5941-MsCML16导入根癌农杆菌EHA105
EHA105感受态的制备参考J.萨姆布鲁克(黄培堂,王嘉玺,朱厚础.J萨姆布鲁克,DW拉塞尔,著[J].分子克隆实验指南,2002:27-30)的方法并加以改进：取EHA105菌种于YEP+Kan+Rif平板上划线，28℃培养48h，挑取单菌落，接种于50mL液体LB中，28℃培养过夜，吸取0.5mL菌液，接种于500mL液体YEP中，28℃培养8h，至OD600nm为0.6，冰浴冷却10min，倒入经灭菌的200mL离心管中，平衡后4℃ 4000rpm离心10min，收集菌体，倒去LB，倒置于灭过菌的纸巾上，控干水分，加入50mL预冷的体积分数为10％的甘油(甘油：YEP液体培养基)，于冰上摇动，悬浮菌体，4℃ 4000rpm离心15min，收集菌体，重复洗涤一次，加入2mL预冷的体积分数为10％的甘油(甘油：YEP液体培养基)，悬浮菌体，分装，25μL/管，加液氮速冻后于-80℃冰箱保存。把感受态细胞置于冰上解冻，将0.2cm内径的电击杯置于冰上预冷，在超净工作台内，将1.5μL pCAMBIA3301-MsCML16质粒、pHSE401-MsCML16(20ng/μL)加至20μL解冻的感受态细胞中，轻弹管壁混匀，冰浴1min后，转移至电击杯中，置于电击仪(MicroPulser，Bio-RAD公司)的电极间，选定程序Agr，进行电击；电击结束后，在超净工作台内，迅速将1mL YEP液体培养基倒入电击杯，再用移液枪转移至摇菌管中，28℃轻柔振荡培养2h；吸取0.3mL菌液，涂布在YEP平板(含35mg/L的利福平和50mg/L的卡那霉素)上，28℃培养箱内倒置培养48h；
2、含重组表达载体pCAMBIA3301-MsCML16、干扰载体pFGC5941-MsCML16农杆菌阳性菌落的鉴定
挑取平板上的单菌落进行菌落PCR检测，并做好标记；进一步挑取PCR阳性菌落至3mL YEB液体培养基(含35mg/L的利福平和50mg/L的卡那霉素)中，28℃振荡培养40h；取2mL菌液用碱裂解法抽提质粒，表达载体pCAMBIA3301-MsCML16用限制性内切酶Nco I(TaKaRa公司)和BstE II(TaKaRa公司)进行酶切检测，确定阳性克隆中含有植物表达载体pCAMBIA3301-MsCML16，表达载体pFGC5941-MsCML16用限制性内切酶Xba I(TaKaRa公司)和BamH I(TaKaRa公司)进行酶切检测，确定阳性克隆中含有植物表达载体pFGC5941-MsCML16；取0.8mL农杆菌液，加0.2mL体积分数为50％的甘油(甘油：YEB液体培养基)，混匀后保存于-80℃超低温冰箱备用。
3、转基因紫花苜蓿植株的获得
(1)紫花苜蓿的遗传转化与鉴定
将构建成功的pCAMBIA3301-MsCML16、pFGC5941-MsCML16植物过量表达载体和干扰载体的质粒转化农杆菌，筛选阳性克隆进一步用于植物的遗传转化，筛选标记均为草丁膦。
取生长40d左右的紫花苜蓿的叶片，自来水清洗表面杂质，6.25％ NaClO表面消毒30min，用灭菌蒸馏水清洗3～5次，除去NaClO；
(2)农杆菌的活化与悬浮
取含有重组表达载体pCAMBIA3301-MsCML16、干扰载体pFGC5941-MsCML16的农杆菌EHA105贮存液，在YEP平板(含35mg/L的利福平和50mg/L的卡那霉素)上划线，28℃培养；挑分离良好的单菌落，接种于2mL液体YEB(含35mg/L的利福平和50mg/L的卡那霉素)中，28℃振荡暗培养24h；吸取菌液20μL，涂布于含同样抗生素的YEP平板上，28℃倒置暗培养36h；将新长出的农杆菌刮下来，用YEP液体培养基悬浮稀释，使OD600nm＝0.6～0.8；
(3)侵染、共培养及转基因苗的产生
在超净工作台内，切掉叶柄叶缘，将叶片切成小块用于转化实验。切掉叶柄叶缘后转移至侵染液中，充分混合，抽真空10min；40kHz超声波3-5min(水温应低于20℃)，再抽真空10min，28℃，50-60rpm，1.5h，保持黑暗；将叶片取出，在灭菌的滤纸上尽可能除去切片表面的农杆菌，然后转移到含有100uM的乙酰丁香酮的SM4固体培养基上，保证叶片正面朝上，黑暗共培养2d；将共培养后的叶片转移到含有草丁膦、特美汀(Timetin)和头孢霉素(Cefo)的SM4固体培养基(保证叶片正面朝上)，光下培养一般4-5周，每2周转一次板。待愈伤组织成熟，转移到含有草丁膦、特美汀(Timetin)和头孢霉素(Cefo)的MSBK选择培养基上生长2周，再转移到1/2MS培养基上生长大约6-8周，胚胎开始发育成小植株。将小植株转移到含1/2MS的组培瓶中生长2-3周进行生根培养。
(4)转基因紫花苜蓿的生长
待生根完成将植株转移到混合营养土中，在温室条件下进行培养，待再生苗长出6～7片叶片后，可取叶片提取DNA进行阳性苗鉴定。来源于同一个愈伤组织的幼苗视为同一个转化事件。收获阳性苗，扦插繁殖用于表型验证。
二转基因紫花苜蓿的PCR检测
1.转基因紫花苜蓿的PCR检测
选取温室自然光照下生长30d的转基因紫花苜蓿幼苗剪取叶片，用2ml离心管装好后投于液氮迅速冷冻，于-80℃冰箱中保存备用。
将以上存放于-80℃冰箱中保存备用的样品取出，加入液氮磨碎样品，用TRE-Trizol试剂(TaKaRa公司)提取叶片的总RNA，采用反转录试剂盒Prime Script RT reagentKit with gDNA Erase(TAKaRa公司)进行反转录反应，制备cDNA模板。
2.设计特异检测引物
在https://sg.idtdna.com/scitools/Applications/RealTimePCR/网站分析MsCML16基因cDNA的序列，设计实时荧光定量PCR的引物：
MsCML16基因的上游引物Y2213：5’-TACGACAAGGACAAGAAC-3’；
MsCML16基因的下游引物Y2214：5’-CGTCACCATCAGAATCAA-3’；
Actin基因的上游引物Y3213：5’-CCCACTGGATGTCTGTAGGTT-3’；
Actin基因的下游引物Y3214：5’-AGAATTAAGTAGCAGCGCAAA-3’；
将步骤一制备的模板cDNA稀释30倍，用于实时荧光定量PCR的模板，反应体系为10μL：ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(2×)5μL，上游和下游引物(10μM)各0.2μL，cDNA模板4μL，无菌水0.6μL；使用仪器为TaKaRa公司生产的Thermal Cycler DiceTM RealTime System，PCR反应条件设置为：95℃ 30s；94℃ 10s，60℃ 60s，40个循环；以不加cDNA模板作为阴性对照，每个样品设置3个重复，以持家基因Actin作为内参基因；反应结束后，进行溶解曲线分析，PCR扩增效率在95％以上，计算基因的相对表达量。
其中，图11是导入MsCML16基因的过表达转基因苜蓿的实时荧光定量PCR鉴定结果图；WT表示野生型；OE表示阳性株系；图12是导入MsCML16基因的干扰转基因紫花苜蓿的实时荧光定量PCR鉴定结果图，WT表示野生型；RNAi表示阳性株系。
实施例8转基因紫花苜蓿低温半致死的鉴定
一、低温半致死测定
选用在植物培养箱内生长40d的转基因紫花苜蓿(OE5,OE6,RNAi3,RNAi7)及其野生型S型植株(WT)，收集倒二片叶片测量相对电导率(Ion leakage)。
测定方法为：
取苜蓿叶片冲洗干净，滤纸吸干叶片表面水分，剪去多余叶柄；每3个单叶放入同一玻璃试管(冰上预冷)，向每支试管放一小块碎冰，每个样品设3个重复；将试管放置于低温冷冻循环仪中，从0℃(冷驯化后-2℃)开始，然后以2℃/h降温处理，每个温度处理1h，每次处理设5个温度，每降2℃取出该温度点的试管，并置于4℃解冻过夜；每个试管加入6mL去离子水，水的电导率为C0，置于摇床25℃振荡4h后测定电导率C1；将试管置于沸水浴40min，冷却至室温并测定电导率C2；根据公式求得相对电导率。
从图13A可以看到，经过7d的低温处理后，结果表明，与野生型(WT)相比，在非冷驯化(non-acclimation，NA)和冷驯化(acclimation，CA)条件下，2个过表达转基因株系都表现出较低的低温半致死温度(TEL50),而RNAi株系在NA和CA条件下具有较高的低温半致死温度。与此同时，未驯化(NA)植株的TEL50显著高于所有冷驯化(CA)植株(图13A)，这表明冷驯化提高了紫花苜蓿的耐寒性，过表达MsCML16也导致紫花苜蓿的耐寒性增强。这说明在低温胁迫下，相比野生型植株，转基因紫花苜蓿提高了耐寒性。
二、存活率测定
选用在植物培养箱内生长40d的转基因紫花苜蓿及其野生型S型植株进行存活率的测定。
测定方法为：
紫花苜蓿冻处理实验主要参考Pennycooke等人(Pennycooke et al.,2008)的方法，并在此基础上结合植物材料的生长状况进行了修改。将紫花苜蓿扦插在含有混合营养土(泥炭土：蛭石：珍珠岩＝3:1:1(v/v)的)的直径7cm的塑料盆中，在长日照(光照16h，黑暗8h)，24℃的光照培养箱中生长40d左右，将其分别放置在-5℃的低温光照培养箱中处理1h，随后将植物转移到4℃过夜，在长日照，22℃的培养箱中恢复生长，7d后测定存活率。需要低温驯化的紫花苜蓿，在生长33d左右时移入长日照，4℃的光照培养箱中冷驯化一周，随后将其放置在-7℃的低温光照培养箱中处理6h，后续操作与非冷驯化材料相同。存活率公式如下：存活率＝存活株数/总株数*100％
其结果如图13B所示，RNAi株系在NA和CA条件下，其株系的存活率都显著低于野生型，而过表达株系的存活均高于野生型，冷驯化(CA)处理提高了所有基因型植株的存活率。结果表明，MsCML16正向调控紫花苜蓿的耐寒性。
实施例9转基因紫花苜蓿耐盐性的鉴定
存活率测定
选用在植物培养箱内生长40d的转基因紫花苜蓿及其野生型S型植株进行存活率的测定。
测定方法为：
紫花苜蓿冻处理实验主要参考Pennycooke等人(Pennycooke et al.,2008)的方法，并在此基础上结合植物材料的生长状况进行了修改。将紫花苜蓿扦插在含有混合营养土(泥炭土：蛭石：珍珠岩＝3:1:1(v/v)的)的直径7cm的塑料盆中，在长日照(光照16h，黑暗8h)，24℃的光照培养箱中生长40d左右，将其分别放置在人工培养箱中进行盐处理，浇灌200mM的NaCl溶液进行盐胁迫处理，并以蒸馏水作为对照。适应7d后继续浇透300mM的NaCl溶液进行处理，处理10d后统计存活率。存活率公式如下：存活率＝存活株数/总株数*100％
其结果如图14A所示，RNAi株系在盐处理条件下，其株系的存活率都显著低于野生型，而过表达株系的存活率显著均高于野生型。结果表明，MsCML16正向调控紫花苜蓿的耐盐性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
SEQ ID NO.1
ATGAAGAACGCGGGATTCGAGCATGTTCTTAGATATTTTGATGAAGATGGTGATGGAAAGGTTTCACCAGCAGAGCTAAGACAAAGGCTGGGAGTAATGGGAGAAGAGATTTTGTTGAAAGAAGCTGAAATGGCTATTGAGGCAATGGATTCAGATGGTGATGGATATTTGAGTTTGGAGGAATTAATTGCTTTGATGGAGGAAGGTGGAGAGGAACAAAAGTTGAAGGATTTGAGAGATGCATTTGAGATGTATGATAGTGAGAAGTGTGGATTTATAACACCAAAGAATTTGAAGAGGATGCTTAAGAAGATGGGTGAGTCTAAGTCTATTGATGAATGTAAAGCTATGATTAAACATTTTGATTTGGATGGGGATGGTTTGCTTAGCTTTGATGAATTCACAGTAATGATGCAGTGA
SEQ ID NO.2
MKNAGFEHVLRYFDEDGDGKVSPAELRQRLGVMGEEILLKEAEMAIEAMDSDGDGYLSLEELIALMEEGGEEQKLKDLRDAFEMYDSEKCGFITPKNLKRMLKKMGESKSIDECKAMIKHFDLDGDGLLSFDEFTVMMQ*
SEQ ID NO.3
CATGCAATTTGATCACCGGTTCGATTTTAAAACCGCATATATAAACTCATTTTATGTTTAGTAAAGCCAACTCATTTTATCAACAAGATTAGGTCTAGCGTGAGGGGTTAGGACTCTAACAACTTGAAGAAACAATATTTGAATCCTGAATGAATGAAATAATTCATTGTGAAATCATCTTATCTTTTTTAGAGTAGTGCTATCAACATTCACTAGAATATATGAATTGTAGTTTATTGTTATTAAGCAATAATTAATTGATGAATTATCTGATTGAGTCTCTGTTTCTAAATAGATCGTGATGATTTAGACAATTATGTTAAGTTCAATGAGATGTCTTGCTCTCAATTGTTATAGTTGTTTAATTGTTACCATATTAGACAATTAATTGCGTAAAGAAACCGACTTCTAGACGGCAATAAGAGTAATCGTCCTCTTATATTTGCTCTTCTTGTAATCCTTAAGGTGTAACGTTTTTTTTTTTAACGTTTTTTATGAAGTTCATATGTTAATATACGTTATAATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATATGAATTCAGTTATCAAATAAAATTCCAACAAAGAAGTCATGTCCTACGAACATCAATGTCATAGGATTCACTTAATACAAATTCAATCATTATAAATATGGTGTTAATTAACGAGTAAGCTATCTTATGAATAATCAAATTCATTTTAACATATGTTCTTTTTGTCATTGATTTAATAAACTAGTACGGCAAATTAAGTAACACGGTTGAAACGTCAAAAAAAAAAGTAACACGGTTGAACTATTATTGGGTCGTCACTTTTCCCACGGATGGAATAACAAGTTACAGTTATCAATTTGTCTATATCATCATCAAATAAGTATTACTTTATTTTCCTTGATAAATGAGAAACTAATAGCGTGACACGTTACATATAACGCGTGGCCTCCATGTGCCAATTTACATTAAAACGTACATCATTCCGAACATTCCCAGCAATTTCGTATTTATTTATTTATCTAGTAACTTCATATTTAACACAACTACAACACGCTAGGATACTACAAACCGACATCAAAACCAATCTATATATATACACGAAGCTAGATTCATATTTTTTTAAGATCACCCCTCTCAAAAACCACTTTGATAATTCATATTTGATACCCTTAGCCAAAAATATATTCATAATATATATAACATCTTACACTTTTGATCATTTGCATATACAAGTTCATAAACTCTTGAGTAGAGCTTTATTAGTCATCTTAATTATATTCAGCTCGGGAGATTAGTCTCTTCAGGGATACGTGATTTACACACAACTATATTATAAAAG。

Claims (10)

1.一种紫花苜蓿类钙调蛋白CML16基因，该钙调蛋白CML16基因的核苷酸序列为如下(1)或(2)：
(1)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
(2)与(1)所述的核苷酸序列具有90％以上的同源性且具有同等功能的核苷酸序列。
2.权利要求1所述紫花苜蓿类钙调蛋白CML16基因编码的蛋白，该蛋白的氨基酸序列为如下(a)或(b)：
(a)如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
(b)由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸而形成的具有同等功能的序列。
3.含有权利要求1所述紫花苜蓿类钙调蛋白CML16基因，或沉默或干扰权利要求1所述紫花苜蓿类钙调蛋白CML16基因的生物材料，其特征在于，该生物材料为重组载体、表达盒、细胞系和宿主菌中的至少一种。
4.权利要求1中所述的紫花苜蓿类钙调蛋白CML16基因，权利要求2中所述的紫花苜蓿类钙调蛋白CML16，或者权利要求3中所述的生物材料在提高植物抗逆性或培育抗逆性提高的转基因植物中的应用，所述的抗逆性为耐寒性或/和耐盐性。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，在目标植物中过表达权利要求1所述的紫花苜蓿类钙调蛋白CML16基因提高植物的抗逆性。
6.一种提高植物抗逆性的方法，其特征在于，在目标植物中过表达权利要求1所述的紫花苜蓿类钙调蛋白CML16基因提高植物的抗逆性，所述的抗逆性为耐寒性或/和耐盐性。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在目标植物中过表达所述的紫花苜蓿类钙调蛋白CML16基因的过程为：构建如权利要求1所述紫花苜蓿类钙调蛋白CML16基因的过表达载体，通过农杆菌介导法将所述的过表达载体转入到目标植物中得到抗逆性提高的转基因植株。
8.权利要求4或5中所述的应用，或者权利要求6或7中所述的方法，其特征在于，所述的植物为单子叶植物或双子叶植物。
9.一种紫花苜蓿类钙调蛋白CML16启动子，该启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
10.权利要求9所述的紫花苜蓿类钙调蛋白CML16启动子在如下(1)或(2)中的应用：
(1)驱动GUS表达；
(2)调控下游基因响应逆境胁迫的表达；所述的逆境胁迫为寒冷胁迫或盐胁迫。
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