CN118028302A

CN118028302A - 紫花苜蓿类钙调蛋白cml44基因及其应用

Info

Publication number: CN118028302A
Application number: CN202311539451.8A
Authority: CN
Inventors: 郭振飞; 吴佳璇; 杨波; 杨蕾
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2023-11-18
Filing date: 2023-11-18
Publication date: 2024-05-14

Abstract

本发明公开了紫花苜蓿类钙调蛋白CML44基因及其应用，该钙调蛋白CML44基因的核苷酸序列为如下(1)或(2)：(1)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；(2)与(1)所述的核苷酸序列具有90％以上的同源性且具有同等功能的核苷酸序列。本发明提供了利用MsCML44基因培育高产和抗病植物的方法，将该基因在紫花苜蓿中过量表达后，提高了转基因苜蓿的产量和抗病性；同时，将该基因在紫花苜蓿中干扰后，降低了转基因苜蓿的产量和抗病性。

Description

紫花苜蓿类钙调蛋白CML44基因及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种紫花苜蓿类钙调蛋白CML44基因及其应用。

背景技术

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)，是一种多年生豆科植物，是世界上栽培最广、最重要的豆科牧草之一，常作为牧草育种的种质资源，也是家畜的优质蛋白质来源，当今人口增长带来对反刍动物产品需求的增加，这意味着紫花苜蓿生产需要相应扩大。然而，实际生产过程中苜蓿经常面临各种生物和非生物胁迫的影响。

病虫害引起的苜蓿病害，是引起草产量损失、品质下降以及草地退化的重要原因，严重影响了苜蓿产业的发展。这便要求人们开发新的方法提高苜蓿自身的生长优势和抗逆性，以期在不利条件下以及从更少和更小的田地中获得更高的产量。培育耐逆的植物品种是作物品质改良的有效途径。

类钙调素蛋白(Calmodulin-likeprotein，CML)作为主要的钙传感蛋白，在植物细胞信号转导中发挥重要作用，含有1～6个EF-hand结构域(Benderetal.，2013)。全基因组鉴定结果表明，CML存在于多种不同物种的植物中，且在一个植物基因组中存在大量同源物，每种蛋白根据其所在物种和起源部位的不同具有不同的功能，因此调节大量的生理和生长过程(Bussemeretal.，2009)。

近年来已有诸多研究报道CML在植物生长发育和逆境响应中发挥着重要的作用。在生长发育方面，杨树(Populus deltoides×Populus euramericana)中PdeCML23-1通过调节吲哚乙酸(IAA)含量促进不定根的发育(Xiaoetal.，2020)。拟南芥中(Arabidopsisthaliana)，CML38与RALF1相互作用，从而抑制根系生长(Camposetal.，2018)。CML36激活质膜定位的Ca²⁺ATP酶(ACA8)并参与Ca²⁺介导的开花(Astegnoetal.，2017)。MtCML42通过直接调控ABI5的转录水平，进一步间接调控FTa1的转录水平从而提早蒺藜苜蓿的开花时间(Sunetal.，2021)。逆境胁迫响应方面，AtCML8、AtCML9、AtCML24、AtCML41和AtCML43被证实正向调节植物对丁香假单胞菌的免疫反应(Zhuetal.，2017；Lebaetal.，2012；Maetal.，2008；Xuetal.，2017；Chiassonetal.，2005)；此外，AtCML8正向调节对青枯菌(Ralstoniasolanacearum)维管或根病原体的抗性，可调节参与植物对多种病原体的防御反应的常见下游过程(Zhuetal.，2021)。在棉花(Gossypium hirsutum)中，GhCML11与GhMYB108互作并形成正反馈调节环，参与抗黄萎病大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)侵染的防御反应(Chengetal.，2016)。拟南芥中，AtCML42可以通过降低COI1介导的JA敏感性和JA响应基因的表达，作为植物应对昆虫的食草性防御的负调节因子(Vadasseryetal.，2012)。蒺藜苜蓿MtCML42正向调节MtCBF1和MtCBF4的表达，进而上调一些COR基因MtGolS1和MtGolS2的表达，使棉子糖积累从而导致耐寒性增加(Sunetal.，2021)。紫花苜蓿因具有诸多生产性能方面的优势而被誉为“牧草之王”，挖掘调控紫花苜蓿增产、抗病的基因并进行相关功能研究，可为为紫花苜蓿品种改良和种质资源的选育奠定理论基础。

发明内容

为克服现有技术的缺点和不足，本发明的首要目的是提供一种提高植物产量和抗病性的紫花苜蓿类钙调蛋白CML44基因。

本发明的另一目的在于提供上述紫花苜蓿类钙调蛋白CML44基因编码的蛋白。

本发明的再一目的在于提供上述紫花苜蓿类钙调蛋白CML44基因的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

第一方面，本发明请求保护一种紫花苜蓿类钙调蛋白CML44基因，该钙调蛋白CML44基因的核苷酸序列为如下(1)或(2)：

(1)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

(2)与(1)所述的核苷酸序列具有90％以上的同源性且具有同等功能的核苷酸序列。

第二方面，本发明请求保护如上所述紫花苜蓿类钙调蛋白CML44基因编码的蛋白，该蛋白的氨基酸序列为如下(a)或(b)：

(a)如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；

(b)由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸而形成的具有同等功能的序列。

第三方面，本发明请求保护含有上述的紫花苜蓿类钙调蛋白CML44基因的生物材料或用于沉默或干扰上述紫花苜蓿类钙调蛋白CML44基因的生物材料，该生物材料为重组载体、表达盒、细胞系和宿主菌中的至少一种。

第四方面，本发明请求保护上述的紫花苜蓿类钙调蛋白CML44基因，上述的紫花苜蓿类钙调蛋白CML44，或者上述的生物材料在提高植物产量和抗病性或培育产量和抗病性提高的转基因植物中的应用。

上述的应用，在目标植物中过表达所述的紫花苜蓿类钙调蛋白CML44基因提高植物的产量和抗病性。

第五方面，本发明请求保护一种提高植物产量和抗病性的方法，在目标植物中过表达所述的紫花苜蓿类钙调蛋白CML44基因提高植物的产量和抗病性。

作为一种优选技术方案，在目标植物中过表达所述的紫花苜蓿类钙调蛋白CML44基因的过程为：构建如上所述紫花苜蓿类钙调蛋白CML44基因的过表达载体，通过农杆菌介导法将所述的过表达载体转入到目标植物中得到产量和抗病性提高的转基因植株。

上述的植物为单子叶植物或双子叶植物，例如紫花苜蓿，但不限于此。

研究过程中，技术人员分别采用pCAMBIA3301和pFGC5941构建过表达载体35S::MsCML44和干扰载体MsCML44-RNAi，筛选压均为草丁膦。选择扦插8-12周的紫花苜蓿成熟叶片进行遗传转化，依次进行侵染、共培养、愈伤组织的诱导、愈伤组织再生和再生苗生根等过程获得转基因紫花苜蓿。

含有紫花苜蓿类钙调蛋白CML44基因的重组载体为重组表达载体，该重组表达载体是通过将上述紫花苜蓿类钙调蛋白CML44基因的核苷酸序列与植物表达载体连接得到的；所述的植物过表达载体优选为pCAMBIA3301。

制备干扰紫花苜蓿类钙调蛋白CML44基因表达的干扰载体，所采用的载体优选为pFGC5941；

含有紫花苜蓿类钙调蛋白CML44基因(MsCML44)的重组表达载体的制备方法，包含以下步骤：

(1)引物设计

引物⑴为MsCML44扩增上游引物Y3945：

5’-ATGTGTCCCCTAACCCGCAATGAA-3’；

引物⑵为MsCML44扩增下游引物Y3946：

5’-CTAAACACGTTGTAGTGTAAGCAA-3’；

引物⑶为引入NcoI酶切位点的上游引物Y3951：

5’-CACGGGGGACTCTTGACCATGGCAATGTGTCCCCTAACCCGCAATGAA-3’；

引物⑷为引入BstEII酶切位点的下游引物Y3952：

5’-CGGGGAAATTCGAGCTGGTCACCCTAAACACGTTGTAGTGTAAGCAA-3’；

引物⑸为引入AscI酶切位点的上游引物Y4029：

5’-ACCATGGGGCGCGCCGAATTGGAGCTGATATTTAAGA-3’；

引物⑹为引入AscI酶切位点的下游引物Y4030：

5’-TCATCGATTGGGCGCGCCGTCACTTTCTAATTCTACCTCCTCAA-3’；

引物⑺为引入XbaI酶切位点的上游引物Y4031：

5’-CTTAATTAACTCTCTAGAGAATTGGAGCTGATATTTAAGA-3’；

引物⑻为引入BamHI酶切位点的下游引物Y4032：

5’-TTGCAGGTATTTGGATCCGTCACTTTCTAATTCTACCTCCTCAA-3’；

引物⑼为MsCML44上游启动子扩增上游引物Y4339：

5’-ATGGGGAAGAATGCCGTGGTGAT-3’；

引物⑽为MsCML44上游启动子扩增下游引物Y4342：

5’-ATTGGCAAGATTCTCCACAGAT-3’；

引物⑾为引入HindIII酶切位点的上游引物Y4360：

5’-ACGACGGCCAGTGCCAAGCTTGATTTAATCCGTATGCATTGTCAGT-3’；

引物⑿为引入BamHI酶切位点的下游引物Y4361：

5’-GACAGATCCACTAGTGGATCCATTGGCAAGATTCTCCACAGAT-3’

引物⒀为引入XbaI酶切位点的上游引物Y3959：

5’-CCGGAGCTAGCTCTAGAATGTGTCCCCTAACCCGCAATGAA-3’；

引物⒁为引入BamHI酶切位点的上游引物Y3960：

5’-CTTGCTCACCATGGATCCAACACGTTGTAGTGTAAGCAA-3’；

(2)MsCML44基因片段的获得：

以紫花苜蓿的cDNA为模板，使用引物⑴和引物⑵扩增MsCML44基因的cDNA开放阅读框，并以此为模板连接同源臂，克隆获得pCAMBIA3301-MsCML44同源臂片段和干扰正义链MsCML44-RNAi-1和反义链MsCML44-RNAi-2同源臂片段；

(3)含有MsCML44基因的重组表达载体pCAMBIA3301-MsCML44和pFGC5941-MsCML44的构建：

以MsCML44基因片段为模板，使用引物⑶和引物⑷使MsCML44基因片段引入NcoI和BstEII两个酶切位点，并与植物表达载体pCAMBIA3301连接，进而构建获得含有MsCML44基因的重组表达载体pCAMBIA3301-MsCML44；

以MsCML44基因片段为模板，使用引物⑸和引物⑹使MsCML44基因片段引入AscI酶切位点，并与植物表达载体pFGC5941连接，获得干扰正义链载体，以此载体为模板，使用XbaI和BamHI进行双酶切获得载体大片段，使用引物⑺和引物⑻使MsCML44基因片段引入XbaI和BamHI酶切位点，与双酶切载体大片段连接，进而构建获得pFGC5941-MsCML44干扰载体；

含有MsCML44基因的重组表达载体pCAMBIA3301-MsCML44的转基因植株和pFGC5941-MsCML44干扰载体的转基因植株是通过将上述重组表达载体或干扰载体转化紫花苜蓿叶片组织，并将转化的植物组织培养得到的。

所述的植物优选为紫花苜蓿；

所述表达紫花苜蓿MsCML44的转基因植株的制备方法，包含如下步骤：

(1)用电击转化的方法将重组表达载体pCAMBIA3301-MsCML44和干扰载体pFGC5941-MsCML44导入根瘤农杆菌EHA105中，分别获得含有重组表达载体pCAMBIA3301-MsCML44和干扰载体pFGC5941-MsCML44的农杆菌阳性菌落；

(2)将活化的含有重组表达载体pCAMBIA3301-MsCML44和干扰载体pFGC5941-MsCML44的农杆菌EHA105浸染紫花苜蓿的叶片，经共培养和草丁膦抗性筛选，获得转基因紫花苜蓿。

本发明从紫花苜蓿中克隆了紫花苜蓿类钙调蛋白CML44的cDNA序列MsCML44，并将获得的MsCML44基因与植物表达载体连接，构建了重组过表达载体和干扰载体，用构建的重组表达载体和干扰载体转化紫花苜蓿植物叶片，然后培育成转基因植株。MsCML44基因受尖刀镰孢菌侵染的诱导；MsCML44定位于细胞核和细胞质中；MsCML44在拟南芥根、茎、叶片和花药均有GUS活性，这与在紫花苜蓿中检测到的MsCML44表达结果基本一致；本发明提供了利用MsCML44基因培育高产抗病植物的方法，将该基因在紫花苜蓿中过量表达后，提高了转基因苜蓿的产量和抗病性；同时，将该基因在紫花苜蓿中干扰后，降低了转基因苜蓿的产量和抗病性。

第六方面，本发明请求保护一种紫花苜蓿类钙调蛋白CML44启动子，该启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

上述的紫花苜蓿类钙调蛋白CML44启动子在如下(1)或(2)中的应用也属于本发明的保护范围：

(1)驱动GUS表达；

(2)调控下游基因响应逆境胁迫的表达；所述的逆境胁迫为尖刀镰孢菌侵染、干旱胁迫或者盐胁迫。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明从紫花苜蓿中克隆了MsCML44的cDNA序列，该MsCML44基因的表达受尖刀镰孢菌侵染的诱导。

(2)本发明将获得的MsCML44蛋白进行亚细胞定位分析，其定位于细胞核、细胞质中。

(3)本发明将获得的MsCML44基因与植物表达载体连接，构建了适合于苜蓿的重组表达载体，并转化紫花苜蓿，过表达MsCML44的转基因紫花苜蓿明显提高了产量和抗病性，RNAi植株明显降低产量和抗病性。

(4)本发明提供了利用MsCML44基因培育高产耐逆境植物的方法。

附图说明

图1是重组表达载体pCAMBIA3301-MsCML44的表达框示意图。

图2是MsCML44基因开放阅读框序列的PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图；

其中，M是标准DNA分子；泳道2是MsCML44基因的扩增片段。

图3是重组表达载体pCAMBIA3301-MsCML44的PCR鉴定琼脂糖凝胶电泳图；

其中，M是标准DNA分子；泳道1、2、3、4、5、6是阳性重组子。

图4是重组表达载体pFGC5941-MsCML44的PCR鉴定琼脂糖凝胶电泳图；

其中，M是标准DNA分子；泳道1、2、3、4是阳性重组子。

图5是MsCML44的亚细胞定位。

图6是尖刀镰孢菌侵染诱导MsCML44基因表达的结果分析柱状图；

其中，表示尖刀镰孢菌侵染对MsCML44基因转录的影响；柱上方的字母a、b和c表示不同处理之间的差异显著(P≤0.05)，即数据柱上方字母相同时表示没有显著差异，数据柱上方字母不同时表示差异显著。

图7是MsCML44基因启动子序列的PCR扩增琼脂糖凝胶电泳图；

其中，M是标准DNA分子；泳道1、2是MsCML44基因启动子序列的扩增片段。

图8是重组干扰载体pFGC5941-P:MsCML44的PCR鉴定琼脂糖凝胶电泳图；

其中，M是标准DNA分子；泳道9是阳性重组子；泳道1、2、3、4、5、6、7、8是阴性重组子。

图9是MsCML44基因的组织特异性表达分析。；

其中，A图表示对MsCML44基因在紫花苜蓿不同组织中的表达情况，纵坐标表示相对表达量，来自于紫花苜蓿(Medicagosativasubsp.sativa)的根、茎、叶、花等组织的表达量数据(TPM:TranscriptperKilobaseperMillionmappedreads)，以叶中的表达量为对照，其他组织的TPM值除以叶中的TPM值。B图表示ProMsCML44::GUS转基因拟南芥幼苗根部(Ⅰ)、叶片(Ⅱ)、花和雄蕊(Ⅲ)、角果(Ⅳ)的GUS染色。

图10是导入MsCML44基因的过表达转基因苜蓿的实时荧光定量PCR鉴定结果图；

其中，WT表示野生型；OE表示阳性株系；

图11是导入MsCML44基因的干扰转基因紫花苜蓿的实时荧光定量PCR鉴定结果图；

其中，WT表示野生型；RNAi表示阳性株系；

图12是导入MsCML44基因的转基因苜蓿生长性状差异结果分析图；

其中，(A)是枝条扦插10周龄转基因植株；(B)、(C)、(D)、(E)、(F)和(G)分别是转基因株系的株高、分枝数、茎节数、开花时间、净光合速率和鲜草产量。柱上方的字母a、b和c表示不同材料之间的差异显著(P﹤0.05)。

图13是导入MsCML44基因的转基因苜蓿抗病性检测结果分析图；

其中，(A)是尖刀镰孢菌侵染4周后的转基因株系；(B)和(C)是尖刀镰孢菌侵染后转基因株系的的相对鲜重(相对鲜重＝接菌组植株鲜重/对照组植株鲜重)和相对根长(相对根长＝接菌组植株根长/对照组植株根长)；柱上方的字母a、b和c表示不同材料之间的差异显著(P﹤0.05)。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

紫花苜蓿(MedicagosativaL.cv.Regen-SY4D)为本实验室所有。

根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105：购自北京天恩泽基因科技有限公司。pCAMBIA3301过表达载体thermos为本实验室保存。pFGC5941干扰载体：为本实验室保存。大肠杆菌DH5α：购自上海超研生物科技有限公司。以上生物材料均为本领域技术人员公知的常规生物材料。

实施例1MsCML44基因的克隆

一、紫花苜蓿cDNA模板制备

紫花苜蓿品种为MedicagosativaL.cv.Regen-SY4D，将紫花苜蓿播种在含有混合营养土(泥炭土：珍珠岩＝3:1(v/v)的)、直径为15cm的塑料盆中，于温室内(25℃)自然光照下培养。紫花苜蓿材料生长40d后，剪取紫花苜蓿的成熟叶片，用Trizol方法提取总RNA，用逆转录酶试剂盒HiScriptIII 1stStrandcDNASynthesisKit(+gDNAwiper)(Vazyme公司)进行反转录，获得cDNA模板，-20℃保存备用。

二、扩增MsCML44基因引物

根据蒺藜苜蓿的基因组数据库CML44基因的cDNA序列，设计扩增紫花苜蓿MsCML44的cDNA开放阅读框(由通用生物公司合成)的引物。

引物⑴扩增MsCML44的上游引物为Y3945，序列为：

5’-ATGTGTCCCCTAACCCGCAATGAA-3’；

引物⑵扩增MsCML44的下游引物为Y3946，序列为：

5’-CTAAACACGTTGTAGTGTAAGCAA-3’。

三、扩增获得MsCML44基因并构建载体

用上述步骤一制备的模板和步骤二设计的引物进行PCR扩增：

PCR反应体系(50μL)：KODFX聚合酶(TOYOBO公司，1U·μL^-1)1μL，2×PCRbufferforKODFX 25μL，dNTPs(2mmol·L^-1)10μL，上游引物(0.3μmol·L^-1)1.5μL，下游引物(0.3μmol·L^-1)1.5μL，反转录第一链cDNA 1μL，用去离子补足至50μL；

PCR反应程序：94℃2min，1个循环；98℃10s，55℃30 s，68℃30s，35个循环；68℃10min，1个循环；扩增产物以质量分数为1％的琼脂糖凝胶电泳检测；

获得一条长约465bp的序列(图2)，将获得的PCR产物用DNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)回收。

实施例2过表达载体pCAMBIA3301-MsCML44和干扰载体pFGC5941-MsCML44的构建一、过表达载体pCAMBIA3301-MsCML44的构建

根据实施例1获得的MsCML44开放阅读框序列，设计带有NcoI和BstEII酶切位点的扩增引物：

引物⑶为引入NcoI酶切位点的上游引物Y3951：

5’-CACGGGGGACTCTTGACCATGGCAATGTGTCCCCTAACCCGCAATGAA-3’；

引物⑷为引入BstEII酶切位点的下游引物Y3952：

5’-CGGGGAAATTCGAGCTGGTCACCCTAAACACGTTGTAGTGTAAGCAA-3’；

将PCR回收片段进行同源臂扩增和载体连接，pCAMBIA3301表达载体分别用限制性内切酶NcoI(NEB公司)和BstEII(NEB公司)双酶切，将回收MsCML44基因同源臂扩增目的片段和酶切后载体大片段，采用ClonExpressII重组反应液按摩尔比1:2的比例进行连接，反应体系如下：5×CEIIBuffer5μL，ExnaseII1μL，回收的目的片段0.2μL，酶切后载体大片段1.6μL，用去离子补足到10μL，37℃连接30min，置于冰上冷却后获得连接产物；

大肠杆菌感受态细胞的制备：用接种环取保存于-80℃超低温冰箱的大肠杆菌DH5α菌液，在LB固体培养基上划板，于37℃培养箱内培养过夜；挑取大肠杆菌DH5α单菌落接种于1mL的LB液体培养基中，在37℃恒温摇床上以200rpm振荡培养约6h，接种于200mLLB液体培养基中，于37℃恒温摇床上以200rpm振荡培养至OD_550nm＝0.6；以2500rpm离心10min收集菌体，加入预冷的体积分数为50％的甘油(甘油：LB液体培养基)洗涤，离心收集细菌；重复用预冷的体积分数为10％的甘油(含甘油的LB液体培养基)洗涤，离心收集细菌，最后将细菌分装，于-80℃保存备用；

连接产物热激转化大肠杆菌：从-80℃取出DH5α感受态细胞，将连接产物加入至50μLDH5α感受态细胞中，冰中放置15min；42℃热激45s后，冰中放置2min；热激后的菌体转入500μLLB液体中，于37℃恒温摇床上以200rpm振荡培养1h。取100μL菌液涂布于LB固体(含200μg/mL卡那霉素)培养基上，于37℃培养箱内倒置培养过夜。

重组质粒pCAMBIA3301-MsCML44的筛选、纯化及测序：挑取白色菌落，做菌落PCR检测。挑取PCR阳性菌落，接种于2mL含200μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃恒温摇床上以200rpm振荡培养过夜；吸取2mL菌液，用质粒DNA纯化试剂盒(Axygen公司)提质粒，4℃保存备用。纯化的重组质粒命名为pCAMBIA3301-MsCML44。

通过PCR检测，以pCAMBIA3301-MsCML44质粒为模板，用引物⑶和引物⑷扩增出大小正确的片段，条带大小为500bp左右，结果表明重组载体上含有MsCML44基因(图3)。进一步对插入片段测序，结果表明插入片段的序列与MsCML44编码区的序列完全一致，并且插入片段两端的酶切位点也完全正确，从而证明成功构建了重组表达载体pCAMBIA3301-MsCML44，该重组表达载体的表达框示意图如图1。

二、干扰载体pFGC5941-MsCML44的构建

根据实施例1获得的MsCML44开放阅读框序列，选取约200bp大小的条带，设计带有AscI(NewEnglandBiolabs，NEB公司)酶切位点的扩增引物进行PCR扩增，获得正义链同源臂，同时将载体pFGC5941使用AscI(NEB公司)单酶切，对PCR产物和酶切产物回收后采用同源重组的方法进行目的片段与载体片段连接。

引物⑸为引入AscI酶切位点的上游引物Y4029：

5’-ACCATGGGGCGCGCCGAATTGGAGCTGATATTTAAGA-3’；

引物⑹为引入AscI酶切位点的下游引物Y4030：

5’-TCATCGATTGGGCGCGCCGTCACTTTCTAATTCTACCTCCTCAA-3’；

回收方法、同源重组方法、质粒转化大肠杆菌方法同上述方法一致。

通过PCR检测，以pFGC5941-MsCML44-1质粒为模板，用引物⑸和引物⑹扩增出大小正确的片段，条带大小为200bp左右，结果表明重组载体上含有200bp大小的MsCML44基因。进一步对插入片段测序，结果表明插入片段的序列与MsCML44编码区的序列完全一致，并且插入片段两端的酶切位点也完全正确，从而证明成功构建了含有正义链片段的正确载体质粒，命名为pFGC5941-MsCML44-1。

根据干扰载体的连接规则和方法进一步设计带有XbaI(NEB公司)和BamHI(NEB公司)双酶切位点扩增，以实施例1获得的MsCML44的基因片段为模板进行PCR扩增，获得反义链同源臂，同时将上述步骤获得的pFGC5941-MsCML44-1载体使用XbaI(NEB公司)和BamHI(NEB公司)双酶切，对PCR产物和酶切产物回收后采用同源重组的方法进行目的片段与载体片段连接。

引物⑺为引入XbaI酶切位点的下游引物Y4031：

5’-CTTAATTAACTCTCTAGAGAATTGGAGCTGATATTTAAGA-3’；

引物⑻为引入BamHI酶切位点的下游引物Y4032：

5’-TTGCAGGTATTTGGATCCGTCACTTTCTAATTCTACCTCCTCAA-3’；

通过PCR检测，以上述质粒为模板，用引物⑺和引物⑻扩增出大小正确的片段，条带大小为200bp左右，结果表明重组载体上含有200bp大小的MsCML44基因。进一步对插入片段测序，结果表明插入片段的序列与MsCML44编码区的序列完全一致，并且插入片段两端的酶切位点也完全正确，从而证明成功构建了含有正、反义链片段，形成发夹结构的正确干扰载体质粒，命名为pFGC5941-MsCML44(图4)。

实施例3MsCML44的亚细胞定位

以野生型紫花苜蓿基因组为模板，扩增获得全长的MsCML44 CDS序列(去除终止密码子)，构建到pCAMBIA1305-GFP载体上，转化大肠杆菌DH5α，PCR鉴定获取阳性菌，确定MsCML44::GFP的亚细胞定位载体构建成功，转化农杆菌，通过农杆菌介导注射本氏烟草(Nicotianabenthamiana)实现瞬时表达，具体操作步骤如下：

引物⒀为引入XbaI酶切位点的上游引物Y3959：

5’-CCGGAGCTAGCTCTAGAATGTGTCCCCTAACCCGCAATGAA-3’；

引物⒁为引入BamHI酶切位点的上游引物Y3960：

5’-CTTGCTCACCATGGATCCAACACGTTGTAGTGTAAGCAA-3’；

(1)将新活化的含有MsCML44-GFP表达载体的农杆菌单克隆接种到含有利福平和卡那霉素的YEP培养基，在摇床上(28℃)以200rpm震荡培养过夜；

(2)当菌液OD_600nm＝0.6-0.8时，以5000rpm离心10min，收集菌体沉淀；

(3)用重悬Buffer工作液(10mMMgCl₂，10mMMES，200μM乙酰丁香酮)重悬菌液，调至OD_600nm＝0.1，将不同组合的菌液等体积混合后备用；

(4)用注射器在1月龄本氏烟草叶片背面轻柔注射将菌液。将植株置于生长室中，25℃生长48-72h，用激光共聚焦扫描显微镜(ZeissLSM800，Germany)观察转化后的叶片并拍照。

MsCML44-GFP荧光在细胞质和细胞核中均可观察到，并与细胞核Marker蛋白的mCherry的荧光重叠，而转化对照载体的GFP荧光在整个细胞中都可以观察到。结果表明，MsCML44定位于细胞质和细胞核中(图5)。

实施例4MsCML44受尖刀镰孢菌侵染诱导的表达分析

一、获得尖刀镰孢菌侵染条件下的紫花苜蓿cDNA模板

紫花苜蓿(MedicagosativaL.cv.Regen-SY4D)土培扦插1个月生根后，移入水培盒，用水洗净根系，将幼苗定殖在泡沫棉上，以1/2的Hoagland(pH＝5.8)营养液进行溶液培养，定期更新营养液和通气。置于16h光照/8h黑暗、22℃的恒温人工培养箱中水培一周，每2d更换一次营养液。将幼苗随机分为4组，选取生长状况一致的幼苗病菌侵染处理。

尖刀镰孢菌处理时，将幼苗分别转移至含有游动孢子悬液(每毫升约含有1×10⁶个游动孢子)中30min，之后转移到1/2Hoagland中。以不加处理的1/2Hoagland培养的样品作为对照组。在侵染后不同时间点采集根组织，在侵染后0、24、48、72hpi(hourpostinoculation)采集根系组织，每个样品收取100mg紫花苜蓿幼苗的根部组织备后续实验使用。所有样品收集于离心管后，在液氮中迅速冷冻，随后转存在-80℃冰箱待用。试验设置3个生物学重复。

测定时将以上待用样品取出，加入液氮磨碎样品，用TRE-Trizol试剂(TaKaRa公司)提取叶片的总RNA，利用分光光度计检测上述提取RNA的浓度后取1μg作为模板，使用HiScriptIIQRTSuperMixforqPCR(Vazyme公司)试剂盒进行反转录，将获得的cDNA置于-20℃保存备用。

二、设计特异检测引物

在https://sg.idtdna.com/scitools/Applications/RealTimePCR/网站分析MsCML44基因cDNA的序列，设计实时荧光定量PCR的引物：

MsCML44基因的上游引物Y4377：5’-GGTGGTGATGAGATTGAGGAGG-3’；

MsCML44基因的下游引物Y4378：5’-CATCCCACATGCCAAGTCTCT-3’；

Actin基因的上游引物Y3213：5’-CCCACTGGATGTCTGTAGGTT-3’；

Actin基因的下游引物Y3214：5’-AGAATTAAGTAGCAGCGCAAA-3’；

三、MsCML44基因表达的实时荧光定量PCR检测

将步骤一制备的模板cDNA稀释30倍，用于实时荧光定量PCR的模板，根据ChamQSYBRqPCRMasterMix试剂使用说明书进行反应液的配制，反应体系为10μL：2×ChamQSYBRqPCRMasterMix5μL，上游和下游引物(10μM)各0.2μL，cDNA模板4.6μL；使用仪器为TaKaRa公司生产的ThermalCyclerDiceTMRealTimeSystem，PCR反应条件设置为：95℃30s，1个循环；95℃5s，60℃30s，40个循环；95℃5s，1个循环；65℃5s，1个循环；以不加cDNA模板作为阴性对照，每个样品设置3个重复，以持家基因Actin作为内参基因；反应结束后，进行溶解曲线分析，PCR扩增效率在95％以上，计算基因的相对表达量；

实时荧光定量PCR的结果显示，尖刀镰孢菌侵染紫花苜蓿后，MsCML44在48和72hpi(hourspost-infection)显著诱导表达，其中MsCML44在48hpi时表达量最高，实验组的表达量是对照组的63倍，说明尖刀镰孢菌侵染诱导MsCML44基因的表达(图6)。

实施例5MsCML44的组织特异性表达分析

一、MsCML44基因启动子片段的获得

首先通过TBtools软件获得MsCML44上游启动子长约2000bp的序列，以此序列设计扩增启动子的上游引物⑼和下游引物⑽，以新疆大叶的DNA为模板，使用高保真酶(KOD)进行PCR扩增。

引物⑼为MsCML44上游启动子扩增上游引物Y4339：

5’-ATGGGGAAGAATGCCGTGGTGAT-3’；

引物⑽为MsCML44上游启动子扩增下游引物Y4342：

5’-ATTGGCAAGATTCTCCACAGAT-3’

PCR反应体系：KODFX聚合酶(TOYOBO公司，1U·μL^-1)1μL，2×PCRbufferfor

KODFX25μL，dNTPs(2mmol·L^-1)10μL，上游引物(0.3μmol·L^-1)1.5μL，下游引物(0.3μmol·L^-1)1.5μL，新疆大叶DNA1μL，用去离子补足至50μL；

PCR反应程序：94℃2min，1个循环；98℃10s，55℃30 s，68℃2min，35个循环；68℃10min，1个循环；扩增产物以质量分数为1％的琼脂糖凝胶电泳检测；

获得一条长约MsCML44上游1821bp的序列(图7)，将获得的PCR产物用DNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)回收。

所述的紫花苜蓿类钙调蛋白CML44启动子序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

MsCML44基因启动子元件分析见表1，其中包含大量的顺式作用元件。根据相关注释，主要包括ABRE(脱落酸响应顺式作用元件)、MBS(干旱诱导的MYB结合位点)、MBSI(参与黄酮类生物合成基因调控的MYB结合位点)、GARE-element(赤霉素响应元件)、WUN_motif(伤口应答元件)以及G-box(光响应元件)等。可以推测，MsCML44可能在生长发育和胁迫响应中发挥作用。

表1MsCML44基因启动子中的顺式作用元件

二、P_MsCML44:GUS表达载体构建

根据步骤一获得的MsCML44上游的启动子序列，设计带有EcoRI和NcoI酶切位点进行同源臂扩增；同时，pFGC5941表达载体分别用限制性内切酶HindIII(NEB公司)和BamHI(NEB公司)双酶切，将回收的P:MsCML44启动子同源臂扩增目的片段和酶切后载体大片段，采用ClonExpressII按摩尔比1:2的比例进行连接，反应体系如下：5×CEIIBuffer5μL，ExnaseII 1μL，回收的目的片段0.2μL，酶切后载体大片段1.6μL，用去离子补足到10μL，37℃连接30min，置于冰上冷却后获得连接产物，重组反应液转化DH5ɑ，挑取单克隆送测序，将测序正确的菌液和质粒保存(图8)。进一步用电击转化的方法将重组表达载pFGC5941-P:MsCML44导入根瘤农杆菌EHA105中。

引物⑾为引入HindIII酶切位点的上游引物Y4360：

5’-ACGACGGCCAGTGCCAAGCTTGATTTAATCCGTATGCATTGTCAGT-3’；

引物⑿为引入BamHI酶切位点的下游引物Y4361：

5’-GACAGATCCACTAGTGGATCCATTGGCAAGATTCTCCACAGAT-3’。

三、获得以MsCML44启动子驱动GUS的转基因拟南芥的遗传转化

(1)将携带pFGC5941-P:MsCML44质粒的农杆菌接种到1mL含卡那霉素和利福平抗性的YEP液体培养基中，28℃下200rpm振荡培养1d，活化菌液；

(2)将上述菌液接种至50mL含卡那霉素和利福平抗性的YEP液体培养基中，28℃下200rpm振荡培养12-18h，至OD_600nm达到1.0-1.6；

(3)室温4000rpm离心10min，收集菌体，使用现配现用的5％(g/100ml)蔗糖重悬细胞，调整OD_600nm至0.6-0.8，加入SilwetL-77至终浓度为0.05％，立即混合均匀；

(4)选取长势良好且花序较多的植株，用移液枪吸取上述侵染液打在野生型拟南芥花上，并用手轻捏使花更好地吸收侵染液，稍微控干植株表面液体，将植株套袋避光放置16h后再恢复正常生长条件；

(5)7d后，重复上述步骤，进行二次侵染，以提高转化效率；

(6)使用草丁膦筛选和PCR鉴定获得纯合MsCML44启动子转基因拟南芥。

四、获得纯合MsCML44启动子转基因拟南芥进行GUS染色

GUS染色的配制：

(1)染色液的配制由100μLX-Gluc母液和900μLX-Gluc基液组成，现配现用，其中X-Gluc母液是溶于N-N-二甲基酰胺(DMF)的X-Gluc配成的20mM贮存液，母液分装成每管100μL，保存于-20℃；X-Gluc基液(50mMPBS，pH7.0)由以下试剂混合配制：1.56gNaH2PO4·2H2O、3.58gNa2HPO4·12H2O、0.744gNa2EDTA、200μLTriton-100、32.9mgK3[Fe(CN)6]和21.1mgK4[Fe(CN)6]·3H2O加入到烧杯中，搅拌混匀，加去离子水定容至100mL，保存于4℃。

(2)在GUS染色液中放入转基因拟南芥的幼苗、茎、叶、花、果荚，抽真空10min。置于37℃避光染色2-24h至颜色出现变化后倒掉染色液，用70％乙醇进行脱色3-5次，使用体式显微镜进行拍照。

通过https://medicago.legumeinfo.org/的BLAST工具得到该网站上提供的MsCML44与新疆大叶基因对应的基因编号(Geneid:medsa.XinJiangDaYe.gnm1.ann1.MS.gene26618)，从LIS豆类信息系统数据库(https://www.legumeinfo.org/)中调取MsCML44基因在紫花苜蓿(Medicagosativasubsp.sativa)的不同组织中的表达量数据，其中根瘤、花、叶、根、伸长前的茎和伸长茎样品均取自成熟紫花苜蓿植株，分析MsCML44基因在紫花苜蓿的不同组织中的表达水平。表达量数据(TranscriptperKilobaseperMillionmappedreads，TPM)结果显示MsCML44在紫花苜蓿根中检测到最高表达。与此同时，在花、茎、叶和根瘤中均存在一定水平的表达，MsCML44在紫花苜蓿中整体呈现组成型表达分布(图9A)。与此同时，获得了以MsCML44启动子驱动GUS的转基因拟南芥纯合株系，GUS染色结果表明，在幼苗的根部有较高的GUS活性，在角果、成熟植株的叶和茎以及成熟花的花药均存在GUS活性，这些结果表明MsCML44主要在植物根部，茎，叶片和花中表达(图9B)。

实施例6转基因苜蓿的产生及分子检测

一、转基因苜蓿的产生

1、将重组表达载体pCAMBIA3301-MsCML44、干扰载体pFGC5941-MsCML44导入根癌农杆菌EHA105

EHA105感受态的制备：取菌株划线，28℃过夜，之后挑单克隆至于10mLYEB(50mg/L利福平)，28℃摇过夜；取300μL接种至300mLYEB培养基(含利福平)，28℃摇过夜至OD_600nm在0.5-0.7；将摇好的菌分装至50mL离心管，每管约30ml，置于冰中10min，之后4℃，6000rpm，5min，彻底去上清，每管加10mL 10％(v/v)甘油(从4℃取出)，冰浴5min后，在冰水混合物上手动轻摇悬浮(摇约10min，期间甘油放4℃)，之后4℃，6000rpm，5min，去上清；每管加10mL10％甘油，冰水上悬浮，之后4℃，6000rpm，5min，去上清；每管加1.5mL10％的甘油，轻摇悬浮；分装至1mL离心管，每管40μL，立即液氮速冻置于-80℃冰箱。

把感受态细胞置于冰上解冻，将0.2cm内径的电击杯置于冰上预冷，在超净工作台内，将1.5μLpCAMBIA3301-MsCML44质粒、pFGC5941-MsCML44(20ng/μL)加至20μL解冻的感受态细胞中，轻弹管壁混匀，冰浴1min后，转移至电击杯中，置于电击仪(MicroPulser，Bio-RAD公司)的电极间，选定程序Agr，进行电击；电击结束后，在超净工作台内，迅速将1mLYEP液体培养基倒入电击杯，再用移液枪转移至摇菌管中，28℃轻柔振荡培养2h；吸取0.3mL菌液，涂布在YEP平板(含35mg/L的利福平和50mg/L的卡那霉素)上，28℃培养箱内倒置培养48h；

2、含重组表达载体pCAMBIA3301-MsCML44、干扰载体pFGC5941-MsCML44农杆菌阳性菌落的鉴定

挑取平板上的单菌落进行菌落PCR检测，并做好标记；进一步挑取PCR阳性菌落至3mLYEB液体培养基(含35mg/L的利福平和50mg/L的卡那霉素)中，28℃振荡培养40h；取2mL菌液用碱裂解法抽提质粒，表达载体pCAMBIA3301-MsCML44用限制性内切酶NcoI(NEB公司)和BstEII(NEB公司)进行酶切检测，确定阳性克隆中含有植物表达载体pCAMBIA3301-MsCML44，表达载体pFGC5941-MsCML44用限制性内切酶XbaI(NEB公司)和BamHI(NEB公司)进行酶切检测，确定阳性克隆中含有植物表达载体pFGC5941-MsCML44；取0.8mL农杆菌液，加0.2mL体积分数为50％的甘油(甘油：YEB液体培养基)，混匀后保存于-80℃超低温冰箱备用。

3、转基因紫花苜蓿植株的获得

(1)紫花苜蓿的遗传转化与鉴定

将构建成功的pCAMBIA3301-MsCML44、pFGC5941-MsCML44植物过量表达载体和干扰载体的质粒转化农杆菌，筛选阳性克隆进一步用于植物的遗传转化，筛选标记均为草丁膦。

取生长40d左右健康无病症的紫花苜蓿叶片，自来水清洗表面杂质，6.25％NaClO表面消毒30min，用灭菌蒸馏水清洗3～5次，除去NaClO；

(2)农杆菌的活化与悬浮

取含有重组表达载体pCAMBIA3301-MsCML44、干扰载体pFGC5941-MsCML44的农杆菌EHA105贮存液，在YEP平板(含35mg/L的利福平和50mg/L的卡那霉素)上划线，

28℃培养；挑分离良好的单菌落，接种于2mL液体YEB(含35mg/L的利福平和50mg/L的卡那霉素)中，28℃振荡暗培养24h；吸取菌液20μL，涂布于含同样抗生素的YEP平板上，28℃倒置暗培养36h；将新长出的农杆菌刮下来，用YEP液体培养基悬浮稀释，使OD₆₀₀ _nm为0.6～0.8；

(3)侵染、共培养及转基因苗的产生

在超净工作台内，切掉叶柄叶缘，将叶片切成小块用于转化实验。切掉叶柄叶缘后转移至侵染液中，充分混合，抽真空10分钟；40kHz超声波3-5min(水温应低于20℃)，再抽真空10min，28℃，50-60rpm，1.5h，保持黑暗；将叶片取出，在灭菌的滤纸上尽可能除去切片表面的农杆菌，然后转移到含有100uM的乙酰丁香酮的SM4固体培养基上，保证叶片正面朝上，黑暗共培养2天；将共培养后的叶片转移到含有草丁膦、特美汀(Timetin)和头孢霉素(Cefo)的SM4固体培养基(保证叶片正面朝上)，光下培养一般4-5weeks，每2周转一次板。待愈伤组织成熟，转移到含有草丁膦、特美汀(Timetin)和头孢霉素(Cefo)的MSBK选择培养基上生长2周，再转移到1/2MS培养基上生长大约6-8周，胚胎开始发育成小植株。将小植株转移到含1/2MS的组培瓶中生长2-3周进行生根培养。

(4)转基因紫花苜蓿的生长

待生根完成将植株转移到混合营养土中，在温室条件下进行培养，待再生苗长出6～7片叶片后，可取叶片提取DNA进行阳性苗鉴定。来源于同一个愈伤组织的幼苗视为同一个转化事件。收获阳性苗，扦插繁殖用于表型验证。

二、转基因紫花苜蓿的PCR检测

1.转基因紫花苜蓿的PCR检测

选取温室自然光照下生长30d的转基因紫花苜蓿幼苗剪取叶片，用2ml离心管装好后投于液氮迅速冷冻，于-80℃冰箱中保存备用。

将以上存放于-80℃冰箱中保存备用的样品取出，加入液氮磨碎样品，用TRE-Trizol试剂(TaKaRa公司)提取叶片的总RNA，采用反转录试剂盒HiScriptIII1stStrandcDNASynthesisKit(+gDNAwiper)(Vazyme公司)进行反转录反应，制备cDNA模板。

2.设计特异检测引物

MsCML44基因的上游引物Y4377：5’-GGTGGTGATGAGATTGAGGAGG-3’；

MsCML44基因的下游引物Y4378：5’-CATCCCACATGCCAAGTCTCT-3’；

Actin基因的上游引物Y3213：5’-CCCACTGGATGTCTGTAGGTT-3’；

Actin基因的下游引物Y3214：5’-AGAATTAAGTAGCAGCGCAAA-3’；

将步骤一制备的模板cDNA稀释30倍，用于实时荧光定量PCR的模板，反应体系为10μL：ChamQUniversalSYBRqPCRMasterMix(2×)5μL，上游和下游引物(10μM)各0.2μL，cDNA模板4μL，无菌水0.6μL；使用仪器为TaKaRa公司生产的ThermalCyclerDiceTMRealTimeSystem，PCR反应条件设置为：95℃30s；94℃10s，60℃60s，40个循环；以不加cDNA模板作为阴性对照，每个样品设置3个重复，以持家基因Actin作为内参基因；反应结束后，进行溶解曲线分析，PCR扩增效率在95％以上，计算基因的相对表达量。

其中，图10是导入MsCML44基因的过表达转基因苜蓿的实时荧光定量PCR鉴定结果图；WT表示野生型；OE表示阳性株系；图11是导入MsCML44基因的干扰转基因紫花苜蓿的实时荧光定量PCR鉴定结果图，WT表示野生型；RNAi表示阳性株系。

实施例7转基因紫花苜蓿产量性状测定

转基因紫花苜蓿的产量性状测定：将扦插4周龄的转基因与野生型紫花苜蓿转移至20cm直径圆盆，一株一盆于室外自然条件下培养，定期进行浇水和施肥，对10周龄的植株进行以下测定。

1.株高的测定：从每个株系植株中随机挑选具备代表性的5株植株，测量其从地面到植株最高部位的绝对高度，记录并求其平均值。

2.茎分枝数和茎节数的测定：从每个株系植株中随机挑选具备代表性的5株植株，记录单株植株的茎一级分枝数作为茎分枝数；记录单株植株的主茎(最长枝条)的节数作为茎节数，记录并求其平均值。

3.开花时间的记录：从每个株系植株中随机挑选具备代表性的植株，记录每棵植株第一朵花盛开(花蕾不计)的日期，计算每个株系的开花所需时长并求平均值。

4.光合特性测定：选择晴朗无云、光照充足的天气，于2023年6月下旬选择紫花苜蓿植株顶端完全展开的健康新叶片进行试验，使用LI-6400XT便携式光合仪测定紫花苜蓿的净光合速率(Pn)，叶室光照强度设置为1200μmol·m-2·s-1。测定时间选在上午9:00～11:30左右，每个株系随机抽取3株进行测定，每个叶片重复读数3次，取平均值记录。

5.鲜草产量测定：从每个株系植株中随机挑选具备代表性的5株植株，于6月29日剪取地上部分，测量并记录单株鲜重，每个株系重复5次，计算平均值。

从图12可以看到，株高方面，相比于野生型植株，4个RNAi转基因株系的株高都有所降低，其中RNAi 47、RNAi 48、RNAi 79的矮化特性较为明显，而5个过表达株系的株高有所升高，其中OE 157和OE 192的增高特性较为明显，株高相对提高了5-9cm(图12B)；茎分枝数方面，总体上过表达株系多于RNAi株系，但除OE 192显著增加之外，其他株系的茎分枝数与野生型差异不显著(图12C)；茎节数方面，相比于野生型植株，OE 157、OE 158和OE 192的主茎节数明显增加，最高比野生型增加42％，而RNAi株系48、79号表现出主茎节数明显少于野生型植株，最低比野生型减少37％(图12D)；开花方面，相比于野生型，OE 116、OE 157、OE158和OE 192有提前开花的表型，提前3-7d开花，而RNAi株系所有株系均有推迟开花的表型，推迟6-10d开花(图12E)。净光合速率方面，相比于野生型，过表达株系的净光合速率Pn均显著提高，比野生型提高5-21％，而RNAi株系中除了RNAi 79，其他株系的净光合速率Pn均显著降低，比野生型降低11-32％(图12F)。鲜草产量方面，相比于野生型，过表达转基因株系鲜重均显著增加，比野生型增加31-57％，RNAi转基因株系鲜重均显著减少，比野生型减少46-68％(图12G)。以上结果表明，MsCML44正向调控紫花苜蓿产量和开花时间。

实施例8转基因紫花苜蓿对尖刀镰孢菌(Fusarium oxysporum)抗性的测定

将尖刀镰孢菌置于PDA培养基中，于在25℃条件下培养5d。采用菌丝琼脂塞接种法测定尖刀镰孢菌的致病性。将充满新鲜菌丝体的培养基切碎与无菌蛭石混合，放入到一次性透明塑料杯(直径9cm)中并在底部穿孔，每杯加入一皿菌丝培养基。后将紫花苜蓿扦插苗用无菌水清洗后移栽到含有菌丝的塑料杯中，未加菌丝的作为对照为接种组，于25℃，16h/8h的培养箱中培养30d。为了排除扦插苗本身生长情况差异造成的影响，设置单独的接种组和未接种组，每盆扦插3颗苗，每个处理组有至少6个重复。处理30d后记录各株苗的鲜重与根长，计算相对鲜重(RFW＝接种组鲜重/对照组鲜重)和相对根长(RRL＝接种组根长/对照组根长)。

从图13可以看到，尖刀镰孢菌侵染处理后，与野生型相比，过表达转基因紫花苜蓿相对鲜重和相对根长显著增加，其中OE 116在病原菌侵染后相对鲜重和相对根长都比野生型增加30％，是最强抗病株系；反之，RNAi植株在病原菌侵染后相对鲜重和相对根长显著减少，其中RNAi 79相对鲜重和相对根长分别比野生型降低30％和60％，是最易感病株系。结果初步表明，MsCML44正向调控紫花苜蓿对尖刀镰孢菌的抗性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

SEQ ID NO.1

ATGTGTCCCCTAACCCGCAATGAATTGGAGCTGATATTTAAGAAACTAGACATAAATAGTGATGGAATTTTATCCCTTGAGGAGCTGAATCAATTGTTAGTGAGAACAGGTTTCAAGTATAGCATAGAGGAGCTTGAATATCTAGTGGGAAAGAAGAGTCTAACCTTGAGTGAGTTCTTATGCTTTTATGACTCCATATTGAATCACAAAAATGGTGATGGTGGTGATGAGATTGAGGAGGTAGAATTAGAAAGTGACCTTTTGAAGGCTTTCAAGGTGTTTGATTTAGATGGAGATGGATTCATCACTAGTCAAGAGCTGGAATGTGTGTTGAAGAGACTTGGCATGTGGGATGAAGAAAAGGATTGTAGATCAATGATTTACTCATATGATATTAATTTAGATGGCAAGCTTGATTTCAAGGAATTTAAGAATATGATGTTGCTTACACTACAACGTGTTTAG

SEQ ID NO.2

MCPLTRNELELIFKKLDINSDGILSLEELNQLLVRTGFKYSIEELEYLVGKKSLTLSEFLCFYDSILNHKNGDGGDEIEEVELESDLLKAFKVFDLDGDGFITSQELECVLKRLGMWDEEKDCRSMIYSYDINLDGKLDFKEFKNMMLLTLQRV

SEQ ID NO.3

GATTTAATCCGTATGCATTGTCAGTATAGAATTTTTTTATAGATACATCCAATCATATCTCATTTATATCATTTTTTTTATAACAGCTCCTAAAACTTCTCAATTATCTACGTTATGAGATGTTTGTGTAAATTTTTTACTCTGACTGTGCATACAAGTTAAACTTCTATTAAAAAGCATGAAATCATGGTATCACCACAAATTTCTTTTTAGGTGTAATACATTCTTTTATGTTGGCAGAGACACCATGCAACAGTCACCGTCGTACATGCATTTACAGAGAACCCTGAACAGATCACCTCAGAAGCTGATATTGTAGTTTCAGCTGCCGGAGTTCCAAATTTGGTCTGTGGGAACTGGATAAAGTCCGGTGCAACTGTGATCGATGTTGGAACAATTCCTGTTGAGGTGAGCTTGTGATTTGCAACTTCATATGTTCTTTCACATTTTGCTTGCTGAATCAGTTAACCAAACTTCTACGGATAAAATGCAACAGGATCCTAGCTGCGAGGATGGTTATCGTCTAGTAGGCGATGTGTGCTTTGAAGAAGTCATAAAGGTGGCATCTGTTATTACTCCTGTACCTGGTGGGGTTGGACCTATGACAGTTACTATGCTTCTAGTTAATACATTAGATTCTGCTAAACGTTTGCTTAATTTTACCTGAGCTCTTCCAGTTTTGTTATTATAGAACTTTTTGTTGAAGGGTTAGAGCACATGTTAGGGTTTTCATAAAGAGCAAATATTTATTGAGAAACATTAAATTTTAATCTTTTGGCACAATTTTCAACGCATAATTTCTATCTTTAGTACCTTATCATTTGCTCTAATGACAAAAGTTAGCATTTCTTTTTGTTGAATTTGGCTCTTTAGAAGCTAATGTTTTCAACGCATAATTTCTATCTTTAGTACCTTATCATTTGCTCTAATGACACGAGTTAGCATTTCTTTTTGTTGAGCATTTCTTTTTGTTGAATTTGGCTCTTTAGAAGCTAATGAAGTGTAAACTAAAGTGCTTGTTTTTTTGGTGGTGGCCGGGGTTTGAACCCCGGACCTTGCATATATTATACGTTGACCCTACCAACTGAGCTAAACTCACACAAACTTAAGTGCTGGTAAAAGAAAAGTGTAAATTAAAGTGAAAAATTCAATCATTGTATTTTTAACAAACTTGTGATGTATTCTGATGTATATGTAATATCAACTCTTGAATTTTGTGAATATTCATTTTACGCTTCTAAACGTGATTGGTTATTTAGAGGAGTTGAATCCTATTTTGTTCGAGGTAATTTTAGATGTGGTGGGTTGACCAACTTAGAAACACTCAAGTTTTTTTTTTTTTTTTGAGGAAAACACTCAAGTTTTATATGAACTCATAATATTGTACTTTTTTTTTTCCGTTAATCATCCCATTCTTGGGGAAAAAGGATCTTATCTAGCCAAAAAATTGTTCTATCTATCAATCTGAACTTATGTTCTCATGAACAATTCGTCTTTAGTGGAGTTTATAAACCATTTGAACTCGATTATATTCATTAACCGGAAAAATACAAAACAGCAAAAACAATGATTTGATTGAATAAAAATATCAACCACACTAGAAAAGTCTAGTCTCTGTTGTTTCCATCAAAAAAAGAAAATCAAATACACTAGAAAGTTCCAGACTTTTAGAATGTATAGCATCCAAACAAAATGTGACAAGTGTTTTGTGAAAAATCTCATCAAAATAATTAAGTGGTCCTACATATCTTATGTGCAATTAATTCACACCTTACACGTATGAGTATTTATACAGGTGCATCTGTGGAGAATCTTGCCAAT。

Claims

1.一种紫花苜蓿类钙调蛋白CML44基因，该钙调蛋白CML44基因的核苷酸序列为如下(1)或(2)：

(1)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

2.如权利要求1所述紫花苜蓿类钙调蛋白CML44基因编码的蛋白，该蛋白的氨基酸序列为如下(a)或(b)：

(a)如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；

3.含有权利要求1所述紫花苜蓿类钙调蛋白CML44基因的生物材料或用于沉默或干扰上述紫花苜蓿类钙调蛋白CML44基因的生物材料，其特征在于，该生物材料为重组载体、表达盒、细胞系和宿主菌中的至少一种。

4.权利要求1中所述的紫花苜蓿类钙调蛋白CML44基因，权利要求2中所述的蛋白，或者权利要求3中所述的生物材料在提高植物产量和抗病性或培育产量和抗病性提高的转基因植物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，在目标植物中过表达权利要求1所述的紫花苜蓿类钙调蛋白CML44基因以提高植物的产量和抗病性。

6.一种提高植物产量和抗病性的方法，其特征在于，在目标植物中过表达权利要求1所述的紫花苜蓿类钙调蛋白CML44基因以提高植物的产量和抗病性。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在目标植物中过表达权利要求1所述的紫花苜蓿类钙调蛋白CML44基因的过程为：构建如权利要求1中所述紫花苜蓿类钙调蛋白CML44基因的过表达载体，通过农杆菌介导法将所述的过表达载体转入到目标植物中得到产量和抗病性提高的转基因植株。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述的植物为单子叶植物或双子叶植物。

9.一种紫花苜蓿类钙调蛋白CML44启动子，该启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

10.权利要求9所述的紫花苜蓿类钙调蛋白CML44启动子在如下(1)或(2)中的应用：

(1)驱动GUS表达；