CN107630020B - 棉花GhTCP4基因及其在改良棉纤维长度中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了GhTCP4基因及其在改良棉纤维长度中的应用。具体地，本发明对棉花GhTCP4基因进行分离克隆和功能鉴定，通过分子生物学及转基因技术调控棉花GhTCP4基因的表达量，实现了对植物生长发育的调节，获得了纤维显著增长的转基因棉花。本发明公开了棉花GhTCP4转录因子样蛋白的功能与用途，尤其在促进纤维细胞伸长，改良棉纤维长度品质性状方面具有积极作用，具有广泛的应用前景。

Description

棉花GhTCP4基因及其在改良棉纤维长度中的应用

技术领域

本发明涉及植物学领域，更具体地涉及棉花GhTCP4基因及其在改良棉纤维长度中的应用。

背景技术

棉花是重要的经济作物，为市场提供大量天然纺织原料。我国是世界上最大的产棉国和消费国，但高档棉纱的优质原棉，大多依赖进口，适纺60～120支纱的中长绒优质原棉缺乏。因此，提高棉纤维品质是棉花育种所面临的一个重要课题。棉纤维是棉花胚珠被表皮层的单细胞发育而成，其分化和发育过程可分为纤维原始细胞分化与突起、纤维细胞的迅速伸长、次生壁的合成和脱水成熟等4个时期。纤维细胞各个时期的生命活动影响棉纤维的产量和品质形成,其中纤维伸长和次生壁合成两个时期对纤维的发育与品质形成关系最为密切。棉纤维发育和结构的特点是由一系列在特定的时间和空间表达的基因决定的，而基因表达的时空特异性主要是由转录调控因子与下游基因的启动子之间的相互作用实现的，因此，转录因子在控制棉纤维起始及发育中的重要作用。

TCP蛋白是植物特有的一类转录调控因子，基因家族含有多个成员，主要功能是控制叶片和花的形态建成，这种作用往往是通过调节细胞的分裂和分化状态来实现的。棉纤维是一类极度伸长生长的单细胞结构，目前还没有关于棉花GhTCP蛋白调控棉纤维细胞发育的功能研究报道，本领域需要深入研究GhTCP的生物学功能。

发明内容

本发明的目的在于提供棉花GhTCP4基因及其在改良棉纤维长度中的应用。

在本发明的第一方面，提供了一种GhTCP4基因或其编码蛋白的用途，所述的GhTCP4基因或其编码蛋白用于选自下组的一种或多种用途：

(a)用于制备促进植物细胞伸长的试剂或组合物；

(b)用于促进植物细胞伸长；

(c)用于制备促进棉纤维伸长的试剂或组合物；和

(d)用于促进棉纤维伸长。

在另一优选例中，所述的植物细胞为纤维细胞。

在另一优选例中，所述的植物选自下组：锦葵科植物、茄科、和十字花科植物。

在另一优选例中，所述的植物选自下组：棉花、烟草、和拟南芥。

在另一优选例中，所述的植物细胞为棉纤维细胞。

在另一优选例中，所述的GhTCP4基因包括野生型GhTCP4基因和突变型GhTCP4基因。

在另一优选例中，所述的突变型包括突变后编码蛋白的功能未发生改变的突变形式(即功能与野生型编码蛋白相同或基本相同)。

在另一优选例中，所述的突变型GhTCP4基因编码的多肽与野生型GhTCP4基因所编码的多肽相同或基本相同。

在另一优选例中，所述的突变型GhTCP4基因包括与野生型GhTCP4基因相比，同源性≥80％(较佳地≥90％，更佳地≥95％)的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的突变型GhTCP4基因包括在野生型GhTCP4基因的5＇端和/或3＇端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的GhTCP4基因包括A亚组GhTCP4基因和D亚组GhTCP4基因。

在另一优选例中，所述的基因包括基因组DNA、cDNA、和/或mRNA。

在另一优选例中，所述的GhTCP4基因的CDS序列如SEQ ID NO.:1所示。

在另一优选例中，所述的GhTCP4基因的(预测)编码蛋白如SEQ ID NO.:2所示。

在另一优选例中，所述的GhTCP4基因的基因组序列如SEQ ID NO.:3所示。

在另一优选例中，所述的GhTCP4基因来源于植物，较佳地来源于锦葵科植物，更佳地来源于棉花，最佳地来源于陆地棉。

在另一优选例中，所述GhTCP4基因为来源于陆地棉A亚组或D亚组的基因。

在本发明的第二方面，提供了一种调控植物细胞长度的方法，包括步骤：

(a)将外源的构建物导入植物细胞，其中所述的构建物含有外源的GhTCP4基因序列、促进GhTCP4基因表达的外源核苷酸序列、或抑制GhTCP4基因表达的外源核苷酸序列，从而获得导入外源构建物的植物细胞；

(b)将上一步骤获得的所述导入外源构建物的植物细胞，再生成植株：和

(c)任选地对所述再生的植株进行鉴定，从而获得植物细胞长度改变的植物。

在另一优选例中，所述的植物细胞长度改变的植物是指与亲本植物相比，植物细胞长度改变。

在另一优选例中，所述外源的GhTCP4基因序列还包含与ORF序列操作性连接的启动子和/或终止子。

在另一优选例中，所述的启动子选自下组：组成型启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子、和强启动子。

在另一优选例中，所述的组成性启动子包括35S启动子。

在另一优选例中，所述的外源核苷酸序列包括干扰所述GhTCP4基因表达的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的外源核苷酸序列包括RNA干扰序列。

在本发明的第三方面，提供了一种促进棉纤维伸长的方法，所述方法包括以下步骤：在所述植物中，抑制GhTCP4基因的表达或抑制GhTCP4蛋白的活性。

在另一优选例中，所述的促进棉纤维伸长包括促进棉纤维细胞伸长。

在另一优选例中，所述方法包括给予植物GhTCP4基因或其编码的多肽的抑制剂。

在另一优选例中，所述方法包括向植物中导入抑制GhTCP4基因表达的外源核苷酸序列。

在另一优选例中，所述外源核苷酸序列包括RNAi干扰序列。

在另一优选例中，所述方法包括步骤：

(a)提供携带GhTCP4基因RNAi干扰序列的表达载体的农杆菌；

(b)将植物细胞或组织或器官与步骤(a)中的农杆菌接触，从而使GhTCP4基因RNAi干扰序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

(c)选择已转入GhTCP4基因RNAi干扰序列的植物细胞或组织或器官；和

(d)将步骤(c)中的植物细胞或组织或器官再生为植株。

在另一优选例中，所述的RNAi干扰序列如SEQ ID NO.:4所示。

在本发明的第四方面，提供了一种GhTCP4基因或其编码蛋白的调控剂的用途，用于选自下组的一种或多种用途：

(a)用于制备调控植物细胞长度的试剂或组合物；

(b)用于调控植物细胞长度；

(c)用于制备调控棉纤维长度的试剂或组合物；和

(d)用于调控棉纤维长度。

在另一优选例中，所述的组合物包括农用组合物。

在另一优选例中，所述的调控剂包括促进剂、抑制剂。

在另一优选例中，所述的调控剂为抑制剂，并且所述的调控是指促进植物细胞和/或棉纤维伸长。

在另一优选例中，所述的调控剂为促进剂，并且所述的调控是指抑制植物细胞和/或棉纤维伸长。

在另一优选例中，所述的调控剂包括小分子化合物、或核酸类物质。

在另一优选例中，所述的核酸类物质选自下组：miRNA、shRNA、siRNA、或其组合。

在本发明的第五方面，提供了一种转基因植株，所述转基因植株中导入GhTCP4基因。

在另一优选例中，所述转基因植株为转基因棉花植株。

在另一优选例中，所述的转基因植株用于促进棉花纤维细胞生长，提高棉纤维长度，和/或改善棉纤维品质。

在本发明的第六方面，提供了一种棉纤维长度相关多肽，所述多肽具有调控棉纤维长度的功能，并且，所述的多肽选自下组：

(i)SEQ ID NO.:2所示氨基酸序列的多肽；

(ii)将(i)所示的多肽经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有调控棉纤维长度功能的多肽；

(iii)氨基酸序列与(i)所示的任一多肽的同源性≥95％(较佳地≥98％，更佳地≥99％)，具有调控棉纤维长度功能的多肽。

在本发明的第七方面，提供了一种编码本发明第六方面所述棉纤维长度相关多肽的基因。

在本发明的第八方面，提供了一种载体，所述载体含有本发明第七方面所述的基因。

在本发明的第九方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第八方面所述的载体或基因组中整合有本发明第七方面所述的基因。

在另一优选例中，所述的宿主细胞选自下组：植物细胞、原核细胞。

在另一优选例中，所述的宿主细胞包括锦葵科植物细胞。

在另一优选例中，所述的宿主细胞包括棉属植物细胞。

在本发明的第十方面，提供了一种制备本发明第六方面所述多肽的方法，所述方法包含：

(a)在适合表达的条件下，培养本发明第九方面所述的宿主细胞；和

(b)从培养物中分离出本发明第六方面所述的多肽。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示陆地棉GhTCP4的序列分析。

图1中A显示了陆地棉两亚组GhTCP4A、GhTCP4D和拟南芥TCP4的蛋白序列同源比对。其中，红色下划线所示为TCP蛋白保守的TCP结构域。

图1中B显示了利用MEGA软件构建的GhTCP4与拟南芥TCP蛋白家族的系统发育树，建树方法采用最大似然(maximum likelihood)法。

图1中C显示了棉属代表种TCP4蛋白同源性比对结果。蛋白序列同源性由BioEdit软件生成。

图2显示GhTCP4表达特征分析。

图2中A显示了GhTCP4在发育中的纤维细胞中的表达量检测结果。

图2中B显示了采用焦磷酸基因分型技术测定纤维细胞不同发育阶段GhTCP4A和GhTCP4D的相对表达量。其中，黑色代表GhTCP4A的相对表达量，绿色(灰色)代表GhTCP4D的相对表达量。开花后天数以DPA(days post anthesis)表示；0DPA为胚珠，其余为纤维细胞。

图2中C显示了海岛棉不同纤维发育时期GbTCP4的表达特征。

图2中D显示了亚洲棉不同纤维发育时期GaTCP4的表达特征。

图3显示GhTCP4调控叶发育的功能分析。

图3中A显示了在棉花中过表达抗miR319剪切的GhTCP4导致叶表型变化。

图3中B在棉花中抑制GhTCP4表达导致叶表型变化。

图3中C显示了GhTCP4-GFP在烟草表皮细胞中的亚细胞定位。其中，细胞核通过DAPI染色显示。

图4显示35S::dsGhTCP4转基因棉花(ds表示双链RNA干扰，是double-strandedRNA interference的缩写)纤维表型分析。其中，误差线所示为标准偏差(STDEV)；“***”表示实验组与对照组进行双样本等方差假设student’s t检验分析，P<0.001，n＝30。

图4中A显示了qRT-PCR检测纤维中GhTCP4的表达量。

图4中B显示35S::dsGhTCP4转基因棉纤维变长表型。

图4中C显示了35S::dsGhTCP4转基因棉纤维长度统计。

图5显示了RDL1::mGhTCP4转基因棉花(OE表示过表达，是Over-expression的缩写)纤维表型分析。其中，误差线所示为标准偏差(STDEV)；“***”表示实验组与对照组进行双样本等方差假设student’s t检验分析，P<0.001，n＝30。

图5中A显示了开花后6天和9天纤维细胞中GhTCP4表达量的检测。

图5中B显示了RDL1::mGhTCP4转基因棉纤维变短表型，Bar＝1cm。

图5中C显示了RDL1::mGhTCP4转基因棉花不同株系纤维长度统计。

图6显示GhTCP4与GhHOX3相互作用。

图6中A显示GhTCP4能够与GhHOX3全长以及同时包含Leu-zipper结构域和STARTdomain结构域的部分结合。

图6中B显示基于firefly luciferase的半分子荧光互补实验证明GhTCP4与GhHOX3相互作用；与对照相比，实验组中可以观测到强荧光信号，表明GhTCP4与GhHOX3存在相互作用。

图6中C显示免疫共沉淀实验证明GhTCP4与GhHOX3相互作用。

图7显示GhTCP4与GhHOX3相互作用抑制GhHOX3对下游基因的激活。

图7中A显示GhTCP4抑制GhHOX3对GhRDL1启动子的激活作用。

图7中B显示GhTCP4抑制GhHOX3对GhEXPA1启动子的激活作用。

图7中C显示GhTCP4抑制GhHOX3-GhHD1异源二聚体对GhRDL1启动子的激活作用。

图7中D显示GhTCP4抑制GhHOX3-GhHD1异源二聚体对GhEXPA1启动子的激活作用。

图8显示了定点突变GhTCP4的原理示意图。其中，P1(S)和P2(AS)为待突变片段全长序列。P3(AS)为突变位点上游反向引物。P4引物5’端15-20bp与引物P3互补，3’端20bp左右与突变位点下游序列互补，中部浅色所示为突变后序列。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现一种能够调控棉纤维/植物细胞长度的GhTCP4基因。实验表明，在棉花体内过表达GhTCP4抑制纤维细胞伸长生长，而抑制GhTCP4的表达促进纤维细胞伸长生长，说明GhTCP4在棉纤维伸长过程中发挥关键的负调控作用。本发明公开了棉花GhTCP4转录因 子样蛋白的功能与用途，尤其在促进纤维细胞伸长，改良棉纤维长度品质性状方面具有积极作用，具有广泛的应用前景。

术语

如本文所用，术语“特异性表达”是指目的基因在植物中特定的时间和/或特定的组织的表达。

如本文所用，“外源的”或“异源的”是指不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系。例如，如果启动子与目的基因序列的组合通常不是天然存在的，则启动子对于该目的基因来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源的”。

GhTCP4基因

如本文所用，术语“GhTCP4基因”、“棉纤维长度相关基因”、“本发明基因”可以互换使用，都是指本发明的具有调控棉纤维长度的基因。

TCP蛋白是植物特有的一类转录调控因子，基因家族含有多个成员，主要功能是控制叶片和花的形态建成，这种作用往往是通过调节细胞的分裂和分化状态来实现的。

在对棉纤维发育的研究过程中，发明人克隆了一个在纤维细胞伸长期特异高表达的编码TCP类蛋白的基因GhTCP4。为了深入研究GhTCP4的生物学功能，发明人进行了棉花转基因功能分析，构建了GhTCP4过表达和RNA干扰(RNAi)的载体进行了棉花转化，并成功获取各个载体的多个转基因株系。对种植于温室和大田转基因植物进行分析，发现在棉花体内过表达GhTCP4抑制纤维细胞伸长生长，而抑制GhTCP4的表达促进纤维细胞伸长生长，说明GhTCP4在棉纤维伸长过程中发挥关键的负调控作用。基因表达检测显示GhTCP4同样调控GhHOX3调控的下游基因GhRDL1和GhEXPA1的表达。蛋白相互作用实验证明GhTCP4与GhHOX3存在直接的蛋白相互作用。进一步的实验证明GhTCP4与GhHOX3的蛋白相互作用削弱了GhHOX3自身以及GhHOX3与GhHD1形成的异源二聚体对下游基因GhRDL1和GhEXPA1启动子的激活作用。这些结果说明转录因子GhTCP4是棉纤维细胞发育的重要调控因子，在促进棉纤维伸长和纤维品质改良等方面具有巨大潜力和应用价值。

针对棉花GhTCP4基因，发明人进行了如下研究：

1.通过Genome walking和RACE技术从陆地棉栽培品系R15中获得了A和D两个亚组完整的GhTCP4基因。

2.构建了GhTCP4正义和双链RNA干扰转基因载体：RDL1::mGhTCP4、35S::dsGhTCP4。

3.通过植物转基因技术进行植物转化，获得了转基因棉花。

4.获得的35S::dsGhTCP4转基因棉花具有纤维长度显著增加的性状；RDL1::GhTCP4的转基因棉花具有纤维长度显著变短的性状；这些性状可以稳定遗传。

5.通过基因表达和蛋白互作实验，阐明了GhTCP4调控棉纤维细胞发育的机理。

本发明首次公开了GhTCP4基因信息和用途，非常意外的发现调节其表达量可以调节棉纤维细胞的生长，尤其抑制GhTCP4表达促进纤维细胞生长，增加棉纤维长度的作用，对于棉花纤维品质改良具有重要应用价值。

本发明的GhTCP4基因可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。基因组DNA可以是与SEQ ID NO.:3所示的序列相同或者是简并的变异体。本发明的DNA可以是单链的或是双链的，DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO.:1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。

如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO.:2的蛋白质，但与SEQ ID NO.:1所示的编码区序列或SEQ ID NO.:3所示的基因组序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO.:2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指:(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上,更好是95％以上时才发生杂 交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO.:2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码棉纤维/植物细胞长度相关多肽的多聚核苷酸。

GhTCP4基因编码的多肽

如本文所用，术语“GhTCP4多肽”、“GhTCP4蛋白”、“棉纤维长度相关多肽”、“本发明多肽”、“GhTCP4基因编码的多肽”可以互换使用，都是指本发明的具有调控棉纤维/植物细胞长度的多肽。

在一优选例中，本发明多肽来源于棉花。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括GhTCP4多肽的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然GhTCP4多肽相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(ii i)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在优选例中，本发明多肽指具有调控棉纤维/植物细胞长度功能的SEQ ID NO.:2序列的多肽。还包括具有与GhTCP4多肽相同功能的、SEQ ID NO.:2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括GhTCP4多肽 的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与GhTCP4多肽的DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗GhTCP4多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含GhTCP4多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了GhTCP4多肽的可溶性片段。通常，该片段具有GhTCP4多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

本发明还提供GhTCP4多肽或其类似物。这些类似物与天然GhTCP4多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“GhTCP4多肽保守性变异多肽”指与SEQ ID NO.:2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。在所述蛋白中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能，在C末端和/或\末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。这些保守性变异多肽最好根据下表进行氨基酸替换而产生。

棉花

棉花是锦葵目(Malvales)锦葵科(Malvaceae)棉属(Gossypium)植物的种子纤维，原产于亚热带。植株灌木状，在热带地区栽培可长到6米高，一般为1到2米。花朵乳白色，开花后不久转成深红色然后凋谢，留下绿色小型的蒴果，称为棉铃。棉铃内有棉籽，棉籽上的茸毛从棉籽表皮长出，塞满棉铃内部。棉铃成熟时裂开，露出柔软的棉纤维。常见棉纤维白色至白中带黄，长约2至4厘米，含纤维素约87～90％。

陆地棉(Gossypium hirsutum L.)因最早在美洲大陆种植而得名，是世界上最重要的棉花栽培品种，占全球棉花种植面积的90％以上。陆地棉为异源四倍体，包括两个亚基因组，A亚组和D亚组。

重组技术和植物改良

本发明基因的全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。 通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或本发明多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的本发明多肽。一般来说有以下步骤：

(1)用本发明的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明多核苷酸和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞(如农作物和林业植物的细胞)。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得棉纤维长度性状变化的植物。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超滤处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

重组的本发明多肽有多方面的用途。例如用于筛选具有调控棉纤维/植物细胞长度的化合物、多肽或其它配体。用表达的重组本发明多肽的筛选多肽库可用于寻找有价值的能抑制、或促进棉纤维/植物细胞伸长的多肽分子。

另一方面，本发明还包括对本发明多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段、或嵌合抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的本发明多肽的基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。本发明的各类抗体可以利用棉纤维长度相关基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与棉纤维长度相关基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。抗本发明多 肽的抗体可用于检测样品中的棉纤维长度相关多肽。

本发明还涉及定量和定位检测棉纤维长度相关多肽水平的测试方法。这些试验是本领域所熟知的。试验中所检测的棉纤维长度相关多肽水平，可用于解释棉纤维长度相关多肽调控棉纤维长度的功能。

一种检测样品中是否存在棉纤维长度相关多肽的方法是利用本发明多肽的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与本发明多肽特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在棉纤维长度相关多肽。

本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析。用本发明多肽特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测本发明多肽的转录产物。

本发明的主要优点包括：

(a)提供了一种能够调控棉纤维/植物细胞长度的GhTCP4基因；

(b)可以通过上调或下调GhTCP4表达量来抑制或促进棉纤维伸长；

(c)GhTCP4表达量下调程度与其纤维增长的幅度成比例。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1

GhTCP4全长基因克隆

1.棉花RNA提取

棉花RNA提取采用冷酚法。采集陆地棉R15(陆地棉品种“晋棉R15”，购自山西省农科院棉花研究所)开花后6天的胚珠表面的纤维，在液氮中磨成粉末，转移到50mL离心管中，加入8mL提取缓冲液(1M Tris-HCl，50mM EDTA，1％SDS，pH9.0)和等体积的水饱和酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，震荡混匀，冰上放置1h，每隔10min混匀一次。4℃，13000g离心20min。重复酚：氯仿：异戊醇抽提2～4次，最后用氯仿：异戊醇(24：1)抽提一次。取上清夜，加入1/2体积的高盐溶液(0.8M柠檬酸钠，1.2M NaCl)和1/2体积异丙醇，混匀，-70℃放置1h。4℃，13000g离心20min，去上清液，沉淀溶于1mL DEPC处理水，4℃，13000g离心10min。上清液转入1.5mL Eppendorf管，加入 1/3体积的8M LiCl和体积的NaAC，-20℃放置过夜。4℃，13000g离心20min。去上清液，用1mL 70％乙醇清洗沉淀2次，室温吹20min，溶于100～200μLDEPC处理水。

2.根据GhTCP4cDNA的序列，合成专一引物(含酶切位点和保护碱基)：GhTCP4-BamHI-F 5’-CGGGATCCATGGGAGAAAATCATCACCAAG-3’SEQ ID NO.:5GhTCP4-KpnI-R 5’-GGGGTACCTCAATGGTGAAAATCAAAGGA-3’SEQ ID NO.:6

以开花后6天的纤维总RNA的反转录产物为模板做PCR反应，反应条件：94℃预变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物电泳纯化、回收后亚克隆到商业化载体pMD18-T上后经测序确认序列正确。

结合Genome walking和RACE技术，从异源四倍体陆地棉(Gossypium hirsutum)栽培品系R15中获得了A和D两个亚组完整的GhTCP4基因，分别命名为GhTCP4A和GhTCP4D。采用类似的方法，也从其它棉花品种中扩增获得TCP4基因序列。

结果显示，GhTCP4编码一个含有401个氨基酸的TCP蛋白，其TCP结构域与拟南芥TCP4保守结构域高度相似(图1中A,B)。GhTCP4A和GhTCP4D在蛋白水平相似度高达97％，并且不同棉种TCP4蛋白同源性也介于96.5％-100％(图1中C)，由此推测陆地棉两个亚组的TCP4蛋白功能基本一致。焦磷酸测序分析显示GhTCP4A和GhTCP4D在棉纤维发育过程中同时表达(图2中B)。

实施例2

35S::dsGhTCP4和RDL1::mGhTCP4表达载体的构建和农杆菌转化

1.35S::dsGhTCP4植物表达载体构建

高保真酶扩增选定的GhTCP4RNA干扰(RNAi)片段，正向片段引入SmaI和XbaI酶切位点，反向片段引入SacI和NotI酶切位点，正向及反向序列分别克隆至含RTM内含子的PBSK载体上RTM序列两端，用SmaI和SacI酶切后替换35S::NOS/p121上的GUS基因，形成35S::dsGhTCP4植物表达载体，并经测序验证序列正确无误。

GhTCP4RNA干扰序列如SEQ ID NO.:4所示。

RNA干扰的引物序列：

dsGhTCP4-sense-F 5’-GCGAGCTCCAGCACGAAATGGGAG SEQ ID NO.:7ATAA-3’

dsGhTCP4-sense-R 5’-ATAAGAATGCGGCCGCGGGGTGGT SEQ ID NO.:8TCCAGAGAATAG-3’

dsGhTCP4-antisense-F 5’-TCCCCCGGGCAGCACGAAATGGGA SEQ ID NO.:9 GATAA-3’

dsGhTCP4-antisense-R 5’-GCTCTAGAGGGGTGGTTCCAGAGA SEQ ID NO.:10ATAG-3’

2.RDL1::mGhTCP4表达载体的构建

(1)GhRDL1基因编码区上游约700bp的启动子片段，以及NOS终止子分别克隆至PCAMBIA-2301载体HindIII、PstI和SacI、EcoRI位点，形成RDL1::2301中间载体。

(2)对GhTCP4进行两轮PCR定点突变，原理和步骤如下：

第一轮PCR以高保真酶扩增突变位点两侧片段，引物为P1-P3，P4-P2。分别割胶回收该二种PCR产物，各取0.1μL混合作为第二轮PCR模版，引物为P1-P2。

按照图8所示方法突变GhTCP4被mi319靶向的位点。突变片段mGhTCP4经测序确认后，以高保真PCR扩增并引入合适酶切位点，克隆至表达载体RDL1::NOS/2301中，形成RDL1::mGhTCP4植物表达载体，并经测序验证序列正确无误(见实施例1)。

定点突变引物序列：

mGhTCP4-P1 5’-CGGGATCCATGGGAGAAAATCATCACCAAG-3’SEQ ID NO.:11

mGhTCP4-P2 5’-GGGGTACCTCAATGGTGAAAATCAAAGGA-3’SEQ ID NO.:12

mGhTCP4-P3 5’-GCTTTGCAATGGGCCTCGCTGAGAAAAAAACTGGCT-3’SEQ ID NO.:13

mGhTCP4-P4 5’-CGAGGCCCATTGCAAAGCAGTAACACACCCTTGGTT-3’SEQ ID NO.:14

3.根癌农杆菌转化

根癌农杆菌的转化采用冻融法。一个单菌落LBA4404或GV3101(Invitrogen)，3mLLB培养基(25μg/mL利福霉素Rif和50μg/mL卡那霉素Kan或庆大霉素Gen)，28℃，220rpm，过夜培养。2mL菌液，50mL LB培养基(25μg/mL Rif和50μg/mL Gen)，28℃，220rpm，培养到OD₆₀₀＝0.5(约6h)。在冰上放置30min，4℃，5000g离心5min。重悬于10mL 0.15M NaCl。4℃，5000g离心5min。重悬于1mL 20mM CaCl₂，50μL/管分装，液氮速冻，-70℃保存感受态细胞。混合含目的基因双元载体和50μL/管感受态细胞，在冰上放置30分钟，液氮速冻1min。在37℃水浴中5min使菌液融化，加1mL LB培养基，28℃，220rpm，培养2～4h。取50～100μL涂LB培养基平板(25μg/mL Rif、50μg/mL Gen和50μg/mL卡那霉素Kan或潮霉素Hyg)，2d后挑单菌落进行PCR鉴定。

实施例3

植物转化以及转基因后代的筛选

含RDL1::mGhTCP4和35S::dsGhTCP4载体质粒的农杆菌分别于添加卡那霉素50mg/L、利福平100mg/L、链霉素300mg/L的YEB细菌培养基上培养2～3d后，挑单菌落接种于含相同抗生素的YEB液体培养基中，于28℃、200rpm/min的摇床上悬浮培养过夜。菌液于4000rpm/min离心10min，沉淀用含葡萄糖30g/L和乙酰丁香酮100μmol/L的1/2MS液体培养基重新悬浮，调OD₆₀₀值为0.4～0.6左右，作为感染液备用。

棉花R15种子(晋棉R15品种)经常规消毒后置于1/2MS0(1/2MS盐+5g/L葡萄糖+7g/L琼脂粉,pH 6.0)培养基，在黑暗中萌发培养，5～7天后将无菌苗下胚轴切成1.0cm左右的切段作为转化外植体备用。

外植体在农杆菌菌液中浸泡感染15～20min，转移到共培养培养基MSB1(MS盐+B5有机+30g/L葡萄糖+0.1mg/L KT+0.1mg/L 2,4-D+2.2g/L Gelrite,pH 6.0)上，22℃暗培养2d后，将外植体转移到培养基MSB2(MSB1+500mg/L头孢霉素+80mg/L卡那霉素)上进行愈伤组织的诱导。外植体经过抗性愈伤组织的诱导、愈伤组织的增殖及胚性愈伤的诱导(培养基MSB3：MS盐+B5有机+30g/L葡萄糖+2.5g/L Gelrite,pH 6.0)、体细胞胚胎发生(培养基MSB4：MS盐+B5有机+30g/L葡萄糖+1.0g/L天门冬酰氨胺+2.0g/L谷氨酰胺+3.0g/LGelrite,pH 6.0；MS盐中KNO₃加倍，去除NH₄NO₃)，再生抗性试管苗。待试管苗长到3-4片真叶时，移栽到花盆中，放入人工气候室生长。

结果如图3所示，在棉花中过表达抗miR319剪切的GhTCP4导致叶表型变化(图3中A-B)，亚细胞定位发现GhTCP4-GFP蛋白定位于烟草叶表皮细胞的细胞核中(图3中C)，提示GhTCP4在纤维细胞中发挥转录调控功能。

实施例4

转基因植物的分子生物学鉴定

1.PCR

DNA提取采用冷酚法。2g材料，在液氮中磨成粉末，转移到50mL离心管中，加入8mL提取缓冲液(1M Tris-HCl，50mM EDTA，1％SDS，pH9.0)和等体积的水饱和酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，震荡混匀，冰上放置1h，每隔10min混匀一次。4℃，13000g离心20min。重复酚：氯仿：异戊醇抽提2～4次，最后用氯仿：异戊醇(24：1)抽提一次。取上清夜，加入1/2体积的高盐溶液(0.8M柠檬酸钠，1.2M NaCl)和1/2体积异丙醇，混匀，-70℃放置1h。4℃，13000g离心20min，去上清液，用1mL 70％乙醇清洗沉淀2次，室温吹20min，沉淀溶于1mL无菌水。4℃，13000g离心10min。取上清液，加5～10μL RNase(10mg/mL)，37℃消化30min。

a.转基因阳性棉花的PCR鉴定采用NPT II特异的引物：

NPTI I-F：5’-GGAGCAAGGTGAGATGACAGGAGATC-3’SEQ ID NO.:15

NPTI I-R：5’-GATTGTCTGTTGTGCCCAGTCATAGC-3’SEQ ID NO.:16

其反应条件为：94℃预变性5min；然后94℃预变性30sec，56℃复性30sec，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min。扩增片段大小约为680bp。

b.35S::dsGhTCP4转基因棉花的鉴定采用转基因载体特异引物：

35S-F:5’-GACGCACAATCCCACTATCC-3’SEQ ID NO.:17

dsGhTCP4-R:5’-CGTCGTAAAACTGGATGGCGGTGTGA-3’SEQ ID NO.:18

其反应条件为：94℃预变性5min；然后94℃预变性30sec，56℃复性30sec，72℃延伸25sec，共35个循环；最后72℃延伸10min。扩增片段大小约为280bp。

c.RDL1::mGhTCP4转基因棉花的鉴定采用转基因载体特异引物：

RDL1-F:5’-CTAAGGCTCCTACTACATTTCTCA-3’SEQ ID NO.:19

mGhTCP4-R：5’-CGTCGTAAAACTGGATGGCGGTGTGA-3’SEQ ID NO.:20

其反应条件为：94℃预变性5min；然后94℃预变性30sec，56℃复性30sec，72℃延伸30sec，共35个循环；最后72℃延伸10min。扩增片段大小约为340bp。

2.荧光定量RT-PCR分析

a.RT-PCR分析

1μg的总RNA，经Oligo(dT)引物反转录，20μL反应液。42℃反应30分钟，反转录第一链cDNA，放置过夜。取0.5μL的反转录产物，25μL PCR反应体系检测目的基因表达。PCR引物为GhTCP4特异的引物：

GhTCP4-qRT-F：5’-TGGCGGTGGATTTATCTTTG-3’SEQ ID NO.:21

GhTCP4-qRT-R：5’-GTCTATCCAAGCACGAACCAA-3’SEQ ID NO.:22

以棉花基因Histone3(AF024716)作为内标，校正RT-PCR反应的模板量。PCR反应条件为：94℃预变性5分钟；然后94℃变性30秒钟，56℃复性30秒钟，72℃延伸1分钟，共30个循环；最后72℃延伸10分钟。

b.荧光定量RT-PCR分析

定量RT-PCR检测采用嵌合荧光法(

Premix Ex Taq^TM II(Perfect RealTime)，TaKaRa，DRR041A)。反应体系如下：

以棉花基因Histone3(AF024716)作为内标。数据分析采用Realplex v2.0(购自德国汉堡Eppendorf，NSW)。实验重复三次，取各组数据的平均值和方差，绘制图表。

表达特征分析表明，GhTCP4的表达在棉纤维细胞分化起始后逐渐增强，在伸长期(6-12DPA)纤维中保持较高的水平，随后逐渐下降(图2中A)。在四倍体海岛棉，二倍体亚洲棉的棉纤维细胞中GhTCP4的同源基因也呈现类似的表达特征(图2中C，D)。棉花TCP4基因特异地在快速伸长的纤维细胞中高表达，可能在纤维细胞的伸长生长过程中发挥功能。

实施例5

转基因棉花的纤维长度和基因表达分析

1.转基因棉花的性状分析

35S::dsGhTCP4、RDL1::mGhTCP4转基因棉花和野生型R15在上海和海南农场种植，常规田间管理。在棉花成熟吐絮期，分别单株收取成熟棉桃，尽量保持收取部位的一致性，随机取一定数量的种子将其纤维梳平并测量其纤维长度，进行统计分析。结果表明，35S::dsGhTCP4转基因棉花的表型可稳定遗传，且呈现逐代增强的趋势，可能与转基因插入的纯合有关。

对成熟棉纤维进行统计，发现转基因棉花的棉纤维长度与对照相比显著增加，且GhTCP4表达量下调越多的株系，其纤维增长的幅度就越明显(图4中A-C)。这种负相关表明GhTCP4在棉纤维细胞中的高表达对其伸长生长具有抑制作用，抑制GhTCP4的活性可促进纤维细胞伸长生长。

对RDL1::mGhTCP4转基因棉花进行基因表达分析，发现RDL1::mGhTCP4纤维细胞中GhTCP4的表达远远高于同一时期的对照组(图5中A)。T2代RDL1::mGhTCP4棉花都出现了纤维显著变短的表型(图5中B，C)，植株其它部位，如叶片、茎节等部位着生的表皮毛的生长也显著受到抑制，说明GhTCP4活性的增强抑制棉纤维的伸长生长。

实施例6

GhTCP4调控棉纤维发育的分子机理

通过酵母双杂交实验发现GhTCP4与GhHOX3存在蛋白相互作用，将GhHOX3按照不同的结构域进行分段并进行酵母双杂交分析。结果表明GhHOX3的LZ+START结构域介导了GhHOX3与GhTCP4的蛋白相互作用(图6中A)。LZ结构域被报道是 homebox类蛋白结合DNA所必须的。

基于萤火虫荧光素酶(firefly luciferase,LUC)的半分子荧光互补(BiFC)实验显示GhTCP4和GhHOX3在烟草细胞中形成稳定的蛋白复合体(图6中B)。进一步的蛋白免疫共沉淀(CoIP)实验也证实了GhTCP4和GhHOX3在植物体内存在直接的蛋白互作(图6中C)。

研究表明，GhHOX3通过直接结合GhRDL1和GhEXPA1启动子区域的L1-box激活基因表达。为了分析GhTCP4与GhHOX3互作的生理意义，构建了GhRDL1和GhEXPA1启动子驱动的LUC基因双荧光报告体系(以水母荧光蛋白REN作为内参)，并以GhTCP4和GhHOX3为效应蛋白(effector)，测定启动子活性对不同蛋白组合的响应情况(图7)。

实验结果表明：与对照相比，瞬时表达GhHOX3可强烈增强GhRDL1和GhEXPA1启动子活性，而单独表达GhTCP4并不影响GhRDL1和GhEXPA1启动子的活性；当共表达GhHOX3和GhTCP4时，GhHOX3对GhRDL1和GhEXPA1启动子的激活效应被显著地抑制(图7中A，B)。上述结果说明GhTCP4通过与GhHOX3的相互作用抑制下游基因表达。

GhHOX3与另一个homeobox类蛋白GhHD1形成异源二聚体对下游基因的转录激活活性更强。发现GhHD1-GhHOX3异源二聚体对GhRDL1或GhEXPA1启动子的激活作用也能被GhTCP4强烈抑制(图7中C，D)。结合转基因棉纤维细胞中的基因的表达数据，上述结果证明GhTCP4与GhHOX3的相互作用抑制了GhHOX3对下游基因的激活，从而调控纤维细胞的伸长生长。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种GhTCP4基因或其编码蛋白的用途，其特征在于，抑制所述的GhTCP4基因或其编码蛋白，用于促进棉纤维细胞伸长和/或用于促进棉纤维伸长；

其中，所述的GhTCP4基因的编码蛋白如SEQ ID NO:2所示。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的GhTCP4基因包括野生型GhTCP4基因和突变型GhTCP4基因。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的突变型包括突变后编码蛋白的功能未发生改变的突变形式。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的GhTCP4基因包括A亚组GhTCP4基因和D亚组GhTCP4基因。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的GhTCP4基因的CDS序列如SEQ ID NO:1所示。

6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述GhTCP4基因为来源于陆地棉A亚组或D亚组的基因。

7.一种促进棉纤维细胞伸长的方法，其特征在于，包括步骤：

(a) 将外源的构建物导入植物细胞，其中所述的构建物含有抑制GhTCP4基因表达的外源核苷酸序列，从而获得导入外源构建物的植物细胞；

(b) 将上一步骤获得的所述导入外源构建物的植物细胞，再生成植株：和

(c) 任选地对所述再生的植株进行鉴定，从而获得植物细胞伸长的植物；

其中，所述的外源核苷酸序列为RNA干扰序列，所述的RNA干扰序列如SEQ ID NO:4所示。

8.一种促进棉纤维伸长的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：在所述植物中，抑制GhTCP4基因的表达或抑制GhTCP4蛋白的活性；

其中，所述方法包括向植物中导入抑制GhTCP4基因表达的外源核苷酸序列；

并且，所述的外源核苷酸序列为RNA干扰序列，所述的RNA干扰序列如SEQ ID NO:4所示。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的促进棉纤维伸长包括促进棉纤维细胞伸长。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(a) 提供携带GhTCP4基因RNA干扰序列的表达载体的农杆菌；

(b) 将植物细胞或组织或器官与步骤(a)中的农杆菌接触，从而使GhTCP4基因RNA干扰序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

(c) 选择已转入GhTCP4基因RNA干扰序列的植物细胞或组织或器官；和

(d) 将步骤(c)中的植物细胞或组织或器官再生为植株。

Images