CN117363634B - 与棉花纤维长度关联的基因簇GhAPs及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供与棉花纤维长度关联的基因簇GhAPs及其应用。本发明发现陆地棉D5染色上四个连续的基因均与纤维长度相关，通过基因结构域分析及拟南芥同源序列比对，这四个基因均编码天冬氨酸蛋白酶(AP)，将编码此蛋白的基因命名为GhAP1‑GhAP4，对这四个GhAPs的转录水平测定表明，GhAPs在纤维伸长阶段均在长纤维亲本中低表达。进一步利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)方式验证GhAPs功能，当抑制GhAP3和GhAP4的表达量时，纤维长度可以分别显著提升11.2％和5.6％。本发明提供的纤维长度相关基因簇，在培育长绒棉、促进我国棉花产业发展方面具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及与棉花纤维长度关联的基因簇GhAPs及其应用。
背景技术
陆地棉(Gossypium hirsutum L.)隶属锦葵目(Malvales)，锦葵科(Malvaceae)，棉属(Gossypium)，因最早在美洲大陆种植而得名，是世界上最重要的棉花栽培品种，占全球棉花种植面积的90％-95％。育种家致力于提高陆地棉的纤维质量，特别是纤维长度(FL)，同时稳定产量以满足现代纺织业的需求。有限的遗传背景和纤维质量与产量之间的负遗传相关性是使用常规育种程序进一步改良棉花品种的主要制约因素(Cao et al(2015)Fine mapping of clustered quantitative trait loci for fiber quality onchromosome 7using a Gossypium barbadense introgressed line.Mol Breed 35:1–13)。因此，了解纤维发育的复杂遗传基础，精细定位FL的稳定数量性状位点(QTL)是当前棉花生物学的一个重要目标。
尽管已经定位了许多FL QTL，并鉴定了候选基因，但可用于分子育种的功能基因和分子标记仍很少(Zhang et al.(2021)Cellulose synthase(CesA)gene family infour Gossypium species:phylogenetics,sequence variation,and gene expressionand relation to fiber quality in Upland cotton.Molecular Genetics andGenomics 296(2):355-368)。亟须发掘一些新的、有效的基因应用于优质棉选育。
天冬氨酸蛋白酶(AP；EC 3.4.23)普遍存在于各种生物体中，包括脊椎动物、植物、酵母、线虫、寄生虫、真菌和病毒(Dunn BM(2002)Structure and mechanism of thepepsin-like family of aspartic peptidases.Chem Rev102(12):4431-4458.)。植物AP被认为参与了几个过程，如繁殖(et al(2004)Structure and function of plantaspartic proteinases.Eur J Biochem271(11):2067–2075)、衰老(ilisavljevic et al(2008)Two types of aspartic proteinases from buckwheat seed-genes structureand expression analysis.JPlant Physiol 165(9):983-990)、程序性细胞死亡和应激反应(Sebastián et al(2020)Overexpression of Arabidopsis aspartic protease APA1gene confers drought tolerance.Plant Sci 292:110406)。最近，人们发现AP在杨树发育过程中参与了控制次生细胞壁的合成(Cao et al(2022)Aspartic proteases modulateprogrammed cell death and secondary cell wall synthesis during wood formationinpoplar.J Exp Bot 73(19):6876-6890)。
但是，在棉花上，对该基因家族的研究较少，其与纤维品质功能相关的研究尚未见报到。
发明内容
本发明的目的在于提供一个推测为天冬氨酸蛋白酶的、与棉花纤维长度关联的基因簇及其用途。
本发明提供的一种编码天冬氨酸蛋白酶的基因簇GhAPs，所述的GhAPs基因簇定位于棉花基因组D5染色体上，其编码蛋白包括SEQ ID NO:1
(GhAP1)、SEQ ID NO:2(GhAP2)、SEQ ID NO:3(GhAP3)和SEQ ID NO:4
(GhAP4)所示。
本发明还提供基因簇GhAPs中GhAP3基因或其编码蛋白的用途，抑制所述的GhAP3基因或其编码蛋白，用于促进棉纤维细胞伸长和/或用于促进棉纤维伸长；其中，所述的GhAP3基因的编码蛋白如SEQ ID NO:3所示。
所述的GhAP3基因簇的CDS序列如SEQ ID NO:7所示。
本发明还提供基因簇GhAPs中GhAP4基因或其编码蛋白的用途，抑制所述的GhAP4基因或其编码蛋白，用于促进棉纤维细胞伸长和/或用于促进棉纤维伸长；其中，所述的GhAP4基因的编码蛋白如SEQ ID NO:4所示。
所述的GhAP4基因的CDS序列如SEQ ID NO:8所示。
所述的GhAP3或GhAP4基因包括野生型基因和突变型基因，所述的突变型包括突变后编码蛋白的功能未发生改变的突变形式。
本发明还提供一种促进棉纤维细胞伸长的方法，包括步骤：
A.以pCLCrVA载体为骨架，构建GhAP3基因沉默载体，构建引物(Primers forVIGS)为Forwardprimer：SEQ ID NO:9；Reverse primer：SEQ ID NO:10；
B.将所述构建的沉默载体转入农杆菌菌株GV3101中，待棉苗两片子叶完全展开时将所述农杆菌菌株接种于子叶；
C.分别以pCLCrVA:00和pCLCrVA:GhCLA1作为阴性和阳性对照，25°C/20℃，光照16h/8h条件下培养直至吐絮；期间，在进入开花期后每隔两周对茎尖生长点进行所述菌株注射以保持目标基因的沉默效果，提高棉花的纤维长度。
本发明还提供另一种促进棉纤维细胞伸长的方法，包括步骤：
A.以pCLCrVA载体为骨架，构建GhAP4基因沉默载体，构建引物(Primers forVIGS)为Forwardprimer：SEQ ID NO:11；Reverse primer：SEQ ID NO:12；
B.将所述构建的沉默载体转入农杆菌菌株GV3101中，待棉苗两片子叶完全展开时将所述农杆菌菌株接种于子叶；
C.分别以pCLCrVA:00和pCLCrVA:GhCLA1作为阴性和阳性对照，25°C/20℃，光照16h/8h条件下培养直至吐絮；期间，在进入开花期后每隔两周对茎尖生长点进行所述菌株注射以保持目标基因的沉默效果，提高棉花的纤维长度。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明人利用国审杂交棉冀1518构建了稳定的分离群体，针对纤维长度构建混池，利用重测序和KASP对纤维长度进行精细定位(图1)，发现D5染色上4个连续的基因均与纤维长度相关，通过基因结构域分析及拟南芥同源序列比对，这4个基因均编码天冬氨酸蛋白酶(AP)，因此，发明人将编码此蛋白的基因命名为GhAP1-GhAP4，对这4个GhAPs的转录水平测定表明，GhAPs在纤维伸长阶段均在长纤维亲本中低表达，进一步利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)方式验证GhAPs功能，当抑制GhAP3和GhAP4的表达量时，纤维长度可以分别显著提升11.2％和5.6％。
纤维品质改良对我国棉花产业高质量发展至关重要，也是今后我国棉花品种选育的重要育种目标(杨君等，2016)。克隆纤维长度相关基因，培育长绒棉，对促进我国棉花产业发展具有重要意义。
附图说明
图1.纤维长度QTLqFLD05精细定位及候选基因挖掘；
图2.GhAP1-GhAP4基因的结构域分析；
其中，图2A为GhAP1，图2B为GhAP2,图2C为GhAP3,图2D为GhAP4；
图3.GhAP1-GhAP4的基因序列分析；
图4.在较长和较短陆地棉中纤维发育期(0-30DPA)GhAP1-GhAP4的表达量比较；
图中：**代表数值达到极显著(P<0.01)差异水平。
图5.开花期和吐絮期注射pCLCrVA:GhCLA1茎尖生长点后，新生植株白化；
图6.在VIGS(病毒诱导的基因沉默)后，10DPA(开花后10天)时棉纤维中GhAP3和GhAP4的表达量；
图中：**代表数值达到极显著(P<0.01)差异水平。
图7.病毒诱导的GhAP3、GhAP4基因沉默后纤维均显著伸长。
图中：**代表数值达到极显著(P<0.01)差异水平。
具体实施方式
实施例1：纤维长度qFLD05精细定位及候选基因簇GhAPs鉴定
研究方法：
(1)亲本选择及构建方法
申请人所在研究团队培育的国审杂交棉冀1518，分别于2014年、2018年和2021年通过河南、河北和国家黄河流域棉区审定，是黄河流域首个纤维品质达到II型的机采棉品种。从该杂交种的自交分离后代中选择表型性状相近且纤维长度差异较大的两个株系A1和A29(表1)进行杂交，构建包含866个株系的次级F2以及F2:3分离群体。
表1次级群本亲本的纤维品质数据(两年平均)
(2)纤维长度极端材料混池构建及重测序
从866个次级F2群体材料中筛选纤维长度极端株各20株分别构建混池，同时对亲本A1、A29及两个纤维长度混池进行全基因组重测序。
(3)目标QTL区段标记加密和关键重组株系筛选
依据重测序结果，针对目标QTL区段开发新标记(包括SNP和Indel等)，采用Kosambi作图函数构建目标QTL区段加密图谱，并筛选目标区段内加密标记间的重组株系。
(4)纤维长度表型鉴定
2021-2022年在威县、衡水将次级F2:3群体随机区组种植，7米行长，三行区，收获期取中部30铃测定纤维品质指标(长度、强度、马克隆值、伸长率、整齐度)，利用最佳线性无偏预测(Best LinearUnbiasedPrediction,BLUP)处理表型数据降低环境影响。
(5)纤维长度QTLqFLD05候选基因预测
首先，根据精细定位区间查看候选基因信息。根据棉花参考基因组信息(WHU-updatedv1，Huang et al.,2020)，鉴定精细定位区间内所包含的基因，结合KEGG和GO分析，初筛候选基因。
其次，利用单倍型和表型相关分析缩小候选基因范围。使用BLUP计算纤维长度表型数据，结合候选基因在群体中的单倍型，利用t-test双尾测验函数检测单倍型与纤维长度的相关性。
最后，结合转录组测序中的表达差异性鉴定候选基因。取亲本在纤维发育不同时期(0DPA、5DPA、10DPA、15DPA、20DPA和30DPA)的纤维进行转录组测序，经过数据聚类、注释及功能富集等生物信息学手段进行差异基因的分析，并验证差异基因的时空特异性表达。查看以上两步所获得基因的差异表达情况，再筛候选基因。
研究结果：发明人利用杂交棉‘冀1518’该杂交种构建了F2:9分离群体，在F2:9群体中筛选A1(纤维较长)和A29(纤维较短)作为亲本构建了包含866个株系的次级F2、F2:3分离群体。根据次级F2群体纤维长度性状分离结果，筛选纤维长度差异较大而其他性状差异较小的材料各20份，对长、短两个混池及亲本进行重测序，联合ED距离和SNP-index关联算法获得6个相关的侯选区域。其中5个区域位于D5染色体4.49Mb-5.16Mb(5个区段共0.55Mb)之间。在上述候选区域内筛选高质量的SNP及InDel位点，开发KASP标记23个和InDel标记1个，利用866个F2:3株系在多环境下的纤维长度数据，在目标区段精细定位纤维长度QTL。结果表明：多环境下在D5染色体标记M8-InDel段检测到纤维长度主效位点。将遗传图谱与物理图谱进行共线性分析，上述区间对应物理位置4.95Mb-5.16Mb(0.21Mb)(图1)，该区段内共有15个基因。
上述定位区间内的15个基因中，有4个相邻的基因均被注释为天冬氨酰蛋白酶家族(aspartic-type endopeptidase activity，GhAP1-GhAP4)(图2)，这4个基因的序列结构见图3，在亲本纤维发育过程中表达量有显著差异，且均在在长纤维亲本A1相较于短纤维亲本A29表达量更低(图4)，结合参考基因组注释信息、单倍型和表型相关分析、表达差异分析，确定基因簇GhAPs为纤维长度QTL的目标基因。
其基因结构如图3所示。
利用同源克隆法在冀1518叶子的cDNA中克隆得到与棉花纤维长度关联的基因簇GhAPs，GhAP1基因的ORF全长1449bp(SEQ ID NO:5)，编码482个氨基酸(SEQ ID NO:1)；GhAP2基因的ORF全长1458bp(SEQ ID NO:6)，编码485个氨基酸(SEQ ID NO:2)；GhAP3基因的ORF全长1473bp(SEQ IDNO:7)，编码490个氨基酸(SEQ ID NO:3)；GhAP4基因的ORF全长1383bp(SEQ ID NO:8)，编码460个氨基酸(SEQ ID NO:4)。本发明所述的与棉花纤维长度关联的基因簇GhAPs可以提高棉花的纤维长度。
实施例2：VIGS验证GhAP3和GhAP4负向调控纤维伸长
研究方法：以pCLCrVA载体为骨架，构建GhAP3和GhAP4沉默载体，构建引物为：
PrimersforVIGS
然后将载体转入农杆菌菌株GV3101中，待棉苗两片子叶完全展开时进行接种，分别以pCLCrVA:00和pCLCrVA:GhCLA1作为阴性和阳性对照，25℃/20℃，光照16h/8h条件下培养直至吐絮。接种后两周pCLCrVA:GhCLA1植株出现白化，表明接种成功，由于子叶期注释距离吐絮时间较长，为了保证沉默效果，进入开花期后通过每隔两周对芽尖生长点(图5左图箭头位置)进行注射的方法，保持目标基因的沉默效果，并分析10DPA时目的基因沉默植株与阴性对照的表达量差异来确定沉默效果。进入开花期后，注射pCLCrVA:GhCLA1茎尖生长点后，新长出的叶子出现白化现象(图5右图)，表明在棉花生长后期可以通过利用VIGS注射茎尖来沉默目的基因，且pCLCrVA:GhAP3、pCLCrVA:GhAP4的纤维在10DPA时表达量与对照pCLCrVA:00相比显著降低(图6)，表明利用该方法可以有效保持目标基因的长期沉默效率，测定两年三个环境的VIGS沉默纤维数据，沉默GhAP3和GhAP4基因之后纤维长度均可显著增长，平均比空载分别显著增加10.03％和5.6％(图7)。表明通过GhAP3和GhAP4基因可以调控纤维伸长，降低其表达量可以显著提高棉花的纤维长度。
结果：
本研究通过混池重测序和KASP技术鉴定了一个与纤维长度相关的编码天冬氨酸蛋白酶基因簇，该基因簇包含4个基因，本发明将其命名为GhAP1-GhAP4，这4个基因在纤维长度形成过程中在长纤维和短纤维材料中表达差异显著，利用VIGS沉默GhAP3和GhAP4时，纤维长度可以分别显著提升11.2％和5.6％。说明该基因簇与纤维长度相关，降低其表达量可以显著提高棉花的纤维长度。
Claims (6)
1.一种GhAP3基因或其编码蛋白的用途，其特征在于，抑制所述的GhAP3基因或其编码蛋白，用于促进棉纤维伸长；其中，所述的GhAP3基因的编码蛋白如SEQ ID NO:3所示。
2.按照权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的GhAP3基因的CDS序列如SEQ ID NO:7所示。
3.一种GhAP4基因或其编码蛋白的用途，其特征在于，抑制所述的GhAP4基因或其编码蛋白，用于促进棉纤维伸长；其中，所述的GhAP4基因的编码蛋白如SEQ ID NO:4所示。
4.按照权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的GhAP4基因的CDS序列如SEQ ID NO:8所示。
5.一种促进棉纤维伸长的方法，其特征在于，包括步骤：
A.以pCLCrVA载体为骨架，构建GhAP3基因沉默载体，构建Forwardprimer：SEQ ID NO:9；Reverse primer：SEQ ID NO:10；
B.将所述构建的沉默载体转入农杆菌菌株GV3101中，待棉苗两片子叶完全展开时将所述农杆菌菌株接种于子叶；
C.分别以pCLCrVA和pCLCrVA:GhCLA1作为阴性和阳性对照，25℃/20℃，光照16h/8h条件下培养直至吐絮；期间，在进入开花期后每隔两周对茎尖生长点进行注射以保持目标基因的沉默效果，提高棉花的纤维长度。
6.一种促进棉纤维伸长的方法，其特征在于，包括步骤：
A.以pCLCrVA载体为骨架，构建GhAP4基因沉默载体，构建Forwardprimer：SEQ ID NO:11；Reverse primer：SEQ ID NO:12；
B.将所述构建的沉默载体转入农杆菌菌株GV3101中，待棉苗两片子叶完全展开时将所述农杆菌菌株接种于子叶；
C.分别以pCLCrVA和pCLCrVA:GhCLA1作为阴性和阳性对照，25℃/20℃，光照16h/8h条件下培养直至吐絮；期间，在进入开花期后每隔两周对茎尖生长点进行注射以保持目标基因的沉默效果，提高棉花的纤维长度。
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