CN103497939B - 一种调控叶绿体发育及光合速率的蛋白质及其基因和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种调控叶绿体发育及光合速率的蛋白质及其基因和应用。该基因编码蛋白是具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，该编码基因具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。该水稻叶绿体发育编码基因发生突变可导致幼叶、剑也以及幼穗白化，近光合速率减弱。将其应用于植物遗传改良等工作，是重要的指示基因，可作为目的基因应用于杂交水稻制种，可以方便检测杂交后代的纯度，将其过量表达有利于提高植物的光合作用，可应用于植物高光效育种。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，具体地说，本发明涉及一种利用图位克隆技术克隆水稻WP4基因(其编码蛋白质为水稻腺苷激酶，OsAK1）以及利用转基因实验鉴定该基因的功能，同时利用该基因调节叶绿体发育，提高光合速率，应用于水稻制种及高光效育种中。
背景技术
叶片是植物进行光合作用的主要器官，水稻籽粒中2/3以上的干物质是开花后通过光合作用获得的（王旭军et al.2005），光合作用的效率与叶绿体结构和功能是否完整、光合作用复合体的稳定性、叶绿素含量的高低都有着复杂的关系。近年来，叶色的应用价值备受关注，叶色变异可以作为标记性状，在水稻杂交育种和良种繁育发挥重要作用，不但可以用于苗期剔除受外源花粉污染的种子和假杂种，还可以用于测定种子纯度（章志兴and陈善福2001）。另外，叶色突变体的研究对有效利用基因工程提高水稻的光合能力，培育高光效水稻，增加水稻产量具有重要的理论意义和应用价值。
目前，利用水稻叶色突变体，已经克隆出多个参与或调控叶绿素代谢和叶绿体发育的基因，通过分析基因功能、表达模式、基因间互作以及核-质信号传导，初步了解了水稻叶色形成及调控机理。目前为止，在拟南芥叶绿素合成过程中的关键酶都已鉴定出来（Nagata 2005），但在水稻中只有少数基因被鉴定出来，其他基因还有待进一步发现。此外，叶绿素降解的调控机制尚未明朗，核-质互作的机理尚不清晰，有待深入进一步研究。
植物腺苷激酶（Adenylate kinase，AK，AMK）催化腺苷三磷酸（ATP）使腺苷酸（AMP）磷酸化而生成腺苷二磷酸（ADP）反应的酶，逆反应由2个分子ADP生成ATP和AMP。在能量代谢、腺嘌呤核苷酸平衡等方面起着关键的作用。在植物中很多腺苷激酶都定位于叶绿体基质中。在水稻种腺苷激酶基因突变对水稻代谢发育的影响目前没有报道。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一种从水稻白叶白穗突变体中克隆的新基因WP4,该基因编码一个腺苷激酶蛋白（OsAK1），调控叶绿体的发育与光合速率。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种调控叶绿体发育与光合速率的蛋白质，该蛋白质具有SEQ ID No.2（即序列表中的序列2）所示的氨基酸序列，且由基因WP4编码。
作为本发明的蛋白质的改进：氨基酸序列还包括在SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个氨基酸生成的衍生物。
本发明还同时提供编码上述蛋白质的基因，其具有SEQ ID NO.1 (即序列表中的序列1)所示的核苷酸序列。
作为本发明的基因的改进：核苷酸序列还包括在SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个核苷酸生成的突变体、等位基因和衍生物。
本发明还同时提供了上述基因的用途：用于构建转基因水稻。
本发明还同时提供了一种转基因植物细胞，为包含本发明所述基因的转基因植物细胞。
本发明的另一个目的是提供一种用WP4基因进行高效的植物转化方法，具体地说，本发明提供了具有SEQ ID NO.1所示的序列片段载体。
本发明的具体实施步骤如下：
一、水稻白条纹叶白穗突变体wp4的分离和表型分析
本研究突变体wp4为水稻，田间表型观察发现该突变体的主要特征是：苗期表现出白条纹叶、随后会转绿，但是抽穗期及抽穗后剑叶、剑叶鞘及幼穗表现出严重的白条纹或白化，株高略矮（图1）。叶绿素测定结果显示突变体wp4的幼苗、剑叶、剑叶鞘和幼穗的叶绿素含量显著低于野生型(图2)。利用透射电镜（TEM）观察野生型和wp4的剑叶及幼穗的叶绿体超微结构，发现野生型的叶绿体含有正常的片层结构，而wp4细胞中含有较少且结构异常的叶绿体(图2)。同时对抽穗后野生型及突变的净光合速率测定发现wp4的光合能力显著低于野生型(图2)。
表1.突变植株与正常植株在不同F2群体中的分离
| 杂交组合 | 正常植株 | 突变株 | χ2(3:1) | P value |
| wp4×Peiai64 | 5024 | 1654 | 0.19 | 0.66 |
| wp4×Nippobare | 840 | 263 | 0.79 | 0.38 |
| wp4×NanJing-11 | 9063 | 2937 | 1.76 | 0.18 |
二、水稻WP4基因的遗传分析与图位克隆
1．突变体性状的遗传分析
用突变体分别与水稻品种93-11和NanJing 11进行正反交，得到的F1后代均表现为正常绿化，在其自交F2群体中正常植株与突变植株分离比接近3：1（表1），表明此突变体性状由一对隐性核基因控制。
2. WP4基因的图位克隆
为了分离WP4基因，本发明首先建立了一个大的多态性高的F2定位群体，由籼稻品种NanJing 11为父本，突变体wp4为母本，挂牌收获单株鉴定后代基因型，对获得的F2群体中有表型分离的群体选取其中的隐性个体进行基因定位，利用SSR分子标记对WP4位点进行初步定位，将其初步定位在第8染色体的短臂上，并介于Z11和Z13两SSR标记之间。然后通过对两标记之间的BAC序列进行分析，发展了新的标记，最终将WP4精确定位于BAC克隆P0007D08的CAPS8-4与Z29之间8.65 kb的范围之内，（图3），分析发现此区段只存在一个开放阅读框（ORF1，SEQ ID NO.1），ORF1编码一个腺苷酸激酶(Adenylate kinase 1)。RT-PCR表明，相对于野生型ORF1（OsAK1）在突变体中的表达量显著下降（图3），因此ORF1（OsAK1）可能就是WP4的目的基因。
3. WP4基因功能互补研究
为了证明ORF1（OsAK1）就是WP4的目的基因，我们对突变体wp4进行了转基因恢复验证实验。转基因恢复验证主要是将野生型WP4基因全长基因组序列克隆到双元植物转基因载体pCAMBIA1390Ubi的多克隆位点。将构建好的恢复载体Ubi:AK1通过农杆菌介导的遗传转化系统转化突变体愈伤，经过抗性愈伤诱导进而分化成转基因苗。转化了WP4基因的突变体（即转基因阳性株系）幼穗颜色复绿，WP4表达量明显增高,净光合速率明显提高（图4）。转基因恢复试验确证了突变体表型是由WP4基因(ORF1,OsAK1)突变引起的，表明本发明获得了使突变体恢复正常功能的转基因水稻。
本发明利用水稻白叶白穗突变体，通过图位克隆法克隆到了WP4基因，该基因编码腺苷激酶1（Adenylate kinase 1, AK1）蛋白。通过转基因互补实验证明了WP4基因在调控水稻叶绿素合成、叶绿体发育及光合作用等方面的功能。因而本发明能调节水稻叶绿体发育提高水稻光合作用。为该基因的进一步利用打下基础。
附图说明
图1是野生型早香粳和wp4突变体各生育期的表型。A为幼苗表型，B为分蘖盛期，D为抽穗期，C，E为抽穗期剑叶和幼穗表型，F为成熟期穗子表型。A,B，D-F左边为野生型，右边卫wp4突变体；C上面为野生型，下面为突变体。
图2为野生型与突变体wp4的叶绿素、叶绿体显微结构及净光合速率的比较分析。A-C为叶绿素a（Chla）,叶绿素b（Chlb）及总叶绿素含量比较，S为幼苗，P为幼穗，FL为剑叶，Sh为剑叶鞘，L2、L3为倒2叶、倒3叶。D-K为叶绿体显微结构观察，D，E为野生型剑叶叶肉细胞叶绿体观察，F为野生型幼穗叶绿体观察，G-I为突变体剑叶叶肉细胞叶绿体观察，J-K为突变体幼穗细胞叶绿体观察。M为野生型与突变体剑叶净光合速率比较分析。
图3为WP4基因的图位克隆。A为WP4的精细定位；B为WP4的候选基因OsAK1的基因结构；C为WP4的候选基因OsAK1的RT-PCR分析。C图中ZXJ为野生型早香粳。
图4是WP4基因功能互补实验，T0转基因水稻的表型；A-B为wp4突变体对照转基因阳性植株1、2抽穗期的表型；C-D为OsAK1在突变体对照及2个转基因阳性植株中的表达情况；E为突变体对照及2个转基因阳性植株剑叶净光合速率比较。
具体实施方式
为了理解本发明，下面以实施例进一步说明本发明，但不限制本发明。
实施例1：WP4基因的克隆
1．水稻材料
水稻（Oryza sativa L）突变体wp4(white panicle 4),原始野生型材料为粳稻品种早香粳.
2.电镜观察
利用透射电镜（TEM）观察野生型和wp4抽穗期剑叶的叶绿体超微结构，发现野生型的叶绿体含有正常的片层结构，而wp4部分叶肉细胞中含有较少且类似前质体结构的囊泡状叶绿体，部分细胞中叶绿体片层结构不正常，对抽穗期的幼穗叶绿体观察发现突变体中只有一些未分化成熟的叶绿体前体（图2）。
3.遗传分析和定位群体
遗传分析确定wp4为隐性突变体，选取突变体和Nanjing11进行杂交，F1代自交，单株收种种植F2群体，从有分离的F2群体中选出2937个隐性个体（白色、白穗）作为定位群体。每株取1克左右的叶片，用来提取总DNA进行基因定位。
4.WP4基因的初步定位和精细定位
采用水稻微量DNA的快速提取方法从水稻叶片中提取用于基因定位的基因组DNA,该DNA抽提的方法为SDS法（Dellaporta et al.1983）。取大约100mg水稻叶片剪碎后放入2ml 离心管，加入钢珠经液氮冷冻后，在磨样机上粉碎，然后提取DNA,获得的DNA沉淀溶解于400μL超纯水中，每一个PCR反应用1μLDNA样品。
在WP4基因的初步定位中，用由30个具有突变表型的F2个体进行SSR分析。首先根据公布的粳稻和籼稻创建的分子遗传图谱，选取近似均匀分布于各染色体上的SSR引物进行PCR扩增（反应体系如下）。通过8%的聚丙烯酰胺凝胶（凝胶 配置方法如下）电泳分离，通过检测条带的多态性，将基因初步定位到第8染色体的短臂上，并介于Z11和Z13两SSR标记之间。
PCR反应体系：
| DNA模板 | 1μL |
| 10╳PCR Buffer | 1μL |
| dNTP(10mM) | 0.1μL |
| 上游引物（10μm） | 0.5μL |
| 下游引物(10μm) | 0.5μL |
| Taq酶（5U/μL） | 0.2μL |
| ddH2O | 6.7μL 至1ml |
8%聚丙烯酰胺凝胶配方:
| 5╳TBE | 6ml |
| 40% Arc-Bis | 6 |
| 10%AP(μL) | 240 |
| TEMED(μL) | 30 |
| ddH2O | 18 至30ml |
聚丙烯酰胺凝胶显色液配方：
| Na3(BO4)4 | 0.152 |
| NaOH | 12g |
| 甲醛 | 3.2ml |
| ddH2O | 至800ml |
注：甲醛是临用前现加，其他三个按相应量提前配好。
然后通过对Z11和Z13两标记之间的BAC序列进行分析，发展了新的分子标记，利用2937个F2极端个体进行精细定位，将WP4精确定位于BAC克隆P0481E12的CAPS8-4与Z29之间8.65 kb的范围之内，（图3），通过分析此区段开放阅读框（ORF）推测候选基因并基因测序分析，寻找突变位点。
新开发分子标记引物序列：
In8-12F (SEQ ID NO.4)5'CTAGGCTCAATCTATATATCCCT3'
In8-12R (SEQ ID NO.5)5'GCGATACTGGACTAAACCC3'
In8-18F (SEQ ID NO.6) 5'TACTGATGCTCTTATAACCACTAGG3'
In8-18R (SEQ ID NO.7) 5'CAATTAGGCCCTGTTGGAA3'
In8-23F(SEQ ID NO.8) 5'CCCTCCCACGGTCCCACCCAGA3'
In8-23R (SEQ ID NO.9) 5' GCGGAGAAGAGCGGCGTGGAATC 3'
In8-25F (SEQ ID NO.10) 5' ACTCCTGGCTGCGCTTGTT 3'
In8-25R (SEQ ID NO.11) 5' TGGTGCGGTCCCGTAGAAT 3'
Z29F (SEQ ID NO.12) 5' GCGACTCTAGTGCCAGTCACTCC 3'
Z29R (SEQ ID NO.13) 5' TTCCAAATCACACTCACTCCTTCC 3'
dCAPS8-1F (SEQ ID NO.14) 5' CAAATATAAGCATCAATCTGATCTGA 3'
dCAPS8-1R (SEQ ID NO.15) 5' GGAAGCGGAGGTGATAGACA 3'
dCAPS8-4F (SEQ ID NO.16) 5' AGCCAACGCACTAGCAGTT 3'
dCAPS8-4R (SEQ ID NO.17) 5' GAGGCATGGATGAAGACATCTAATAT 3'
5.基因预测和比较分析
根据精细定位的结果，在17kb范围内根据RiceGAAS(Rice Automat ed Systrm,http://ricegaas.dna.affrc.go.jp/)和TIGR（http://rice.plantbiology.msu.edu/）的预测，发现在此区间内只有1个候选基因Adenylate kinase 1, OsAK1，我们设计了引物，采用PCR的方法分别从wp4突变体和野生型品种基因组中扩增出所有候选基因进行测序分析。野生型品种WP4基因序列为SEQ ID NO.1,命名为WP4基因，其编码的蛋白质测序得到的核苷酸序列为SEQ ID NO.2，WP4基因cDNA序列为SEQ ID NO.3。
实施例2：转基因实验
植物转化：
1．载体构建
将WP4基因的完整基因组序列通过In-fusion重组酶系统（http://bioinfo.clontech.com/infusion/）将其重组到pCAMBIA1390Ubi表达载体中，首先利用SpeI酶切pCAMBIA1390Ubi表达载体，使其线性化，在利用引物gAK1Cf，gAK1Cr通过PCR扩增野生型基因组DNA,电泳检测切胶回收，利用In-fusion重组酶系统将PCR产物重组到pCAMBIA1390Ubi表达载体，测序确认没有发生碱基突变，把构建好的载体通过热击的方法转入农杆菌（A grobacterium tumefaciens）菌株中。
扩增ORF序列的引物序列为：
gAK1Cf:5’- GGTAGATCTGACTAGTTAGTAGAAGTTGTGCGTTTGTGTTG -3’(SEQ IDNO.18)
gAK1Cr:5’- TAGCGTTAACACTAGTAAAATAAGTGAATCTGAGCACGTTC -3’(SEQ IDNO.19)
2.遗传转化：
（1）转化受体的选择
将突变体wp4种子成熟胚诱导愈伤组织，经过诱导培养基增减2周后将胚芽剪下，继续培养1周，挑选生长旺盛的愈伤用作转化的受体。
（2）遗传转化
采用农杆菌介导的遗传转化方法（Hiei et al.1994）,将pCAMBIA1390Ubi空载体和pCAMBIA1390Ubi:WP4载体的EHA105菌株侵染水稻愈伤，在黑暗、25℃条件下共培养3天后，在含有120mg/L G418的筛选培养基上培养。筛选抗性愈伤在含有120mg/L预分化培养基上培养10天左右。将预分化的愈伤转至分化培养基上在光照条件下培养。一个月左右得到抗性转基因植株。对植株进行鉴定和连续的观察，发现转空载体的转基因植株表型与wp4相比不发生变化，即剑叶、幼穗仍然表现白化，而pCAMBIA2300:WP4载体的阳性转基因植株与野生型表现一致，即wp4的突变表型得到了恢复，见图4。
综上所述, SEQ ID No.2为调控叶绿体发育与光合速率的蛋白质序列，该蛋白质具有调控水稻叶绿素合成、叶绿体发育及光合作用功能。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
<110> 中国水稻研究所
<120> 一种调控叶绿体发育及光合速率的蛋白质及其基因和应用
<130> 1
<160> 19
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 2815
<212> DNA
<213> 水稻（Oryza sativa L）
<400> 1
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<211> 290
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Met Ala Ser Ser Met Ala Ala Thr Ala Thr Leu Ser Pro Pro Val Leu
1 5 10 15
Ser Ala Glu Arg Pro Thr Val Arg Gly Gly Leu Phe Leu Pro Pro Ser
20 25 30
Pro Ala Thr Ser Arg Ser Leu Arg Leu Gln Ser Ala Arg Arg Cys Gly
35 40 45
Ile Ser Pro Ala Thr Arg Lys Pro Arg Ser Leu Pro Arg Ala Ala Lys
50 55 60
Val Val Val Ala Val Lys Ala Asp Pro Leu Lys Val Met Ile Ala Gly
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Leu Leu Gln Pro Asp Ala Gln Glu Lys Gly Trp Leu Leu Asp Gly Tyr
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195 200 205
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210 215 220
Gln Arg Phe Asp Asp Thr Glu Glu Lys Val Lys Leu Arg Leu Gln Thr
225 230 235 240
His Tyr Gln Asn Val Glu Ser Leu Leu Ser Ile Tyr Glu Asp Val Ile
245 250 255
Val Glu Val Lys Gly Asp Ala Leu Val Asp Asp Val Phe Ala Glu Ile
260 265 270
Asp Lys Gln Leu Thr Ser Ser Leu Asp Lys Lys Thr Glu Met Val Ala
275 280 285
Ser Ala
290
<210> 3
<211> 873
<212> DNA
<213> 水稻（Oryza sativa L）
<400> 3
atggcctctt ccatggccgc caccgccacc ctctcgccgc cggttttatc cgccgagagg 60
ccgactgtcc gcggcggcct cttcttgccc ccttcgccgg cgacctcccg ctctctccgc 120
ctccaatccg cccgccgctg cggcatctcg ccggcgacca ggaagccacg ctccttgcct 180
cgagcagcca aggttgttgt ggctgtgaag gctgatcctt tgaaggtcat gatagcaggg 240
gctccagcat ctggaaaggg aacgcagtgt gagctcatca agagcaaata tggtctggtg 300
cacatttctg ctggagattt gctaagggca gaaattgctg caggcagtga gaatgggaag 360
cgagctaagg aatttatgga gaagggtcag ctggttcctg atgagattgt tgttaatatg 420
gtgaaggaac gccttctgca accagatgct caggaaaagg gttggttgtt ggatgggtac 480
ccaagaagct attcgcaagc gatggcgctg gaaactctta atatccgacc tgacattttc 540
attcttttgg atgttccaga tgaacttctt gttgaaaggg tagttgggag acggcttgat 600
cctgtaactg ggaaaatata ccatctaaag tattccccac cggagaatga agaaatcgct 660
tcaaggctta cacagagatt tgatgataca gaagaaaagg ttaagctgag gttacagact 720
cattatcaaa atgtagaatc cttgctatca atttacgaag atgtgatagt tgaggtaaaa 780
ggggatgctt tggtggatga tgtgtttgct gagatcgaca agcagctgac ttctagcctt 840
gataagaaaa cagaaatggt ggctagcgca tga 873
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
ctaggctcaa tctatatatc cct 23
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
gcgatactgg actaaaccc 19
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
tactgatgct cttataacca ctagg 25
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
caattaggcc ctgttggaa 19
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
ccctcccacg gtcccaccca ga 22
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
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gcggagaaga gcggcgtgga atc 23
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actcctggct gcgcttgtt 19
<210> 11
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<212> DNA
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<400> 11
tggtgcggtc ccgtagaat 19
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
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<400> 12
gcgactctag tgccagtcac tcc 23
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 13
ttccaaatca cactcactcc ttcc 24
<210> 14
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 14
caaatataag catcaatctg atctga 26
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 15
ggaagcggag gtgatagaca 20
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gaggcatgga tgaagacatc taatat 26
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ggtagatctg actagttagt agaagttgtg cgtttgtgtt g 41
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 19
tagcgttaac actagtaaaa taagtgaatc tgagcacgtt c 41
Claims (1)
1.调控叶绿体发育及光合速率的蛋白质编码基因在培育高光合速率的转基因植物中的应用，该基因为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
Priority Applications (1)
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Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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Family Applications (1)
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-
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| AP004584.3 Oryza sativa Japonica Group genomic DNA, chromosome 8, PAC clone:P0007D08;Sasaki,T. et al.;《GenBank》;20080216;核苷酸序列和氨基酸序列 * |
| Functions of Chloroplastic Adenylate Kinases in Arabidopsis;Peter Robert Lange et al.;《Plant Physiology》;20080228;第146卷;第492-504页，尤其是摘要、图1-4、图7、表II、第499-501页讨论部分 * |
| Membrane potential, adenylate levels and Mg2+ are interconnected via adenylate kinase equilibrium in plant cells;Abir U. Igamberdiev et al.;《Biochimica et Biophysica Acta》;20031231;第111-119页 * |
| NM_001067345.1 Oryza sativa Japonica Group Os08g0109300 (Os08g0109300) mRNA, complete cds;Tanaka,T. et al.;《GenBank>;20100608;氨基酸序列 * |
| 三个水稻叶色突变体的基因克隆与功能分析;邹国兴;《中国博士学位论文全文数据库》;20130215;全文 * |
| 水稻叶色突变体及其基因定位和克隆的研究进展;张力科 等;《作物杂志》;20091231;第12-16页 * |
| 水稻叶色突变体研究进展;陈青 等;《热带生物学报》;20100930;第1卷(第3期);第269-281页 * |
| 水稻叶色突变分子机制的研究进展;刘聪利 等;《中国稻米》;20121231;第18卷(第4期);第15-21页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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