CN107151669B - GhPRE1基因及其在改良棉纤维品质中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了调控棉纤维发育的GhPRE1基因及其在改良棉纤维长度、断裂比强度、马克隆值和纺纱均匀性等品质中的应用。具体地，本发明提供了一种GhPRE1基因的功能与用途，即采用棉纤维细胞特异的RDL1启动子增强GhPRE1基因的表达，可以改良棉纤维长度性状，断裂比强度、马克隆值和纺纱均匀性等品质，获得了纤维品质显著改良且更加符合纺织工业生产需求的转基因棉花。本发明的GhPRE1基因具有广泛的应用价值，为转基因技术改良棉属植物和其它植物农艺性状提供了新的途径。

Description

GhPRE1基因及其在改良棉纤维品质中的应用

技术领域

本发明涉及植物学领域，更具体地涉及GhPRE1基因及其改良棉纤维品质中的应用。

背景技术

棉花是世界上最主要的农作物之一，产量大、生产成本低，使棉制品价格比较低廉。棉纤维能制成多种规格的织物，从轻盈透明的巴里纱到厚实的帆布和厚平绒，适于制作各类衣服、家具布和工业用布。棉织物坚牢耐磨，能够洗涤和在高温下熨烫，棉布由于吸湿和脱湿快速而使穿着舒服，应用广泛。我国是世界上棉花产量最高的国家之一。

棉纤维是由棉花种子表皮细胞分化产生的，为极度伸长的单细胞结构。其分化和发育过程可分为：纤维细胞分化与突起、纤维细胞的迅速伸长、次生壁的合成和脱水成熟等4个时期。纤维细胞各个时期的生命活动影响棉纤维的产量和品质形成,其中纤维伸长和次生壁合成两个时期对纤维的发育与品质形成关系最为密切。棉纤维发育和结构的特点是由一系列在特定的时间和空间表达的基因决定的，而基因表达的时空特异性主要是由转录调控因子与下游基因的启动子之间的相互作用实现的。克隆鉴定棉纤维发育的关键调控基因，并对其功能进行研究，认识棉纤维发育的分子调控机理，对于改善棉纤维品质、提高作物产量等具有十分重要的生物学意义和应用价值。因此，本领域迫切需要开发新的调控棉纤维发育的基因，并对其功能应用进行相应的研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种调控棉纤维发育的GhPRE1基因及其在改良棉纤维品质中的应用。

在本发明的第一方面，提供了一种GhPRE1基因或其编码蛋白的用途，所述的GhPRE1基因或其编码蛋白用于选自下组的用途：

(a)用于制备促进棉属植物棉纤维伸长的试剂或组合物；

(b)用于改善棉属植物的棉纤维长度性状；

(c)用于增加棉属植物棉纤维的长度；

(d)用于增强棉属植物棉纤维的断裂比强度；

(e)用于改善棉属植物棉纤维的马克隆值；

(f)用于提高棉属植物棉纤维的纺纱均匀性。

在另一优选例中，所述的GhPRE1基因或其编码蛋白还用于选自下组的一种或多种用途：

(d)用作制备促进植物细胞伸长的试剂或组合物；和

(e)用于增加植物细胞的长度。

在另一优选例中，所述的植物为棉属植物。

在另一优选例中，所述的“改善棉属植物的棉纤维长度性状”或所述的“增加棉属植物棉纤维的长度”指：导入外源的所述“GhPRE1基因”所获得的转基因棉属植物的棉纤维长度L1与未导入外源的所述“GhPRE1基因”的同一种类的棉属植物的棉纤维长度L0之比值(L1/L0)为105％-120％，较佳地为110％-112％。

在另一优选例中，所述的“增强棉属植物棉纤维的断裂比强度”指：导入外源的所述“GhPRE1基因”所获得的转基因棉属植物的棉纤维断裂比强度S1与未导入外源的所述“GhPRE1基因”的同一种类的棉属植物的棉纤维断裂比强度S0之比值(S1/S0)为103％-120％，较佳地为105％-112％。

在另一优选例中，所述的“增强棉属植物棉纤维的纺纱均匀性”指：导入外源的所述“GhPRE1基因”所获得的转基因棉属植物的棉纤维纺纱均匀性A1与未导入外源的所述“GhPRE1基因”的同一种类的棉属植物的棉纤维纺纱均匀性A0之比值(A1/A0)为105％-125％，较佳地为110％-115％。

在另一优选例中，所述的“改善棉属植物棉纤维的马克隆值”指导入外源的所述“GhPRE1基因”所获得的转基因棉属植物的棉纤维马克隆值处于国家B2级标准。

在另一优选例中，所述的GhPRE1基因包括野生型GhPRE1基因和突变型GhPRE1基因。

在另一优选例中，所述的突变型包括突变后编码蛋白的功能未发生改变的突变形式(即功能与野生型编码蛋白相同或基本相同)。

在另一优选例中，所述的突变型GhPRE1基因编码的多肽与野生型GhPRE1基因所编码的多肽相同或基本相同。

在另一优选例中，所述的突变型GhPRE1基因包括与野生型GhPRE1基因相比，同源性≥80％(较佳地≥90％，更佳地≥95％)的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的突变型GhPRE1基因包括在野生型GhPRE1基因的5＇端和/或3＇端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的基因包括DNA、cDNA、和/或mRNA。

在另一优选例中，所述的GhPRE1基因的CDS序列如SEQ ID NO.:1所示。

在另一优选例中，所述的GhPRE1基因的编码蛋白如SEQ ID NO.:2所示。

在另一优选例中，所述的GhPRE1基因的基因组序列如SEQ ID NO.:3所示。

在另一优选例中，所述的GhPRE1基因来源于棉属植物。

在另一优选例中，所述的棉属植物为棉花。

在另一优选例中，所述的包括陆地棉、海岛棉、亚洲棉和草棉。

在另一优选例中，所述的棉纤维为棉属(Gossypium)植物的种籽纤维。

在另一优选例中，所述的GhPRE1基因具有促进棉纤维伸长的功能。

在另一优选例中，所述的细胞选自下组：纤维细胞、胚轴细胞、根细胞、种子细胞、和叶柄细胞。

在本发明的第二方面，提供了一种调控棉属植物的棉纤维长度性状的方法，包括步骤：

(a)将外源的构建物导入植物细胞，其中所述的构建物含有外源的GhPRE1基因序列、促进GhPRE1基因表达的外源核苷酸序列、或抑制GhPRE1基因表达的外源核苷酸序列，从而获得导入外源构建物的植物细胞；

(b)将上一步骤获得的所述导入外源构建物的植物细胞，再生成植株：和

(c)任选地对所述再生的植株进行性状鉴定，从而获得性状改良的植物。

在另一优选例中，所述外源的GhPRE1基因序列还包含与ORF序列操作性连接的启动子和/或终止子。

在另一优选例中，所述的启动子选自下组：组成型启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子、和强启动子。

在另一优选例中，所述的组成性启动子包括35S启动子。

在另一优选例中，所述的组织特异性启动子包括RDL1启动子。

在另一优选例中，所述的终止子选自下组：NOS终止子。

在另一优选例中，所述的外源核苷酸序列包括干扰所述GhPRE1基因表达的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的外源核苷酸序列包括RNA干扰序列。

在本发明的第三方面，提供了一种促进棉属植物的棉纤维伸长的方法，所述方法包括以下步骤：在所述棉属植物中，促进GhPRE1基因的表达或促进GhPRE1蛋白的活性。

在另一优选例中，所述的表达为棉纤维组织中的表达。

在另一优选例中，所述的表达为棉纤维组织发育期的表达。

在另一优选例中，所述的棉纤维组织发育期的表达为棉纤维发育第1-30天，较佳地2-20天，更佳地3-12天的表达。

在另一优选例中，所述方法包括给予植物GhPRE1基因或其编码的多肽的促进剂。

在另一优选例中，所述方法包括向植物中导入外源的GhPRE1基因。

在另一优选例中，所述方法包括步骤：

(i)提供一植物或植物细胞；和

(ii)将GhPRE1基因序列导入所述植物或植物细胞，从而获得转基因的植物或植物细胞。

在另一优选例中，所述方法包括步骤：

(a)提供携带GhPRE1基因序列的表达载体的农杆菌；

(b)将植物细胞或组织或器官与步骤(a)中的农杆菌接触，从而使GhPRE1的基因序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

(c)选择已转入GhPRE1基因序列的植物细胞或组织或器官；和

(d)将步骤(c)中的植物细胞或组织或器官再生为植株。

在本发明的第四方面，提供了一种促进棉属植物细胞伸长的方法，所述方法包括以下步骤：促进所述细胞中GhPRE1基因的表达或促进GhPRE1蛋白的活性。

在另一优选例中，所述方法包括给予细胞GhPRE1基因或其编码的多肽的促进剂。

在另一优选例中，所述方法包括向细胞中导入外源的GhPRE1基因。

在本发明的第五方面，提供了一种GhPRE1基因或其编码蛋白的调控剂的用途，用于选自下组的用途：

(a)用于调控棉属植物的棉纤维长度性状，或用于制备调控棉纤维长度的试剂或组合物；

(b)用于调控棉属植物的棉纤维的断裂比强度，或用于制备调控棉纤维断裂比强度的试剂或组合物；

(c)用于调控棉属植物的棉纤维的马克隆值，或用于制备调控棉纤维马克隆值的试剂或组合物；

(d)用于调控棉属植物的棉纤维的纺纱均匀性，或用于制备调控棉纤维纺纱均匀性的试剂或组合物。

在另一优选例中，所述的组合物包括农用组合物。

在另一优选例中，所述的调控剂包括促进剂、抑制剂。

在另一优选例中，所述的调控剂为促进剂，并且所述的调控是指促进所述棉纤维伸长。

在另一优选例中，所述的调控剂为抑制剂，并且所述的调控是指抑制所述棉纤维伸长。

在另一优选例中，所述的调控剂包括小分子化合物、或核酸类物质。

在另一优选例中，所述的核酸类物质选自下组：miRNA、shRNA、siRNA、或其组合。

在本发明的第六方面，提供了一种增强棉属植物棉纤维的断裂比强度的方法，所述方法包括以下步骤：在所述棉属植物中，促进GhPRE1基因的表达或促进GhPRE1蛋白的活性。

在本发明的第七方面，提供了一种改善棉属植物棉纤维的马克隆值的方法，所述方法包括以下步骤：在所述棉属植物中，促进GhPRE1基因的表达或促进GhPRE1蛋白的活性。

在本发明的第八方面，提供了一种提高棉属植物棉纤维的纺纱均匀性的方法，所述方法包括以下步骤：在所述棉属植物中，促进GhPRE1基因的表达或促进GhPRE1蛋白的活性。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了转基因载体35S::GhPRE1、35S::dsGhPRE1、RDL1::GhPRE1的构建。其中，图1A显示了转基因所用商业化载体pCAMBIA2301空载体图谱；图1B显示了转基因所用商业化载体pBI 121空载体图谱；1C显示了载体35S::GhPRE1、RDL1::GhPRE1、35S::dsGhPRE1、35S::GhPRE1-VENUS的构建示意图。

图2显示了GhPRE1基因表达特征和蛋白亚定位。其中，图2A显示了GhPRE1基因在棉纤维不同发育时期的表达特征；图2B显示了GhPRE1基因在棉花不同组织中的表达量；图2C显示了C末端融合GFP的GhPRE1-GFP蛋白在烟草表皮细胞中的亚细胞定位。

图3显示了35S::GhPRE1转基因拟南芥表型分析。其中，图3A显示了35S::GhPRE1转基因植物萌发后5天的小苗表现出下胚轴和根等部位显著伸长的特征，L2、L15和L16为三个独立的转基因株系；图3B显示了35S::GhPRE1转基因植物中GhPRE1表达量的检测；图3C显示了生长3周的35S::GhPRE1和35S::GhPRE1-VENUS转基因拟南芥叶柄表现出增长的表型。

图4显示了RDL1::GhPRE1，35S::dsGhPRE1转基因棉花的PCR分子鉴定。其中，图4A显示了RDL1::GhPRE1转基因棉花阳性鉴定结果；图4B显示了35S::dsGhPRE1转基因棉花阳性鉴定结果。其中的PCR鉴定采用NPT II特异的引物，载体泳道(正对照)为以pCAMBIA2301载体为模板扩增的产物。

图5显示了RDL1::GhPRE1转基因棉花的纤维长度分析和qRT-PCR分子鉴定。其中，图5A显示了RDL1::GhPRE1转基因棉花表现出成熟棉纤维增长的表型；图5B显示了RDL1::GhPRE1转基因棉花纤维长度统计结果；图5C显示了qRT-PCR检测RDL1::GhPRE1转基因棉花开花后6天纤维细胞中GhPRE1的表达量。

图6显示了35S::dsGhPRE1转基因棉花的纤维长度分析和qRT-PCR分子鉴定。其中，图6A显示了35S::dsGhPRE1转基因棉花表现出成熟棉纤维增长的表型；图6B显示了35S::dsGhPRE1转基因棉花纤维长度统计结果；图6C显示了qRT-PCR检测35S::dsGhPRE1转基因棉花开花后6天纤维细胞中GhPRE1的表达量。

图7显示了GhACY转基因棉花的分子鉴定和纤维表型分析。其中图A显示了GhACY基因在开花后3-12天的纤维细胞中高表达；图B显示了35S::dsGhACY转基因棉花幼叶中GhACY的表达量分析；图C显示了35S::dsGhACY转基因棉花纤维长度有轻微变短的表型；图D显示了35S::GhACY转基因棉花中GhACY的表达分析；图E显示了35S::GhACY转基因棉花纤维长度无明显变化。

图8显示了大田种植的RDL1::GhPRE1转基因棉花的纤维品质检测结果。从中可以看出2014年和2015年种植的RDL1::GhPRE1转基因棉花纤维长度、断裂比强度、马克隆值和纺纱均匀性等品质稳定地优于对照组的品质，说明利用GhPRE1改良的棉花在农业生产和棉纺工业中具有重要的应用前景。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入地研究，首次发现了一种能够调控棉纤维发育的GhPRE1基因，以及GhPRE1基因在改良棉纤维长度、断裂比强度、马克隆值、纺纱均匀性等纤维品质中的应用。实验表明：采用棉纤维细胞特异的RDL1启动子增强GhPRE1基因的表达，可以改良棉纤维长度性状，断裂比强度、马克隆值和纺纱均匀性等品质，获得了纤维品质显著改良的转基因棉花。在此基础上完成了本发明。

棉花

棉花是锦葵科棉属植物，是一种重要的经济作物，其种子纤维为市场提供大量天然纺织原料。植株灌木状，在热带地区栽培可长到6米高，一般为1到2米。花朵乳白色，开花后不久转成深红色然后凋谢，留下绿色小型的蒴果，称为棉铃。棉铃内有棉籽，棉籽上的茸毛从棉籽表皮长出，塞满棉铃内部。棉铃成熟时裂开，露出柔软的棉纤维。常见棉纤维白色至白中带黄，长约2至4厘米，含纤维素约87～90％。

陆地棉(Gossypium hirsutum)为四倍体栽培棉种，又名：大陆棉、美洲棉、墨西哥棉等，是世界上四大棉花栽培种中重要的品种，在中国产棉区普遍栽培。叶较大，3-5裂，裂刻长度不及叶片长度的1/2，有苞叶外蜜腺，花冠较大，乳白色，通常无红心，铃大，卵圆形，铃面腺体少，较光滑，种子中等大小，一般为毛籽，纤维长度约为21-32mm，纤维细度为4500-7000m/g，纤维直径为13.5-19μm，单纤维强力为3.5-4.5g。

GhPRE1基因

如本文所用，术语“GhPRE1基因”、“棉纤维长度相关基因”、“本发明基因”可以互换使用，都是指本发明的具有调控棉纤维长度功能的基因。

如本文所用，术语“特异性表达”是指目的基因在植物中特定的时间和/或特定的组织的表达。

如本文所用，“外源的”或“异源的”是指不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系。例如，如果启动子与目的基因序列的组合通常不是天然存在的，则启动子对于该目的基因来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源的”。

本发明利用数字基因表达谱分析技术和RT-PCR分析从陆地棉中筛选获得一个特异地在棉纤维伸长期高表达的基因GhPRE1，并在拟南芥中异源表达GhPRE1证明其确实具有促进细胞伸长生长的功能。在陆地棉中，GhPRE1特异地在开花后6～9天快速伸长的棉纤维中高表达。上述结果提示，GhPRE1可能特化为纤维细胞生长的调控因子，在棉纤维细胞发育早期发挥转录调控作用，正向调节棉纤维的伸长生长。

为了进一步深入研究GhPRE1的生物学功能，为高产优质棉花品种的培育提供分子依据，本发明进行了转基因功能分析，构建了GhPRE1过表达和RNA干扰(RNAi)的载体进行了棉花转化，并成功获取各个载体的多个转基因株系。对种植于温室和大田转基因植物进行分析，发现过表达GhPRE1的转基因植株，表现出纤维长度显著增加的表型，而抑制GhPRE1表达的转基因植株，表现出纤维长度显著变短的表型。这一结果说明转录因子GhPRE1是棉纤维细胞发育的重要调控因子，在促进棉纤维伸长和纤维品质改良等方面具有巨大潜力和应用价值。

本发明的GhPRE1基因可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。基因组DNA可以是与SEQ ID NO.:3所示的序列相同或者是简并的变异体。本发明的DNA可以是单链的或是双链的，DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO.:1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。

如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO.:2的蛋白质，但与SEQ ID NO.:1所示的编码区序列或SEQ ID NO.:3所示的基因组序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO.:2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指:(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上,更好是95％以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO.:2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码棉纤维相关多肽的多聚核苷酸。

GhPRE1基因编码的多肽

如本文所用，术语“棉纤维长度相关多肽”、“本发明多肽”、“GhPRE1基因编码的多肽”、“GhPRE1基因编码的蛋白”、“GhPRE1多肽”可以互换使用，都是指本发明的、来源于棉属植物的、具有调控棉纤维长度功能的多肽。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括棉纤维长度相关多肽的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然棉纤维长度相关多肽相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“棉纤维长度相关多肽”指具有棉纤维长度相关多肽活性的SEQID NO.:2序列的多肽。该术语还包括具有与棉纤维长度相关多肽相同功能的、SEQ ID NO.:2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括棉纤维长度相关多肽的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与棉纤维长度相关多肽的DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗棉纤维长度相关多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含棉纤维长度相关多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了棉纤维长度相关多肽的可溶性片段。通常，该片段具有棉纤维长度相关多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

本发明还提供棉纤维长度相关多肽或多肽的类似物。这些类似物与天然棉纤维长度相关多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“棉纤维长度相关多肽保守性变异多肽”指与SEQ ID NO.:2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。在所述蛋白中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能，在C末端和/或\末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

重组技术和植物改良

本发明棉纤维长度相关基因的全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或棉纤维长度相关多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的棉纤维长度相关多肽。一般来说有以下步骤：

(1)用本发明的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明多核苷酸和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞(如农作物和林业植物的细胞)。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得棉纤维长度变化的植物。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超滤处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

重组的棉纤维长度相关多肽有多方面的用途。例如用于筛选具有调控棉纤维长度功能的化合物、多肽或其它配体。用表达的重组棉纤维长度相关多肽筛选多肽库可用于寻找有价值的能抑制、或促进棉纤维长度相关多肽功能的多肽分子。

另一方面，本发明还包括对棉纤维长度相关多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段、或嵌合抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的棉纤维长度相关多肽基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。本发明的各类抗体可以利用棉纤维长度相关基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与棉纤维长度相关基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。抗棉纤维长度相关多肽的抗体可用于检测样品中的棉纤维长度相关多肽。

本发明还涉及定量和定位检测棉纤维长度相关多肽水平的测试方法。这些试验是本领域所熟知的。试验中所检测的棉纤维长度相关多肽水平，可用于解释棉纤维长度相关多肽调控棉纤维长度的功能。

一种检测样品中是否存在棉纤维长度相关多肽的方法是利用棉纤维长度相关多肽的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与棉纤维长度相关多肽特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在棉纤维长度相关多肽。

本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析。用棉纤维长度相关多肽特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测棉纤维长度相关多肽的转录产物。

本发明的主要优点包括：

(a)提供了棉纤维长度相关基因及其所编码的多肽。

(b)本发明的GhPRE1基因可以促进纤维细胞伸长。

(c)提供了一种有针对性地调控棉纤维长度的方法。

(d)提供了一种改进棉纤维断裂比强度的方法。

(e)提供了一种改进棉纤维马克隆值的方法。

(f)提供了一种改进棉纤维纺纱均匀性的方法。

(g)提供的GhPRE1基因和方法同样适用于其它植物的遗传改良。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1

GhPRE1cDNA的分离

棉花RNA提取采用冷酚法。采集陆地棉R15(“晋棉R15”，购自山西省农科院棉花研究所)开花后6天的胚珠表面的纤维，在液氮中磨成粉末，转移到50mL离心管中，加入8mL提取缓冲液(1M Tris·HCl，50mM EDTA，1％SDS，pH9.0)和等体积的水饱和酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，震荡混匀，冰上放置1h，每隔10min混匀一次。4℃，13000g离心20min。重复酚：氯仿：异戊醇抽提2～4次，最后用氯仿：异戊醇(24：1)抽提一次。取上清夜，加入1/2体积的高盐溶液(0.8M柠檬酸钠，1.2M NaCl)和1/2体积异丙醇，混匀，-70℃放置1h。4℃，13000g离心20min，去上清液，沉淀溶于1mL DEPC处理水，4℃，13000g离心10min。上清液转入1.5mL离心管，加入1/3体积的8M LiCl和体积的NaAC，-20℃放置过夜。4℃，13000g离心20min。去上清液，用1mL 70％乙醇清洗沉淀2次，室温吹20min，溶于100～200μL DEPC处理水。

根据GhPRE1cDNA的序列，合成专一引物(含酶切位点和保护碱基)：

GhPRE1-BamHI-F	5＇-CGGGATCCATGTCAAGCAGAAGGTGGAG-3＇	SEQ ID NO.:4
			GhPRE1-KpnI-R	5＇-GGGGTACCTTAATTAAATAAGCTTCGGA-3＇	SEQ ID NO.:5

以开花后6天的纤维总RNA的反转录产物为模板做PCR反应，反应条件：94℃预变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物电泳纯化、回收后亚克隆到商业化载体pMD18-T上后经测序确认序列正确。

实施例2

35S::GhPRE1、RDL1::GhPRE1和35S::dsGhPRE1等表达载体的构建和农杆菌转化

a.35S::GhPRE1和RDL1::GhPRE1植物表达载体构建

首先对pCAMBIA-2301植物表达载体进行改造，然后装入目标基因，具体步骤如下：

(1)在酶切位点HindIII-PstI和SacI-EcoRI间分别引入35S启动子和NOS终止子构建p35S::2301中间载体。

(2)在酶切位点HindIII-PstI和SacI-EcoRI间分别引入pRDL1启动子和NOS终止子构建pRDL1::2301中间载体。

(3)设计GhPRE1全长cDNA的PCR扩增引物，同时分别引入相应酶切位点用PrimeSTAR HS高保真聚合酶扩增目标片段(见实施例1)。

(4)核对读码框后，GhPRE1片段经BamHII和KpnI双酶切，连到p35S::2301载体的相应位点中，形成35S::GhPRE1植物表达载体，并经测序验证序列正确无误。

(5)核对读码框后，GhPRE1片段经BamHII和KpnI双酶切，连到pRDL1::2301载体的相应位点中，形成RDL1::GhPRE1植物表达载体，并经测序验证序列正确无误。

b.35S::dsGhPRE1表达载体构建

高保真酶扩增选GhPRE1片段，正向片段引入SacI和NotI酶切位点，反向片段引入SmaI和XbaI酶切位点，正向及反向序列分别克隆至含RTM内含子的PBSK载体上RTM序列两端，用SmaI和SacI酶切后替换35S::NOS/p121上的GUS基因，形成35S::dsGhPRE1植物表达载体，并经测序验证序列正确无误。RNA干扰的引物序列：

c.35S::GhPRE1-VENUS表达载体构建

(1)设计GhPRE1全长cDNA的PCR扩增引物，反向引物去除终止密码子；同时分别引入相应酶切位点用PrimeSTAR HS高保真聚合酶扩增目标片段。PCR引物序列如下：

GhPRE1-BamHI-F	5＇-CGGGATCCATGTCAAGCAGAAGGTGGAG-3＇	SEQ ID NO.:10
			GhPRE1-SmaI-R	5＇-TCCCCCGGGATTAAATAAGCTTCGGATGATG-3＇	SEQ ID NO.:11

(2)核对读码框后，GhPRE1片段经BamHII和SmaI双酶切，连到p35S::2301载体的相应位点中，形成35S::GhPRE1植物表达载体。

(3)设计荧光蛋白VENUS全长cDNA的PCR扩增引物，同时分别引入相应酶切位点用PrimeSTAR HS高保真聚合酶扩增目标片段。PCR引物序列如下：

(4)荧光蛋白VENUS PCR产物经SmaI和KpnI双酶切后连接到35S::GhPRE1植物表达载体相应的酶切位点中，形成35S::GhPRE1-VENUS植物表达载体。

d.根癌农杆菌转化

根癌农杆菌的转化采用冻融法。一个单菌落LBA4404或GV3101(Invitrogen)，3mLLB培养基(25μg/mL利福霉素Rif和50μg/mL卡那霉素Kan或庆大霉素Gen)，28℃，220rpm，过夜培养。2mL菌液，50mL LB培养基(25μg/mL Rif和50μg/mL Gen)，28℃，220rpm，培养到OD₆₀₀＝0.5(约6h)。在冰上放置30min，4℃，5000g离心5min。重悬于10mL 0.15M NaCl。4℃，5000g离心5min。重悬于1mL 20mM CaCl₂，50μL/管分装，液氮速冻，-70℃保存感受态细胞。混合含目的基因双元载体和50μL/管感受态细胞，在冰上放置30分钟，液氮速冻1min。在37℃水浴中5min使菌液融化，加1mL LB培养基，28℃，220rpm，培养2～4h。取50～100μL涂LB培养基平板(25μg/mL Rif、50μg/mL Gen和50μg/mL卡那霉素Kan或潮霉素Hyg)，2天后挑单菌落为模板，并以目标基因引物进行PCR鉴定。将PCR鉴定为阳性的单克隆进行扩摇，进行下一步的植物转化。

实施例3

植物转化以及转基因后代的筛选

a.棉花的转基因

含RDL1::GhPRE1和35S::dsGhPRE1载体质粒的农杆菌分别于添加卡那霉素50mg/L、利福平100mg/L、链霉素300mg/L的YEB细菌培养基上培养2～3天后，挑单菌落接种于含相同抗生素的YEB液体培养基中，于28℃、200rpm/min的摇床上悬浮培养过夜。菌液于4000rpm/min离心10min，沉淀用含葡萄糖30g/L和乙酰丁香酮100μmol/L的1/2MS液体培养基重新悬浮，调OD₆₀₀值为0.4～0.6左右，作为感染液备用。

棉花R15种子(晋棉R15品种)经常规消毒后置于1/2MS0(1/2MS盐+5g/L葡萄糖+7g/L琼脂粉,pH 6.0)培养基，在黑暗中萌发培养，5～7天后将无菌苗下胚轴切成1.0cm左右的切段作为转化外植体备用。

外植体在农杆菌菌液中浸泡感染15～20min，转移到共培养培养基MSB1(MS盐+B5有机+30g/L葡萄糖+0.1mg/L KT+0.1mg/L 2,4-D+2.2g/L Gelrite,pH 6.0)上，22℃暗培养2天后，将外植体转移到培养基MSB2(MSB1+500mg/L头孢霉素+80mg/L卡那霉素)上进行愈伤组织的诱导。外植体经过抗性愈伤组织的诱导、愈伤组织的增殖及胚性愈伤的诱导(培养基MSB3：MS盐+B5有机+30g/L葡萄糖+2.5g/L Gelrite,pH 6.0)、体细胞胚胎发生(培养基MSB4：MS盐+B5有机+30g/L葡萄糖+1.0g/L天门冬酰氨胺+2.0g/L谷氨酰胺+3.0g/LGelrite,pH 6.0；MS盐中KNO₃加倍，去除NH₄NO₃)，再生抗性试管苗。待试管苗长到3-4片真叶时，移栽到花盆中，放入人工气候室生长。

通过遗传转化共获得5个不同的T0代RDL1::GhPRE1转基因棉花阳性株系，以及7个不同的T0代35S::dsGhPRE1转基因棉花阳性株系。后期经RT-PCR表达量检测，筛选获得2个RDL1::GhPRE1转基因棉花株系和3个35S::dsGhPRE1转基因棉花株系用于后续分析。

b.拟南芥的转基因

拟南芥植物的转化采用花芽浸泡法(floral dip)(Clough和Bent，1998，PlantJ.16，735-743)。含35S::GhPRE1、35S::GhPRE1-VENUS载体质粒的农杆菌培养方法同上，菌液于4000rpm/min离心10min后，菌体重悬于500mL含0.02％Silwet L-77的5％蔗糖溶液中。植株地上部分在菌液中浸泡5s，平放于塑料盆内，保湿，避光，16～24h。T0代种子在4℃春化2～4天，用20％漂水处理15min，无菌水清洗3～4遍。悬于0.5％的琼脂糖(55℃)，铺在0.6％琼脂的LB培养基(50μg/mL Kan或Hyg)，22℃，连续光照，约一周后，将绿色抗性苗移栽到营养土(泥炭：蛭石：珍珠岩1：1：1)中生长。

收取T1代种子在含卡那霉素的抗性板上萌发，筛选阳性苗并移栽到营养土中生长；收取T2代在含卡那霉素的抗性板上萌发，观察分离比，筛选转基因纯合株系。选取纯合株系的种子在垂直板上萌发，发现阳性植株的下胚轴和主根等部位具有显著伸长的表型(图3A)。选取有伸长表型的株系，提取RNA并反转录检测目标基因GhPRE1的表达量(见实施例4)，发现GhPRE1的含量在阳性拟南芥苗中显著积累(图3B)。将阳性苗移栽到营养土中生长，3周后发现拟南芥叶柄等部位和对照相比也有显著伸长的表型(图3C)。

实施例4

转基因植物的分子生物学鉴定

a.PCR鉴定

DNA提取采用冷酚法。2g材料，在液氮中磨成粉末，转移到50mL离心管中，加入8mL提取缓冲液(1M Tris-HCl，50mM EDTA，1％SDS，pH9.0)和等体积的水饱和酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，震荡混匀，冰上放置1h，每隔10min混匀一次。4℃，13000g离心20min。重复酚：氯仿：异戊醇抽提2～4次，最后用氯仿：异戊醇(24：1)抽提一次。取上清夜，加入1/2体积的高盐溶液(0.8M柠檬酸钠，1.2M NaCl)和1/2体积异丙醇，混匀，-70℃放置1h。4℃，13000g离心20min，去上清液，用1mL 70％乙醇清洗沉淀2次，室温吹20min，沉淀溶于1mL无菌水。4℃，13000g离心10min。取上清液，加5～10μL RNase(10mg/mL)，37℃消化30min。

PCR鉴定采用NPT II特异的引物：

NPTII-F：	5＇-GGAGCAAGGTGAGATGACAGGAGATC-3＇	SEQ ID NO.:14
			NPTII-R：	5＇-GATTGTCTGTTGTGCCCAGTCATAGC-3＇	SEQ ID NO.:15

其反应条件为：94℃预变性5min；然后94℃预变性30sec，56℃复性30sec，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min。扩增片段大小为680bp。

RDL1::GhPRE1和35S::dsGhPRE1转基因棉花的PCR分子鉴定结果见图4。

b.荧光定量RT-PCR分析

a.RT-PCR分析

1μg的总RNA，经Oligo(dT)引物反转录，20μL反应液。42℃反应30分钟，反转录第一链cDNA，放置过夜。取0.5μL的反转录产物，25μL PCR反应体系检测目的基因表达。PCR引物为GhPRE1特异的引物：

GhPRE1-qRT-F：	5＇-GAAACCTCCTTCTGTATTCCTCC-3＇	SEQ ID NO.:16
			GhPRE1-qRT-R：	5＇-AAGGGAAGCATAGTGTCTCAAAAT-3＇	SEQ ID NO.:17

以棉花基因Histone3(AF024716)作为内标，校正RT-PCR反应的模板量。PCR反应条件为：94℃预变性5分钟；然后94℃变性30秒钟，56℃复性30秒钟，72℃延伸1分钟，共30个循环；最后72℃延伸10分钟。

b.荧光定量RT-PCR分析

定量RT-PCR检测采用嵌合荧光法(

Premix Ex Taq^TM II(Perfect RealTime)，TaKaRa，DRR041A)。反应体系如下：

以棉花基因Histone3(AF024716)作为内标。数据分析采用Realplex v2.0(购自德国汉堡Eppendorf，NSW)。实验重复三次，取各组数据的平均值和方差，绘制图表。

通过荧光定量PCR分析了GhPRE1在棉花根、茎、叶和胚珠等不同组织的表达特征，发现该基因在棉花胚珠中有较高的表达量(图2B)；进一步分析了不同发育时期棉纤维细胞中GhPRE1的表达水平，发现其在开花后3-12天的纤维细胞中高表达，特别是在开花后6天左右的纤维细胞中表达量最高(图2A)。GhPRE1在伸长期的纤维细胞中特异高表达，暗示其在棉纤维的伸长发育过程中行使重要功能。亚细胞定位显示GhPRE1-VENUS融合蛋白定位于细胞核和细胞质(图2C)。

实施例5

转基因棉花的性状分析

35S::dsGhPRE1、RDL1::GhPRE1转基因棉花和野生型R15在上海和海南农场种植，常规田间管理。在棉花成熟吐絮期，分别单株收取成熟棉桃，尽量保持收取部位的一致性，随机取一定数量的种子将其纤维梳平并测量其纤维长度，进行统计分析。

结果表明，RDL1::GhPRE1转基因棉花纤维长度显著增加(图5A,B)，转基因棉花纤维平均长度达到32mm，部分纤维长度达到34mm以上(对照受体棉纤维长度为28mm左右；基因表达检测显示在T2代转基因棉纤维中GhPRE1的含量显著增加(图5C)。而35S::dsGhPRE1抑制GhPRE1表达的转基因植株的基因表达检测显示棉纤维中GhPRE1的含量被显著下调(图6C)，纤维长度表现出显著变短的表型(图6A,B)。

将RDL1::GhPRE1转基因棉花纤维送往中国农业科学院棉花研究所的“农业部棉花品质监督检验测试中心”进行进一步的品质检测。检测结果如图8所示，RDL1::GhPRE1转基因棉花纤维长度显著增加。转基因棉花上半部平均长度为32.1-33.9mm,对照受体棉纤维长度为29.1-29.8mm。并且，RDL1::GhPRE1转基因棉花纤维的断裂比强度显著优于对照；马克隆值处于国家B2级标准且优于对照；纺纱一致性系数显著高于对照，表明RDL1::GhPRE1转基因棉花纤维的成纱更强力，可纺性更好。

图8的棉花纤维检测结果报告书由中国农业科学院棉花研究所的“农业部棉花品质监督检验测试中心”出具。Ox-2-1/2或Ox-7-2表示RDL1::GhPRE1同一转基因株系在不同大田区域的重复，WT表示野生型对照。“*”表示RDL1::GhPRE1转基因棉花的纤维品质显著优于对照组(WT)。

依据中华人民共和国农业部第2244号公告，纤维品质各个指标的定义如下：

(1)上半部平均长度(Len)是棉纤维长度分布中纤维平均长度以上的所有纤维的长度平均值，单位毫米。

(2)整齐度指数(Unf)是平均长度和上半部分平均长度的比值。

(3)断裂比强度(Str)是棉花纤维试样受到拉伸直至断裂时，所显示出来每单位线密度所受的力，单位cN/tex。国家标准规定断裂比强度分五档：S1代表很强,比强度大于等于31cN/tex；S2代表强,29.0～30.9cN/tex；S3代表中等，26.0～28.9cN/tex；S4代表差，24.0～25.9cN/tex；S5代表很差，比强度小于24.0cN/tex。

(4)马克隆值(Mic)是棉花纤维细度与成熟度的综合指标。马克隆值越大，表明棉花纤维越粗和成熟度越好，反之，棉花纤维越细和成熟度较差。按国家棉花标准马克隆值分为：A级范围为3.7-4.2；B1级范围为3.5-3.6；B2级范围为4.3-4.9；C1级范围为3.4及以下；C2级范围为5.0及以上。其中，A级最优，B1、B2次之，C1、C2较差。

(5)伸长率(Elong)是棉花纤维试样受到拉伸直至断裂时，纤维的绝对伸长长度与纤维正常伸展长度的比值。表征棉纤维抵抗拉伸的能力。

(6)反射率(Rd)是棉花对光的反射程度。反射率高，表明棉花纤维成熟较好，色泽好。

(7)黄度(+b)是棉花白度差别的物理量。一般来说，黄度低，品级高。

(8)纺纱一致性系数(SCI)是大容量纤维测试仪(high volume instrument,HVI)提供一个多重回归经验性公式，它能反映纤维的可纺性和估算成纱强力。公式中共涉及测试项目中纤维断裂比强度、马克隆值、上半部平均长度、长度整齐度、反射率、黄色深度6个参数，其中前4个为主要参数，影响较大。一般计算公式如下：

SCI＝-414.67+2.9×Str-9.32×Mic+49.17×Len+4.74×Unf+0.65×Rd+0.36×(+b)

一般情况下，SCI值越大，成纱强力和可纺性越好。

实施例6

转基因拟南芥的性状分析

35S::GhPRE1和35S::GhPRE1-VENUS转基因载体通过农杆菌介导的花芽浸泡法转入拟南芥，通过抗性筛选和RT-PCR的方法得到纯合的转基因阳性植株。取35S::GhPRE1和35S::GhPRE1-VENUS转基因种子和同时收取的野生型种子在MS培养基上萌发，观察植物表型。

结果表明，35S::GhPRE1转基因拟南芥幼苗下胚轴和主根等部位都有显著增长的表型，并且GhPRE1表达量越高，增长的表型越明显(图3A,B)。对萌发后3周的小苗进行观察，发现GhPRE1高表达的拟南芥叶柄较对照组长得多(图3C)。35S::GhPRE1-VENUS转基因拟南芥与35S::GhPRE1转基因拟南芥具有相同的表型变化(图3C),说明棉花GhPRE1在异种植物中的高表达也能促进植物伸长生长。

对比例1

棉纤维发育是一个复杂的多基因控制的动态过程。至今已有一些棉纤维功能基因的研究报道，大多数转基因棉花的结果是可以抑制棉纤维伸长，但通过转基因技术成功提高纤维品质的报道并不多。E6基因是最早分离得到的棉纤维高表达基因，通过RNAi技术下调E6基因表达(仅为野生型水平的2-40％)，却未对相应的转基因植株及其纤维发育造成影响(John ME,and Keller G.(1996).Structural characterization of genescorresponding to cotton fiber mRNA,E6:reduced E6protein in transgenic plantsby antisense gene.Plant Molecular Biology,1996,30(2):297-306)。

申请人分离了若干棉纤维特异高表达的基因，如GaMYB2和GaHOX1，功能分析表明它们与拟南芥表皮毛发育的调控因子GL1和GL2具有一致的功能(Wang S,Wang JW,etal.2004.Control of plant trichome development by a cotton fiber MYBgene.Plant Cell 16(9):2323-2334.和Guan XY,Li QJ,et al.(2008).The HD-Zip IVgene GaHOX1from cotton is a functional homologue of the ArabidopsisGLABRA2.Physiologia Plantarum 134:174-182.)，可能对棉纤维的起始和伸长具有重要功能。但转基因实验结果表明，抑制这些基因的表达可引起棉纤维变短，但是过表达这些基因并不能使纤维增长。申请人近期分离了一个新的棉纤维高表达的基因GhACY，该基因在开花后3-12天快速伸长的纤维细胞中高表达(图7A)。通过农杆菌转化获得了GhACY抑制与高表达的转基因棉花(方法同实施例3)，对T2转基因棉花的纤维进行长度分析，发现GhACY表达受抑制的棉纤长度有轻微变短的表型(图7B，C)；过表达GhACY的转基因棉花纤维长度则并无显著变化(图7D，E)。

实施例与对比例1的比较说明本发明提供的GhPRE1基因及其转基因构建方式可特异地实现对植物生长发育的调控，以获得在育种上有利用价值的材料。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (13)

1.一种GhPRE1基因或其编码蛋白的用途，其特征在于，所述的GhPRE1基因或其编码蛋白用于选自下组的用途：

(d)用于增强棉属植物棉纤维的断裂比强度；

(e)用于改善棉属植物棉纤维的马克隆值；

(f)用于提高棉属植物棉纤维的纺纱均匀性；

并且，所述GhPRE1基因的编码蛋白如SEQ ID NO:2所示。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的GhPRE1基因或其编码蛋白还用于选自下组的用途：

(a)用于制备促进棉属植物棉纤维伸长的试剂或组合物；

(b)用于改善棉属植物的棉纤维长度性状；

(c)用于增加棉属植物棉纤维的长度。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的“改善棉属植物的棉纤维长度性状”或所述的“增加棉属植物棉纤维的长度”指：导入外源的所述“GhPRE1基因”所获得的转基因棉属植物的棉纤维长度L1与未导入外源的所述“GhPRE1基因”的同一种类的棉属植物的棉纤维长度L0之比值(L1/L0)为105％-120％。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的GhPRE1基因的CDS序列如SEQ ID NO.:1所示。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的GhPRE1基因的基因组序列如SEQ IDNO.:3所示。

6.一种提高棉属植物棉纤维的纺纱均匀性的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：向所述棉属植物中，导入外源的GhPRE1基因，从而促进GhPRE1基因的表达或促进GhPRE1蛋白的活性；

并且，所述GhPRE1基因的编码蛋白如SEQ ID NO:2所示。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的表达为棉纤维组织中的表达。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的表达为棉纤维组织发育期的表达。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的棉纤维组织发育期的表达为棉纤维发育第1-30天的表达。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的棉纤维组织发育期的表达为棉纤维发育第2-20天的表达。

11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的棉纤维组织发育期的表达为棉纤维发育第3-12天的表达。

12.一种增强棉属植物棉纤维的断裂比强度的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：向所述棉属植物中，导入外源的GhPRE1基因，从而促进GhPRE1基因的表达或促进GhPRE1蛋白的活性；

并且，所述GhPRE1基因的编码蛋白如SEQ ID NO:2所示。

13.一种改善棉属植物棉纤维的马克隆值的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：向所述棉属植物中，导入外源的GhPRE1基因，从而促进GhPRE1基因的表达或促进GhPRE1蛋白的活性；

并且，所述GhPRE1基因的编码蛋白如SEQ ID NO:2所示。

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