CN109852626B - 一种GhOR基因及其编码的蛋白、表达载体、转化植株和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种GhOR基因及其编码的蛋白、表达载体、转化植株和应用，涉及棉花育种技术领域，所述GhOR基因具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。将本发明提供的GhOR基因构建表达载体，再将表达载体转入棉花中，提高了棉花纤维中类胡萝卜素的含量，使得棉花成熟纤维长度变长、强度增加和马克隆值下降，改善了棉花纤维品质。

Description

一种GhOR基因及其编码的蛋白、表达载体、转化植株和应用

技术领域

本发明涉及棉花育种技术领域，具体涉及一种GhOR基因及其编码的蛋白、表达载体、转化植株和应用。

背景技术

类胡萝卜素在动植物中均具有重要的生物功能，尤其是营养价值高及抗氧化能力强等，因而在多种作物中展开了通过基因工程技术提高类胡萝卜素水平的研究。前人在一个花椰菜的橙色突变体中分离得到一种显性突变基因OR。相对于野生型Boor基因，橙色花椰菜突变体中插入了一个转座子元件，进而该基因会获得多种转录产物。在马铃薯块茎中超量表达OR基因后β-胡萝卜素大量积累导致块茎呈现明显的橙色。大量的研究证实OR蛋白是类胡萝卜素合成途径关键限速酶PSY(Phytoene Synthase,八氢番茄红素合成酶)翻译后修饰的主要调控蛋白，可通过调节PSY蛋白水平及酶活影响类胡萝卜素产量；另一方面，OR蛋白可通过调控色质体及色素细胞形成来影响类胡萝卜素的积累。

棉花是最重要的纤维作物，前人研究表明，棉花纤维在发育早期有较低水平的类胡萝卜素，但纤维发育后期类胡萝卜素含量极低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种GhOR基因及其编码的蛋白、表达载体、转化植株和应用，将本发明提供的GhOR基因构建表达载体，再将表达载体转入棉花中，提高了棉花纤维的类胡萝卜素含量，使得成熟纤维长度变长、强度增加和马克隆值下降，改善了棉花纤维品质。

本发明提供了一种GhOR基因，所述GhOR基因具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

本发明还提供了上述技术方案所述的GhOR基因编码的蛋白，所述蛋白具有SEQIDNo.6所示的氨基酸序列。

本发明还提供了一种表达载体，将上述技术方案所述的GhOR基因插入到载体p5-SCFP中得到。

优选的，所述载体p5-SCFP的构建方法包括：将SCFP启动子替换p5载体中35S启动子后得到。

优选的，所述GhOR基因经BamHⅠ和KpnⅠ双酶切，得到酶切GhOR基因；将所述载体p5-SCFP经BamHⅠ和KpnⅠ双酶切，得到酶切载体p5-SCFP；将所述酶切GhOR基因插入酶切载体p5-SCFP中，得到表达载体。

本发明还提供了一种转化植株，将上述技术方案所述的表达载体采用农杆菌介导法遗传转化到棉花中得到。

本发明还提供了上述技术方案所述的GhOR基因、蛋白、表达载体或转化植株在改善棉花品质中的应用。

本发明提供了上述技术方案所述的GhOR基因、蛋白、表达载体或转化植株在提高棉花纤维的类胡萝卜素含量中的应用。

本发明提供了一种GhOR基因，所述GhOR基因具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。将本发明提供的GhOR基因构建表达载体，再将表达载体转入棉花中，提高了棉花纤维的类胡萝卜素含量，使得成熟纤维长度变长、强度增加和马克隆值下降，改善了棉花纤维品质。

附图说明

图1为GhOR、Ghor1的序列比对，其中A，GhOR与Ghor1的核苷酸序列比对结果，虚线部分为GhOR相对于Ghor1缺失的序列；B，GhOR与Ghor1氨基酸序列比对结果，虚心部分为GhOR相对于Ghor1的缺失部分；

图2为p5-SCFP-GhOR载体构建流程；

图3为SCFP-GhOR转基因20DPA棉纤维色素含量变化，其中，左图，SCFP-GhOR转基因棉花不同株系及null系(#106后代分离得到非转基因系)开花后10天纤维中GhOR基因表达水平；右图，SCFP-GhOR转基因棉花不同株系及null系开花后10天纤维中类胡萝卜素含量及色素提取液颜色；星号显示与对照间存在显著性差异，*：P<0.05；**:P<0.01；

图4为SCFP-GhOR转基因棉花成熟纤维及其品质检测结果，其中A，SCFP-GhOR转基因棉花(#105、#106)的成熟纤维，标尺代表1cm；B-D，三个时期收获成熟纤维上半部平均长度、马克隆值和断裂比强度的比较结果。上标为不同字母的平均值之间差异显著(P<0.05)，最大平均值上标为a，次大平均值上标为b，最小平均值上标为c。

具体实施方式

本发明提供了一种GhOR基因，所述GhOR基因具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

在本发明中，所述GhOR基因具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，具体序列如下：

ATGGTTTCTTTGAGTCGAGTCTTGGCAGTTTCCTATACGATAAAGCCATCCATTCCCTGCAACACTTTTTCTTTAAGCTCTAGATTTCCTCAAACGAAACCCAAACTGAATTCGAAATGGCGATCCATGGCGACTGAACCTGACTCTTCTTCCTTCGCGCCTTCTATTGATTCTGATTCTTCCGCTGATAAAGCTACAGCCGGATTTTGCATCATAGAAGGGCCTGAAACAGTCCAGGATTTTGCTAATATGGAATTGCAAGAAATTCGGGATAATATCCGAAGCCGGCGGAACAAAGTGTTTCTGCAAATGGAAGAGGTTCGGAGGCTAAGGATACAACAACGCATTAAAAGTGCTGAACTTGGCATTTTAAAGGAAGAGCGAGAAATAGAACTTACCTCAGCAAATCTCAAGGTTTATTACGCAACTTGTTATTCTCTTATTGCTGGGATTATCCTTTTTGGTGGACTTATAGCACCCACTCTGGAGCTTAAGTTAGGACTAGGGGGCACGACATACACAGATTTCATCAGTAGTATGCACCTGCCAATGCAATTGAGTCAGGTTGATCCTATAGTGGCATCATTCTCTGGAGGAGCTGTCGGTGTTATTTCAGCCTTGATGGTAGTTGAAATGAACAATGTTAAACAGCAGGAGCATAAACGATGCAAGTATTGTCTTGGAACGGGATATCTTGCTTGTGCTCGCTGCTCAAATACTGGATCACTTGTTCTTATTGAACCTGTCTCAACAGGTAATGGTGGAGACCGACCTTTATCAACTCCCAAAACAGAAAGATGTTCAAACTGTTCAGGTTCTGGAAAGGTCATGTGCCCTACATGTCTCTGCACTGGAATGGCAATGGCTAGTGAACATGACCCACGAAATGACCCATTTGATTAG。

在本发明中，所述GhOR基因的获取方法，优选包括以下步骤：

1)以棉花叶cDNA为模版，用引物Ghor1-F和Ghor1-R进行PCR扩增，得到Ghor1基因的cDNA；

所述引物Ghor1-F具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；

所述引物Ghor1-R具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；

2)以步骤1)得到的Ghor1基因的cDNA为模板，用引物Ghor1-F和GhOR-R进行不对称PCR扩增，得到第一扩增产物；

所述引物GhOR-R具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；

3)以步骤1)得到的Ghor1基因的cDNA为模板，用引物GhOR-F和Ghor1-R进行不对称PCR扩增，得到第二扩增产物；

所述引物GhOR-F具有SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；

4)将所述步骤2)得到的第一扩增产物和步骤3)得到的第二扩增产物混合后进行退火延伸，得到GhOR基因。

在本发明中，所述Ghor1基因的cDNA具有SEQ ID No.7所示的核苷酸序列，具体序列如下：

ATGGTTTCTTTGAGTCGAGTCTTGGCGGTTTCCTATACGATAAAGCCATCCATTCCCTGCAACACTTGTTCTTTAAGCTCTAGATTTCCTCAAAAGAAACCCAAACTGAATTCGAAATGGCGATCCATGGCGACTGGACCTGACTCTTCTTCCTTCGCGCCTTCTATTGATTCTGATTCTTCCGCTGATAAAGCTACAGCCGGATTTTGCATCATAGAAGGGCCTGAAACAGTCCAGGATTTTGCTAATATGGAATTGCAAGAAATTCAGGATAATATCCGAAGCCGGCGGAACAAAGTGTTTCTGCAAATGGAAGAGGTTCGGAGGCTAAGGATACAACAACGCATTAAAAGTGCTGAACTTGGCATTTTAAAGGAAGAGCGAGAAATAGAACTTCCTAATTTTCCATCATTCATCCCATTCTTGCCTCCACTGACCTCAGCAAATCTCAAGGTTTATTACGCAACTTGTTATTCTCTTATTGCTGGGATTATCCTTTTTGGTGGACTTATAGCACCCACTCTGGAGCTTAAGTTAGGACTAGGGGGCACTTCATACGCAGATTTCATCAGTAGTATGCACCTGCCAATGCAATTGAGTCAGGTTGATCCTATAGTGGCATCATTCTCTGGAGGAGCTGTCGGTGTTATTTCAGCCTTGATGGTAGTTGAAATAAACAGTGTTAAACAGCAGGAGCATAAACGATGCAAGTATTGTCTTGGAACGGGATATCTTGCTTGTGCTCGCTGCTCAAATACTGGATCACTTGTTCTTATTGAACCAGTCTCAACAGGTAATGGAGGAGATCGACCTTTATCAACTCCCAAAACAGAAAGATGTTCAAACTGTTCAGGTTCTGGAAAGGTCATGTGCCCTACATGTCTCTGCACTGGAATGGCAATGGCTAGTGAACATGACCCACGAAATGACCCATTTGATTAG。

在本发明中，所述Ghor1基因的cDNA的下划线部分的CCTAATTTTCCATCATTCATCCCA TTCTTGCCTCCACTG在GhOR基因中被删除。

本发明优选以棉花叶cDNA为模版，用引物Ghor1-F和Ghor1-R进行PCR扩增，得到Ghor基因的cDNA；所述引物Ghor1-F具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；所述引物Ghor1-R具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。

本发明对所述棉花叶cDNA的提取方法没有特殊限定，采用常规提取方法即可。

在本发明中，所述引物Ghor1-F具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，具体序列如下：

CGAGGATGGTTTCTTTGAGTC；

所述引物Ghor1-R具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，具体序列如下：

CTCTAATCAAATGGGTCATTTCG。

本发明对所述PCR扩增的体系没有特殊限定，采用常规不对称PCR体系即可。在本发明中，所述PCR扩增的程序包括：94℃，5min；94℃30sec，56℃30sec，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。

本发明优选以得到的Ghor1基因的cDNA为模版，用引物Ghor1-F和GhOR-R进行不对称PCR扩增，得到第一扩增产物；所述引物GhOR-R具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。

在本发明中，所述引物GhOR-R具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，具体序列如下：

GCTGAGGTAAGTTCTATTTCTCGCTCTTC。

本发明对所述不对称PCR扩增的体系没有特殊限定，采用常规不对称PCR扩增的体系即可；所述不对称PCR扩增的程序包括：94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃1min，25个循环；72℃延伸10min。

本发明以得到的第一扩增产物为模版，用引物GhOR-F和Ghor1-R进行不对称PCR扩增，得到第二扩增产物；所述引物GhOR-F具有SEQ ID No.5所示的核苷酸序列。

在本发明中，所述引物GhOR-F具有SEQ ID No.5所示的核苷酸序列，具体序列如下所示：

GAGAAATAGAACTTACCTCAGCAAATCTCAAGGT。

本发明对所述不对称PCR扩增的体系没有特殊限定，采用常规不对称PCR体系即可；所述不对称PCR扩增的程序包括：94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃1min，25个循环；72℃延伸10min。

本发明将得到的第一扩增产物和得到的第二扩增产物混合后进行退火延伸，得到GhOR基因。

在本发明中，所述退火延伸的程序包括：56℃2min，72℃延伸10min，1个循环。

本发明还提供了上述技术方案所述的GhOR基因编码的蛋白，所述蛋白具有SEQ IDNo.6所示的氨基酸序列，具体序列如下所示：

MVSLSRVLAVSYTIKPSIPCNTFSLSSRFPQTKPKLNSKWRSMATEPDSSSFAPSIDSDSSADKATAGFCIIEGPETVQDFANMELQEIRDNIRSRRNKVFLQMEEVRRLRIQQRIKSAELGILKEEREIELTSANLKVYYATCYSLIAGIILFGGLIAPTLELKLGLGGTTYTDFISSMHLPMQLSQVDPIVASFSGGAVGVISALMVVEMNNVKQQEHKRCKYCLGTGYLACARCSNTGSLVLIEPVSTGNGGDRPLSTPKTERCSNCSGSGKVMCPTCLCTGMAMASEHDPRNDPFD。

在本发明中，所述Ghor1基因编码的蛋白具有SEQ ID No.8所示的氨基酸序列，具体序列如下：

MVSLSRVLAVSYTIKPSIPCNTCSLSSRFPQKKPKLNSKWRSMATGPDSSSFAPSIDSDSSADKATAGFCIIEGPETVQDFANMELQEIQDNIRSRRNKVFLQMEEVRRLRIQQRIKSAELGILKEEREIELPNFPSFIPFLPP LTSANLKVYYATCYSLIAGIILFGGLIAPTLELKLGLGGTSYADFISSMHLPMQLSQVDPIVASFSGGAVGVISALMVVEINSVKQQEHKRCKYCLGTGYLACARCSNTGSLVLIEPVSTGNGGDRPLSTPKTERCSNCSGSGKVMCPTCLCTGMAMASEHDPRNDPFD。在本发明中，所述下划线PNFPSFIPFLPPL的氨基酸序列在GhOR基因编码的蛋白的氨基酸序列中被删除。

本发明还提供了一种表达载体，将上述技术方案所述的GhOR基因插入到载体p5-SCFP中得到。

在本发明中，所述载体p5-SCFP优选将SCFP启动子替换p5载体中35S启动子的序列后得到。

在本发明中，所述SCFP启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，具体序列如下：

ATTACAACTTTTCTCTACCAATCAAATTTAAAAAATAGAAAAATGAAAATCGATGAATTGGATCACCACAATTTAGCCCAAAGAAAAACACAGTCAACCCCTCTCACAGGGTAGGAATGATTTCGAGGTATAGATAGACATAGTAACGGGCAACTTTAACTATTGCTGCCTCGATTTGAGGAAAATATCAAATCCAAGACAAAAATTTCAATTATACACTATGCCATACCATTATAAATATCCCCGTTCGCAATATCATCACCATTATTTGAATTTGCATTGCAACATTCGTCACCGTTAGTTATACCATCACCATCACTTAATTACTAAAATAATTATTGGTTTCTCAATATGAAAAAGCTCGAGTGCATTTTCTTTTGAATATCAACCGAAAAGAAAGAAAAAACTAAAGATTTTGGAAGATGACGGGGAAACCAAAAAGGAAATTTTGGGCATTTTTAAAATGAGAAAGACGAATGTAATAACCCATTTTTCTTTCTTACTCTGACAACGCCACAGATGCTTTACATGCATCATGTGATCGTGGGGGACCCCGAAACTTGGCATACGGAAAGCACCAACGGCACAGCATTAAAAGAAATTGTGTATAATGTTAAAAGACCATTAATTCAGTCTCATCCAACCAGGCTTAAAAGTCTTCATGCCTTTTCTCACCTCTGATTTCATCTAATGAAAAGCGGACAAGTTGAAGGATCACTCGTTGCTTGTGTGAGCTTTCATTATTTATTATTATGTTTTAGGTAACCATAGGAAGAAGCCATTAACAACAGCATGAAAAACAGCTAGTTTCTCCGCAAACAAGATAAACTTTTAAACTTTTTACCACTGCACCCCCCCCAAAGACCAGTTTTTAACTCCACCTACCAAGCATTCAAGAAGCACCAACCAACTTAATTACCAGCTTAACAAGACAGTACAGGTTTCTGGGATATTTGTAGTCTCTCAAGGACATCACCACCTCCACTCACCTTCCCATTTTTCTCTAGCACCCCCTAAAAA。

本发明对所述GhOR基因插入到载体p5-SCFP中的方法没有特殊限定，采用常规基因插入到载体的方法即可。在本发明中，所述GhOR基因优选经BamHⅠ和KpnⅠ双酶切，得到酶切GhOR基因；将所述载体p5-SCFP优选经BamHⅠ和KpnⅠ双酶切，得到酶切载体p5-SCFP；将所述酶切GhOR基因插入酶切载体p5-SCFP中，得到表达载体。本发明对所述酶切的条件没有特殊限定，采用BamHⅠ和KpnⅠ常规双酶切的条件即可。

本发明还提供了一种转化植株，将上述技术方案所述的表达载体采用农杆菌介导法遗传转化到棉花中得到。本发明对所述表达载体采用农杆菌介导法遗传转化到棉花中的方法没有特殊限定，采用常规即可。

本发明还提供了上述技术方案所述的GhOR基因、蛋白、表达载体或转化植株在改善棉花品质中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述的GhOR基因、蛋白、表达载体或转化植株在提高棉花纤维的类胡萝卜素含量中的应用。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种GhOR基因及其编码的蛋白、表达载体、转化植株和应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

GhOR的获得与序列分析

根据花椰菜or基因(Boor)序列在陆地棉查询同源基因，选取序列相似性最高且在棉花各组织中表达水平较高的基因Ghor1作为靶标基因。以棉花叶片cDNA为模板，用引物参Ghor1-F和Ghor1-R扩增克隆Ghor1的cDNA序列，并测序验证。具体操作如常规操作方法。

Ghor1-F(SEQ ID No.2)：CGAGGATGGTTTCTTTGAGTC；

Ghor1-R(SEQ IDNo.3)：CTCTAATCAAATGGGTCATTTCG。

参照照花椰菜橙色突变体基因BoOR，利用不对称重叠延伸PCR技术，以Ghor1基因cDNA序列为模板，进行扩增得到GhOR基因(删除Ghor1中397bp-435bp，具体序列为SEQ IDNo.10：5’-CCTAATTTTCCATCATTCATCCCATTCTTGCCTCCACTG-3’)。首先，分别进行两组不对称PCR(PCR1和PCR2)：

按常规操作方法组成扩增体系，在PCR1中，上游引物为Ghor1-F(5μmol/L)1μL，下游引物为GhOR-R(0.5μmol/L)1μL；在PCR2中，上游引物为GhOR-F(0.5μmol/L)1μL，下游引物Ghor1-R(5μmol/L)1μL。扩增程序为：94℃，5min；94℃，30sec，56℃，30sec，72℃，1min，25个循环；

GhOR-F(SEQ ID No.5)：GAGAAATAGAACTTACCTCAGCAAATCTCAAGGT；

GhOR-R(SEQ IDNo.4)：GCTGAGGTAAGTTCTATTTCTCGCTCTTC。

反应结束后，直接将PCR1和PCR2产物混合，56℃退火2min，72℃延伸10min，得到GhOR基因(SEQ ID No.1)。扩增产物电泳回收、克隆、测序验证。

如图1A、B，与Ghor1基因相比，GhOR CDS缺失39bp(397bp-435bp)，缺失序列为5’-CCTAATTTTCCATCATTCATCCCATTCTTGCCTCCACTG-3’；其编码蛋白氨基酸序列缺失13aa(132aa-144aa)，缺失氨基酸序列为N-PNFPSFIPFLPPI-C(SEQ ID No.11)。

实施例2

纤维发育初期特异表达GhOR载体p5-SCFP-GhOR构建

使用SCFP启动子替换p5载体中35S启动子序列得到p5-SCFP载体。实施例1得到的GhOR基因的编码序列构建入植物表达载体p5-SCFP的流程见图2。用BamHⅠ和KpnⅠ将GhOR基因的编码序列从克隆载体上切下，插入到P5-SCFP载体的相应位点上，即获得最终的表达载体P5-SCFP-GhOR。所有限制性内切酶购自MBI公司，按照使用说明书操作。DNA片段的回收、连接和大肠杆菌转化按前述常规操作方法进行。参考Bio-RAD MicroPulser用户说明书，将上述载体通过电激转化法导入农杆菌LBA4404。

实施例3

SCFP-GhOR转基因棉花获得

用杆菌介导法进行棉花遗传转化。选取颗粒饱满的野生型冀棉14号棉花种子，以60～100颗/瓶置于无菌三角瓶中。摇动三角，用75％酒精润洗1分钟，弃去废液，用0.1％HgCl₂灭菌约10分钟后使用无菌水充分漂洗6～8次。

充分消毒后，向三角瓶中加入适量的无菌水，于30℃摇床以100～110r/min转速摇晃，每隔12h更换无菌水直至长出1cm左右的胚根，将胚根插入种子萌发培养基中于30℃暗室中培养至2～3cm。

将制备的载体通过电激转化法导入农杆菌LBA4404，再将导入的农杆菌单菌落接种于含有50mg/LKm和125mg/L Sm的液体YEB培养基中，置于28℃摇床(200rpm/min)。约20h后每隔一个小时测量菌液的OD值(OD600)直至OD600在0.8～1.0。收集农杆菌液，离心，8000rpm/min，1min，弃上清。用含有AS(乙酰丁香酮，100μmo1/L)的共培养液体培养基按1:1(v/v)重悬沉淀后，收集重悬液于100mL三角瓶，置于30℃摇床(100～110r/min)培养约30min。将下胚轴切成长约0.8～1cm的小段，置于重悬液中，30℃摇床上侵染40min，弃液体，将下胚段铺在共培养基表面。于暗室培养48h左右，转入筛选培养基中，30℃培养(16h光照/8h黑暗)，每隔15天左右继代一次至愈伤形成。

待愈伤增多后，转到愈伤培养基上培养。挑取状态良好的胚性愈伤接入悬浮培养基中，置于30℃(100～110r/min)摇床上悬浮培养一周左右，经30目筛网过滤，将过滤后的细小胚性颗粒铺于体胚伸长培养基中，至绿色成熟体胚长出。挑至伸长培养基中继续培养至1cm左右，转入生根培养基中直至幼苗长成(约10cm)，移栽至营养钵，继续培养。

以上操作均须在无菌条件下完成。

表1根癌农杆菌介导的棉花遗传转化用培养基

MS:Murashige&Skoog,1962；B5:Gamborg,1986；Gelrite:Sigma,货号:G1910；SH:Schenk&Hildebrandt,1972。

生长健壮的再生棉花幼苗移栽至种植钵，在温室中常规管理至棉花纤维和种子成熟。对T0代转基因植株进行GUS组织染色(步骤见常规操作方法)，筛选出GUS阳性转化子。对11个转化子进行PCR扩增验证筛选出阳性转基因材料。对筛选出的阳性材料、WT 10DPA纤维GhOR基因表达量进行检测，选取表达量较高的#105、#106株系进行T1代种子及下一步研究取材。

实施例4

SCFP-GhOR转基因棉花纤维中GhOR表达及类胡萝卜素水平

取2个SCFP-GhOR转基因棉花株系#105、#106号开花后10天的纤维提取RNA检测GhOR基因的表达，并检测相应的类胡萝卜素水平。如图3，在两个转基因材料的纤维中GhOR的表达均明显提高，同时纤维中类胡萝卜素含量与对照株系相比显著提高了约20％～30％，提取液颜色明显加深。这些结果显示在棉花中导入SCFP-GhOR转基因，可以提高GhOR的在纤维中表达，并提高纤维中的类胡萝卜素水平。

实施例5

SCFP-GhOR转基因棉纤维品质改良

将SCFP-GhOR转基因棉花(#105和#106)和非转基因对照株系(null)进行平行栽培，收获成熟纤维检测纤维品质。结果如图4，比较不同批次收获的成熟纤维品质发现，SCFP-GhOR转基因棉花上半部纤维长度和断裂比强度显著增加，马克隆值显著降低，即SCFP-GhOR转基因棉花纤维更长、更强、更细，纤维品质显著改良。

由以上实施例可以得出，将本发明提供的GhOR基因转入表达载体，再将表达载体转入棉花中，提高了棉花纤维中类胡萝卜素的含量，使得成熟纤维长度变长、强度增加和马克隆值下降，改善了棉花纤维品质。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 西南大学

<120> 一种GhOR基因及其编码的蛋白、表达载体、转化植株和应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 903

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggtttctt tgagtcgagt cttggcagtt tcctatacga taaagccatc cattccctgc 60

aacacttttt ctttaagctc tagatttcct caaacgaaac ccaaactgaa ttcgaaatgg 120

cgatccatgg cgactgaacc tgactcttct tccttcgcgc cttctattga ttctgattct 180

tccgctgata aagctacagc cggattttgc atcatagaag ggcctgaaac agtccaggat 240

tttgctaata tggaattgca agaaattcgg gataatatcc gaagccggcg gaacaaagtg 300

tttctgcaaa tggaagaggt tcggaggcta aggatacaac aacgcattaa aagtgctgaa 360

cttggcattt taaaggaaga gcgagaaata gaacttacct cagcaaatct caaggtttat 420

tacgcaactt gttattctct tattgctggg attatccttt ttggtggact tatagcaccc 480

actctggagc ttaagttagg actagggggc acgacataca cagatttcat cagtagtatg 540

cacctgccaa tgcaattgag tcaggttgat cctatagtgg catcattctc tggaggagct 600

gtcggtgtta tttcagcctt gatggtagtt gaaatgaaca atgttaaaca gcaggagcat 660

aaacgatgca agtattgtct tggaacggga tatcttgctt gtgctcgctg ctcaaatact 720

ggatcacttg ttcttattga acctgtctca acaggtaatg gtggagaccg acctttatca 780

actcccaaaa cagaaagatg ttcaaactgt tcaggttctg gaaaggtcat gtgccctaca 840

tgtctctgca ctggaatggc aatggctagt gaacatgacc cacgaaatga cccatttgat 900

tag 903

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgaggatggt ttctttgagt c 21

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctctaatcaa atgggtcatt tcg 23

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gctgaggtaa gttctatttc tcgctcttc 29

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gagaaataga acttacctca gcaaatctca aggt 34

<210> 6

<211> 300

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Val Ser Leu Ser Arg Val Leu Ala Val Ser Tyr Thr Ile Lys Pro

1 5 10 15

Ser Ile Pro Cys Asn Thr Phe Ser Leu Ser Ser Arg Phe Pro Gln Thr

20 25 30

Lys Pro Lys Leu Asn Ser Lys Trp Arg Ser Met Ala Thr Glu Pro Asp

35 40 45

Ser Ser Ser Phe Ala Pro Ser Ile Asp Ser Asp Ser Ser Ala Asp Lys

50 55 60

Ala Thr Ala Gly Phe Cys Ile Ile Glu Gly Pro Glu Thr Val Gln Asp

65 70 75 80

Phe Ala Asn Met Glu Leu Gln Glu Ile Arg Asp Asn Ile Arg Ser Arg

85 90 95

Arg Asn Lys Val Phe Leu Gln Met Glu Glu Val Arg Arg Leu Arg Ile

100 105 110

Gln Gln Arg Ile Lys Ser Ala Glu Leu Gly Ile Leu Lys Glu Glu Arg

115 120 125

Glu Ile Glu Leu Thr Ser Ala Asn Leu Lys Val Tyr Tyr Ala Thr Cys

130 135 140

Tyr Ser Leu Ile Ala Gly Ile Ile Leu Phe Gly Gly Leu Ile Ala Pro

145 150 155 160

Thr Leu Glu Leu Lys Leu Gly Leu Gly Gly Thr Thr Tyr Thr Asp Phe

165 170 175

Ile Ser Ser Met His Leu Pro Met Gln Leu Ser Gln Val Asp Pro Ile

180 185 190

Val Ala Ser Phe Ser Gly Gly Ala Val Gly Val Ile Ser Ala Leu Met

195 200 205

Val Val Glu Met Asn Asn Val Lys Gln Gln Glu His Lys Arg Cys Lys

210 215 220

Tyr Cys Leu Gly Thr Gly Tyr Leu Ala Cys Ala Arg Cys Ser Asn Thr

225 230 235 240

Gly Ser Leu Val Leu Ile Glu Pro Val Ser Thr Gly Asn Gly Gly Asp

245 250 255

Arg Pro Leu Ser Thr Pro Lys Thr Glu Arg Cys Ser Asn Cys Ser Gly

260 265 270

Ser Gly Lys Val Met Cys Pro Thr Cys Leu Cys Thr Gly Met Ala Met

275 280 285

Ala Ser Glu His Asp Pro Arg Asn Asp Pro Phe Asp

290 295 300

<210> 7

<211> 942

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atggtttctt tgagtcgagt cttggcggtt tcctatacga taaagccatc cattccctgc 60

aacacttgtt ctttaagctc tagatttcct caaaagaaac ccaaactgaa ttcgaaatgg 120

cgatccatgg cgactggacc tgactcttct tccttcgcgc cttctattga ttctgattct 180

tccgctgata aagctacagc cggattttgc atcatagaag ggcctgaaac agtccaggat 240

tttgctaata tggaattgca agaaattcag gataatatcc gaagccggcg gaacaaagtg 300

tttctgcaaa tggaagaggt tcggaggcta aggatacaac aacgcattaa aagtgctgaa 360

cttggcattt taaaggaaga gcgagaaata gaacttccta attttccatc attcatccca 420

ttcttgcctc cactgacctc agcaaatctc aaggtttatt acgcaacttg ttattctctt 480

attgctggga ttatcctttt tggtggactt atagcaccca ctctggagct taagttagga 540

ctagggggca cttcatacgc agatttcatc agtagtatgc acctgccaat gcaattgagt 600

caggttgatc ctatagtggc atcattctct ggaggagctg tcggtgttat ttcagccttg 660

atggtagttg aaataaacag tgttaaacag caggagcata aacgatgcaa gtattgtctt 720

ggaacgggat atcttgcttg tgctcgctgc tcaaatactg gatcacttgt tcttattgaa 780

ccagtctcaa caggtaatgg aggagatcga cctttatcaa ctcccaaaac agaaagatgt 840

tcaaactgtt caggttctgg aaaggtcatg tgccctacat gtctctgcac tggaatggca 900

atggctagtg aacatgaccc acgaaatgac ccatttgatt ag 942

<210> 8

<211> 313

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Met Val Ser Leu Ser Arg Val Leu Ala Val Ser Tyr Thr Ile Lys Pro

1 5 10 15

Ser Ile Pro Cys Asn Thr Cys Ser Leu Ser Ser Arg Phe Pro Gln Lys

20 25 30

Lys Pro Lys Leu Asn Ser Lys Trp Arg Ser Met Ala Thr Gly Pro Asp

35 40 45

Ser Ser Ser Phe Ala Pro Ser Ile Asp Ser Asp Ser Ser Ala Asp Lys

50 55 60

Ala Thr Ala Gly Phe Cys Ile Ile Glu Gly Pro Glu Thr Val Gln Asp

65 70 75 80

Phe Ala Asn Met Glu Leu Gln Glu Ile Gln Asp Asn Ile Arg Ser Arg

85 90 95

Arg Asn Lys Val Phe Leu Gln Met Glu Glu Val Arg Arg Leu Arg Ile

100 105 110

Gln Gln Arg Ile Lys Ser Ala Glu Leu Gly Ile Leu Lys Glu Glu Arg

115 120 125

Glu Ile Glu Leu Pro Asn Phe Pro Ser Phe Ile Pro Phe Leu Pro Pro

130 135 140

Leu Thr Ser Ala Asn Leu Lys Val Tyr Tyr Ala Thr Cys Tyr Ser Leu

145 150 155 160

Ile Ala Gly Ile Ile Leu Phe Gly Gly Leu Ile Ala Pro Thr Leu Glu

165 170 175

Leu Lys Leu Gly Leu Gly Gly Thr Ser Tyr Ala Asp Phe Ile Ser Ser

180 185 190

Met His Leu Pro Met Gln Leu Ser Gln Val Asp Pro Ile Val Ala Ser

195 200 205

Phe Ser Gly Gly Ala Val Gly Val Ile Ser Ala Leu Met Val Val Glu

210 215 220

Ile Asn Ser Val Lys Gln Gln Glu His Lys Arg Cys Lys Tyr Cys Leu

225 230 235 240

Gly Thr Gly Tyr Leu Ala Cys Ala Arg Cys Ser Asn Thr Gly Ser Leu

245 250 255

Val Leu Ile Glu Pro Val Ser Thr Gly Asn Gly Gly Asp Arg Pro Leu

260 265 270

Ser Thr Pro Lys Thr Glu Arg Cys Ser Asn Cys Ser Gly Ser Gly Lys

275 280 285

Val Met Cys Pro Thr Cys Leu Cys Thr Gly Met Ala Met Ala Ser Glu

290 295 300

His Asp Pro Arg Asn Asp Pro Phe Asp

305 310

<210> 9

<211> 1200

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ccccgttcgc aatatcatca ccattatttg aatttgcatt gcaacattcg tcaccgttag 60

ataacccatt tttctttctt actctgacaa cgccacagat gctttacatg catcatgtga 120

tcgtggggga ccccgaaact tggcatacgg aaagcaccaa cggcacagca ttaaaagaaa 180

attacaactt ttctctacca atcaaattta aaaaatagaa aaatgaaaat cgatgaattg 240

gatcaccaca atttagccca aagaaaaaca cagtcaaccc ctctcacagg gtaggaatga 300

tttcgaggta tagatagaca tagtaacggg caactttaac tattgctgcc tcgatttgag 360

gaaaatatca aatccaagac aaaaatttca attatacact atgccatacc attataaata 420

tccccgttcg caatatcatc accattattt gaatttgcat tgcaacattc gtcaccgtta 480

gttataccat caccatcact taattactaa aataattatt ggtttctcaa tatgaaaaag 540

ctcgagtgca ttttcttttg aatatcaacc gaaaagaaag aaaaaactaa agattttgga 600

agatgacggg gaaaccaaaa aggaaatttt gggcattttt aaaatgagaa agacgaatgt 660

aataacccat ttttctttct tactctgaca acgccacaga tgctttacat gcatcatgtg 720

atcgtggggg accccgaaac ttggcatacg gaaagcacca acggcacagc attaaaagaa 780

attgtgtata atgttaaaag accattaatt cagtctcatc caaccaggct taaaagtctt 840

catgcctttt ctcacctctg atttcatcta atgaaaagcg gacaagttga aggatcactc 900

gttgcttgtg tgagctttca ttatttatta ttatgtttta ggtaaccata ggaagaagcc 960

attaacaaca gcatgaaaaa cagctagttt ctccgcaaac aagataaact tttaaacttt 1020

ttaccactgc acccccccca aagaccagtt tttaactcca cctaccaagc attcaagaag 1080

caccaaccaa cttaattacc agcttaacaa gacagtacag gtttctggga tatttgtagt 1140

ctctcaagga catcaccacc tccactcacc ttcccatttt tctctagcac cccctaaaaa 1200

<210> 10

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cctaattttc catcattcat cccattcttg cctccactg 39

<210> 11

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Pro Asn Phe Pro Ser Phe Ile Pro Phe Leu Pro Pro Ile

1 5 10

Claims (7)

1.一种GhOR基因，其特征在于，所述GhOR基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种权利要求1所述的GhOR基因编码的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。

3.一种表达载体，其特征在于，将权利要求1所述的GhOR基因插入到载体p5-SCFP中得到。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述载体p5-SCFP的构建方法包括：将SCFP启动子替换p5载体中35S启动子后得到。

5.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述GhOR基因经BamHⅠ和KpnⅠ双酶切，得到酶切GhOR基因；将所述载体p5-SCFP经BamHⅠ和KpnⅠ双酶切，得到酶切载体p5-SCFP；将所述酶切GhOR基因插入酶切载体p5-SCFP中，得到表达载体。

6.权利要求1所述的GhOR基因、权利要求2所述的蛋白或权利要求3～5任一项所述的表达载体在改善棉花品质中的应用。

7.权利要求1所述的GhOR基因、权利要求2所述的蛋白或权利要求3～5任一项所述的表达载体在提高棉花纤维的类胡萝卜素含量中的应用。

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