CN107099543A

CN107099543A - 金银花克隆LjHQT基因、克隆方法、植物表达载体及用途

Info

Publication number: CN107099543A
Application number: CN201710474027.8A
Authority: CN
Inventors: 蒲高斌; 魏丽; 李佳; 刘谦; 张永清
Original assignee: Shandong University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Shandong University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2017-06-21
Filing date: 2017-06-21
Publication date: 2017-08-29

Abstract

本发明从金银花中克隆酰基转移酶基因LjHQT，与其他植物HQT的同源性介于42～71％之间。经试验验证，LjHQT在转基因株系中的表达量与绿原酸含量呈正相关，有效提高了植物的抗病性。本发明从金银花中克隆酰基转移酶基因LjHQT，与其他植物HQT的同源性介于42～71％之间。经试验验证，LjHQT对奎尼酸的亲和力更高。在香豆酰辅酶A饱和时，LjHQT对奎尼酸的亲和力(Km＝77±45μmol/L)比莽草酸(Km＝5579±371μmol/L)高70倍。LjHQT能显著提高转基因株系中绿原酸含量，有效提高转基因植株的抗病性。

Description

金银花克隆LjHQT基因、克隆方法、植物表达载体及用途

技术领域

本发明涉及一种金银花克隆LjHQT基因。属于基因克隆技术领域。

背景技术

HQT基因产物是绿原酸生物合成途径中的关键酶之一。2008年，Rommens等对马铃薯块茎特异表达经过修改的MYB转录因子基因StMtf1M，激活了苯丙醇生物合成途径，使绿原酸的含量大幅提高，并同时检测到奎尼酸-羟肉桂酰基转移酶基因(HQT)的表达显著上升。Carla Clé等将番茄在温室内培养，并对其HQT基因进行表达调控，HQT高表达的番茄叶绿原酸含量最高，而野生型次之，HQT基因沉默的番茄叶绿原酸含量最低。他们发现HQT高表达的番茄叶绿原酸含量是野生型的2.5倍，并最终得出了HQT对番茄叶中绿原酸含量的积累起到关键作用的结论，这也与Niggeweg等的结论一致。再一次证实了HQT的表达量与番茄中绿原酸的含量直接相关。

综上所述，金银花中高含量的绿原酸及其同属植物中HQT的发现，以及HQT与多种植物绿原酸的生物合成密切相关，HQT表达量的增减往往伴随着绿原酸含量的升降这一事实，预示着金银花植物体内极有可能存在HQT基因的表达，并且它与金银花中绿原酸的积累密切相关。

发明内容

本发明的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种金银花克隆LjHQT基因。

本发明还提供了上述基因的克隆方法，利用上述基因构建的植物表达载体。

本发明还提供了上述基因的用途。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

金银花克隆LjHQT基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

上述基因的克隆方法，包括以下步骤：

(1)提取金银花RNA，反转录获得cDNA；

(2)参照其他植物HQT保守区设计简并引物，以cDNA为模板，进行PCR扩增，获得核心序列；简并引物如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；

(3)通过RACE方法从核心序列克隆全长cDNA序列，即为LjHQT基因。

简并引物的序列如下：

P1：5'-GACTHTGCYTAARGHTNGC-3'，如SEQ ID NO.3所示；

P2：5'-CACHCCAATCAHTCCYTCNCCNGt-3'，如SEQ ID NO.4所示；

其中，N代表任意一种核苷酸；R代表A或G；Y代表C或T；H代表A或C或T。

作为优选的技术方案之一，步骤(1)中，RNA的提取对象为金银花幼叶片。

作为优选的技术方案之一，步骤(2)中，所述其他植物为马铃薯、番茄、烟草或咖啡。

作为优选的技术方案之一，步骤(2)中PCR扩增使用Ex Taq酶，扩增程序如下：95℃变性4分钟后，依次进行94℃30秒、55℃40秒、72℃90秒30个循环，最后于72℃延伸15分钟。

作为优选的技术方案之一，步骤(2)中所得核心序列为860bp。

作为优选的技术方案之一，步骤(3)所得LjHQT基因全长1,621bp，其中包括1,320bp的编码区、209bp的5’非翻译区和一个包含18个多聚腺苷酸尾的92bp 3’非翻译区，与其他植物HQT的同源性介于42～71％之间。

一种利用上述基因构建的植物表达载体。

作为优选的技术方案之一，所述植物表达载体是利用Gateway技术构建得到的。

上述基因的用途，利用上述基因构建植物表达载体，通过遗传转化获得抗病性转基因植物。

本发明的有益效果：

本发明从金银花中克隆酰基转移酶基因LjHQT，与其他植物HQT的同源性介于42～71％之间。经试验验证，LjHQT对奎尼酸的亲和力更高。在香豆酰辅酶A饱和时，LjHQT对奎尼酸的亲和力(Km＝77±45μmol/L)比莽草酸(Km＝5579±371μmol/L)高70倍。LjHQT能显著提高转基因株系中绿原酸含量，有效提高转基因植株的抗病性。

附图说明

图1是金银花LjHQT与其他植物HQT的序列比对(CAE46932，烟草；ABK79689，刺棘蓟；ABO77956，咖啡；AEK80405，金银花)；

图2是LjHQT系统发育分析；

图3是LjHQT的Southern blot杂交分析；

图4A～图4C是LjHQT原核表达载体的构建及分子检测；

图5是SDS-PAGE分析金银花LjHQT诱导表达及纯化回收情况；

图6是LjHQT的酶促产物HPLC分析；

图7是LjHQT植物过表达载体的构建；

图8是LjHQT过表达拟南芥的筛选及PCR分析；

图9是转基因拟南芥的RT-PCR分析；

图10A是绿原酸(CGA)含量分析，图10B是与野生型(wildtype)拟南芥相比，过表达LjHQT的转基因株系绿原酸水平HPLC图谱，图10C是绿原酸提高了拟南芥的抗病性。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

1、LjHQT基因的分离

从金银花叶中提取总RNA，反转录获得cDNA。参照其它植物HQT保守区设计简并引物，以cDNA为模板，使用Ex Taq酶(购自TaKaRa)成功扩增出LjHQT的核心片段。引物的设计参照“保守-简并杂合寡核苷酸引物”(CODEHOP)策略，使用Block maker程序(http://blocks.fhcrc.org/blocks/blockmkr/make_blocks.html)完成简并引物设计：

P1：5'-GACTHTGCYTAARGHTNGC-3'，如SEQ ID NO.3所示；

P2：5'-CACHCCAATCAHTCCYTCNCCNGT-3'，如SEQ ID NO.4所示；

PCR扩增程序为，95℃变性4分钟后，依次进行94℃30秒、55℃40秒、72℃90秒30个循环，最后于72℃延伸15分钟。为了获得全长基因，根据已获得的LjHQT核心序列的5’端和3’端各设计3个基因特异引物，使用RACE技术获得该基因的两端侧翼序列。

2、异源表达和蛋白纯化

重组质粒经过测序验证后，转化到大肠杆菌E.coli BL21-Rosetta(DE3)菌株(购自TransGen Biotech)中。含有重组质粒的菌株接入10ml含有卡那霉素(50μg ml^-1)和氯霉素(34μg ml^-1)的LB培养基，37℃培养过夜，次日稀释100倍接入200ml LB培养基中于37℃、200rpm继续培养至OD₆₀₀为0.6～0.8时，添加终浓度为1mmol/L的IPTG，降温至30℃，6小时后，通过离心收集菌体并重悬于3ml 0.1mol/L磷酸钾缓冲液(pH 7.5)，超声波冰上破碎菌体。

冰上破碎的菌体匀浆于4℃10,000g下离心10分钟。上清通过镍琼胶糖凝胶柱(Novagen).用含有0.5mol/L NaCl和40mmol/L咪唑的0.1mol/L磷酸钾缓冲液洗涤镍琼胶糖凝胶柱三次后，重组目标蛋白用含有400m mol/L咪唑的0.1mol/L磷酸钾缓冲液洗涤洗脱。为了长期保持重组蛋白活性，洗脱缓冲液通过PD-10柱(Amersham Pharmacia Biotech,Uppsala,Sweden)，用含10％体积浓度甘油的0.1mol/L Tris–HCl(pH 7.5)置换缓冲液重新洗脱，洗脱的重组蛋白保存于–80℃。重组蛋白的纯化效率用SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)检测。Bradford法测定蛋白浓度。

3、体外酶促反应及产物分析

20μl的反应体系中含有100mmol/L磷酸钾缓冲液(pH 7.5)，1mmol/L二硫苏糖醇，1μg重组LjHQT蛋白，0.1～5mmol/L的不同底物(香豆酰辅酶A，咖啡酰辅酶A，奎尼酸和莽草酸)。反应自加入酶蛋白开始计时，30℃条件下反应30分钟，加入20μl乙腈/HCl(体积比99∶1)终止反应。HPLC检测条件：C18column(LiChroCART 125-4,Merck)，流动相A：90％H₂O，9.9％CH₃CN 0.1％HCOOH；B：80％CH₃CN，19.9％H₂O，0.1％CH₃COOH(流动相各组分占比均为体积百分比)。

4、动力学分析

重组蛋白动力学常数的测定是在一个底物浓度饱和的情况下，用另一个底物介于其K_m的0.2～6.0范围内的5个浓度值进行计算获得的。实验使用上述标准的250μl 0.1mol/L磷酸钾缓冲液反应体系，每个实验重复3次。常数参数的测定在35℃和pH6.5条件下完成。K_m和K_cat值由Lineweaver–Burke曲线的结果得出。

5、Southern blont印记杂交分析

(1)使用EcoRI,EcoRV和HindIII分别酶切10μg基因组DNA。

(2)配制0.7％的琼脂糖凝胶，将完全酶解的基因组DNA于4℃解冻后，70℃开盖温育5分钟，取基因组DNA 30μl、10倍Loading buffer 10μl于一新的EP管中充分混匀后和DNAmarker一并点入凝胶电泳孔中，在TAE电泳缓冲液中，5V/cm电压下电泳4小时。电泳后，将DAN Marker部位的凝胶切下放人溴化乙锭中染色。

(3)切除凝胶无用部分，将凝胶左上角切掉，作为指示凝胶方位标记，蒸馏水淋洗后，置于0.2mol/L HCl中摇动漂洗2分钟，然后用去离子水漂洗；

(4)将凝胶置于数倍体积的1.5mol/L NaCl和0.5mol/L NaOH中浸泡45min，期间温和地振摇几次，使DNA变性；

(5)用去离子水漂洗凝胶，然后将凝胶浸泡于数倍体积的1mol/L Tris-HCl(pH7.4)、1.5mol/L NaCl中，于室温下温和地不断振摇，使之中和。更换中和液，将凝胶继续浸泡15min；

(6)当凝胶仍浸于中和液时，用一张滤纸包裹一块玻璃板做成一凝胶平台，放入一个大玻璃皿内，倒入转移缓冲液10×SSC，使液面略低于平台表面，将滤纸两端浸入转移缓冲液中，当平台上方的滤纸湿透后，用玻棒赶走滤纸和玻璃板之间的所有气泡；

(7)准备尼龙膜：用一干净刀子裁制一张长度和宽度均比凝胶约大1mm的膜，切去膜的一角与凝胶的切角相对应，将膜漂浮于一盘去离子水中，直至由下而上完全湿润，然后将其浸入转移缓冲液中至少5min；

(8)从中和液中取出凝胶，将凝胶翻转使其背面向上，将凝胶放于平台上湿润的滤纸中央，用玻棒赶走凝胶和滤纸间的气泡；

(9)用保鲜膜围绕凝胶周边，在凝胶上方放置湿润的尼龙膜，并使两者的切角相重叠，用玻棒赶走尼龙膜与凝胶之间的气泡；

(10)用转移缓冲液湿润两张与凝胶同样大小的滤纸，湿润的滤纸放在尼龙膜上方，用玻棒赶走滤纸和尼龙膜之间的气泡；

(11)放置高度为6cm，面积略小于滤纸的吸水纸于滤纸上方，并在吸水纸上方放一块玻璃板，然后用一500g的重物压实；

(12)转移10h，定时更换吸水纸；

(13)转好的膜于2X SSC溶液中润洗数分钟。置两层滤纸之间，于室温晾干，80℃1h烘烤固定后，将膜用保鲜膜包裹，-20℃放置保存待用或直接用于分子杂交。

(14)使用地高辛标记一个LjHQT片断(364bp)作为探针，该片断包括启动子和部分5’端编码区。用于扩增该片断的引物如下：

正向引物：5'-GTACACAACAGAGAGATAACTGTC-3'，如SEQ ID NO.5所示；

反向引物：5'-GGTCATGTGCTCGCTGTTGGTG-3'，如SEQ ID NO.6所示。

取15μl PCR扩增回收产物在PCR仪中99℃变性10min，迅速投入冰水浴中骤冷5min；稍离心后，加入以下成分：六聚体随机引物2.0μl，dNTP标记混合物2.0μl，Klenow酶1.0μl，37℃温浴20h以上。65℃加热10min终止反应，于-20℃保存待用。

(15)洗膜和结果检测

杂交结束后，用100ml 2倍漂洗缓冲液(2×SSC，0.1％SDS)于50℃洗膜2次，每次5分钟；用100ml 0.5倍漂洗缓冲液(0.5×SSC，0.1％SDS)于68℃洗膜2次，每次15分钟；用100ml缓冲液1(100mmol/L马来酸，150mmol/L NaCl，pH7.5)于37℃洗膜2次，每次5分钟；室温下在20ml缓冲液2(100mmol/L马来酸，150mmol/L NaCl，1％(m/V)封闭液，pH7.5)浸膜30分钟，并在振荡器上进行；室温下在20ml抗体复合物溶液(每次使用前将Anti—Digoxigenin—Ap在10000rpm离心5min，取上清做1∶5000倍稀释，用Buffer 2稀释)中温育30min，并在振荡器上进行；倒掉上述溶液，室温下用100ml缓冲液1洗膜2次，每次15分钟；倒掉缓冲液1，室温下在20ml缓冲液3(100mmol/L Tris-Cl，100mmol/L NaCl，50mmol/LMgCl2pH 9.5)中平衡5分钟；倒掉缓冲液3，并将混有200μl的NBT/BCIP的10ml缓冲液3倒入装有膜的器皿中，避光数小时后，可见到杂交带。用50ml蒸馏水洗膜5min终止显色反应。观察结果。

6、系统发育分析

19个植物酰基转移酶基因的氨基酸序列使用CLUSTALX version 1.81(Thompsonet al.,1997)进行比对。比对结果运用PHYLIP软件包进行系统发育树构建，自展值设定为100。最终的发育树使用TREEVIEW WIN32(Page,1996)软件观察分析。

7、花侵染法转化拟南芥

(7-1)拟南芥(Col-0野生型)生长至抽苔1cm时，将顶端减掉以诱导侧生花序的生成；

(7-2)在转化前一天，取1ml活化过的含有表达载体质粒的农杆菌GV3101加到含相应抗生素及50μg/ml利福平的40ml YEP培养基中，28℃震荡培养至OD₆₀₀约为1.0～1.2；

(7-3)室温，4200rpm，离心10分钟，收集菌体，用浸染液(5w.t.％蔗糖，0.05w.t.％Silwet L-77)重悬菌体，使OD₆₀₀约为0.8；

(7-4)用移液器将农杆菌滴到花序上进行浸染，待所有花序都被侵染后，将拟南芥放入真空干燥器中抽真空1分钟；

(7-5)用保鲜袋覆盖花序，置于20～22℃避光培养一天剪开顶部露出花序，再培养一天后揭去保鲜袋，培养至种子成熟。

8、转基因植株的筛选

将适量待灭菌的拟南芥中子放入1.5ml离心管中，加入1ml体积浓度75％的乙醇(含有0.03％体积比的TritonX-100)震荡消毒1分钟，再用体积浓度70％的乙醇震荡消毒1分钟(两次)，最后用吸头将种子吸到无菌滤纸上吹干，然后用无菌的牙签将其点入培养基中。

对收获的T0代种子进行表面消毒，然后均匀涂布于1/2MS平板上(含卡那霉素50mg.L^-1)。春化处理3天后移入人工气候室生长。萌发约10天，子叶深绿色的植株为转基因植株，而子叶发浅绿甚至黄化的植株为非转基因植株。将转基因植株转入土中生长直至收获得到T1代转基因种子，T1代植株单株收种子，每株收取的种子继续筛选，将后代分离比为3∶1(阳性：阴性)的阳性植株移栽后生长至收获T2代转基因种子，单株收种后，每株收取的种子经筛选可以得到纯系T2代转基因种子。

9、病原菌接种

Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000在含利福平50mg.L^-1的LB培养基中生长，30℃下过夜收集菌体，用10ml MgCl₂溶液(80mmol.L^-1)重悬，密度为2×10⁸个菌落/ml。用无菌注射器吸取菌液，拔掉针头，轻压叶片进行侵染。

10、结果与分析

10.1 LjHQT cDNA的分离

利用简并引物，以金银花幼叶片cDNA为模板，通过PCR扩增，获得了一个860bp的核心序列。序列比对表明，该片段属于酰基转移酶。通过RACE方法，克隆了该基因的全长cDNA序列，命名为LjHQT(accession number AEK80405)，其序列如SEQ ID NO.1所示。LjHQTcDNA全长1,621bp，其中包括1,320bp的编码区、209bp的5’非翻译区和一个包含18个多聚腺苷酸尾的92bp 3’非翻译区。用Expasy开发的Protparam工具(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)进行蛋白质基本理化性质的分析，LjHQT编码一个439个氨基酸的多肽，推测的分子量为48.4kDa，等电点(pI)为6.42，其序列如SEQ ID NO.2所示。LjHQT的氨基酸序列含有2个保守域：HXXXDG和DFGWG(图1)。LjHQT与其它植物HQT的同源性介于42～71％之间。系统发育分析结果表明，LjHQT蛋白与其他物种的HQT组成一个分支，与HCT蛋白形成两个独立的亚家族(图2)。

SEQ ID NO.1

SEQ ID NO.2

MGSEGSVKTMNITVKDSSMVQPAKNTPEKKLWNSNLDLVVGRIHILTVYFYRSNGSQNFFEPRVLKEALSNVLVSFYPMAGRLGKDDEGRVEINCNGEGVLFVEAESDCCVDDFGDFTPSTEMRRLTPTVDYSGDISSYPLIILQVTYFKCGGVSLGVGVHHTLSDGVSSLHFINTWSDMARGLSIAIPPFIDRTLLRPRTPPTPTFDHVEYHPPPSMITKPLSGPKGVSTAILKLSLDQLTTLKAKAKNEGNGKDHSTYEILAAHLWRCACKARDLSANQTSKLYIATDGRSRLCPPLPPGYLGNVVFTATPMADSGDLQAEPVTSTAKRIHNSLTRMDNEYLRSALDFLETTPDLKTLVRGPNYFASPNLNINSWTRLPVHDADFGWGRPIFMGPASILYEGTIYIIPSTTNDRSLSLAVCLDAGHMARFEKCLYEF

10.2 LjHQT在金银花中的基因组结构

从金银花幼叶中提取基因组DNA，分别用NdeI,HindIII和EcoRV酶切。一个380bp的LjHQT片断(位于LjHQT核酸序列1～380位之间)作为探针。Southern blot杂交结果显示，存在2-4个不同大小的条带(图3)。由于NdeI,HindIII和EcoRV在LjHQT内没有酶切位点，此结果表明金银花基因组中存在2～4个LjHQT拷贝。

10.3 LjHQT的功能鉴定及酶学特性分析

将LjHQT与原核表达载体PET30a融合，转化BL21大肠杆菌菌株(图4A～图4C)。经1.0mmol/L IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)28℃诱导4小时后，菌体经超声波破碎，分别取少量破碎液和经离心后的蛋白上清SDS-PAGE电泳检测，结果显示，在C末端添加组氨酸标签的重组LjHQT在大肠杆菌中实现了体外表达。通过镍琼脂糖凝胶柱纯化的方法获得纯化的蛋白。SDS-PAGE结果显示，纯化的重组蛋白在48kDa的位置上形成一个单一条带(图5)。

取纯化的重组金银花HQT蛋白，加入到体外催化反应体系中。酶促产物的定性及定量分析结果显示，重组的LjHQT能有效催化奎尼酸与咖啡酰辅酶A和香豆酰辅酶A的转酰基反应，分别生成绿原酸和香豆酰奎尼酸(图6)，而对照没有反应产物出现。为研究LjHQT的底物特异性，同时以莽草酸为底物进行了测试，HPLC检测几乎没有产物出现。

分别以咖啡酰辅酶A和香豆酰辅酶A为酰基供体，以奎尼酸和莽草酸为酰基受体，开展了LjHQT的酶动力学研究。结果表明，LjHQT对奎尼酸的亲和力更高(表1)。在香豆酰辅酶A饱和时，LjHQT对奎尼酸的亲和力(Km＝77±45μmol/L)比莽草酸(Km＝5579±371μmol/L)高70倍。同时以CGA(chlorogenic acid，绿原酸)为底物，通过检测咖啡酰辅酶A生成量，测定了LjHQT催化CGA裂解的能力。结果表明，LjHQT能够催化该反应，Km为146±25μmol/L。

表1 LjHQT的酶动力学分析

10.4 过表达LjHQT拟南芥植株的获得

为了进一步研究LjHQT基因对于绿原酸积累的影响，利用Gateway技术构建了LjHQT植物高效表达载体，在该载体中LjHQT置于花椰菜花叶病毒35S强效启动子之下，其序列如SEQ ID NO.7所示，空载体作为对照，二者分别转入农杆菌GV3101，经鉴定正确后转化拟南芥(图7)。经过Kan筛选和后代分离鉴定，共获得5个LjHQT转基因纯系和2个空载体转化株系(图8)。

SEQ ID NO.7

10.5 过表达LjHQT拟南芥绿原酸含量与抗病性分析

RT-PCR结果表明，5个转基因株系中均有LjHQT基因表达，其中以Line5和Line8表达量较高，而对照中没有(图9)。通过HPLC检测了各株系中绿原酸含量，结果表明，各转基因株系中均有绿原酸积累(图10A)。其中含量最低的为0.33μg/mg(鲜重)，最高为0.92μg/mgFW，对照中无绿原酸。

有研究表明，绿原酸能提高植物抗病性。野生型拟南芥并不合成绿原酸，而转LjHQT基因后，在转基因株系里检测到了绿原酸的积累，本发明对绿原酸含量最高的lon5和对照分别进行了研究。叶片在接种病原菌DC3000 4d后，表现出明显差异(图10B和图10C)。lon5的抗病能力明显高于对照。

11、结论

本发明成功克隆了金银花中一个酰基转移酶基因LjHQT。植物酰基转移酶家族(BAHD)利用酰基CoA为底物，产生各种挥发性脂类、修饰后的花青素以及与植物抵抗病原微生物侵害的相关化合物。BAHD家族成员在结构上都有一定的相似性。LjHQT与其它植物HQT的同源性介于42～71％之间。与其家族成员一致，LjHQT含有两个主要的保守区域，HXXXD和DFGWG。这两个区域基本上在所有的成员中都有体现。但是，这些保守区在一些酶中会发生变化，如DFGWG这个保守区就会在杨树中变成DFG-FG、DFGWA、DFGWK、NFGWG和DYGWG这样的一些区域。

体外酶促反应表明，LjHQT更倾向于催化奎尼酸为酰基受体的反应。这一催化特点与来源于烟草、番茄等物种的HQT蛋白相似，表明LjHQT参与了金银花中绿原酸的生物合成。但目前还无法推断LjHQT是催化咖啡酰辅酶A和奎尼酸直接生成绿原酸，还是催化香豆酰辅酶A和奎尼酸生成香豆酰奎尼酸，进而在C3’H作用下羟化生成绿原酸。两个不同的合成途径，可能取决于不同组织中咖啡酰辅酶A与香豆酰辅酶A的相对含量。Niggeweg等利用RNAi方法，降低番茄中HQT基因的表达，结果使番茄叶片中绿原酸含量降低了98％。另有研究表明，拟南芥中由于缺乏HQT基因，尽管HCT和C3’H基因都有功能，其体内依然没有检测到绿原酸积累。本发明验证了LjHQT在转基因拟南芥中持续表达，其表达量与拟南芥中绿原酸含量呈正相关。这进一步验证了LjHQT在绿原酸生物合成中的重要功能。

本发明以高绿原酸含量的转基因拟南芥为对象，通过叶片接种致病菌DC3000，研究了绿原酸在植物抗病中的作用。结果表明，与对照相比，绿原酸提高了拟南芥叶片的抗病性，减缓了病原菌的侵染。相似结果在烟草抗尾孢真菌和病原细菌DC3000侵染的研究中也有报道。CGA可能通过其抗氧化能力，介导植物的抗病反应。植物伤口部位感染后，CGA被多酚氧化酶氧化，生成苯醌。苯醌通过细胞壁物质交联抑制病原菌的侵染。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东中医药大学

<120> 金银花克隆LjHQT基因、克隆方法、植物表达载体及用途

<130> 2017

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1320

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgggaagtg aaggaagtgt gaagacgatg aatatcaccg tcaaagattc gtctatggta 60

cagccggcga agaatacgcc ggagaagaag ctctggaact cgaatctgga ccttgtagtc 120

ggtcggatcc acatcttgac cgtctatttc tacagatcga acggatctca gaatttcttc 180

gaacctaggg ttttgaagga ggctctgagt aatgttttgg tctcgtttta cccaatggcc 240

ggaagattag ggaaggatga tgaaggaaga gttgagatta actgtaacgg tgaaggtgtg 300

ttgtttgttg aggctgaatc tgattgttgt gttgatgatt ttggtgattt cactccttct 360

acggagatgc ggaggcttac gccgactgtg gattattccg gcgatatttc ttcttatccg 420

ctcatcattt tacaggtaac atatttcaag tgtgggggag tgtctctagg agttggggtg 480

catcacaccc tatcagatgg tgtttcctcc ctccacttca tcaacacatg gtccgacatg 540

gctcgtggcc tctcaatagc aatcccaccg ttcatcgacc gcaccctcct tcgtccaaga 600

accccaccca ccccaacatt tgatcacgtc gaataccacc caccgccctc catgatcacc 660

aaacccttgt caggccccaa gggcgtctca accgccatcc taaagctctc cctcgaccaa 720

cttaccaccc tcaaggctaa agccaagaat gaaggtaacg gaaaggacca cagcacctac 780

gagatcctag ctgctcactt gtggcggtgt gcctgcaagg cccgggacct cagcgccaac 840

cagacgagca agttatacat agccacagac gggcgatcga ggctttgccc accactcccg 900

ccgggctacc taggaaatgt ggtgttcaca gccacgccaa tggcggattc cggtgatctc 960

caggcagagc cggtaactag cacagctaag agaatccaca actcattgac cagaatggat 1020

aatgagtact tgaggtccgc tctcgacttt ctggagacaa caccagacct caaaactctt 1080

gtgcgagggc caaactactt tgctagcccg aacctcaaca tcaatagctg gactaggctc 1140

ccggttcacg acgcggattt cgggtggggc cggcccatat ttatgggacc tgcaagtata 1200

ctatacgagg gtacaatata tataataccg agcacaacaa acgaccggag cttgtcattg 1260

gcggtgtgct tagacgcggg tcacatggct cggttcgaaa agtgcttgta tgagttctaa 1320

<210> 2

<211> 439

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Gly Ser Glu Gly Ser Val Lys Thr Met Asn Ile Thr Val Lys Asp

1 5 10 15

Ser Ser Met Val Gln Pro Ala Lys Asn Thr Pro Glu Lys Lys Leu Trp

20 25 30

Asn Ser Asn Leu Asp Leu Val Val Gly Arg Ile His Ile Leu Thr Val

35 40 45

Tyr Phe Tyr Arg Ser Asn Gly Ser Gln Asn Phe Phe Glu Pro Arg Val

50 55 60

Leu Lys Glu Ala Leu Ser Asn Val Leu Val Ser Phe Tyr Pro Met Ala

65 70 75 80

Gly Arg Leu Gly Lys Asp Asp Glu Gly Arg Val Glu Ile Asn Cys Asn

85 90 95

Gly Glu Gly Val Leu Phe Val Glu Ala Glu Ser Asp Cys Cys Val Asp

100 105 110

Asp Phe Gly Asp Phe Thr Pro Ser Thr Glu Met Arg Arg Leu Thr Pro

115 120 125

Thr Val Asp Tyr Ser Gly Asp Ile Ser Ser Tyr Pro Leu Ile Ile Leu

130 135 140

Gln Val Thr Tyr Phe Lys Cys Gly Gly Val Ser Leu Gly Val Gly Val

145 150 155 160

His His Thr Leu Ser Asp Gly Val Ser Ser Leu His Phe Ile Asn Thr

165 170 175

Trp Ser Asp Met Ala Arg Gly Leu Ser Ile Ala Ile Pro Pro Phe Ile

180 185 190

Asp Arg Thr Leu Leu Arg Pro Arg Thr Pro Pro Thr Pro Thr Phe Asp

195 200 205

His Val Glu Tyr His Pro Pro Pro Ser Met Ile Thr Lys Pro Leu Ser

210 215 220

Gly Pro Lys Gly Val Ser Thr Ala Ile Leu Lys Leu Ser Leu Asp Gln

225 230 235 240

Leu Thr Thr Leu Lys Ala Lys Ala Lys Asn Glu Gly Asn Gly Lys Asp

245 250 255

His Ser Thr Tyr Glu Ile Leu Ala Ala His Leu Trp Arg Cys Ala Cys

260 265 270

Lys Ala Arg Asp Leu Ser Ala Asn Gln Thr Ser Lys Leu Tyr Ile Ala

275 280 285

Thr Asp Gly Arg Ser Arg Leu Cys Pro Pro Leu Pro Pro Gly Tyr Leu

290 295 300

Gly Asn Val Val Phe Thr Ala Thr Pro Met Ala Asp Ser Gly Asp Leu

305 310 315 320

Gln Ala Glu Pro Val Thr Ser Thr Ala Lys Arg Ile His Asn Ser Leu

325 330 335

Thr Arg Met Asp Asn Glu Tyr Leu Arg Ser Ala Leu Asp Phe Leu Glu

340 345 350

Thr Thr Pro Asp Leu Lys Thr Leu Val Arg Gly Pro Asn Tyr Phe Ala

355 360 365

Ser Pro Asn Leu Asn Ile Asn Ser Trp Thr Arg Leu Pro Val His Asp

370 375 380

Ala Asp Phe Gly Trp Gly Arg Pro Ile Phe Met Gly Pro Ala Ser Ile

385 390 395 400

Leu Tyr Glu Gly Thr Ile Tyr Ile Ile Pro Ser Thr Thr Asn Asp Arg

405 410 415

Ser Leu Ser Leu Ala Val Cys Leu Asp Ala Gly His Met Ala Arg Phe

420 425 430

Glu Lys Cys Leu Tyr Glu Phe

435

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> N代表任意一种核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<223> N代表任意一种核苷酸；R代表A或G；Y代表C或T；H代表A或C或T

<220>

<221> misc_feature

<222> (17)..(17)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 3

gacthtgcyt aarghtngc 19

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> N代表任意一种核苷酸；Y代表C或T；H代表A或C或T

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(19)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (22)..(22)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 4

cachccaatc ahtccytcnc cngt 24

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gtacacaaca gagagataac tgtc 24

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggtcatgtgc tcgctgttgg tg 22

<210> 7

<211> 800

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cccacagatg gttagagagg cttacgcagc aggtctcatc aagacgatct acccgagcaa 60

taatctccag gaaatcaaat accttcccaa gaaggttaaa gatgcagtca aaagattcag 120

gactaactgc atcaagaaca cagagaaaga tatatttctc aagatcagaa gtactattcc 180

agtatggacg attcaaggct tgcttcacaa accaaggcaa gtaatagaga ttggagtctc 240

taaaaaggta gttcccactg aatcaaaggc catggagtca aagattcaaa tagaggacct 300

aacagaactc gccgtaaaga ctggcgaaca gttcatacag agtctcttac gactcaatga 360

caagaagaaa atcttcgtca acatggtgga gcacgacaca cttgtctact ccaaaaatat 420

caaagataca gtctcagaag accaaagggc aattgagact tttcaacaaa gggtaatatc 480

cggaaacctc ctcggattcc attgcccagc tatctgtcac tttattgtga agatagtgga 540

aaaggaaggt ggctcctaca aatgccatca ttgcgataaa ggaaaggcca tcgttgaaga 600

tgcctctgcc gacagtggtc ccaaagatgg acccccaccc acgaggagca tcgtggaaaa 660

agaagacgtt ccaaccacgt cttcaaagca agtggattga tgtgatatct ccactgacgt 720

aagggatgac gcacaatccc actatccttc gcaagaccct tcctctatat aaggaagttc 780

atttcatttg gagagaacac 800

Claims

1.金银花克隆LjHQT基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取金银花RNA，反转录获得cDNA；

(3)通过RACE方法从核心序列克隆全长cDNA序列，即为LjHQT基因。

3.根据权利要求2所述的克隆方法，其特征在于，步骤(1)中，RNA的提取对象为金银花幼叶片。

4.根据权利要求2所述的克隆方法，其特征在于，步骤(2)中，所述其他植物为马铃薯、番茄、烟草或咖啡。

5.根据权利要求2所述的克隆方法，其特征在于，步骤(2)中PCR扩增使用Ex Taq酶，扩增程序如下：95℃变性4分钟后，依次进行94℃30秒、55℃40秒、72℃90秒30个循环，最后于72℃延伸15分钟。

6.根据权利要求2所述的克隆方法，其特征在于，步骤(2)中所得核心序列为860bp。

7.根据权利要求2所述的克隆方法，其特征在于，步骤(3)所得LjHQT基因全长1,621bp，其中包括1,320bp的编码区、209bp的5’非翻译区和一个包含18个多聚腺苷酸尾的92bp 3’非翻译区，与其他植物HQT的同源性介于42～71％之间。

8.一种利用权利要求1所述基因构建的植物表达载体。

9.根据权利要求8所述的植物表达载体，其特征在于，所述植物表达载体是利用Gateway技术构建得到的。

10.权利要求1所述基因的用途，其特征在于，利用上述基因构建植物表达载体，通过遗传转化获得抗病性转基因植物。