CN103305527A - 水稻基因pmrp在改良水稻农艺性状方面的应用 - Google Patents

Abstract

水稻的分蘖是水稻株型结构中非常重要的农艺性状，直接影响水稻单位面积的产量。本发明通过蛋白质组学方法在叶片卷曲、异常矮小的水稻突变体中筛选到一个表达发生明显下降的蛋白质PMRP，过表达PMRP的拟南芥分枝增多、过表达PMRP的水稻分蘖增多。PMRP促进水稻分蘖方面的功能为水稻遗传改良和增产提供重要的理论和生产实践基础。

Description

水稻基因PMRP在改良水稻农艺性状方面的应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一个水稻PMRP基因在改良水稻农艺性状方面的应用，尤其是涉及水稻PMRP基因在促进水稻分蘖方面的应用。

背景技术

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，全球约有一半的人以稻米作为主食。水稻的分蘖是水稻株型结构中非常重要的农艺性状，它直接决定水稻的穗数及其产量，是培育“超级水稻”的一个重要方面，因而广受世界各国关注。探索控制水稻分蘖的分子机理有助于生产上遗传调控分蘖并促进植物分枝的分子机理研究。水稻分蘖是种子植物的一种特殊的分枝现象。目前，在拟南芥、番茄、豌豆、矮牵牛和玉米等一些植物中都已经报道存在着许多与分枝方式有关的突变体，如 revoluta，pinhead，lateral suppressor [ls]，more axillary growth [max]，ramosus [rms]，Teosinte branched1 [Tb1] ，decreased apical dominance [dad]，supershoot/bushy，通过对这些突变体的研究发现，几个与分枝调控有关的基因在单子叶植物和双子叶植物之间具有保守性。因此，研究水稻分蘖的分子机理可通过比较基因组学方法和分子进化观点从种子植物分枝整体入手，从而有望早日比较全面了解水稻分蘖乃至植物界分枝的分子机制。而水稻中与分蘖相关基因的分离与鉴定是控制水稻分蘖的分子机理研究的瓶颈。

分离与鉴定控制水稻分蘖的相关基因可采用正向遗传学方法，以分蘖极端突变体为材料，采用图位克隆方法，分离控制水稻分蘖的基因。MOC1 基因是李家洋院士等以自然发生的一个单秆分蘖的突变体“moc1”为材料，采用图位克隆的方法分离出来的控制水稻分蘖的关键基因；D3基因，是 Shiji Ishikawa 等以多蘖型矮秆突变体“Id3”为材料，采用图位克隆的方法分离出来的与水稻分蘖相关的又一基因；水稻 OsTB1 基因，是 TaiTo Takeda 等基于与玉米 TB1 (Teosinte branched 1) 基因序列相似性采用同根克隆方法分离出来的，水稻 OsTB1 与玉米的 TB1 相同，是侧芽生长的负调节因子，主要控制从腋芽原基到侧枝形成的生长过程。

MOC1、OsTB1 和 D3 这3个水稻分蘖相关基因本身就说明了控制水稻分蘖的遗传因子不是唯一的，可能还存在着其他控制水稻分蘖的基因，它们要么与分蘖芽的形成有关，要么与分蘖芽的伸长有关，亦或兼而有之。因此，为了更全面地阐明水稻分蘖的分子机理，继续挖掘与分离水稻分蘖相关的新基因非常迫切。

本发明申请人利用蛋白质组学技术在叶片卷曲、株型矮小的水稻突变体d61-4和 brd1-4中鉴定到一个表达明显下降的蛋白质，经质谱鉴定为PMRP蛋白。PMRP是一个推测的膜蛋白，功能未知。该蛋白含有一个START（Steroidogenic Acute Regulatory related lipid Transfer Domain）保守域，含有该保守域的蛋白可能参与到近/远轴极性的建立过程，而近/远轴极性可直接影响腋生器官（分蘖）的分化。因此对PMRP在调控植物分枝方面的功能分析可为水稻农艺性状的改良提供理论基础。

发明内容

1. 本发明的目的在于确定PMRP在促进植物分枝、分蘖方面的功能，涉及PMRP促进水稻分蘖方面的应用，以改良水稻株型、提高水稻产量。

2. 为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了在拟南芥和水稻中过表达水稻基因PMRP，统计过表达该基因后转基因拟南芥和转基因水稻的分枝、分蘖数，结果发现，过表达该基因后拟南芥植株分枝增多、水稻植株分蘖增多。

3. 所述PMRP基因，基因序列号为Os02g0468400，蛋白序列号为gi|47497322 ，CDS全长为1308 bp，编码435个氨基酸。

4. 本发明的技术方案涉及水稻基因PMRP在促进水稻分蘖方面的应用。

5. 将PMRP基因超表达获得了分枝增多的转基因拟南芥和分蘖增多的转基因水稻。

6. 本发明明确了PMRP可以促进拟南芥分枝、水稻分蘖，为改良水稻株型及提高产量奠定了理论基础。

附图说明

图1为实施例一中叶片卷曲、异常矮小突变体d61-4和brd1-3同野生型的比较，其中，A：d61-4和brd1-3 同野生型水稻幼苗的比较；B：d61-4和brd1-3 的放大图。

图2为实施例一中brd1-3 和 d61-4 地上部和各自野生型对照总蛋白的2D-DIGE图谱，其中A： Wt (cy3)，brd1-3 (cy5)；B：Wt (cy3)，d61-4 (cy5)，红色箭头表示相对于野生型在突变体中的上调蛋白，绿色箭头表示相对于野生型在突变体中的下调蛋白。

图3为实施例一中突变体d61-4和brd1-3同野生型水稻PMRP蛋白水平分析，其中A,B：d61-4和brd1-3 突变体总蛋白和各自野生型对照总蛋白的2D-DIGE图谱，箭头示PMRP蛋白点，PMRP在两个突变体中均被下调。（A：Wt(cy3)，d61-4(cy5)；B：Wt(cy3)，brd1-3 (cy5)；绿色点表示被下调的蛋白）。

图4为实施例二中过表达PMRP拟南芥的表型。其中A：野生型拟南芥（Col）和过表达PMRP拟南芥（pmrp-ox）3个株系的表型；B：过表达PMRP拟南芥pmrp-ox-3的放大图，红色箭头示莲座叶片直立表型。

图5为实施例二中过表达PMRP拟南芥不同株系（pmrp-ox-1，pmrp-ox-2，pmrp-ox-3）中PMRP的表达分析。

图6为实施例四中过表达PMRP转基因水稻同野生型水稻的比较。

具体实施方式

本发明实施例公开了水稻PMRP基因改良水稻农艺性状方面的应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例一

水稻PMRP蛋白的筛选及质谱鉴定

1） 筛选控制水稻发育蛋白质所用材料：水稻突变体d61-4和brd1-3异常矮小，叶片卷曲（图1），但发育时期不受影响，是比较蛋白质组学分析的良好材料；

2） 水稻材料的培养：水稻突变体d61-4，brd1-3和各自野生型对照的水稻种子催芽24小时、木村B营养液培养14天后，分别收获地上部和地下部，液氮冷冻后，-80℃冰箱保存备用；

3） 水稻幼苗地上部总蛋白的提取：在液氮中研磨组织，称取0.1 g干粉加入1.5 ml离心管中；迅速加入0.25 ml buffer Y，震荡 1 min；65℃，恒温10 min；20℃，14,000×g，离心20 min；转移0.25 ml上清到加有0.25 ml预冷的Tris饱和酚（pH 7.5-7.9）的1.5 ml离心管中，震荡1 min，然后10℃，14000×g，离心15 min；移走上相，保留中间相和下相；用冷的buffer Y 重复抽提酚相2次；加入5倍体积（1.25 ml）冷的0.1 M醋酸铵甲醇溶液，-20℃过夜；4℃，14000×g，离心20 min，弃上清；用预冷的0.1 M醋酸铵甲醇溶液清洗沉淀3次，每次清洗时先在-20℃放置10 min，然后4℃，14,000×g，离心10 min，弃上清；用1ml冷的乙醇清洗沉淀。4℃，14,000×g，离心10 min，移走上清。冰上干燥沉淀5 min；加入0.25 ml DIGE buffer 溶解沉淀，室温放置2 h，使蛋白充分溶解（不能含有DTT和ß-ME及两性电解质Pharmalyte）；4℃，14,000×g，离心20 min，取上清液；用Brandford法定量蛋白，然后分装放入-80℃备用。Buffer Y： 100 mM Tris-HCl，pH 8.0，2% SDS，2% mercaptoethanol，5 mM EGTA，10 mM EDTA，1 mM PMSF。Buffer Z： 50 mM Tris-HCl，pH 8.0。DIGE buffer：7 M urea，2 M 硫脲，4% CHAPS；

4） 蛋白质的CyDye 荧光标记：CyDye荧光染料用DMF(Dimethylformamide)溶解，终浓度为1 nmol/ml，Cy3显示红色，Cy5显示蓝色。每管1 ml分装，真空干燥后，-80℃保存；使用时，每管加10 ml DMF溶解1 nmol CyDye荧光染料；用0.3 M Tris-HCl（pH 8.8）调不含DTT和Pharmalyte的蛋白样品的pH值到8.5；野生型水稻蛋白样品（50 mg）中加入0.5 ml Cy3，突变体蛋白样品（50 mg）中加入0.5 ml Cy5，冰上、黑暗放置1-3 h；每个样品中加0.5 ml 10 mM lysine，轻轻的混匀，冰上、黑暗放置10 min；

5） 双向电泳：把两种蛋白质样品混在一起，用水化液（7 M尿素，2 M硫脲，4% CHAPS，0.5% 2% Pharmalyte 3-10，0.001% 溴酚兰）稀释至450 ml后20,000×g离心,取上清上样；第一向等电聚焦使用24 cm固相pH梯度胶条放在固相pH梯度胶条槽中，在Ettan IPGphor 等电聚焦系统中进行，胶条的pH范围为pH 4-7（Amersham Biosciences，Sweden）。电泳条件按如下程序进行：30V，6h→60V，6h→200V，1h→500V，1h→1000V，1h→8000V，6.5h，总伏时为64KV•h。等电聚焦后，胶条在平衡液1（50 mM Tris-HCl pH6.8，6M尿素，30%甘油，2%SDS，0.002%溴酚兰）和平衡液2（50 mM Tris-HCl pH6.8，6 M尿素，30%甘油，2%SDS，0.002%溴酚兰， 2.5%碘代乙酰胺）中平衡，每步20 min。然后胶条放到12.5% ExcelGel SDS 胶（Amersham Pharmacia Biotech）上，用封闭液（0.5%琼脂糖，0.002%溴酚兰溶于SDS电泳缓冲液中）连接。然后在Ettan DALT Six电泳单元中进行第二相SDS-PAGE。按常规SDS-PAGE条件进行。分离胶浓度12.5%，堆积胶浓度4.5%。电泳缓冲液（25 mMTris-base，192 mM甘氨酸，0.1%SDS），电泳条件：2.5 W，30 min→17W，约5 h。用24 cm，pH4-7的IPG胶条，进行等电聚焦电泳。在20℃条件下，20 V，2 h；40 V，10 h；500 V，1 h；1000 V，1 h；8000V，10 h；

6） 凝胶的扫描：用Typhoon 9410 荧光扫描仪对凝胶进行扫描。分析差异蛋白点；

7） 蛋白质凝胶斑点切取：蛋白质凝胶斑点的切取通过蛋白质凝胶斑点切取仪（Spot Picker）完成。将需要切取的蛋白质斑点的坐标值在软件中列表，切取仪将按照列表逐一切取凝胶并按顺序放到指定的96孔板中；

8）蛋白质样品MALDI-TOF质谱分析：酶解样品经过质谱分析后得到肽质量指纹图谱（peptide mass fingerprinting，PMF）数据，将这些数据利用Mascot软件（Matrix science, London）在NCBI数据库中进行检索鉴定蛋白。对于检索的结果，软件提供一个可信度分值（MOWSE Score），如果实际值大或等于该值则错误率小于5%。当出现多个大于标准MOWSE Score值的结果时候，一般选取得分最大的结果，同时还参考其匹配肽段的序列覆盖率（sequence coverage）以及分子量、等电点等参数来加以确定；

申请人比较了突变体d61-4和brd1-3地上部总蛋白同各自的野生型对照的双向电泳图谱（图2）。红点代表在突变体中上调的蛋白，绿点代表下调的蛋白。黄点代表变化不明显的蛋白。蛋白质组学的结果表明，在突变体d61-4和brd1-3中有多个发生了相同变化的蛋白，点3经质谱分析鉴定是一个putative membrane related protein(简称PMRP)，在蛋白质水平上PMRP在突变体d61-4和突变体brd1-3 中均为下调（图2，图3）。PMRP是一个推测的膜蛋白，共435个氨基酸，这个蛋白含有一个START（Steroidogenic Acute Regulatory related lipid Transfer Domain.）保守域。含有该保守域的蛋白可能参与到近/远轴极性的建立过程，而近/远轴极性可直接影响腋生器官（分枝、分蘖）的分化。因此本发明对PMRP在拟南芥和水稻中的功能进行了分析。

由于基因家族中存在着基因功能冗余现象，使得通过功能缺失突变体研究这些基因的功能有困难，而相应的功能获得突变体则可弥补这个缺陷，所以本发明申请人通过对过表达PMRP拟南芥和水稻的表型分析来确定基因的功能。具体实施方式如下：

实施例二

PMRP在拟南芥中的功能分析

1) 载体的构建：利用高保真Taq酶从水稻cDNA扩增出PMRP的cDNA，将经测序验证的PMRP片段用PstI和BamHI酶切后连接到pBluescript II SK质粒中，再用KpnI和SacI切下目的片段， 连接到pSN1301的相应位点，用PstI和BamHI连接到把PMRP的cDNA片断连到PSN1301载体中获得PMRP过表达载体（以35S为启动子）；

2) 将上述质粒导入农杆菌菌株GV3101中：取50 ml GV3101感受态细胞，加入0.5 mg质粒，轻轻混匀，冰上放置；2500V，电击5 ms，立刻加入800 ml YEB培养基；28℃，150 rpm，恢复培养45 min；涂布适量的细胞于筛选培养基平板上，超净台吹干表层液体；28℃培养两天；

3) 花絮浸泡法转化拟南芥及阳性苗的筛选：接种含有表达载体的农杆菌克隆于5ml YEB培养基（含100 mg /ml Kana，100mg /ml Rif）中，28℃，200 rpm，振荡培养至对数生长晚期；按1：50的比例转接到200 ml YEB培养基中，28℃，200 rpm，振荡培养至OD₆₀₀为0.6左右；5,000 rpm，离心15 min，收集菌体；重悬于渗透缓冲液（5% 蔗糖，0.02% silwet L-77），调OD₆₀₀为0.6左右；将拟南芥花蕾在渗透缓冲液中浸泡30 sec，平放，遮光保湿培养一天，然后拟南芥于培养室中继续正常培养；收获成熟后的拟南芥种子；10%次氯酸钠消毒15 min，灭菌水反复冲洗3次；将种子铺在筛选培养基上（20 mg/L Hyg），暗培养4-5d。阳性苗下胚轴明显高于阴性苗。

实施例三

过表达PMRP拟南芥中PMRP表达分析（图5）

提取培养7d的拟南芥幼苗叶片RNA，反转录为cDNA，RT-PCR分析PMRP的表达量，所用引物为5`CGGGATCCCGATGGCGGGGGAGACGGATTC3`和5`GGGGTACCCCCTATTCCAAGTGCCTGGG3`，以ACTIN为内参。

过表达PMRP拟南芥表现为莲座叶直立、腋生分生组织增多表型（图4），经统计分析野生型拟南芥主枝为1，而PMRP表达量增多的拟南芥分枝也增多，pmrp-ox-1的分枝为2，pmrp-ox-2的分枝为3，pmrp-ox-3的分枝为5（图4，5）。这说明PMRP在促进拟南芥分枝方面有重要的作用。

实施例四

过表达PMRP水稻的表型分析

1） 以35S为启动子构建PMRP的过表达载体：用双元表达载体pCAMBIA1301在HindIII和EcoRI 2 个酶切位点之间插入玉米泛素蛋白基因启动子(Ubi1pro)和Nos ter序列，得到质粒pUN1301。该质粒含有潮霉素磷酸转移酶基因(HPT)和GUS基因, 二者均被CaMV35S 启动子驱动。在Ubi1Pro 后引入BamHI、SmaI、KpnI和SacI 4个酶切位点。将经测序验证的PMRP片段用PstI和BamHI酶切后连接到pBluescript II SK质粒中，再用KpnI和SacI切下目的片段， 连接到pUN1301的相应位点， 得到含有Ubi1Pro::PMRP的植物表达载体pUN1301/PMRP。将上述质粒导入农杆菌菌株EHA105 中(同上述质粒导入农杆菌菌株GV3101方法)；

2） 成熟种子的消毒：先用70%(v/v)乙醇处理3分钟，再用0.1%(w/v)升汞(每升加5-6滴吐温-80)浸泡12-13分钟，无菌水冲洗4-5次，用无菌纸吸干种子表面水分；

3） 成熟胚的取用：取消毒后的成熟种子，用无菌水浸泡12-16小时后，转移到无菌培养皿中，用无菌纸吸干水分，再用解剖刀剥取成熟胚，盾片朝上将其接种到培养基上；

4） 愈伤组织诱导培养基和芽分化培养基：NB培养基（N6 major salts，B5 minor salts，B5 vitamins，300mg.L^-1casamino acid，500mg.L^-1 proline，500 mg.L^-1 glutamine，30 mg.L^-1 sucrose，7 mg.L^-1 agar，pH 5.8）；NBD0.5培养基（NB medium，0.5 mg.L^-1 2,4-D）；NBD2（NB medium，2 mg.L^-1 2,4-D）；AAMD0.5-As培养基(AAM medium，100 µmol.L^-1 cetosyringone，0.5 mg.L^-1 2, 4-D，pH 5.2)；NBD2-As培养基(NBD2 medium+100 µmol.L^-1 acetosyringone，10 g.L^-1 glucose，pH 5.2)；NBD0.5-CH1培养基(NBD0.5 edium，600 mg.L^-1 cefotaxime，25 mg.L^-1 hygromycin)；NBD0.5-CH2培养基(NBD0.5 medium，300 mg.L^-1 cefotaxime，50 mg.L^-1 hygromycin)；RE1-CH培养基（MS，30 g.L^-1 sucrose，20-30 g.L^-1 sorbitol，500 mg.L^-1 casamino acid，1 mg.L^-1 6-BA，0.25 mg.L^-1 NAA，0.5 mg.L^-1 KT，0.2 mg.L^-1 ZT，300 mg.L^-1 cefotaxime，50 mg.L^-1 hygromycin，10 g.L^-1 agar，pH5.8)； RE2-H 培养基(MS，30 g.L^-1 sucrose，10-20 g.L^-1 sorbitol，500 mg.L^-1 casamino acid，1 mg.L^-1 6-BA，0.5 mg.L^-1 NAA，0.5mg.L^-1 KT，0.2 mg.L^-1 ZT，50 mg.L^-1 hygromycin，8 mg.L^-1 agar， pH 5.8)； MS0培养基( MS major salts，MS minor salts and MS vitamins，20 g .L^-1 sucrose，7 mg.L^-1 agar，pH 5.8)；MS0-H培养基 (MS0 medium，70 mg.L^-1 hygromycin)；1/2 MSNM 培养基(Half-strength MS major salts，MS minor salts ，MS vitamin，20 g.L^-1 sucrose，0.2 mg.L^-1 NAA，1.0 mg.L^-1 MET(paclobutrazol)，7 mg.L^-1 agar，pH 5.8)；1/2 MSNMH培养基(1/2 MSNM medium，50 mg.L^-1 hygromycin)。

5） 农杆菌侵染愈伤组织法侵染转化水稻：将水稻愈伤组织切成0.3-0.4 mm 大小，浸入农杆菌悬液中20 分钟，在无菌滤纸上吸干多余的菌液后，置于铺有一层无菌滤纸的NBD2-As 培养基上，黑暗中培养3天。收集愈伤组织，并用含500 mg·L-1 头孢霉素的无菌水冲洗3次，吸去多余水分，将愈伤组织转入筛选培养基NBD0.5-CH1 中培养2周，再移到NBD0.5-CH2 培养基上继续筛选2次，每次2周。最后，得到鲜黄色的潮霉素抗性愈伤组织；

6）转基因植株的再生：为了提高植株分化率，先将愈伤组织放在铺有一层无菌滤纸的培养皿中，25°C、黑暗条件下自然干燥1-2天。然后将这些愈伤组织分割成2 mm的小块，转移到预分化培养基 RE1-CH上培养12-15天，其中前6-7天黑暗培养，后8-9天光照培养，光照强度为45-55 mmol·m^-2·s^-1。之后,将已分化出不定芽的愈伤组织转移到分化培养基RE2-H中培养15天，使不定芽长成高2-4cm的小苗。最后， 这些小苗被分开转移到1/2 MSNMH生根培养基中，2周后生根，移栽到盛有营养土的水桶中，在温室中栽培至收获；

7） 经抗生素筛选及gus染色分析得到过表达PMRP水稻阳性苗，结果见图6。

由图6结果可见过表达PMRP水稻呈现分蘖增多表型，经统计分析，野生型水稻的分蘖数为3±0.5，过表达表明PMRP水稻的分蘖数为5±0.5。水稻PMRP基因可促进水稻分蘖。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的应用及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (4)

1.水稻基因PMRP在改良水稻农艺性状方面的应用。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述水稻农艺性状为水稻分蘖。

3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述水稻基因PMRP基因序列号为Os02g0468400。

4. 根据权利要求1 所述应用，其特征在于，将水稻PMRP基因过表达获得分蘖增多的转基因水稻。

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