CN101698850A - 水稻OsMS2基因及其编码的蛋白 - Google Patents

Abstract

一种基因工程技术领域的水稻OsMS2基因及其编码的蛋白；本发明涉及水稻OsMS2基因，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示；该基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；本发明还涉及一种包含SEQ ID NO：1所示的基因的质粒；本发明还涉及一种包含SEQ IDNO：1所示的基因的植物表达载体；本发明还涉及一种包含SEQ ID NO：1所示的基因的宿主细胞；本发明还涉及一种制备水稻雄性不育株的方法，包括如下步骤：步骤一，将包含SEQID NO：1所示的基因的植物表达载体转化入水稻细胞；步骤二，培育转化的水稻细胞，得到水稻雄性不育植株。本发明的OsMS2基因编码的蛋白可用来产生新的水稻雄性不育系，也可利用本发明的核酸序列合成重组OsMS2蛋白来行使脂肪酰基还原酶的功能。

Description

水稻OsMS2基因及其编码的蛋白

技术领域

本发明涉及一种基因工程技术领域的基因及其编码的蛋白，具体是一种水稻OsMS2(脂肪酰基还原酶)基因及其编码的蛋白。

背景技术

在植物花粉的发育过程中，花粉壁起着非常重要的作用。它对于花粉粒的正常发育、花粉粒对外界的耐受力都是非常必须的。此外，花粉外壁还可以保护花粉免受外界环境和病菌侵害并在花粉从花药移向柱头的过程中起到了重要的作用。花粉外壁主要由聚合的孢子花粉素构成。孢子花粉素已经被证实是含有聚合苯酚和脂肪酸衍生物的复合物，这些聚合物含有芳香族或共轭的侧链，它们在授粉和花粉萌发过程中细胞间的识别中起着重要的作用。外壁表面也显示着高度修饰的模式，并因物种而异。在花粉外壁的缝隙中填充着一些粘性油脂以及类似于蛋白的物质，统称为含油层。它的主要成分为脂肪酸和长链脂肪酸衍生物，如酯和油脂的不稳定复合物以及各种蛋白。

在水稻花粉壁的发育过程中，四分体晚期已开始了小孢子外壁的发育。当小孢子从四分体分离出来时其外壁并不明显，但是出现了壁物质的沉积。到了小孢子早期才形成了细带状的初生壁，这时的初生壁在光学显微镜下尚无法分辨，但在原有四分孢子沉积的壁物质的基础上，聚集形成了一电子致密的细带状结构，其表面附着了一些黑色颗粒。发育到小孢子中期，则形成了光学显微镜下可见的外壁结构，小孢子外壁物质快速沉积，在质膜外侧形成了三条宽窄不等的电子致密带，最内侧的较粗，中间的略细，最外侧的致密带上规则地分布了一些黑色小体，显然是由早期的黑色颗粒形成的。小孢子壁继续发育，中间的电子致密带变细，两边的带明显加宽，结果花粉外壁分化出覆盖层、柱状层和基层。至此，外壁基本形成，即由两边较宽的电子致密带(覆盖层，基层)和中间的透明带(柱状层)组成。小孢子发育晚期，小孢子的外壁没有出现明显的形态变化，但壁物质沉积更加致密。二胞花粉早期，花粉外壁的覆盖层、柱状层、基层、外壁内层和花粉内壁，由表及里，层次分明。花粉外壁已完全形成。

目前已报道的花粉壁不正常的突变体中，拟南芥cer6/pop1。不能形成正常的含油层。cer1突变体含油层呈现出粒状表面，与野生型相比，含油层中的脂滴数量多但个体小。拟南芥dex1突变体在小孢子从四分体释放的过程中发生了异常，形成不正常的小孢子壁结构。拟南芥flp1(faceless pollen-1)突变体，在小孢子外壁和含油层中都有缺陷，因此对醋解实验敏感。水稻wda1(Wax-deficient anther1)突变体，在花药壁和花粉壁的蜡质积累上存在缺陷，经证明WDA1基因的编码产物参与了长链脂肪酸的合成。拟南芥中的MS2(MALESTERILITY 2)基因所编码的产物与小孢子的形成有关。ms2突变体的花粉发育过程中的首次异常，发生在小孢子从四分体中释放的阶段。MS2基因在野生型花药的绒毡层中表达，与花粉外壁物质的形成有关，ms2突变体所产生的花粉粒含有非常薄的花粉外壁，它对醋解实验很敏感。此外，有关分析表明MS2基因编码的产物与一种加州希蒙得木蛋白FAR和小麦中的TAA基因编码的蛋白具有一定的相似性，它们都作为一种脂肪酰基还原酶，参与到脂肪醇的合成代谢过程中，而脂肪醇是形成花粉外壁所必须的代谢产物。

OsMS2基因与拟南芥中MS2基因的氨基酸序列具有很高的相似性，为49.9％。与小麦中TAA基因、Jojoba的FAR基因也有很高的相似性，分别为32.3％，30.9％。并且其同源部分主要集中在两个保守功能域，即NAD结合结构域和雄性不育结构域。但是对那些OsMS2基因的同源基因的研究仅限于表型、生理及遗传定位等方面。

经对现有技术的文献检索发现，尚未发现有关水稻OsMS2基因及其编码的蛋白的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种水稻OsMS2基因及其编码的蛋白；本发明的蛋白在控制水稻花粉发育方面具有明显的作用，可用于产生新的水稻雄性不育系，用来生产杂交种子，开展轮回选择和创造基因库；也可利用本发明蛋白的编码序列体外合成重组OsMS2蛋白来行使脂肪酰基还原酶的功能，将脂肪酸还原成脂肪醇。

本发明是通过以下的技术方案实现的，

第一方面，本发明涉及一种水稻OsMS2基因，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

第二方面，本发明涉及一种水稻OsMS2基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

第三方面，本发明涉及一种质粒，该质粒包含SEQ ID NO：1所示的基因。

第四方面，本发明涉及一种植物表达载体，该载体包含SEQ ID NO：1所示的基因。

第五方面，本发明涉及一种宿主细胞，该宿主细胞包含SEQ ID NO：1所示的基因。

所述宿主细胞为大肠杆菌。

所述宿主细胞为农杆菌。

第六方面，本发明涉及一种制备水稻雄性不育株的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一，将包含SEQ ID NO：1所示的基因的植物表达载体转化入水稻细胞；

步骤二，培育转化的水稻细胞，得到水稻雄性不育株。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：本发明的蛋白在控制水稻花粉发育方面具有明显的作用，可用于产生新的水稻雄性不育系，用来生产杂交种子，开展轮回选择和创造基因库；也可利用本发明蛋白的编码序列体外合成重组OsMS2蛋白来行使脂肪酰基还原酶的功能，将脂肪酸还原成脂肪醇。

附图说明

图1 osms2突变体植株的形态学观察图；

图2 OsMS2基因座位定位示意图；

图3 OsMS2基因序列示意图；

图4野生型与osms2突变体扫描电镜和醋解实验的观察图；

图5 OsMS2互补质粒pCAMBIA 1301-OsMS2的构建示意图；

图6碘染显示转基因苗互补成功的结果图；

图7 OsMS2全长在pET30a载体中蛋白表达结果图；

图8气象色谱检测结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

在本实施例中，“分离的”、“纯化的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。

在本实施例中，术语“水稻脂肪酰基还原酶蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有脂肪酰基还原酶活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1中第1-1827位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.1序列的编码框第1-1827位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.1中第1-1827位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ IDNO.1所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与SEQ IDNO.1中从核苷酸第1-1827位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO.1中从核苷酸第1-1827位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。

该术语还包括能编码具有与天然的水稻脂肪酰基还原酶OsMS2蛋白相同功能的蛋白的SEQID NO.2中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’端和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

在本实施例中，术语“水稻脂肪酰基还原酶蛋白(或多肽)”指具有脂肪酰基还原酶蛋白活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。该术语还包括具有与天然参与水稻花粉发育蛋白相关相同功能的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括水稻脂肪酰基还原酶蛋白的活性片段和活性衍生物。

本实施例的水稻脂肪酰基还原酶蛋白的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与水稻脂肪酰基还原酶蛋白相关DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用水稻脂肪酰基还原酶蛋白相关多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。

在本实施例中，“水稻脂肪酰基还原酶蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO.2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。

本发明还包括水稻脂肪酰基还原酶蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然水稻脂肪酰基还原酶多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本实施例的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本实施例中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本实施例的水稻脂肪酰基还原酶多肽时，可以将水稻脂肪酰基还原酶蛋白编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成水稻脂肪酰基还原酶蛋白表达载体。

如本实施例所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子调控序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

在本实施例中，术语“宿主细胞”为真核细胞。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、水稻细胞和其它植物细胞。

还可用Northern印迹法技术分析水稻脂肪酰基还原酶基因产物的表达，即分析水稻脂肪酰基还原酶的RNA转录物在细胞中的存在与否和数量。

此外，本实施例还提供了一种可用作探针的核酸分子，该分子通常具有水稻脂肪酰基还原酶的核苷酸编码序列的8-100个连续核苷酸，较佳地具有15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码水稻脂肪酰基还原酶蛋白相关的核酸分子。

此外，根据本实施例的水稻脂肪酰基还原酶基因的核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选水稻脂肪酰基还原酶相关同源基因或同源蛋白。

本实施例的水稻脂肪酰基还原酶相关核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本实施例所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用水稻的DNA、市售的DNA/cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的DNA/cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可通过化学合成将突变引入本实施例蛋白序列中。

除了用重组法产生之外，本实施例蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。可以分别化学合成本实施例蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。

本实施例是利用γ射线对粳稻9522品系进行处理，种植后在F2代挑选花药发育异常的突变体，挑选分离比为3∶1的隐性单基因突变体为研究对象。获得一新的水稻隐性雄性不育突变体osms2。通过遗传定位方法，首先将突变基因座位定位在水稻3号染色体上的标记OS301、OS302附近，并进一步确定于OS302、SJ302之间。进一步精细定位，在OS302和SJ302之间发展了7对有多态性InDel分子标记，最终将OsMS2基因定位在SJ622和CL7-4之间。通过对网上(http://www.tigr.org)的序列分析，SJ622和CL7-4两标记之间物理距离大约为35kb。在这一范围内NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)和tigr(http://www.tigr.org)都预测分析有13个基因，其中有一个编码类似MS2蛋白的基因。通过对这些基因进行反复测序分析，发现突变体中OsMS2基因所在的第八个外显子上有一碱基C的缺失。该基因共有九个外显子，编码608个氨基酸，在其编码区内有两个保守结构域。一个是NADbinding 4 domain，另一个是Male sterility domain，它们在水稻花发育过程中都起到了非常重要的作用。OsMS2的突变是由于基因第八个外显子中的一个碱基发生缺失而造成的，该碱基位于两个功能域之间，缺失后导致翻译提前终止，虽然对NAD-binding-4功能域不造成影响，但是严重阻碍了Male sterility功能域的功能行使，同时这个单碱基的缺失也使翻译提前终止，最终不能产生有功能的蛋白，所以OsMS2基因的突变造成了植物的雄性不育。本实施例中的OsMS2基因与拟南芥中MS2基因的氨基酸系列具有很高的相似性，为49.9％。与小麦中TAA基因、Jojoba的FAR基因也有很高的相似性，分别为32.3％，30.9％。并且其同源部分主要集中在两个保守功能域，即NAD结合结构域和雄性不育结构域。本研究发现的OsMS2基因是新发现的水稻中的脂肪酰基还原酶的基因，并将其命名为OsMS2(Oryza sativa LMale Sterile2)。

通过对雄性不育突变体osms2花器官发育各时期进行组织切片、扫描电镜、生理生化分析观察，发现该基因的突变会导致水稻花粉外壁不能正常发育(图4)，从而造成雄性不育(图1)；生理生化分析表明突变体内不能形成正常的花粉，当将OsMS2基因转入突变体时可以恢复突变体的表型(见图6，图6中，A.野生型B.突变体C.T₁代转基因苗)。另外，体外重组表达的OsMS2蛋白具有将脂肪酸转变成脂肪醇这种脂肪酰基还原酶的功能(图8)，这说明该基因确实控制了水稻花粉外壁脂肪醇的生物合成过程。

本实施例在控制水稻花粉发育方面具有明显的作用，可以产生新的水稻雄性不育系，用来生产杂交种子，开展轮回选择和创造基因库，在农业生产上具有十分重要的应用。另外，也可以将OsMS2蛋白应用于脂肪醇的合成或脂肪酸还原成脂肪醇这一工业生产领域。

实施例1

osms2突变体植株的获得和形态学的观察

该突变体是用⁶⁰Co γ射线诱变粳稻9522种子，处理剂量为280Gy。对诱变的F₂代中一雄性不育突变体三代回交，获得隐性单基因调控的稳定遗传的突变体osms2。所有植物材料种植于上海市农业科学院试验基地。osms2突变体与粳稻9522回交，F₁代全部为可育，自交F2代中出现分离，其中正常植株为153，突变株为49，正常植株与突变植株比例接近3∶1(χ²＝0.006，χ^0.05＝3.84)，表明该雄性不育突变体表型由一个隐性单核基因突变造成。

对osms2突变体植株的形态学观察，如图1，A，B，C，D，E，左侧为野生型；A，B，C，D，E，右侧为突变体。osms2突变体表现为完全的雄性不育，其在营养生长期没有明显的表型缺陷，发育后期雄性不育突变体整株形态与野生型粳稻9522相比，osms2突变体穗小无结实，整株形态直立(图1A)。至生殖生长期，除花药以外，其他花器官的发育与野生型相比，亦没有明显的差异(图1B，C，D)。osms2突变体的花药为白色，而相对应的野生型粳稻9522花药为黄色，并且突变体花药比野生型小(图1E)。

实施例2

OsMS2基因的定位和克隆

(1)定位群体。将osms2突变体与籼稻品系广陆矮4号杂交，自交获得F₂代，选择其中为雄性不育植株为定位群体。

(2)水稻DNA提取。采用改进的CTAB法。简单步骤如下：取叶片0.1-0.2克(约半片)放到小研钵中，加入适量的液氮，立刻研磨至粉状，装入2ml离心管，加入700ul 100℃预热的1.5xCTAB溶液于离心管中，小心混匀后放入56℃水浴，20分钟后取出离心管，加入等体积氯仿/异戊醇，猛烈混匀，离心(13000rpm)10分钟，取上清于新管中，加入900ul无水乙醇混匀后-20℃放半小时以上。将析出的DNA离心，14000rpm(10分钟)。去掉上清，将沉淀用1ml70％乙醇清洗一次，离心干燥，溶于200ul 1/10TE或水中，4℃冰箱保存。

(3)InDel分子标记分析。InDel分子标记设计是根据比较粳稻日本晴籼稻9311两品系的已公布的核苷酸序列，对差异的部分设计引物，验证2个亲本粳稻9522和广陆矮4号之间的多态性，PCR扩增程序为：10ul体系中，1ul模板，1ul 10pmol/ul Primer1，1ul10pmol/ul Primer2，1ul 10×Buffer(Mg²⁺)，1ul 2mM dNTP，0.1ul Taq，3.9ul水。通过6％的PAGE胶电泳，银染方法检测。

(4)群体分离分析(bulked segregant analysis)初定位方法。用132对标记进行扩增反应，发现3号染色体上的标记OS301、OS302与OsMS2基因座位有明显的连锁关系。选取该染色体上附近引物SJ301、SJ302，在194个F2代分离群

体中进行进一步验证，发现都与OsMS2有连锁关系，并且最终确定在OS302和SJ302(图2)之间。精细定位是图位克隆的关键步骤之一，为进一步定位OsMS2位点，扩大F2代群体到7500株，从中得到用于定位突变体2420株。在OS302和SJ302之间发展了7个InDel标记(表1)，最终将OsMS2位点定位在SJ622和CL7-4之间。通过在网上(http://www.tigr.org)下载的粳稻日本晴第3号染色体拼接的序列分析，SJ622和CL7-4两标记之间物理距离大约为35kb(图2)。

(5)OsMS2基因的克隆。在这一范围35Kb内NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)和tigr(http://www.tigr.org)都预测分析有13个基因，在这些基因中有一个编码类似MS2蛋白的基因，对这些基因进行了反复测序，发现突变体中OsMS2基因所在的第八个外显子上有一碱基C的缺失(图3)。这个单碱基的缺失造成移码，并使翻译提前终止，最终不能产生有功能的蛋白。

表1  InDel分子标记及其核酸序列

分子标记	上游引物序列	下游引物序列	位置
				SJ301SJ303CL8-1CL7-4CL6-4SJ302SJ622	5’TCGCACGCAGGAATGAAC      3’5’AACCCTGATTCGATCGTATCTAT 3’5’AGCCAAACAAACACCTCCG     3’5’GCGAGCGAGACGGTGG        3’5’CCCAAATCTCGTTTTCTGCG    3’5’CGTTTGATGATAAATCAAGTCG  3’5’AGGGATTGAGGCTCTGTG      3’	5’TGGGTCGCTGTTGGGTTT     3’5’GTTTTGCGGGGCTAAGTTCTAT 3’5’TGTACTCCGTCCAGTTCTCCTT 3’5’CGAAAAGGACGCAAAAATCA   3’5’TTCTCGTGCTCGTGCCA      3’5’ATGCTCTGCTCCACCGT      3’5’CTCCATCGCTGTTCTGCT     3’	AC126221AC073556AC073556AC073556AC107225AC144491

最终从克隆AK121254上(由Rice Genome Resource Center(RGRC)提供)分离到OsMS2基因全长cDNA(详见：OsMS2基因的全长cDNA序列)。PCR引物：OsMS2cDNAF：5’-AAAAATGGGGATGAGTTCATGCG-3’和OsMS2cDNAR：5’-AAAATCAAACGGAGGCGCCG -3’PCR反应程序：94℃ 5min；1次；94℃30sec，55℃30sec；72℃30sec；34次，72℃5min，1次。

实施例3

OsMS2基因的功能分析

为了进一步验证这个基因的功能，构建了基因互补的载体pCAMBIA 1301-OsMS2，并转化突变体植株，观察突变体表型是否能够被恢复。所用引物为：OsMS2-F：5’

aaaaaaagaattctgacatggcatcaacctgaaca 3’和

OsMS2-R：5’aaaaaaactcgagttgcagttcgaaccagctcctag 3’

以粳稻9522的基因组DNA为模板进行PCR扩增约6K的片段，包括OsMS2基因的启动子、终止子和基因全长。用EcoRI和Xhol限制性内切酶进行酶切，连接用EcoRI和SalI(与Xhol为同尾酶)酶切的pCAMBIA 1301载体(图5)，构建成pCAMBIA1301-OsMS2。

将构建好的载体转换农杆菌，侵染幼穗愈伤，继代两周后转入分化培养基，有转基因苗出现后转入生根培养基，小苗长高后移入大田种植，待植株长成后观察其表型，并应用PCR方法对转基因植株进行鉴定，以确认互补构建转化成功。图9显示osms2突变体T₁代的转基因苗表型恢复，花粉形态同于野生型，并能被I-IK染色。所以osms2突变体的雄性不育确实是由于OsMS2基因的突变造成的，进而说明OsMS2基因参与了水稻的花粉发育。

osms2突变体水稻在营养发育阶段没有明显异常，但是进入生殖生长后，野生型水稻花药为黄色，osms2突变体却表现为白色花药，雄性不育，其它花器官与野生型没有明显区别(图1)。细胞学观察结果表明在花粉发育早期，小孢子外壁形成时，突变体osms2中小孢子外壁结构异常，其不像野生型那样产生典型的颗粒状外壁，而是非常光滑，且不规则，极易被醋解(图4)。在发育的后期，小孢子完全退化，引起完全雄性不育。通过生化方法检测野生型与突变体花药中脂肪醇的含量，发现osms2突变体花药中不能检测到脂肪醇，这说明OsMS2参与了水稻花药中脂肪醇的合成。

实施例4

OsMS2蛋白的表达纯化和分析

在该实施例中，以AK121254 cDNA克隆为模板，用序列如下的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物进行扩增，获得水稻OsMS2 cDNA作为插入片段。

PCR反应中使用的5’端寡核苷酸引物序列为：

PET-MS2F：5’-AAAAGGTACCATGGGGATGAGTTCATGCG-3’

该引物含有KpnI限制性内切酶的酶切位点，其中包含了起始密码子并开始编码序列；

3’端引物序列为：

PET-MS2R：5’-AAAAGAATTCTCAAACGGAGGCGCCG -3’

该引物含有EcoRI限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是翻译终止子和水稻OsMS2的部分编码序列。

水稻OsMS2基因cDNA PCR产物经纯化后与pMD-18T载体按常规方法重组并转化至感受态大肠杆菌DH5a，挑取阳性克隆鉴定后纯化并测序(ABI公司的377型测序仪)。将正确序列的水稻OsMS2基因cDNA通过KpnI和EcoRI限制性酶切位点克隆至表达载体pET30a，形成载体pET30a-OsMS2，然后转化BL21(DE3)菌株。经测序证实，pET30a-OsMS2已插入了完整的OsMS2蛋白编码序列。通过IPTG诱导，发现pET30a-OsMS2能够表达OsMS2蛋白(图7)。

挑表达OsMS2蛋白的阳性BL21克隆接种于5ml LB培养基中，37℃300rpm振荡培养过夜，1∶100稀释于LB培养基继续振荡培养1.5hr，加IPTG至1mM后诱导6hr，5,000g，4℃离心10min去上清，置冰上用10ml PBS(0.14M NaCl，2.7mM KCl，10.1mM Na2HPO4，1.8mMKH2PO4，pH7.3)重悬，超声破碎后再加入20％Triton X-100至1％轻摇30min，然后12,000g4℃离心10min，取上清装入透析袋中，50倍体积透析液I中透析10hr，换100倍透析液II中透析10hr，换100倍透析液III中透析10hr，换100倍透析液IV中透析10hr，吸出蛋白液，过Ni-NTA柱，50ml washing buffer过柱，然后20ml elution buffer过柱，收集液体，即得到水稻OsMS2蛋白。

实施例5

重组OsMS2具有脂肪酰基还原酶活性

由于OsMS2编码一种脂肪酰基还原酶，参与到脂肪醇的生化合成途径中。如果OsMS2发生突变，必然会引起脂肪醇等一系列相关代谢产物含量发生变化。通过GC-MS(气相色谱)实验检测到了突变体中脂肪醇含量的变化。这证明了OsMS2在体内是具有脂肪酰基还原酶功能的。体外重组表达OsMS2蛋白，并做酶活实验进一步也证明了其能够将脂肪酸还原成脂肪醇。具体如下：

体外表达重组的OsMS2蛋白(图7)，通过气相色谱质谱联用(GC-MS)来测定重组OsMS2中脂肪醇含量的变化，进而证明OsMS2基因的功能(图8A，B，C)。选取C16，C18，C20脂肪酸作为作用底物，选取C16，C18，C20脂肪醇混合物为标准品(图8A)，结果表明，与作为对照的pET-30a空载体构成的重组蛋白相比(图8C)，pET30a-OsMS2重组蛋白提取物中16，18，20个碳原子的脂肪醇含量明显升高(图8B)，这说明OsMS2蛋白的表达与大肠杆菌中脂肪醇含量的升高很可能存在联系，即OsMS2基因参与了脂肪醇的合成，OsMS2蛋白是脂肪醇合成途径中的一个催化脂肪酸还原成脂肪醇的脂肪酰基还原酶。

序列表

<110>上海交通大学

<120>水稻OsMS2基因及其编码的蛋白

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1827

<212>DNA

<213>Oryza sativa

<400>1

atggggatga gttcatgcgt gaacctatcc cgtgtcgccg ccgccgccgc agggagacgg    60

ccgggatttg ccggtgagct gggaggtcgc cgtggtcatg gcagaagcgt gcttccggtt    120

gttgctgcac tgccggtgag gaggaaggga agcggttgtg gcgtggcgtg ctgcgtctcc    180

tcctcgtctt cctcctccgt gcacggcaag aactcggcgg cggcggcgga gggtcacgcc    240

ggcggcattg ggatcgcgga gttcctcggc ggcaagaact tcctcatcac cggcggaacc    300

gggttcctgg caaaagttct catcgagaag atattgcgga cgaatcccga cgttggcaag    360

atctacgtgc tgatcaaggc gaaggacggt gacgcagcac tgaaaagatt gcacaacgag    420

gttgtggaca cagaattgtt cagtcgtttg caggaaatcc atggcaagga ttaccacagc    480

ttcgcggcaa gaaagctggt gcctgtagtc ggagatgtca gagaagccaa cgttggcatc    540

gcccctgagc ttgccggcgt gatcgccgac gaggtcgaca tcatcgtcaa ctcagcagca    600

aacaccactt tcgacgagag gtacgatgtt gcaatggaca tcaacaccgt agggccattc    660

aggataatga gcttcgcgca gcggtttcgg aggctgaagc tgttcttgca agtgtcaaca    720

gcatatgtga acggacagag gcaaggtgtg gtgctagaga agccatttcg cttgggggac    780

accatagcca aggagttagg atctccagat tcttcacaac acaagaacac catgcttgac    840

atcgaggcag agatcaagct ggcttttgac cacaggagac acggtgatga ttcagcctct    900

ttctctgaag aaatgaaaga gttaggatta gagagggcaa aactccatgg gtggcaagat    960

acatatgtgt tcaccaaggc catgggagag atggtgatca actccatgcg aggagatata    1020

ccggttgtca ccatcaggcc aagcgtcatc gagagcacct ggagggatcc cttccccggt    1080

tggatggaag ggaacaggat gatggatcct gttgtgctgt actacggcaa aggccagctg    1140

agcgggttcc tcgctgaccc ggagggtgtt cttgacgtgg ttccggcgga catggtggtg    1200

aacgcaacgc tggcgtccat ggcgaagcac gggcgcggcg gcgcggcggc ggcggcggcg    1260

gcggcggagg ggatgcacgt gtaccacgtg gcgtcgtcga cggtgaaccc gctggcgttc    1320

ggcgacctga gccggttcct cttccagcac ttcacggggt cgccgtacag cgacgcggcg    1380

gggcggccca tccacgtgcc gccgatgcgg ctgttcgaca ccatggagca gttcgccagc    1440

tacgtcgaga ccgacgcgct gctgcgcgcc ggccgcctcg ccggcgccgg cgccggcgcc    1500

ggagacgaga gggtgtcgca gcggctgcgc gagctctgcg ccaagtccgt cgagcagacc    1560

atctacctcg gcagcatcta ccagccctac accttctacg gcggcaggtt cgacaatggg    1620

aacacggagg cgctgatcgg ggagatgtcg gaggaggaga aggcgcggtt ccacttcgac    1680

gtgaggagca tcgagtggac ggactacatc accaacgtgc acatcccggg gctcaggaag    1740

cacgtcatga aggggagggg cgtcggcggc ggcagcggcg cgtcgtcgtc atcgaacgcc    1800

tcgctgctcg ccggcgcctc cgtttga                                        1827

<210>2

<211>608

<212>PRT

<213>Oryza sativa

<400>2

Met Gly Met Ser Ser Cys Val Asn Leu Ser Arg Val Ala Ala Ala Ala

1               5                   10                  15

Ala Gly Arg Arg Pro Gly Phe Ala Gly Glu Leu Gly Gly Arg Arg Gly

            20                  25                  30

His Gly Arg Ser Val Leu Pro Val Val Ala Ala Leu Pro Val Arg Arg

        35                  40                  45

Lys Gly Ser Gly Cys Gly Val Ala Cys Cys Val Ser Ser Ser Ser Ser

    50                  55                  60

Ser Ser Val His Gly Lys Asn Ser Ala Ala Ala Ala Glu Gly His Ala

65                  70                  75                  80

Gly Gly Ile Gly Ile Ala Glu Phe Leu Gly Gly Lys Asn Phe Leu Ile

                85                  90                  95

Thr Gly Gly Thr Gly Phe Leu Ala Lys Val Leu Ile Glu Lys Ile Leu

            100                 105                 110

Arg Thr Asn Pro Asp Val Gly Lys Ile Tyr Val Leu Ile Lys Ala Lys

        115                 120                 125

Asp Gly Asp Ala Ala Leu Lys Arg Leu His Asn Glu Val Val Asp Thr

    130                 135                 140

Glu Leu Phe Ser Arg Leu Gln Glu Ile His Gly Lys Asp Tyr His Ser

145                 150                 155                 160

Phe Ala Ala Arg Lys Leu Val Pro Val Val Gly Asp Val Arg Glu Ala

                165                 170                 175

Asn Val Gly Ile Ala Pro Glu Leu Ala Gly Val Ile Ala Asp Glu Val

            180                 185                 190

Asp Ile Ile Val Asn Ser Ala Ala Asn Thr Thr Phe Asp Glu Arg Tyr

        195                 200                 205

Asp Val Ala Met Asp Ile Asn Thr Val Gly Pro Phe Arg Ile Met Ser

    210                 215                 220

Phe Ala Gln Arg Phe Arg Arg Leu Lys Leu Phe Leu Gln Val Ser Thr

225                 230                 235                 240

Ala Tyr Val Asn Gly Gln Arg Gln Gly Val Val Leu Glu Lys Pro Phe

                245                 250                 255

Arg Leu Gly Asp Thr Ile Ala Lys Glu Leu Gly Ser Pro Asp Ser Ser

            260                 265                 270

Gln His Lys Asn Thr Met Leu Asp Ile Glu Ala Glu Ile Lys Leu Ala

        275                 280                 285

Phe Asp His Arg Arg His Gly Asp Asp Ser Ala Ser Phe Ser Glu Glu

    290                 295                 300

Met Lys Glu Leu Gly Leu Glu Arg Ala Lys Leu His Gly Trp Gln Asp

305                 310                 315                 320

Thr Tyr Val Phe Thr Lys Ala Met Gly Glu Met Val Ile Asn Ser Met

                325                 330                 335

Arg Gly Asp Ile Pro Val Val Thr Ile Arg Pro Ser Val Ile Glu Ser

            340                 345                 350

Thr Trp Arg Asp Pro Phe Pro Gly Trp Met Glu Gly Asn Arg Met Met

        355                 360                 365

Asp Pro Val Val Leu Tyr Tyr Gly Lys Gly Gln Leu Ser Gly Phe Leu

    370                 375                 380

Ala Asp Pro Glu Gly Val Leu Asp Val Val Pro Ala Asp Met Val Val

385                 390                 395                 400

Asn Ala Thr Leu Ala Ser Met Ala Lys His Gly Arg Gly Gly Ala Ala

                405                 410                 415

Ala Ala Ala Ala Ala Ala Glu Gly Met His Val Tyr His Val Ala Ser

            420                 425                 430

Ser Thr Val Asn Pro Leu Ala Phe Gly Asp Leu Ser Arg Phe Leu Phe

        435                 440                 445

Gln His Phe Thr Gly Ser Pro Tyr Ser Asp Ala Ala Gly Arg Pro Ile

    450                 455                 460

His Val Pro Pro Met Arg Leu Phe Asp Thr Met Glu Gln Phe Ala Ser

465                 470                 475                 480

Tyr Val Glu Thr Asp Ala Leu Leu Arg Ala Gly Arg Leu Ala Gly Ala

                485                 490                 495

Gly Ala Gly Ala Gly Asp Glu Arg Val Ser Gln Arg Leu Arg Glu Leu

            500                 505                 510

Cys Ala Lys Ser Val Glu Gln Thr Ile Tyr Leu Gly Ser Ile Tyr Gln

        515                 520                 525

Pro Tyr Thr Phe Tyr Gly Gly Arg Phe Asp Asn Gly Asn Thr Glu Ala

    530                 535                 540

Leu Ile Gly Glu Met Ser Glu Glu Glu Lys Ala Arg Phe His Phe Asp

545                 550                 555                 560

Val Arg Ser Ile Glu Trp Thr Asp Tyr Ile Thr Asn Val His Ile Pro

                565                 570                 575

Gly Leu Arg Lys His Val Met Lys Gly Arg Gly Val Gly Gly Gly Ser

            580                 585                 590

Gly Ala Ser Ser Ser Ser Asn Ala Ser Leu Leu Ala Gly Ala Ser Val

        595                 600                 605

Claims (8)

1.一种水稻OsMS2基因，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的水稻OsMS2基因编码的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.一种质粒，其特征在于，该质粒包含SEQ ID NO：1所示的基因。

4.一种植物表达载体，其特征在于，该载体包含SEQ ID NO：1所示的基因。

5.一种宿主细胞，其特征在于，该宿主细胞包含SEQ ID NO：1所示的基因。

6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征是，所述宿主细胞为大肠杆菌。

7.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征是，所述宿主细胞为农杆菌。

8.一种根据权利要求1所述的水稻OsMS2基因编码的蛋白制备水稻雄性不育株的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一，将包含SEQ ID NO：1所示的基因的植物表达载体转化入水稻细胞；

步骤二，培育转化的水稻细胞，得到水稻雄性不育株。

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