CN102242111B - 具有cyp704b2基因的载体的应用 - Google Patents

Abstract

一种基因工程技术领域的CYP704B2基因及其编码蛋白的应用。本发明涉及一种编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：(a)由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有脂肪酸羟基化酶活性的由(a)衍生的蛋白质；本发明还涉及一种质粒，该质粒包含如SEQ ID NO：1所示的基因；本发明还涉及一种宿主细胞，该宿主细胞包含如SEQ ID NO：1所示的基因；本发明还涉及一种多肽，该多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明的CYP704B2基因为花药特异性表达基因，该基因具有调控水稻花药表皮层和花粉外壁角质单体成份合成的功能，该基因功能的缺失会特异性导致水稻的雄性不育。

Description

具有CYP704B2基因的载体的应用

本发明专利申请为中国发明专利申请号200910309083.1，申请日2009年10月30日，申请人“上海交通大学”，发明名称“CYP704B2基因及其编码的蛋白”的分案申请。

技术领域

本发明涉及一种基因工程技术领域的基因及其编码的蛋白，具体涉及一种具有CYP704B2基因(细胞色素P450基因)的载体的应用。

背景技术

水稻是我国最主要的粮食作物之一，我国有60％以上人口以稻米为主食，是世界上最大的稻米生产国和消费国。我国水稻年播种面积3000万公顷，占世界的20％；产量1.85亿吨，占世界的近1/3，单位面积产量6.35吨/公顷，比全球平均产量3.85吨/公顷高65％。水稻在我国谷物产量中始终保持在总量的40％左右，占据了近半壁江山，其中一个重要的原因就是水稻雄性不育系的发明与杂种优势的广泛应用发挥了举足轻重的作用。生物界不同遗传背景的亲本配组所产生的F1代都比其父母代具有更强的生长势和抗逆性，这就是杂种优势。作物杂种优势利用是提高作物产量的重要途径，杂交水稻的推广应用，为中国乃至世界的粮食增产做出了巨大贡献，而作物雄性不育系是有效利用杂种优势的前提和基础。利用水稻雄性不育系生产杂交种子，使水稻的杂种优势在生产上得以广泛应用才成为可能。因此，研究选育新型水稻雄性不育系并对其调控机理进行深入研究，是进一步发掘水稻优质和超高产品种必要前提和基础。

水稻雄性器官花药的发育是一个复杂的过程，涉及到花药细胞的分裂分化，花粉母细胞的减数分裂和花粉的有丝分裂等发育过程，任何发育过程的异常都可影响花粉的正常发育。绒粘层是花药壁细胞中的最内层细胞，与花粉母细胞和小孢子直接接触，该层细胞是花药各层细胞中代谢最活跃和旺盛的一层细胞，能合成和分泌花粉成熟所需的一些营养物质及外壁组成成份。另一方面，在高等开花植物的雄性器官花药的发育过程中，可育花粉的形成和成熟绝大部分依赖于花药配子体壁细胞层如表皮层，内皮层，中层和绒粘层的物质代谢，营养供给及其抵御外界不利生长因子的保护作用。因此，花粉外壁的正常形成是可育花粉发育和成熟的决定性因素。现有的转基因工程技术是建立在对植物正常发育过程分子调控机制充分研究和认识的基础上加以应用的，因此，深入研究水稻雄蕊发育及小孢子成熟过程、分子调控机理及调控网络并加以应用是在生产上研发新型雄性不育株系的基础。阻碍绒毡层及小孢子外壁正常发育是水稻雄性不育株系生产的有效途径之一。但是目前对水稻绒毡层发育的分子调控网络，特别是花粉外壁组成成份及其分子调控机制和网络还不清楚。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种具有CYP704B2基因的载体的应用。本发明的CYP704B2基因为花药特异性表达基因，该基因具有调控水稻花药表皮层和花粉外壁角质单体成份合成的功能，该基因功能的缺失会特异性导致水稻的雄性不育。

本发明是通过以下的技术方案实现的：

本发明涉及一种编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：

(a)由SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有脂肪酸羟基化酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

所述基因的序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还涉及一种质粒，该质粒包含如SEQ ID NO：1所示的基因。

本发明还涉及一种宿主细胞，该宿主细胞包含如SEQ ID NO：1所示的基因。

本发明还涉及一种多肽，该多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：本发明的CYP704B2基因为花药特异性表达基因，该基因具有调控水稻花药表皮层和花粉外壁角质单体成份合成的功能，该基因功能的缺失会特异性导致水稻的雄性不育；可利用敲除或抑制CYP704B2的特异性表达技术获得新的水稻雄性不育系，在农业生产上具有十分重要的应用。

附图说明

图1CYP704B2突变体植株的形态学观察示意图；

图2CYP704B2突变体花药角质单体合成缺陷的示意图；

图3CYP704B2座位定位示意图；

图4CYP704B2基因组序列示意图；

图5CYP704B2互补植株的形态学观察对比图；

图6CYP704B2突变体和野生型9522花药组织切片示意图；

图7CYP704B2体外表达蛋白催化C16和C18脂肪酸的ω羟基化的催化活性和效率的分析结果示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本实施例。这些实施例仅用于说明本实施例而不用于限制本实施例的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

在实施例中，“分离的”、“纯化的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。

在实施例中，术语“调控水稻花粉外壁角质单体合成的蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有调控花粉外壁角质单体合成的单氧酶活性多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO：1中第1～1635位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO：1序列的编码框第1～1635位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO：1中第1～1635位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO：1所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与SEQ ID NO：1中从核苷酸第1～1635位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO：1中从核苷酸第1～1930位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。

该术语还包括能编码具有与天然的调控水稻花粉外壁角质单体合成的相同功能的蛋白的SEQ ID NO：2中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1～90个，较佳地1～60个，更佳地1～20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

在实施例中，术语“调控水稻花粉外壁角质单体合成蛋白”指具有调控水稻花粉外壁角质单体合成蛋白活性的SEQ ID NO：2序列的多肽。该术语还包括具有与天然调控水稻花粉外壁角质单体合成的脂肪酸羟化酶SEQ ID NO：1序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括调控水稻温光敏核不育蛋白的活性片段和活性衍生物。

实施例的调控水稻花粉外壁角质单体合成蛋白的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与水稻花粉外壁角质单体合成相关DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用水稻花粉外壁角质单体合成相关多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。

在实施例中，“调控水稻花粉外壁角质单体合成蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO.2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。

本实施例还包括调控水稻花粉外壁角质单体合成蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然调控花粉外壁角质单体合成相关蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，实施例的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在实施例中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产实施例的水稻温光敏不育相关多肽时，可以将调控水稻温光敏核不育蛋白编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成调控水稻温光敏核不育相关蛋白表达载体。

如实施例所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子调控序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

在实施例中，术语“宿主细胞”为真核细胞。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、水稻细胞和其它植物细胞。

还可用Northern印迹法技术分析调控花粉外壁角质单体合成基因产物的表达，即分析调控花粉外壁角质单体合成基因的RNA转录物在细胞中的存在与否和数量。

此外，实施例还提供了一种可用作探针的核酸分子，该分子通常具有调控水稻花粉外壁角质单体合成基因的核苷酸编码序列的8-100个连续核苷酸，较佳地具有15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码调控水稻花粉外壁角质单体合成相关的核酸分子。

此外，根据实施例的调控水稻花粉外壁角质单体合成基因的核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表达蛋白质的同源性基础上，筛选调控水稻花粉外壁角质单体合成相关同源基因或同源蛋白。

实施例的调控水稻花粉外壁角质单体合成相关核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据实施例所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可通过化学合成将突变引入实施例蛋白序列中。

除了用重组法产生之外，实施例蛋白的片段还可用固相技术，通过直接合成肽而加以生产。在体外合成蛋白质可以用手工或自动进行。可以分别化学合成实施例蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。

实施例是利用γ射线对粳稻9522品系进行处理，种植后在F2代挑选花药发育异常的突变体，挑选分离比为3∶1的隐性单基因突变体为研究对象。获得一新的水稻隐性雄性不育突变体CYP704B2。通过遗传定位方法，首先将突变基因座位定位在水稻第3染色体InDel标记OS302和SJ301之间。进一步精细定位，在这两个标记之间发展了5对有多态性InDel分子标记，将该基因座位定位在CL8-1和SJ622之间，物理距离为116kb。在CL8-1引物附近设计合成的引物primer1进行PCR扩增发现该引物在突变体CYP704B2中不能扩增出任何片段，推测突变体中该区域可能存在染色体片段的缺失。通过对primer 3F和primer 2R引物扩增的突变体片段测序分析表明该突变体在primer2和primer3之间存在3.1K的缺失，其中一个TPR基因的3’端缺失258bp，另一个细胞色素P450基因的启动子和基因组区域缺失2844bp.通过功能互补实验分析确定细胞色素P450基因的缺失造成了水稻花粉的不育。已知的文献报道表明，细胞色素P450基因在植物中是一个在植物进化过程中基因发生复制和拷贝最多的一个家族，它们在植物生长的许多方面，如在植物的进化过程中使植物适应陆地生长条件，参与植物激素类的合成及其信号转导途径，参与植物次生代谢及其脂类代谢途径等等。除此之外，细胞色素P450基因家族成员也参与了植物雄性发育的过程，例如拟南芥CYP703A2基因的突变导致花药中少数花粉的不育，本研究发现的CYP704B2基因是新发现的在水稻中参与植物雄性发育过程的基因。将这个基因命名为CYP704B2(Cytochrome 704B2)基因。

通过对花药不育突变体CYP704B2花器官发育各时期进行组织切片、扫描电镜、染色体观察，发现该基因的突变会导致水稻小孢子从四分体中释放出来后，花粉外壁不能正常合成，单核期小孢子开始降解，成熟花药中无花粉粒；通过启动子加分子标记GUS分析表明CYP704B2基因从减数分裂至空泡花粉期在花药的绒粘层和小孢子中特异表达；RT-PCR也表明CYP704B2基因在花药中特异性表达，在根、茎、叶及内外稃中均不表达；生化测定分析表明突变体花药表面角质单体减少了90％以上，体外酵母表达分析发现该基因能催化角质单体前体C16和C18脂肪酸ω位点的羟基化，形成ω羟基化的角质单体；互补实验显示CYP704B2基因可以恢复突变体的表型。说明该基因功能确实是影响到水稻的花粉发育，这种影响可能是通过调节花粉外壁角质单体成份的合成来实现。

实施例1

CYP704B2突变体植株的获得和形态学的观察

该突变体采用60Coγ射线诱变粳稻9522(Wild type/WT)种子，处理剂量为280Gy。对诱变的F2代中一雄性不育突变体三代回交，获得隐性单基因调控的稳定遗传的突变体CYP704B2。CYP704B2突变体与粳稻9522回交，F1代全部为可育，自交F2代中出现分离，其中正常植株为78，突变株为23(χ2＝0.161)，表明该雄性不育突变体表型由一个单核基因突变造成。

对CYP704B2突变体植株的形态学观察。如图1，野生型和突变型CYP704B2的表型对比显示：野生型稻穗结实后下垂(左)，而CYP704B2突变型小穗不结实呈直立状(右)，野生型花药包含成熟花粉呈现为黄色(左)(B，C)，突变型CYP704B2花药为淡黄色且无花粉粒(右)(B，C)。

实施例2

CYP704B2突变体花药角质单体成份的测定示意图

步骤一，花药角质单体的抽提。选择野生型和突变体二孢时期的冻干花药约4mg，用700μl氯仿抽提花药表面的蜡质成份后，随后再加入700μl氯仿于50℃处理30min后于摇床上轻微摇动过夜，重复该步骤约4～6次确保所有的脂类已被抽提。用硅胶干燥器干燥后的脱脂花药进一步用来分析花药表面的角质单体成份。干燥的脱脂花药用1ml含有1当量盐酸的甲醇溶液于80℃处理2h，该转酯反应能将脱脂的花药解聚，释放出易被抽提的，且能用于GC和GC-MS分析的甲酯化物质，之后加入2ml饱和的NaCl水溶液和20ug的三十二烷内标，用1ml正己烷抽提疏水性的角质单体，重复抽提共3次。

步骤二，角质单体的衍生，GC-MS和GC-FID检测分析。含角质单体的抽提液用氮吹仪吹干，迅速加入160ul的吡啶和40ul的双三甲基硅三氯乙酰胺混匀，70℃衍生40min.Agilent6890N GC-5973N MS用来分析花药表面的角质单体，检测条件如下：50进柱并停留2min，以10℃每分钟的速度升温至150℃，150℃停留1min，再以3℃每分钟的速度升温至310℃。根据出峰时间和出峰面积对角质单体成份进行定性和定量分析(图2)。

实施例3

CYP704B2基因的定位和克隆

步骤一，定位群体，将CYP704B2与籼稻品系龙特甫B杂交，自交获得F2代，选择其中为雄性不育植株为定位群体；

步骤二，水稻DNA提取。采用改进的CTAB法进行提取，包括如下步骤：取叶片0.1～0.2克(约半片)放到小研钵中，加入适量的液氮，立刻研磨至粉状，装入2ml离心管，加入700ul 100℃预热的1.5xCTAB溶液于离心管中，小心混匀后放入56℃水浴，20分钟后取出离心管，加入等体积氯仿/异戊醇，猛烈混匀，13000rpm离心10分钟，取上清于新管中，加入900ul无水乙醇混匀后-20℃放半小时以上。将析出的DNA离心，14000rpm离心10分钟。去掉上清，将沉淀用1ml70％乙醇清洗一次，离心干燥，溶于200ul 1/10TE或水中，4℃冰箱保存；

步骤三，InDel分子标记分析。共设计了132对多态性标记，SSR引物根据已发表的序列合成(http://www.gramene.org/microsat/ssr.html)，其他InDel分子标记设计是根据比较粳稻日本晴和籼稻9311两品系的已公布的核苷酸序列，对差异的部分设计引物，验证2个亲本粳稻9522和籼稻广陆矮之间的多态性，PCR扩增程序为：10ul体系中，1ul模板，1ul 10pmol/ulPrimer1，1ul 10pmol/ul Primer2，1ul 10×Buffer(Mg2+)，1ul 2mM dNTP，0.1ul Taq，3.9ul水。之后通过6％的PAGE胶电泳，银染方法检测。

步骤四，群体分离分析(bulked segregant analysis)初定位方法

应用这些多态性标记进行PCR扩增分析，在194个定位群体中发现突变基因与3号染色体上的Marker CL6-4和SJ301表现连锁，进一步扩大定位群体(1668个)和设计另外的多态性标记定位发现该基因处于距离为116kb的SJ622和LH301两个Marker之间(图3A)。而定位群体扩大至2700个隐性单体时，引物CL8-1仍未发现重组子。推测该突变体位点可能存在该标记的附近。在该标记附近设计的三对引物1，2和3(图3B)，扩增发现其中在突变体中引物1一直不能扩增出野生型的条带，引物2PCR扩增情况正常，引物3也能扩增出相应大小的目的片段。因此用引物3的正向引物3-F和引物2的反向引物2-R在突变体基因组模板中进行PCR扩增发现，突变体中该区域仅有1.5kb，而野生性9522基因组中该区域长度为4.6kb.通过对突变体中该区域的扩增片段进行测序分析发现突变体中有3102base的缺失，缺失区域包括Os03g07260基因3’末端258bp，Os03g07250基因的1，732bp和两基因间的1，112bp区域(图3B)。

Os03g07260编码一tetratricopeptide repeat domain(TPR)蛋白，Os03g07250基因编码一个含545个氨基酸的细胞色素P450蛋白，其中该基因有472个氨基酸的缺失，具体见图4，图4中，下划线表示CYP704B2缺失区域的氨基酸序列。

用分子标记对定位群体中的雄性不育单株进行基因型分析，利用MapDraw V2.1构建目标基因区域的分子标记的连锁图谱(图2)。所用标记的序列如表1。

表1 InDel分子标记及其核酸序列

实施例4

CYP704B2基因的功能分析

为了进一步验证这个基因的功能，构建了基因互补的载体，并转化突变体植株，观察突变体表型是否能够被恢复。从水稻日本晴BAC克隆(OSJNBa0091P11)中用引物primer 1-F：5′aaaGGATCCAGGTGGAAGACAAGGTGGTG 3′and primer 2-R：5′aaaCTGCAGTTGGTCGAACACGAGGTAGG 3′扩增出含CYP704B2全长基因组序列的3.8kb片段，该片段覆盖Os03g07250起始密码子上游1.23kb和终止密码子下游649bp。将该片段通过BamH1和Pst1插入到pCAMBIA1301载体中，pCAMBIA1301：测序验证正确，CYP704B2通过热击导入农杆菌EHA105，使用遗传手段转化突变体幼穗愈伤，以观察是否会引起植株恢复野生型性状。T0代获得互补植株，图5显示T0代互补植株CYP704B2突变体花粉发育恢复，花药中含成熟花粉变成黄色，T1代出现可育∶不育植株的分离比为3∶1(50株可育∶17株不育)；图5中，B图为互补植株花药表面结构，C图为互补植株的成熟花粉粒。

由此可见所克隆的CYP704B2基因是引起CYP704B2突变体雄性不育表型的基因。通过对花药不育突变体CYP704B2花器官发育各时期进行组织切片观察，发现CYP704B2基因的

突变会导致水稻在小孢子不能发育成正常的成花粉粒，最后在突变体花药中被彻底瓦解，具体见图6；图6中，E：表皮层，En：内皮层，Mi：中层，T：绒毡层，Tds：四分体，Ms：小孢子，DMs：降解的小孢子，ST：膨大的绒毡层。说明CYP704B2基因是调控水稻雄性不育的基因，对花药中角质单体的合成具有调控作用。

实施例5

CYP704B2体外表达蛋白催化C16和C18脂肪酸的ω羟基化

步骤一，全长CDNA的分离。用带有BamHI的正向引物5’-AAAGGATCCATGAAGAGCCCCATGGAGGA-3’和带有KpnI反向引物：5’-AAAGGTACCTCAGACGGAGGTGGAGACGCGGA-3’从水稻花药CDNA模板中分离得到CYP704B2的全长CDNA，将分离得到的全长CDNA经测序正确后装入酵母表达载体pYeDP60，转化毕赤酵母WAT11菌株。

步骤二，在酵母细胞中表达CYP704B2蛋白。选择含有目的构建的酵母单菌落在SGI液体培养基中生长过夜后，1∶50稀释到500mlYPGE培养基中生长至细胞密度为8＊107/ml。加入半乳糖浓度至20g/L来启动蛋白的表达，诱导约8～15小时后细胞密度为2～5＊108/ml，收获菌体悬浮于含有1mM EDTA和600mM山梨醇的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)中，用0.45mm直径的玻璃珠手动破碎酵母细胞壁，10,000g离心10min，上清液再用100,000g离心1h，沉淀用匀浆机悬浮于50mM Tris-HCl(pH 7.4)，1mM EDTA和30％(v/v)glycerol中，保存于-30℃，p450蛋白的浓度用CO法测定。

步骤三，CYP704B2酶的底物特异性分析。用7.5pmol的P450蛋白和100μM的C14标记的脂肪酸一起加入含1mM NADPH的20mM磷酸钠缓冲液中(pH 7.4)，通过加入20μl0.2％乙酸终止酶活反应。通过薄层层析分离反应体系中的反应产物和酶活底，含有代谢物的区域用液体闪烁计数器进行定量分析，同时p450酶的底物特异性通过GC-MS进行定性分析，根据所测物质的峰面积进行定量统计分析，图7是CYP704B2对各底物(棕榈酸，油酸，亚油酸和亚麻酸)的催化活性和效率的分析结果示意图。

分子离子峰m/z(相对强度％)为73(23％)(CH3)3Si+，75(29％)((CH3)2Si+＝O)，103(14％)(CH2(OSi(CH3)3))，146(9％)(CH2＝C+(OSi(CH3)3-OCH3)，159(6％)(CH3-O+＝C+(OSi(CH3)3)CH＝CH2)，311(100％)(M-47)，327(4％)(M-31)，343(32)％(M-15)为16-羟基C16脂肪酸。

分子离子峰m/z(相对强度％)为73(100％)(CH3)3Si+，75(95％)((CH3)2Si+＝O)，103(28％)(CH2(OSi(CH3)3))，146(17％)(CH2＝C+(OSi(CH3)3-OCH3)，159(20％)(CH3-O+＝C+(OSi(CH3)3)CH＝CH2)，337(51％)(M-47)，353(8％)(M-31)，369(19％)(M-15)，384(12％)(M)为18-羟基C18(1)脂肪酸。

分子离子峰m/z(相对强度％)为73(100％)(CH3)3Si+，75(75％)((CH3)2Si+＝O)，103(17％)(CH2(OSi(CH3)3))，146(10％)(CH2＝C+(OSi(CH3)3-OCH3)，159(14％)(CH3-O+＝C+(OSi(CH3)3)CH＝CH2)，335(11％)(M-47)，351(5％)(M-31)，369(9％)(M-15)，382(2％)(M)为18-羟基C18(2)脂肪酸；

分子离子峰m/z(相对强度％)73(100％)(CH3)3Si+，75(17％)((CH3)2Si+＝O)，103(69％)(CH2(OSi(CH3)3))，146(2％)(CH2＝C+(OSi(CH3)3-OCH3)，159(4％)(CH3-O+＝C+(OSi(CH3)3)CH＝CH2)，337(2％)(M-47)，353(0.5％)(M-31)，369(3％)(M-15)，380(0.5％)(M)18-羟基C18(3)脂肪酸。

本实施例利用水稻隐性雄性不育突变体CYP704B2，通过遗传定位方法，分离到一个新的调控水稻花粉角质单体的蛋白及其基因序列，该蛋白在调控花粉外壁角质单体的合成和发育方面具有明显的作用，可以利用该基因通过遗传工程的手段产生新的水稻雄性不育系，用来生产杂交种子。

Claims (4)

1.一种CYP704B2基因的应用，其特征在于，所述的CYP704B2基因的碱基序列如SEQ ID NO：1所示；所述的应用是指：该基因用于调控水稻花药表皮层和花粉外壁角质单体成份合成，利用敲除或抑制该基因的特异性表达，以获得水稻的雄性不育系。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征是，通过突变CYP704B2基因获得水稻雄性不育材料。

3.一种权利要求1中所述CYP704B2基因所编码的多肽的应用，该多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，其特征在于，利用其催化C16和C18脂肪酸的ω羟基化，实现花粉外壁和花药外壁的正常发育。

4.一种恢复CYP704B2基因缺失导致的水稻的雄性不育的方法，其特征在于，从水稻日本晴BAC克隆中用引物扩增出含CYP704B2全长基因组序列的3.8kb片段，该片段覆盖Os03g07250起始密码子上游1.23kb和终止密码子下游649bp，将该片段通过BamH1和Pst1插入到pCAMBIA1301载体中，通过热击导入农杆菌EHA105，使用分子手段转化突变体愈伤并实现野生型性状的恢复；

所述的CYP704B2基因的碱基序列如SEQ ID NO：1所示；

所述的引物序列为

primer 1-F: 5' aaaGGATCCAGGTGGAAGACAAGGTGGTG 3'，

primer 2-R: 5' aaaCTGCAGTTGGTCGAACACGAGGTAGG 3'。

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