CN103348008B - 产生脂酰CoA衍生物的基因破坏子 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了微生物生物体,特别地酵母例如解脂耶罗维亚酵母,其具有一个或多个被破坏的基因。所述基因破坏可产生提高的脂酰CoA衍生物产量。
Description
相关申请的交叉参考
本申请要求2010年12月23日提交的美国临时申请No.61/427,032和2011年6月29日提交的美国临时申请No.61/502,697的优先权利益,所述临时申请各自的完整内容通过引用并入本文。
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发明领域
本发明涉及显示改善的性质,特别地改善的脂酰CoA衍生物产量的经修饰的微生物。
发明背景
微生物产生脂酰CoA和脂酰CoA衍生物,例如脂肪醇、脂肪酸、脂肪醛、脂肪酯、脂肪醋酸酯、蜡酯、烷烃和烯烃。此类脂酰CoA衍生物可用于产生许多种产品,包括喷气燃料和柴油机燃料(例如,生化柴油)、化学表面活性剂、聚合物、营养补剂、药物、食品添加剂、化妆品和个人护理品。
脂肪酸是细胞膜的主要组分并且被生物体用于能量贮存。脂肪酸通过脂酰CoA的β-氧化而代谢,或相反地,脂肪酸通过脂肪酸合酶的多酶复合物从乙酰-CoA合成。脂肪醇是脂肪酰基-硫酯底物(例如,脂酰CoA或脂酰ACP)的还原产物,且与脂肪酸一样,可通过培养细胞酶促产生。将脂肪酰基-硫酯底物(例如,脂酰CoA或脂酰ACP)转化成脂肪醇的酶通常称为"脂肪醇形成酰基-CoA还原酶(fattyalcoholformingacyl-CoAreductase)"或"脂肪酰基还原酶"("FAR")。
从微生物生物体商业产生和回收脂肪醇是个挑战,这部分是因为脂肪醇在许多微生物中不太稳定。脂肪醇(例如,十六醇)可用作微生物的碳源,从而可在商业目的的回收之前被微生物代谢。脂肪醇可能被催化烷烃氧化为脂肪酸(通过脂肪醇)的酶降解。脂肪酸还可进一步被β-氧化途径中的酶降解成乙酰-CoA或被一组乙酰基转移酶转化成贮藏脂质。
因此,需要有效产生脂酰CoA衍生物的微生物生物体。
发明概述
本发明提供了,显示改善的性质(包括提高的脂酰CoA衍生物产量)的经修饰的微生物生物体。在一些方面,经修饰的微生物生物体具有被破坏的基因,相较于其中所述基因未被破坏的相同类型的对照生物体,所述破坏的基因赋予提高的脂酰CoA衍生物产量。在一个实施方案中,所述生物体是解脂耶罗维亚酵母(Yarrowialipolytica)。
在一个方面,本发明涉及,其中一个或多个内源基因被破坏并且包含有效地连接于启动子的编码功能性脂肪酰基还原酶(FAR)蛋白的外源基因的微生物生物体,其中内源基因是YALI0C17545或其同源物和/或YALI0E28336或其同源物。在另一个方面,内源YALI0C17545基因或其同源物以及内源基因YALI0E28336或其同源物被破坏。在另一个方面,微生物生物体还包括内源基因YALI0E11099或其同源物以及内源基因YALI0E28534或其同源物中的一个或多个的破坏。在另一个方面,内源基因YALI0E11099或其同源物以及内源基因YALI0E28534或其同源物被破坏。在另一个方面,微生物生物体还包括选自YALI0B10406、YALI0A19536、YALI0E32769、YALI0E30283、YALI0E12463、YALI0E17787、YALI0B14014、YALI0A10769、YALI0A15147、YALI0A16379、YALI0A20944、YALI0B07755、YALI0B10175、YALI0B13838、YALI0C02387、YALI0C05511、YALI0D01738、YALI0D02167、YALI0D04246、YALI0D05291、YALI0D07986、YALI0D10417、YALI0D14366、YALI0D25630、YALI0E03212、ALI0E07810、YALI0E12859、YALI0E14322、YALI0E15378、YALI0E15400、YALI0E18502、YALI0E18568、YALI0E22781、YALI0E25982、YALI0E28314、YALI0E32417、YALI0F01320、YALI0F06578、YALI0F07535、YALI0F14729、YALI0F22121、YALI0F25003、YALI0E14729、YALI0B17512及其同源物的一个或多个内源基因的破坏。在另一个方面,内源基因YALI0B17512被破坏。
在另一个方面,两个或更多个内源基因被破坏。在另一个方面,三个或更多个内源基因被破坏。在另一个方面,四个或更多个内源基因被破坏。
在另一个方面,微生物生物体包含:内源基因的编码序列的全部或部分的缺失、内源基因的突变(以便基因编码具有降低的活性的多肽),抑制内源基因的表达的反义RNA或小干扰RNA或减少内源基因的表达的经修饰的调控序列。在一个实施方案中,微生物生物体包含内源基因的编码序列的全部或部分的缺失。
在一个方面,外源基因编码编码功能性FAR蛋白,所述蛋白包含与含有SEQIDNO:2的栖藻海杆菌(Marinobacteralgicola)FAR蛋白具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性的多肽序列。在另一个方面,外源基因编码功能性FAR蛋白,所述蛋白包含与含有SEQIDNO:4的水油海杆菌(Marinobacteraquaeolei)FAR蛋白具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性的多肽序列。在另一个方面,外源基因编码功能性FAR蛋白,所述蛋白包含与含有SEQIDNO:6的海洋杆菌属的种(Oceanobactersp.)RED65的FAR蛋白具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性的多肽序列。在一个方面,外源基因包括与FAR_Maa(SEQIDNO:1)、FAR_Maq(SEQIDNO:3)或FAR_Ocs(SEQIDNO:5)的核酸序列具有至少80%的序列同一性,通常至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性的核酸序列。在一个实施方案中,脂肪酰基还原酶是与FAR_Maa的核酸序列(SEQIDNO:1)具有至少80%的序列同一性,通常至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性的基因。
在一个方面,功能性FAR蛋白是相对于SEQIDNO:2、4或6分别包含一个或多个氨基酸置换的FAR变体,其中表达FAR变体的细胞,相较于表达FAR变体所源自的野生型FAR蛋白的相同类型的对应细胞,产生至少1.5倍的脂酰CoA衍生物。在另一个方面,外源FAR基因编码FAR变体,所述变体相对于FAR_Maa(SEQIDNO:2)、FAR_Maq(SEQIDNO:4)或FAR_Ocs(SEQIDNO:6)包含1至约50,例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30或40个氨基酸置换。在一个实施方案中,外源FAR基因编码FAR变体,所述变体相对于FAR_Maa(SEQIDNO:2)包含1至约50,例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30或40个氨基酸置换。
在另一个方面,微生物生物体具有多个拷贝的内源基因(例如,二倍体数目)并且超过一个拷贝的内源基因被破坏。在另一个方面,微生物生物体表达多个拷贝的外源基因。在另一个方面,外源基因被整合入微生物生物体的基因组。
在另一个方面,微生物生物体还包含第二外源基因,其编码脂肪酸合酶(FAS)、酯合酶、酰基-ACP硫酯酶(TE)、脂酰CoA合酶(FACS)、乙酰-CoA羧化酶(ACC)、木糖异构酶或转化酶。隐球酵母
在一个方面,微生物生物体是藻类、细菌、霉菌、丝状真菌或酵母,例如产油酵母(oleaginousyeast)。在一个方面,微生物生物体是酵母。在一个方面,酵母是耶罗维亚酵母属(Yarrowia)、酒香酵母属(Brettanomyces)、假丝酵母属(Candida)、隐球酵母属(Cryptococcus)、拟内孢霉属(Endomycopsis)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、油脂酵母属(Lipomyces)、管囊酵母属(Pachysolen)、毕赤酵母属(Pichia)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、红酵母属(Rhodotorula)、酵母菌属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、毛孢子菌属(Trichosporon)或三角酵母属(Trigonopsis)。在一个方面,酵母是产油酵母,例如解脂耶罗维亚酵母、副解脂耶罗维亚酵母(Yarrowiaparalipolytica)、Candidarevkauji、铁红假丝酵母(Candidapulcherrima)、热带假丝酵母(Candidatropicalis)、产朊假丝酵母(Candidautilis)、弯假丝酵母D(CandidacurvataD)、弯假丝酵母R(CandidacurvataR)、Candidadiddensiae、Candidaboldinii、粘红酵母(Rhodotorulaglutinous)、禾本红酵母(Rhodotorulagraminis)、胶红酵母(Rhodotorulamucilaginosa)、小红酵母(Rhodotorulaminuta)、高产酵母菌株(Rhodotorulabacarum)、圆红冬孢酵母菌(Rhodosporidiumtoruloides)、Cryptococcus(terricolus)albidusvar.albidus、罗伦隐球酵母(Cryptococcuslaurentii)、Trichosporonpullans、皮状丝孢酵母(Trichosporoncutaneum)、Trichosporoncutancum、茁芽丝孢酵母(Trichosporonpullulans)、Lipomycesstarkeyii、Lipomyceslipoferus、子囊菌油脂酵母(Lipomycestetrasporus)、Endomycopsisvernalis、Hansenulaciferri、星汉逊酵母(Hansenulasaturnus)或变异三角酵母(Trigonopsisvariabilis)。在一个方面,酵母是解脂耶罗维亚酵母。
在另一个方面,微生物生物体相较于相同类型的对照生物体(例如,其中一个或多个基因未被破坏的在其他方面相同的对照微生物生物体)显示至少1倍、至少1.2倍、至少1.5倍、至少4倍或至少20倍的脂酰CoA衍生物产量的增加。
在另一个方面,本发明涉及微生物生物体,其包含一个或多个被破坏的内源基因(其中至少之一个被破坏的基因是YALI0C17545、YALI0E28336、YALI0E11099、YALI0B10406、YALI0A19536、YALI0E28534、YALI0E32769、YALI0E30283、YALI0E12463、YALI0E17787、YALI0B14014、YALI0A10769、YALI0A15147、YALI0A16379、YALI0A20944、YALI0B07755、YALI0B10175、YALI0B13838、YALI0C02387、YALI0C05511、YALI0D01738、YALI0D02167、YALI0D04246、YALI0D05291、YALI0D07986、YALI0D10417、YALI0D14366、YALI0D25630、YALI0E03212、ALI0E07810、YALI0E12859、YALI0E14322、YALI0E15378、YALI0E15400、YALI0E18502、YALI0E18568、YALI0E22781、YALI0E25982、YALI0E28314、YALI0E32417、YALI0F01320、YALI0F06578、YALI0F07535、YALI0F14729、YALI0F22121、YALI0F25003、YALI0E14729、YALI0B17512或此类基因的任一个的同源物)和有效地连接至启动子的编码功能性脂肪酰基还原酶的外源基因,其中微生物生物体相较于相同类型的对照生物体(例如,其中一个或多个基因未被破坏的在其他方面相同的对照微生物生物体)显示至少1倍、至少1.2倍、至少1.5倍、至少4倍或至少20倍的脂酰CoA衍生物产量的增加。
在另一个方面,被破坏的内源基因的至少一个是YALI0C17545、YALI0E28336、YALI0E11099、YALI0B10406、YALI0A19536、YALI0E28534、YALI0E32769、YALI0E30283、YALI0E12463、YALI0E14729、YALI0B17512或此类基因的任一个的同源物。
在一个方面,YALI0C17545或其同源物被破坏。在另一个方面,YALI0E28336或其同源物被破坏。在另一个方面,YALI0C17545或其同源物和YALI0E28336或其同源物被破坏。
在另一个方面,微生物生物体还包含第二被破坏的基因,所述基因是YALI0C17545、YALI0E28336、YALI0E11099、YALI0B10406、YALI0A19536、YALI0E28534、YALI0E32769、YALI0E30283、YALI0E12463、YALI0E17787、YALI0B14014、YALI0A10769、YALI0A15147、YALI0A16379、YALI0A20944、YALI0B07755、YALI0B10175、YALI0B13838、YALI0C02387、YALI0C05511、YALI0D01738、YALI0D02167、YALI0D04246、YALI0D05291、YALI0D07986、YALI0D10417、YALI0D14366、YALI0D25630、YALI0E03212、ALI0E07810、YALI0E12859、YALI0E14322、YALI0E15378、YALI0E15400、YALI0E18502、YALI0E18568、YALI0E22781、YALI0E25982、YALI0E28314、YALI0E32417、YALI0F01320、YALI0F06578、YALI0F07535、YALI0F14729、YALI0F22121、YALI0F25003、YALI0E14729、YALI0B17512或此类基因的任一个的同源物。
在一个方面,微生物生物体包含两个被破坏的内源基因。当两个基因被破坏时,YALI0C17545或其同源物和/或YALI0E30283或其同源物可被破坏。在另一个方面,微生物生物体包含3个被破坏的内源基因。在另一个方面,微生物生物体包含4个或更多个被破坏的内源基因。
在另一个方面,微生物生物体包含被破坏的内源基因或其同源物的组合。组合可以是:
a.YALI0C17545和YALI0E28336;
b.YALI0C17545和YALI0B10406;
c.YALI0C17545和YALI0E28534;
d.YALI0C17545和YALI0E30283;
e.YALI0E28336和YALI0E30283;
f.YALI0E11099和YALI0E30283;
g.YALI0A19536和YALI0E30283;
h.YALI0A19536和YALI0E28534;
i.YALI0E30283和YALI0E12463;
j.YALI0B10406和YALI0E14729;
k.YALI0C17545和YALI0E14729;
l.YALI0E11099和YALI0E14729;
m.YALI0C17545、YALI0E28336和YALI0E11099;
n.YALI0C17545、YALI0E28336和YALI0B10406;
o.YALI0C17545、YALI0E28336和YALI0A19536;
p.YALI0C17545、YALI0E28336和YALI0E28534;
q.YALI0C17545、YALI0E28336和YALI0E32769;
r.YALI0C17545、YALI0E28336和YALI0E12463;
s.YALI0C17545、YALI0E11099和YALI0B10406;
t.YALI0C17545、YALI0B10406和YALI0A19536;
u.YALI0E28336、YALI0E11099和YALI0B10406;
v.YALI0E11099、YALI0B10406和YALI0A19536;
w.YALI0C17545、YALI0E28534和YALI0B17512;
x.YALI0E11099、YALI0A19536、YALI0B10406和YALI0B17512;
y.YALI0C17545、YALI0E28336、YALI0E11099和YALI0B10406;
z.YALI0C17545、YALI0E28336、YALI0E11099和YALI0A19536;
aa.YALI0C17545、YALI0E28336、YALI0E11099和YALI0E28534;
bb.YALI0C17545、YALI0E28336、YALI0E11099和YALI0E32769;
cc.YALI0C17545、YALI0E28336、YALI0B10406和YALI0A19536;
dd.YALI0C17545、YALI0E28336、YALI0B10406和YALI0E32769;
ee.YALI0C17545、YALI0E28336、YALI0A19536和YALI0E28534;
ff.YALI0C17545、YALI0E28336、YALI0E28534和YALI0E32769;
gg.YALI0C17545、YALI0E28336、YALI0E28534和YALI0E12463;
hh.YALI0E28336、YALI0E11099、YALI0B10406和YALI0E32769;或
ii.YALI0E11099、YALI0E28336、YALI0C17545和YALI0E14729。
在一个方面,解脂耶罗维亚酵母细胞包含一个或多个被破坏的内源基因,其中至少一个被破坏的基因是YALI0C17545,YALI0E28336,YALI0E11099,YALI0B10406,YALI0A19536,YALI0E28534,YALI0E32769,YALI0E30283,YALI0E12463,YALI0E14720,YALI0B17512或此类基因的任一个的同源物,和有效地连接于启动子的编码功能性脂肪酰基还原酶的外源基因,其中解脂耶罗维亚酵母细胞,相较于相同类型的对照生物体(例如,其中一个或多个基因未被破坏的、在其它方面相同的对照微生物生物体),显示至少1倍、至少1.2倍、至少1.5倍、至少4倍或至少20倍的脂酰CoA衍生物产量的增加。在一个方面,外源基因包括与FAR_Maa(SEQIDNO:1)、FAR_Maq(SEQIDNO:3)或FAR_Ocs(SEQIDNO:5)的核酸序列具有至少80%的序列同一性,通常至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性的核酸序列,或其编码多肽,所述多肽包括与FAR_Maa(SEQIDNO:2),FAR_Maq(SEQIDNO:4)或FAR_Ocs(SEQIDNO:6)的多肽具有至少80%的序列同一性,通常至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性的氨基酸序列;或编码FAR变体多肽,所述多肽相对FAR_Maa(SEQIDNO:2)、FAR_Maq(SEQIDNO:4)或FAR_Ocs(SEQIDNO:6)包含1至约50个,例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30或40个氨基酸置换。在一个实施方案中,外源FAR基因编码FAR变体,所述变体相对于FAR_Maa(SEQIDNO:2)包含1至约50个,例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30或40个氨基酸置换。
在另一个方面,本发明提供了其中一个或多个内源基因被破坏的微生物生物体,其中内源基因选自YALI0C17545、YALI0E28336、YALI0E11099、YALI0B10406、YALI0A19536、YALI0E28534、YALI0E32769、YALI0E30283、YALI0E12463、YALI0E17787、YALI0B14014、YALI0A10769、YALI0A15147、YALI0A16379、YALI0A20944、YALI0B07755、YALI0B10175、YALI0B13838、YALI0C02387、YALI0C05511、YALI0D01738、YALI0D02167、YALI0D04246、YALI0D05291、YALI0D07986、YALI0D10417、YALI0D14366、YALI0D25630、YALI0E03212、ALI0E07810、YALI0E12859、YALI0E14322、YALI0E15378、YALI0E15400、YALI0E18502、YALI0E18568、YALI0E22781、YALI0E25982、YALI0E28314、YALI0E32417、YALI0F01320、YALI0F06578、YALI0F07535、YALI0F14729、YALI0F22121、YALI0F25003、YALI0E14729、YALI0B17512及其同源物。在另一个方面,内源基因YALI0B17512或其同源物被破坏。在另一个方面,YALI0B17512编码包含细胞质结构域的多肽,并且所述破坏包括细胞质结构域的至少部分的缺失。在另一个方面,内源基因YALI0C17545或其同源物和内源基因YALI0E28336或其同源物中的一个或多个被破坏。
在另一个方面,本发明提供了用于产生脂酰CoA衍生物的方法,包括提供本文中描述的微生物生物体;和在产生脂酰CoA衍生物的条件下培养微生物生物体。该方法还可包括回收(例如,分离)脂酰CoA衍生物。在一个方面,每升培养基产生至少5g/L或至少15g/L的脂酰CoA衍生物。
在另一个方面,产生脂酰CoA衍生物的方法可包括,将含纤维素的生物质与一种或多种纤维素酶接触以产生可发酵的糖;和将可发酵的糖与微生物生物体接触。在另一个方面,用于产生脂酰CoA衍生物的方法可包括,将包含蔗糖的可发酵的糖与如本文中描述的微生物接触。
在一个方面,脂酰CoA衍生物是脂肪醇、脂肪酸、脂肪醛、脂肪酯、脂肪醋酸酯、蜡酯、烷烃或烯烃。在另一个方面,脂酰CoA衍生物是脂肪醇。在一个方面,脂酰CoA衍生物具有8至24个碳原子的碳链长度,例如具有8至24个碳原子的脂肪醇。
在另一个方面,本发明提供了包含由本文中描述的方法产生的脂酰CoA衍生物的组合物。
附图概述
图1举例说明解脂耶罗维亚酵母菌中脂酰CoA衍生物的生物合成的途径。显示了从葡萄糖生物合成脂酰CoA的天然途径(反应1-3)以及降解烷烃并且将烷烃产物氧化成脂酰CoA的天然途径(反应4-7)。还显示了用于产生脂酰CoA衍生的产物的天然和外源途径,所述途径包括:酰基转移酶(三酰甘油)、硫酯酶(脂肪酸)、酯合酶(酯)、酰基-CoA还原酶("FAR")(脂肪醛和脂肪醇)以及醛脱羧酶(烷烃)。
图2举例说明用于在解脂耶罗维亚酵母菌中表达FAR基因的pCEN411质粒。
发明详述
I.定义
除非另外定义,否则本文中使用的所有技术和科学术语通常具有与本发明所属领域内的技术人员通常所理解的含义相同的含义。一般而言,本文中使用的命名法以及下文中描述的分析化学、细胞培养、分子遗传学、有机化学以及核酸化学和杂交的实验室方法是本领域公知和常用的命名法和实验室方法。应指出,如本文中所使用的,除非上下文中明确地另有所指,否则"一个/一种(a)"、"一个/一种(an)"和"所述的(the)"包括复数所指物。在包括其在内的意义上使用术语"包含"及其同源词(cognate);即,等同于术语"包括"及其相应的同源词。
通常按照本领域中的常规方法和各种一般性参考资料进行技术和方法。参见,例如,Sambrook等人,2001,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第3版;Ausubel,ed.,1990-2008,CurrentProtocolsinMolecularBiology。标准技术或其改进形式用于核酸和多肽合成以及用于化学合成和化学分析。一般而言,按照制造商的说明书进行酶促反应和纯化步骤。关于有关酵母重组技术、营养和生长的技术,参见,例如,Walker,1998,YeastPhysiologyandBiotechnology。
当应用于基因时,术语"破坏的"是指减少或消除基因的表达和/或对应基因产物(mRNA和/或蛋白质)的功能活性的任何遗传修饰。遗传修饰包括基因的完全或部分灭活、抑制、缺失、中断、阻断或下调。这可以例如通过基因“敲除”、灭活、突变(例如,破坏基因产物的表达或活性的插入突变、缺失突变、点突变或移码突变)或通过使用抑制性RNA(例如,有义、反义或RNAi技术)来实现。破坏可包括基因的编码序列的全部或部分。
术语"敲除"具有其在本领域中的常规含义,并且是指其中通过基因操作,通常通过重组事件(其中基因的全部或部分被缺失或者插入异源DNA,从而细胞或生物体不产生由所述基因编码的功能性产物)灭活特定基因的生物体或细胞。敲除还指,产生具有灭活的基因的生物体或细胞的过程,通常通过用人工DNA片段(例如,编码选择标记)替代基因的编码序列的至少部分和/或使基因的编码序列的至少部分缺失,从而在细胞或生物体中不表达功能性基因产物。在一些实施方案中,基因的完整编码序列被切除。
"编码序列"是指编码蛋白质的氨基酸序列的那部分核酸。
术语"表达"包括参与产生多肽的任何步骤,包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
术语"脂酰CoA衍生物"是,可在微生物中从脂酰CoA、脂酰ACP或其它类似脂肪酰基硫酯代谢衍生的化合物。衍生物包括但不限于,脂肪醇、脂肪酸、脂肪醛、脂肪酯、脂肪醋酸酯、蜡酯、烷烃和烯烃。可使用记法"Ca:b"描述饱和或不饱和脂酰CoA衍生物,其中"a"是代表碳原子总数的整数,"b"是表示碳链中双键数目的整数。不饱和脂酰Co-A衍生物可称为"顺式Δx"或"反式Δx",其中"顺式"和"反式"是指围绕双键的碳链的构型。"x"表示双键的第一个碳的编号,其中例如,碳1是脂肪酸的羧酸碳或结合至脂肪醇的-OH基的碳。对于下面描述的衍生物,"R"是C8至C24的饱和、不饱和、线性、分枝或环烃(或衍生物式中的"C7至C23",其明确地连接末端碳)。
如本文中所用,术语"脂肪醇"是指式R-OH的脂肪醇,其中"R"如上所定义。在一些实施方案中,根据本文中公开的方法产生的脂肪醇是C8-C24饱和或不饱和脂肪醇(即,C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21、C22或C24脂肪醇)。在一些实施方案中,产生下列脂肪醇中的一种或多种:1-辛醇(C8:0)、1-癸醇(C10:0)、1-十二醇(C12:0)、1-十四醇(C14:0)、1-十六醇(C16:0)、1-十八醇(C18:0)、1-花生醇(C20:0)、1-二十二醇(C22:0)、1-二十四醇(C24:0)、顺式Δ9-1-十六碳烯醇(C16:1)和顺式Δ11-1-十八烯醇(C18:1)。应理解,除非另有所指,否则"Cx脂肪醇"包括具有"x"个碳原子的饱和和不饱和脂肪醇。
如本文中所用,术语"脂肪酸"是指式的化合物。
如本文中所用,术语"脂肪醛"是指式的化合物。
术语"脂肪酯"包括式或的化合物。
其中R'是短链,例如,C1至C6,优选地C1至C4的烃。例如,脂酰CoA可与短链醇(例如,甲醇或乙醇)反应以形成常规脂肪酯。或者,脂肪醇可与短链硫酯(例如,乙酰CoA)反应以形成酯。两种酯类型都包括在术语"脂肪酯"中。
如本文中所用,术语"脂肪醋酸酯"是指式的化合物。
如本文中所用,术语'蜡酯'是指,从长链脂肪酸和长链醇衍生的酯。
本文中通过名称对特定内源基因的引用是为了举例说明而非限定。应理解,基因名称在不同生物之间可发生变化,并且对基因名称的引用无意是限定性的,而意欲包括同源物(即,其对于相关微生物生物体可以是内源的)和多态性变体。可基于序列同一性和/或相似的生物学(例如,酶促)活性鉴定同源物和变体。在某些实施方案中,本发明包括与命名的基因或基因产物具有至少50%、60%、70%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性的多核苷酸或多肽序列。
"同一性"或"百分比同一性",在两个或更多个多核苷酸或多肽序列的背景中,是指两个或更多个这样的序列或子序列(sub-sequence),它们是相同的或分别具有指定百分比的相同的核苷酸或氨基酸残基。可如下测定百分比同一性:在比较窗口中比较两个最佳对齐的序列,其中比较窗口中的多核苷酸或多肽序列的部分相较于用于比对两个序列的参照序列(其也可包含缺口以最优化比对)可包含添加或缺失(即,缺口)。例如,当就比较窗口或指定区域中的最大对应性(如使用序列比较算法或通过手工比对和目测而测量的)进行比较和比对时,序列可在指定的区域中与参照序列具有至少50%、60%、70%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的百分比同一性。
可例如通过Smith和Waterman,1981,Adv.Appl.Math.2:482的局部同源性算法,通过Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443的同源性比对算法,通过Pearson和Lipman,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444的相似性搜索法,通过此类算法的计算机化实现(GCGWisconsin软件包中的TFASTA和GAP、BESTFIT、FASTA)或通过目测观察(通常参见,CurrentProtocolsinMolecularBiology,F.M.Ausubel等人,eds.,CurrentProtocols,JohnWiley&Sons,Inc.(1995补充材料)(Ausubel))进行序列的比对比较。
适合于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的实例是BLAST和BLAST2.0算法,所述算法分别描述于Altschul等人,1990,J.Mol.Biol.215:403-410和Altschul等人,1977,NucleicAcidsRes.3389-3402中。用于进行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心公共地获得。该算法包括,首先通过鉴定查询序列中的长度为W的短字(shortword)来鉴定高评分序列对(HSP),当与数据库序列中相同长度的字比对时,其匹配或满足某一正值阈值评分T。T称为相邻字评分阈值(neighborhoodwordscorethreshold)(Altschul等人,同上)。这些初始相邻字命中用作起始搜索以发现含有它们的更长HSP的种子。随后沿着每一个序列在两个方向上延伸字命中,只要累计比对评分能够增加。对于核苷酸序列,使用参数M(一对匹配残基的奖励评分;总是>0)和N(错配残基的罚分;总是<0)计算累积评分。对于氨基酸序列,使用评分矩阵计算累积评分。当累积比对评分从其最大达到值下降数量X;累积评分因一个或多个负评分残基比对的积累而归零或低于零;或达到任一序列的末端时,停止每一个方向上的字命中的延伸。BLAST算法参数W、T和X确定比对的灵敏性和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用11的字长(W)、10的期望值(E)、M=5、N=-4以及两条链的比较作为缺省值。对于氨基酸序列,BLASTP程序使用3的字长(W)、10的期望值(E)以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff,1989,ProcNatlAcadSciUSA89:10915)作为缺省值。序列比对和序列同一性%的示例性测定可使用提供的缺省参数,应用GCGWisconsin软件包(Accelrys,MadisonWI)中的BESTFIT或GAP程序。
"参照序列"是指,用作序列比较的基础的确定的序列。参照数列可以是更大序列的子集,例如全长基因或多肽序列的区段。一般而言,参照序列在长度上为至少20个核苷酸或氨基酸残基,在长度上为至少25个残基,在长度上为至少50个残基,在长度上为至少100个残基或核酸或多肽的全长。由于两个多核苷酸或多肽各自可(1)包含在两个序列之间相似的序列(即,完整序列的部分),和(2)还可包含在两个序列之间差异的序列,两个(或更多个)多核苷酸或多肽之间的序列比较通常通过在“比较窗口”上比较两个多核苷酸的序列以鉴定和比较具有序列相似性的局部区域来进行。
"比较窗口"是指至少约20个连续核苷酸位置或氨基酸残基的概念上的区段,其中可将序列与具有至少20个连续核苷酸或氨基酸的参照序列相比较,并且其中为了两个序列的最佳比对,比较窗口中的序列的部分相较于参照序列(其不包含添加或缺失)可包含20%或更少的添加或缺失(即,缺口)。比较窗口可以比20个连续残基长,包括任选地30、40、50、100个残基或更长的窗口。
如本文中所用,"多核苷酸"是指以单链或双链形式存在的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的聚合物及其互补序列。
术语"多肽"和"蛋白质"在本文中可互换使用,其是指氨基酸残基的聚合物。
"提高的产量"是指当在相同条件下培养时,相较于由其中基因未被破坏的相同类型的对照微生物生物体产生的量,由经修饰的微生物生物体(即,其中一个或多个内源基因被破坏的微生物生物体)产生的可测量的脂酰CoA衍生物的量的增加。"相同类型的对照生物体"意指,除了此处描述的被破坏的基因或基因的组合外,具有与经修饰的微生物生物体的基因组基本上相同的基因组的相同物种的生物体。例如,其中脂肪酸合酶过表达的解脂耶罗维亚酵母菌(Y.lipolytica)菌株(例如,DSMZ1345)可以是其中脂肪酸合酶过表达并且其中指定的基因或基因的组合被破坏的相同解脂耶罗维亚酵母菌株(例如,DSMZ1345)的"相同类型的对照生物体"。术语"在其它方面相同的生物体"可与"相同类型的对照生物体"互换使用。提高的产量可通过任何机制来实现,例如增加的产生和/或减少的降解或利用。
如针对多肽所用的,术语"功能性"意指多肽显示体内催化活性。术语"功能性"可与术语"具有生物学活性的"互换使用。
针对多肽或蛋白质使用的术语"野生型"或"天然的"意指天然发现的由微生物表达的多肽或蛋白质。当用于微生物时,该术语意指天然存在的(非遗传修饰的)微生物。
如本文中所用的,"FAR"(也称为"形成脂肪醇的酰基-CoA还原酶"或"脂肪酰基还原酶")是指将脂肪酰基-硫酯底物(例如,脂酰CoA或脂酰ACP)转化成脂肪醇的酶。"CoA"是参与脂肪酸的合成和氧化的非蛋白质酰基载体基团因子(或部分)。"ACP"是用于脂肪酸合成的脂肪酸合酶的多肽或蛋白质亚基。
如本文中所用,术语"野生型FAR"是指天然产生的FAR多肽。在一些实施方案中,野生型FAR由γ蛋白杆菌(包括但不限于海杆菌属(Marinobacter)、海洋杆菌属(Oceanobacter)和河氏菌属(Hahella)的菌株)产生。天然存在的FAR多肽例如描述于美国专利公开案2011/0000125(通过引用并入本文)中。在一些实施方案中,野生型FAR是天然存在的FAR多肽,其由栖藻海杆菌菌株DG893产生(SEQIDNO:2)。在一些实施方案中,野生型FAR是天然存在的FAR多肽,其由水油海杆菌菌株VT8产生(SEQIDNO:4)。在一些实施方案中,野生型FAR是天然存在的FAR多肽,其由海洋杆菌RED65产生(SEQIDNO:6)。
如本文中所用,术语"FAR变体"是指,相对于野生型FAR多肽在一个或多个氨基酸位置上具有置换的全长FAR多肽或其功能性片段,其中相较于表达野生型FAR多肽的细胞,表达变体的细胞(例如,微生物)能够催化增加的脂肪醇产生。在一些实施方案中,FAR变体与SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6的FAR多肽具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性,以及还包含一个或多个氨基酸置换,所述氨基酸置换导致,与利用其所源自的野生型FAR多肽可实现的脂酰CoA衍生物产量相比较,增加的脂酰CoA衍生物(例如,脂肪醇)产量。FAR变体描述于例如美国申请No.13/171,138(通过引用并入本文)中。如本文中所用,除非根据上下文明确不同,否则"FAR"、"FAR蛋白"、"FAR变体"或"FAR片段"意欲指功能性FAR蛋白、功能性FAR变体或功能性FAR片段,即使未明确地指出亦如此。
术语"内源的"是指,本来就包含在生物体中的基因或蛋白质(即,编码在野生型生物体中发现的序列)。相反地,如针对基因所使用的,术语"外源的"或"异源的"可互换地指,起源于所述微生物之外的基因,例如来自另一个物种的基因或修饰的或重组的基因。可通过本领域已知的方法将外源或异源基因引入微生物。
可通过转染、转导、转化或任何其它方法将核酸序列“引入”细胞。引入真核或原核细胞的核苷酸序列可被整合入染色体或可以以附加体形式进行维持。
如针对细胞所用的,术语"进行转化"或"转化"意指,细胞具有整合入其基因组的或以附加体形式(例如,质粒)存在的非天然核酸序列,所述核酸序列可维持多个世代。
"载体"是指包含编码蛋白质的DNA序列的DNA构建体。载体可以是包含有效地连接于能够在适当的宿主中实现DNA的表达的适当的控制序列(即,启动子)的蛋白质编码序列的表达载体。
"有效地连接"意指这样排列DNA序列区段,以使它们为了它们所期望的目的协同作用,例如启动子控制与其有效连接的基因序列的转录。
"启动子序列"是被细胞识别以进行编码区的表达的核酸序列。控制序列可包含适当的启动子序列。启动子序列包含转录控制序列,其介导多肽的表达。启动子可以是在选择的细胞中显示转录活性的任何核酸序列,包括突变的、截短的和杂合的启动子,并且可获自对于宿主细胞是内源的或外源的(异源的)编码细胞外或细胞内多肽的基因。
术语"培养"是指,在适当的条件下在液体或固体培养基中生长一群微生物细胞。通常,使用液体培养基。在一些实施方案中,培养是指底物至终产物的发酵生物转化。
术语"接触"是指,在酶可对底物起作用的条件下组合酶与底物。本领域技术人员将理解,将包含酶(例如,纤维素酶)的溶液与底物(例如,含有纤维素的生物质)混合将实现"接触"。类似地,在培养微生物的背景中,在含有底物(例如,可发酵的糖)的培养基中培养微生物将实现微生物与底物的"接触"。
术语"纤维素酶"是指,能够破坏纤维素的晶体结构并且将纤维素(β-1,4-葡聚糖或β-D-葡糖苷键)水解成更短的寡糖、二糖(例如,纤维二糖)和/或单糖(例如,葡萄糖)的酶的种类。纤维素酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。
术语"含有纤维素的生物质"、"纤维质生物质"和"纤维质底物"是指包括纤维素的材料。生物质可源自于植物、动物或微生物,可包括农业、工业和林业残渣、市政固体废物、工业废弃物和为了能源目的种植的陆生和水生作物。生物质的实例包括但不限于,木材、木浆、纸浆、玉米纤维、玉米谷粒(corngrain)、玉米穗轴、作物残渣例如玉米壳、玉米秸、草、小麦、麦秸秆、大麦、大麦秸秆、干草、稻草、柳枝稷、废纸、纸张和纸浆处理废物、木本或草本植物、果实或蔬菜浆、酒糟、稻壳、棉花、大麻、亚麻、剑麻、甘蔗渣、高粱、大豆、获自谷粒制粉的组分、树、枝、根、叶、木屑、锯屑、灌木和草丛、蔬菜、果实、花、畜粪及其混合物。
"可发酵的糖"意指简单的糖(单糖、二糖和短的寡糖),包括但不限于葡萄糖、果糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖和蔗糖。
术语"可回收的脂酰CoA衍生物"是指,可按照本领域已知的方法从产生脂酰CoA衍生物的反应混合物分离的脂酰CoA衍生物的量。
II.引言
我们已令人惊讶地发现,表达脂肪酰基还原酶(FAR)的微生物生物体例如解脂耶罗维亚酵母的某些内源基因和基因的组合的破坏导致增加的脂酰CoA衍生物的产量。FAR(也称为"形成脂肪醇的酰基-CoA还原酶"或"脂肪酰基还原酶")是指,在与NAD(P)H至NAD(P)+的氧化偶联的反应中,催化脂酰CoA、脂酰ACP或其它脂肪酰基硫酯复合物还原成脂肪醇的酶,如下列方案1中显示的:
其中"R"表示C7至C23的饱和、不饱和、线性、分枝或环状烃链,并且"R1"表示CoA、ACP或其它脂肪酰基硫酯底物。CoA是参与脂肪酸的合成和氧化的非蛋白质酰基载体基团因子(或部分)。"ACP"是用于合成脂肪酸的脂肪酸合酶的多肽或蛋白质亚基。在一些实施方案中,可在方案1描述的反应中产生脂肪醛中间产物。
野生型FAR蛋白已描述于WO2011/008535(2011年1月20日公布)(通过引用并入本文,用于所有目的)中。从海洋细菌(例如海水中发现的γ蛋白杆菌)的纲的属分离的某些FAR酶(特别地获自海杆菌属和海洋杆菌属的菌株或其分类学等同物的FAR),当编码此类酶的基因在异源细胞中表达时,能够产生高产率的脂肪醇。如下文实施例部分所描述的,现已发现,其中某些基因或基因的组合被破坏并且表达编码FAR蛋白的基因的微生物生物体,相较于其中基因未被破坏的、表达编码FAR蛋白的外源基因的在其它方面相同的微生物生物体,具有增加的脂酰CoA衍生物产量。因此,在一个方面,本发明涉及显示增加的脂酰CoA衍生物产量的微生物生物体,其中微生物生物体包含一个或多个被破坏的内源基因,且包含编码FAR蛋白的外源基因。此类经修饰的微生物生物体可用于脂酰CoA衍生物的商业生产。
本发明的各个方面描述于下列部分中。
III.内源基因的破坏
用于破坏的内源基因
在一个方面,本发明涉及重组微生物生物体(例如酵母)以及使用此类微生物生物体的方法,在所述微生物生物体中一个或多个内源基因被破坏,并且所述微生物生物体显示提高的脂酰CoA衍生物产量。
参考解脂耶罗维亚酵母基因组来命名本文中描述的内源基因。Dujon,等人,2004,"Genomeevolutioninyeasts"Nature430:35-44。缩写的基因名称(例如,"C17545")和基因全名(例如,"YALI0C17545")可互换使用,并且两者都包括基因的多态性变体。在一些实施方案中,宿主细胞不是解脂耶罗维亚酵母菌,并且内源基因是解脂耶罗维亚酵母菌基因的同源物。如上文中指出的,基因名称在不同生物体间可发生变化,本文中使用的任何基因名称无意是限定性的,且意欲也包括同源物。表1提供了来自解脂耶罗维亚酵母菌的示例性被破坏的基因的核苷酸序列的列表以及编码的蛋白质的活性。基于对科学文献的参考和/或基于功能和序列表征来描述生物学活性。虽然已知的或预测的生物学活性可用于鉴定同源物,但用于本发明的核苷酸序列和/或蛋白质不限于先前已被鉴定为参与脂酰CoA衍生物产生的那些核苷酸序列和/或蛋白质。
在一些实施方案中,本发明的微生物生物体(例如,藻类、细菌、霉菌、丝状真菌或酵母例如解脂耶罗维亚酵母)具有一个或多个被破坏的内源基因(选自表1中列出的基因及其同源物)。
表1.解脂耶罗维亚酵母中被破坏的基因的核苷酸序列
解脂耶罗维亚酵母菌基因名称 | SEQ ID NO.(DNA) | 已知的或预测的生物学活性 |
YALI0C17545 | 7 | 磷脂酰肌醇转移蛋白质 |
YALI0E28336 | 8 | |
YALI0E11099 | 9 | β-氧化酶PAT1 |
YALI0B10406 | 10 | 烯酰CoA水合酶 |
YALI0A19536 | 11 | 醇脱氢酶 |
YALI0E28534 | 12 | |
YALI0E32769 | 13 | 酰基转移酶DGAT2 |
YALI0E30283 | 14 | GUP1 |
YALI0E12463 | 15 | SOR1 |
YALI0E17787 | 16 | 脂肪醇脱氢酶ADH2 |
YALI0B14014 | 17 | GMC氧化还原酶 |
YALI0A10769 | 18 | 酶脱氢酶 |
YALI0A15147 | 19 | 脂肪醇脱氢酶ADH4 |
YALI0A16379 | 20 | 脂肪醇脱氢酶ADH3 |
YALI0A20944 | 21 | 过氧化物酶体膜蛋白 |
YALI0B07755 | 22 | CoA连接酶 |
YALI0B10175 | 23 | 酶脱氢酶 |
YALI0B13838 | 24 | 烷烃单加氧酶ALK5 |
YALI0C02387 | 25 | 转录因子YAS1 |
YALI0C05511 | 26 | 磷脂酰肌醇转移蛋白质 |
YALI0D01738 | 27 | 酶脱氢酶 |
YALI0D02167 | 28 | 酶脱氢酶 |
YALI0D04246 | 29 | 过氧化物酶体膜蛋白PXA2 |
YALI0D05291 | 30 | 转录因子SCS2 |
YALI0D07986 | 31 | 酰基转移酶DGAT1 |
YALI0D10417 | 32 | |
YALI0D14366 | 33 |
解脂耶罗维亚酵母菌基因名称 | SEQ ID NO.(DNA) | 已知的或预测的生物学活性 |
YALI0D25630 | 34 | 脂肪醇脱氢酶ADH1 |
YALI0E03212 | 35 | FAD结合氧化还原酶 |
YALI0E07810 | 36 | 酶脱氢酶 |
YALI0E12859 | 37 | 酰基-CoA连接酶 |
YALI0E14322 | 38 | 2,4-二烯酰基-CoA还原酶 |
YALI0E15378 | 39 | β-氧化酶MFE2 |
YALI0E15400 | 40 | 脂肪醛脱氢酶ALDH2 |
YALI0E18502 | 41 | 黄素蛋白加氧酶 |
YALI0E18568 | 42 | β-氧化酶POT1 |
YALI0E22781 | 43 | 氧化固醇结合蛋白 |
YALI0E25982 | 44 | 烷烃单加氧酶ALK1 |
YALI0E28314 | 45 | |
YALI0E32417 | 46 | 转录因子YAS2 |
YALI0F01320 | 47 | 烷烃单加氧酶ALK2 |
YALI0F06578 | 48 | 酰基转移酶ARE2 |
YALI0F07535 | 49 | |
YALI0F14729 | 50 | 硫酯酶 |
YALI0F22121 | 51 | 烯酰CoA水合酶 |
YALI0F25003 | 52 | 酶脱氢酶 |
YALI0E14729g | 53 | ABC1烷烃转运蛋白 |
YALI0B17512g | 54 | Sec62ER蛋白转位酶 |
在一些实施方案中,微生物生物体例如解脂耶罗维亚酵母具有一个或多个被破坏的内源基因,其中至少一个被破坏的基因是YALI0C17545、YALI0E28336、YALI0E11099、YALI0B10406、YALI0A19536、YALI0E28534、YALI0E32769、YALI0E30283、YALI0E12463、YALI0E17787、YALI0B14014、YALI0A10769、YALI0A15147、YALI0A16379、YALI0A20944、YALI0B07755、YALI0B10175、YALI0B13838、YALI0C02387、YALI0C05511、YALI0D01738、YALI0D02167、YALI0D04246、YALI0D05291、YALI0D07986、YALI0D10417、YALI0D14366、YALI0D25630、YALI0E03212、ALI0E07810、YALI0E12859、YALI0E14322、YALI0E15378、YALI0E15400、YALI0E18502、YALI0E18568、YALI0E22781、YALI0E25982、YALI0E28314、YALI0E32417、YALI0F01320、YALI0F06578、YALI0F07535、YALI0F14729、YALI0F22121、YALI0F25003、YALI0E14729、YALI0B17512或此类基因的任一个的同源物。
在一些实施方案中,被破坏的内源基因是C17545(SEQIDNO:7)或其同源物。在一些实施方案中,被破坏的内源基因是E28336(SEQIDNO:8)或其同源物。在一些实施方案中,被破坏的内源基因是E11099(SEQIDNO:9)或其同源物。在一些实施方案中,被破坏的内源基因是E28534(SEQIDNO:12)或其同源物。在一些实施方案中,被破坏的内源基因是B17512(SEQIDNO:54)或其同源物。
在一些实施方案中,微生物生物体例如解脂耶罗维亚酵母是其中微生物生物体的1、2、3、4或5个内源基因被破坏的微生物生物体。在一些实施方案中,1个或多个,2个或更多个,3个或更多个,4个或更多个或5个或更多个内源基因被破坏。具有多个被破坏的内源基因的微生物生物体可有利地显示协同作用,如已在酵母中观察到的(参见下文实施例)。本发明包括但不限于实施例部分中显示的示例性实施方案。在一些实施方案中,微生物生物体具有2、3或4个被破坏的内源基因。
在另一个实施方案中,微生物生物体具有至少2个被破坏的内源基因。在一些实施方案中,第一被破坏的基因和第二被破坏的基因都选自下列:YALI0C17545、YALI0E28336、YALI0E11099、YALI0B10406、YALI0A19536、YALI0E28534、YALI0E32769、YALI0E30283、YALI0E12463、YALI0E17787、YALI0B14014、YALI0A10769、YALI0A15147、YALI0A16379、YALI0A20944、YALI0B07755、YALI0B10175、YALI0B13838、YALI0C02387、YALI0C05511、YALI0D01738、YALI0D02167、YALI0D04246、YALI0D05291、YALI0D07986、YALI0D10417、YALI0D14366、YALI0D25630、YALI0E03212、ALI0E07810、YALI0E12859、YALI0E14322、YALI0E15378、YALI0E15400、YALI0E18502、YALI0E18568、YALI0E22781、YALI0E25982、YALI0E28314、YALI0E32417、YALI0F01320、YALI0F06578、YALI0F07535、YALI0F14729、YALI0F22121、YALI0F25003、YALI0E14729、YALI0B17512或此类基因的任一个的同源物。在一些实施方案中,来自该列表的3、4、5或超过5个基因被破坏。
在具有两个被破坏的基因的实施方案中,特别有用的用于破坏的基因包括但不限于,C17545基因(或其同源物)和/或E30283基因(或其同源物)和/或E28336基因(或其同源物)和/或E11099基因(或其同源物)和/或E28534基因(或其同源物)和/或B17512基因(或其同源物)。在一些实施方案中,C17545基因(或其同源物)和E28336基因(或其同源物)被破坏。在一些实施方案中,C17545基因(或其同源物)和E11099基因(或其同源物)被破坏。在一些实施方案中,C17545基因(或其同源物)和E28534基因(或其同源物)被破坏。在一些实施方案中,C17545基因(或其同源物)和B17512基因(或其同源物)被破坏。在一些实施方案中,E28336基因(或其同源物)和E11099基因被破坏。在一些实施方案中,E28336基因(或其同源物)和E28534基因(或其同源物)被破坏。在一些实施方案中,E28336基因(或其同源物)和B17512基因(或其同源物)被破坏。在一些实施方案中,E11099基因(或其同源物)和E28534基因(或其同源物)被破坏。在一些实施方案中,E11099基因(或其同源物)和B17512基因(或其同源物)被破坏。在一些实施方案中,E38534基因(或其同源物)和B17512基因(或其同源物)被破坏。
在一个实施方案中,微生物生物体例如解脂耶罗维亚酵母具有至少一个被破坏的内源基因,所述基因是YALI0C17545、YALI0E28336、YALI0E11099、YALI0B10406、YALI0A19536、YALI0E28534、YALI0E32769、YALI0E30283、YALI0E12463、YALI0E14729、YALI0B17512或此类基因的任一个的同源物。在另一个实施方案中,微生物生物体具有第一破坏基因和第二被坏的基因,两种基因都选自该组基因。在该实施方案中,微生物生物体可具有其它被破坏的基因(例如,也选自该组的第三、第四或第五被破坏的基因)或其可仅具有两个被破坏的基因。
在一些实施方案中,微生物生物体例如解脂耶罗维亚酵母具有两个被破坏的基因或其同源物。在一些实施方案中,显示提高的脂酰CoA衍生物产量的微生物生物体包含两个被破坏的内源基因的下列组合的任一个:
a.YALI0C17545和YALI0E28336;
b.YALI0C17545和YALI0B10406;
c.YALI0C17545和YALI0E28534;
d.YALI0C17545和YALI0E30283;
e.YALI0E28336和YALI0E30283;
f.YALI0E11099和YALI0E30283;
g.YALI0A19536和YALI0E30283;
h.YALI0A19536和YALI0E28534;
i.YALI0E30283和YALI0E12463;
j.YALI0E14729和YALI0B10406;
k.YALI0E14729和YALI0C17545;和
l.YALI0E14729和YALI0E11099;及(a)-(l)的同源物。
在另一个实施方案中,微生物生物体例如解脂耶罗维亚酵母具有3个或更多个(例如,3个)被破坏的基因或其同源物。在一些实施方案中,显示提高的脂酰CoA衍生物产量的微生物生物体包含三个被破坏的内源基因的下列组合的任一个:
m.YALI0C17545、YALI0E28336和YALI0E11099;
n.YALI0C17545、YALI0E28336和YALI0B10406;
o.YALI0C17545、YALI0E28336和YALI0A19536;
p.YALI0C17545、YALI0E28336和YALI0E28534;
q.YALI0C17545、YALI0E28336和YALI0E32769;
r.YALI0C17545、YALI0E28336和YALI0E12463;
s.YALI0C17545、YALI0E11099和YALI0B10406;
t.YALI0C17545、YALI0B10406和YALI0A19536;
u.YALI0E28336、YALI0E11099和YALI0B10406;
v.YALI0E11099、YALI0B10406和YALI0A19536;和
w.YALI0C17545、YALI0E28534和YALI0B17512;及(m)-(w)的同源物。
在一些实施方案中,其中微生物生物体例如解脂耶罗维亚酵母具有3个或更多个(例如,3个)被破坏的基因,2个或更多个被破坏的基因选自C17545基因、E28336基因、E11099基因、E28534基因、B17512基因及其同源物。在一些实施方案中,C17545基因(或其同源物)和E28336基因(或其同源物)被破坏。在一些实施方案中,C17545基因(或其同源物)和E11099基因(或其同源物)被破坏。在一些实施方案中,C17545基因(或其同源物)和E28534基因(或其同源物)被破坏。在一些实施方案中,C17545基因(或其同源物)和B17512基因(或其同源物)被破坏。在一些实施方案中,E28336基因(或其同源物)和E11099基因被破坏。在一些实施方案中,E28336基因(或其同源物)和E28534基因(或其同源物)被破坏。在一些实施方案中,E28336基因(或其同源物)和B17512基因(或其同源物)被破坏。在一些实施方案中,E11099基因(或其同源物)和E28534基因(或其同源物)被破坏。在一些实施方案中,E11099基因(或其同源物)和B17512基因(或其同源物)被破坏。在一些实施方案中,E38534基因(或其同源物)和B17512基因(或其同源物)被破坏。在一些实施方案中,所有3个被破坏的基因都选自C17545基因、E28336基因、E11099基因、E28534基因、B17512基因及其同源物。在一些实施方案中,C17545基因(或其同源物)、E28336基因(或其同源物)和E11099基因(或其同源物)被破坏。在一些实施方案中,C17545基因(或其同源物)、E28336基因(或其同源物)和E28534基因(或其同源物)被破坏。在一些实施方案中,C17545基因(或其同源物)、E28336基因(或其同源物)和B17512基因(或其同源物)被破坏。在一些实施方案中,C17545基因(或其同源物)、E11099基因(或其同源物)和B17512基因(或其同源物)被破坏。在一些实施方案中,C17545基因(或其同源物)、E28534基因(或其同源物)和B17512基因(或其同源物)被破坏。在一些实施方案中,E28336基因(或其同源物)、E11099基因(或其同源物)和E28534基因(或其同源物)被破坏。在一些实施方案中,E28336基因(或其同源物)、E11099基因(或其同源物)和B17512基因(或其同源物)被破坏。在一些实施方案中,E28336基因(或其同源物)、E28534基因(或其同源物)和B17512基因(或其同源物)被破坏。在一些实施方案中,E11099基因(或其同源物)、E28534基因(或其同源物)和B17512基因(或其同源物)被破坏。
在另一个实施方案中,微生物生物体具有4个或更多个(例如,4个)被破坏的基因或其同源物。在一些实施方案中,显示提高的脂酰CoA衍生物产量的微生物生物体包含4个被破坏的内源基因的下列组合的任一个:
x.YALI0C17545、YALI0E28336、YALI0E11099和YALI0B10406;
y.YALI0C17545、YALI0E28336、YALI0E11099和YALI0A19536;
z.YALI0C17545、YALI0E28336、YALI0E11099和YALI0E28534;
aa.YALI0C17545、YALI0E28336、YALI0E11099和YALI0E32769;
bb.YALI0C17545、YALI0E28336、YALI0B10406和YALI0A19536;
cc.YALI0C17545、YALI0E28336、YALI0B10406和YALI0E32769;
dd.YALI0C17545、YALI0E28336、YALI0A19536和YALI0E28534;
ee.YALI0C17545、YALI0E28336、YALI0E28534和YALI0E32769;
ff.YALI0C17545、YALI0E28336、YALI0E28534和YALI0E12463;
gg.YALI0E28336、YALI0E11099、YALI0B10406和YALI0E32769;
hh.YALI0E11099、YALI0EA19536、YALI0B10406和YALI0B17512;和
ii.YALI0E11099、YALI0E28336、YALI0C17545和YALI0E14729;及(x)-(ii)的同源物。
在一些实施方案中,其中微生物生物体例如解脂耶罗维亚酵母具有4个或更多个(例如,4个)被破坏的基因,2个或更多个被破坏的基因选自C17545基因、E28336基因、E11099基因、E28534基因、B17512基因及其同源物。在一些实施方案中,3个或更多个被破坏的基因选自C17545基因、E28336基因、E11099基因、E28534基因、B17512基因及其同源物。在一些实施方案中,所有4个被破坏的基因选自C17545基因、E28336基因、E11099基因、E28534基因、B17512基因及其同源物。在一些实施方案中,C17545基因(或其同源物)、E28336基因(或其同源物)、E11099基因(或其同源物)和E28534基因(或其同源物)被破坏。在一些实施方案中,C17545基因(或其同源物)、E28336基因(或其同源物)、E11099基因(或其同源物)B17512基因(或其同源物)被破坏。在一些实施方案中,E28336基因(或其同源物)、E11099基因(或其同源物)、E28534基因(或其同源物)和B17512基因(或其同源物)被破坏。
在一些实施方案中,表3或表4中所列的内源基因的任一个或内源基因的特定组合在生物体中被破坏。在一些实施方案中,生物体包含其它被破坏的基因。参考解脂耶罗维亚酵母基因组来命名表3和表4中引用的基因;然而,本领域技术人员将理解,可在解脂耶罗维亚酵母菌以为的微生物生物体(例如,在藻类、细菌、霉菌、丝状真菌或酵母)中通过破坏该微生物生物体中的表3或表4所列的基因的同源物来产生等同的破坏。
除了本文中描述的任一种内源基因破坏外,还可在本发明的微生物生物体中任选地破坏(例如,通过"敲除"、灭活、突变或抑制,如本文中描述的)、引入和/或修饰一个或多个其它基因。此类其它基因可以是但不必一定是,先前已被鉴定为参与脂酰CoA衍生物产生的基因。
破坏的方法
如定义中所述,术语"破坏的",当用于基因时,是指减少或消除基因的表达和/或对应基因产物(mRNA和/或蛋白质)的生物学活性(例如,对于表1中所列的基因,表1中所列的已知或预测的生物学活性)的遗传修饰。在一些实施方案中,破坏消除或实质性减少基因产物的表达,如通过例如免疫测定法所测定的。"实质性减少"在本说明书中意指,表达的蛋白质的量,相较于来自未破坏的基因的表达,减少至少50%,通常至少75%,有时至少80%、至少90%或至少95%。在一些实施方案中,基因产物(例如,蛋白质)从破坏的基因表达,但蛋白质已被突变(例如,一个或多个氨基酸的缺失或一个或多个氨基酸置换的插入),从而蛋白质的生物学活性(例如,酶促活性)被完全消除或实质性降低。如本文中所用的,"完全消除"意指基因产物不具有可测量的活性。"实质性降低"在该情况下意指,蛋白质的生物学活性相较于未突变的蛋白质降低至少50%,通常至少75%,有时至少80%、至少90%或至少95%。基因产物(例如,蛋白质)的生物学活性可通过功能测定例如酶测定来测量。例如,在一些实施方案中,微生物生物体具有内源基因的蛋白质编码序列的全部或部分的缺失、内源基因的突变(使得基因编码不具有活性或具有降低的活性的多肽)(例如,插入突变、缺失突变、点突变或移码突变),因抑制内源基因表达的反义RNA或小干扰RNA而引起的减少的表达,或减少内源基因表达的修饰或缺失的调控序列(例如,启动子),其任一种可导致破坏的基因。在一些实施方案中,通过缺失破坏微生物中的所有被破坏的基因。
应理解,在酵母和其它微生物中进行基因破坏的方法是公知的,用于减少或消除内源基因表达的具体方法对于本发明不是至关重要的。在一个实施方案中,可通过同源重组来实现破坏,通过所述同源重组,待破坏的基因被间断(例如,通过插入选择标记基因)或被无效(例如,"基因敲除")。用于基因敲除和多个基因敲除的方法是公知的。参见,例如,下文中的实施例5;Rothstein,2004,"Targeting,Disruption,Replacement,andAlleleRescue:IntegrativeDNATransformationinYeast"In:Guthrie等人,Eds.GuidetoYeastGeneticsandMolecularandCellBiology,PartA,p.281-301;Wach等人,1994,"NewheterologousmodulesforclassicalorPCR-basedgenedisruptionsinSaccharomycescerevisiae"Yeast10:1793-1808。用于插入诱变的方法也是公知的。参见例如,Amberg等人,eds.,2005,MethodsinYeastGenetics,p.95-100;Fickers等人,2003,"NewdisruptioncassettesforrapidgenedisruptionandmarkerrescueintheyeastYarrowialipolytica"JournalofMicrobiologicalMethods55:727-737;Akada等人,2006,"PCR-mediatedseamlessgenedeletionandmarkerrecyclinginSaccharomycescerevisiae"Yeast23:399-405;Fonzi等人,1993,"IsogenicstrainconstructionandgenemappinginCandidaalbicans"Genetics134:717-728。
反义抑制在本领域是公知的。可通过使用反义方法抑制转录、稳定性和/或翻译来破坏内源基因。对于反义技术,将与基因的mRNA互补的核酸链(DNA、RNA或类似物)引入细胞。该互补链将结合基因的mRNA,从而有效地破坏基因。
可将破坏的方法独立地用于每一个破坏的基因。因此,当破坏多个基因时,不必以相同的方式破坏基因。例如,微生物生物体可具有一个被一段人工DNA破坏或替代的基因("敲除"),一个被插入突变破坏的基因以及另一个其启动子被改变(以减少表达)的基因。在一些实施方案中,以相同的方式破坏2个或更多个基因。在一些实施方案中,通过相同的破坏事件(例如,重组事件)破坏2个或更多个基因。在一个实施方案中,以相同的方式或通过相同的破坏事件破坏所有被破坏的基因。在一个实施方案中,所有被破坏的基因是“敲除基因”,即,通过破坏或替代至少一部分编码序列来灭活的基因。在另一个实施方案中,所有被破坏的基因是通过相同破坏事件破坏的敲除基因。
在一个实施方案中,多个基因拷贝被破坏。如本文中所用,"基因拷贝"是指,二倍体或多倍体生物中存在于同源染色体上的相同靶基因(例如,内源基因,如本文中描述的)。例如,微生物生物体可具有多组染色体,从而具有多个拷贝的每一种靶基因。在一些实施方案中,微生物生物体是二倍体(即,具有两组染色体,从而具有2个拷贝的每一种靶基因)。在一些实施方案中,微生物生物体是多倍体(即,具有超过2组的染色体)。在一些实施方案中,微生物生物体是三倍体(即,具有3组染色体,从而具有3个拷贝的每一种靶基因)。在一些实施方案中,微生物生物体是四倍体(即,具有4组染色体,从而具有4个拷贝的每一种靶基因)。在一些实施方案中,微生物生物体具有2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个拷贝的靶基因。在一些实施方案中,微生物生物体具有2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个被破坏的拷贝的靶内源基因。在一个实施方案中,所有拷贝的靶内源基因在微生物生物体中被破坏。
术语"一个或多个基因拷贝"是指,相同靶基因的拷贝数,然而"一个或多个被破坏的基因"是指一个或多个单独的基因。例如,微生物生物体可具有两个被破坏的基因拷贝,然而仅具有一个被破坏的基因。
当两个或更多个内源基因被破坏时,对于每一个被破坏的基因,可独立地选择待破坏的拷贝数。可通过例如进行多轮的与可回收的标记的重组来破坏多个拷贝的基因。
IV.截短的SEC62的表达
在另一个方面,本发明涉及重组微生物生物体例如酵母,其中编码Sec62蛋白的内源基因或其同源物或等位基因变体已被修饰。Sec62是在酵母中参与蛋白质至内质网内的转位的蛋白质。耶罗维亚酵母Sec62由YALI0B17512编码,具有SEQIDNO:64所示的氨基酸序列,并且包含细胞质结构域(SEQIDNO:64的氨基酸207至396)。也参见Genbank登录号CAA67878.1和Swennen等人,1997,"CloningtheYarrowialipolyticahomologueoftheSaccharomycescerevisiaeSEC62gene,"CurrGenet31(2):128-132。如下文实施例中所描述的,我们已发现,表达缺乏完整细胞质结构域的截短的Sec62蛋白的酵母细胞相较于其中Sec62蛋白未被截短的对照酵母细胞,具有增加的脂酰CoA衍生物产量。
因此,本发明提供了表达截短的Sec62蛋白或同源物的微生物生物体。生物体可用于本文中描述的任何方法或过程,其可与本文中描述的被破坏的基因和本文中描述的组合组合。
因此,在一些实施方案中,生物体例如藻类、细菌、霉菌、丝状真菌或酵母(例如,解脂耶罗维亚酵母)是其中编码Sec62的内源基因(YALI0B17512或其同源物)包含编码至少一部分编码的Sec62蛋白的细胞质结构域的序列的部分缺失的生物体。在一些实施方案中,编码序列的部分缺失包括编码的Sec62蛋白的整个细胞质结构域的缺失。
在一些实施方案中,Sec62蛋白是SEQIDNO:64或是与SEQIDNO:64大体上同一的同源物或等位基因变体(例如,与SEQIDNO:64具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性)。在一些实施方案中,Sec62蛋白分离或衍生自选自酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)(Genbank登录号CAB56541.1;SEQIDNO:77)、乳克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)(Genbank登录号CAH00127.1;SEQIDNO:78)和裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)(Genbank登录号CAB16220.1;SEQIDNO:79)的生物体。
在一些实施方案中,微生物生物体(例如,解脂耶罗维亚酵母菌)表达其中整个细胞质结构域(对应于SEQIDNO:64的氨基酸207-396)被缺失的截短的Sec62蛋白或同源物。在一些实施方案中,微生物生物体表达截短的Sec62蛋白或同源物,其中一部分细胞质结构域被缺失,例如,从约位置210至约位置396;从约位置250至约位置396;从约位置300至约位置396;从约位置330至约位置396;从约位置210至约位置350;从约位置210至约位置300;从约位置250至约位置350;或从约位置300至约位置350,其中参照SEQIDNO:64对氨基酸进行编号。在一些实施方案中,微生物生物体表达截短的Sec62蛋白或同源物,其中从约位置267至约位置396的一部分细胞质结构域被缺失。在一些实施方案中,微生物生物体表达其中从约位置302至约位置396的一部分细胞质结构域被缺失的截短的Sec62蛋白或同源物。在一些实施方案中,微生物生物体表达其中从约位置337至约位置396的一部分细胞质结构域被缺失的截短的Sec62蛋白或同源物。
在一些实施方案中,微生物生物体是二倍体(即,具有两组染色体,从而具有两个拷贝的编码Sec62的基因)。在一些实施方案中,微生物生物体是多倍体(即,具有超过2组的染色体,从而具有超过2个拷贝的编码Sec62的基因)。在一些实施方案中,超过一个拷贝的Sec62基因被修饰以表达截短的Sec62蛋白。在一些实施方案中,Sec62基因的所有拷贝都被修饰以表达截短的Sec62蛋白。
应理解,用于缺失所有或一部分Sec62的细胞质结构域的具体方法对于本发明不是关键的。在一些实施方案中,可通过用一段人工DNA(例如,选择标记)替代编码细胞质结构域或其部分的序列部分来实现细胞质结构域或其部分的缺失。在一些实施方案中,可通过除去编码细胞质结构域或其部分的编码序列部分来实现细胞质结构域或其部分的缺失。
V.外源FAR的表达
FAR蛋白
在一个方面,显示提高的脂酰CoA衍生物产量的经修饰的微生物生物体(例如,微生物生物体,例如解脂耶罗维亚酵母,其中1、2、3、4或更多个内源基因被破坏,如本文中描述的)表达或过表达FAR。如实施例部分中描述的,其中某些内源基因或基因的组合被破坏并且表达编码FAR蛋白的外源基因的微生物生物体,相较于其中相应的内源基因未被破坏的、表达编码FAR蛋白的外源基因的对照微生物生物体(例如,在其它方面相同的微生物生物体),具有增加的脂酰CoA衍生物产量。
在一些实施方案中,生物体例如藻类、细菌、霉菌、丝状真菌或酵母(例如,解脂耶罗维亚酵母)表达外源FAR蛋白(即,通常不在所述生物体中表达的FAR,例如来源于不同物种的蛋白质)。在一些实施方案中,外源FAR蛋白是野生型FAR蛋白。在一些实施方案中,就增加的脂酰CoA衍生物(例如脂肪醇)的活性或产率选择或工程化外源FAR蛋白(即,如本文中描述的FAR变体)。在一些实施方案中,FAR蛋白是美国专利公开案2011/0000125或2011年6月28日提交的美国专利申请No.13/171,138(所述专利公开案和专利申请各自的完整内容通过引用并入本文)中描述的FAR蛋白或变体。
在一个实施方案中,外源FAR蛋白来自海洋细菌例如γ蛋白杆菌的属(例如,海杆菌属和海洋杆菌属)。在一个实施方案中,外源FAR蛋白来自海杆菌属的种,包括但不限于水油海杆菌、M.arcticus、M.actinobacterium和M.lipolyticus。在一个实施方案中,外源FAR蛋白来自栖藻海杆菌(在本文中也称为"FAR_Maa")。在一个实施方案中,外源FAR蛋白来自水油海杆菌(在本文中也称为"FAR_Maq")。在另一个实施方案中,外源FAR蛋白来自海洋杆菌属的种,包括但不限于海洋杆菌属的种Red65(更名为Bermanellamarisrubi)(在本文中也称为"FAR_Ocs")、海洋杆菌属菌株WH099和O.kriegii。在另一个实施方案中,外源FAR蛋白来自河氏菌属,包括但不限于H.chejuensis及其等同物种。
在一个实施方案中,外源FAR基因是FAR_Maa(来自栖藻海杆菌菌株DG893的野生型FAR,SEQIDNO:1)、FAR_Maq(来自水油海杆菌的野生型FAR,SEQIDNO:3)、FAR_Ocs(来自海洋杆菌属的种RED65的野生型FAR,SEQIDNO:5)或编码功能性FAR酶的片段。在一个实施方案中,FAR基因与SEQIDNOs:1、3或5的任一个具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的DNA序列同一性。在一个实施方案中,FAR基因与SEQIDNO:1具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的DNA序列同一性。
在另一个实施方案中,外源FAR蛋白与SEQIDNOs:2、4或6(其分别对应于野生型FAR_Maa、野生型FAR_Maq和野生型FAR_Ocs的多肽序列)具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性。在一个实施方案中,FAR蛋白与SEQIDNO:2具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的序列同一性。
在其它实施方案中,FAR酶是FAR_Hch(HahellachejuensisKCTC2396,GenBankNo.YP_436183.1,SEQIDNO:65)、FAR_Mac(来自海洋放线细菌(marineactinobacterium)菌株PHSC20C1,SEQIDNO:66)、FAR_JVC(JCVI_ORF_1096697648832,GenBankNo.EDD40059.1,SEQIDNO:67)、FAR_Fer(JCVI_SCAF_1101670217388,SEQIDNO:68)、FAR_Key(JCVI_SCAF_1097205236585,SEQIDNO:69)、FAR_Gal(JCVI_SCAF_1101670289386,SEQIDNO:70)或其变体或功能性片段。表2提供了此类细菌FAR蛋白与FAR_Maa(SEQIDNO:2)和FAR_Ocs(SEQIDNO:6)的近似氨基酸序列同一性。
表2.同源物相于FAR_Maa和FAR_Ocs的氨基酸序列同一性
在其它实施方案中,FAR酶或功能性片段分离或衍生自选自下述的生物体:葡萄(Vitisvinifera)(Genbank登录号CAO22305.1,SEQIDNO:71;或CAO67776.1,SEQIDNO:72)、裂解烯烃脱硫杆菌(Desulfatibacillumalkenivorans)(Genbank登录号NZ_ABII01000018.1)、橙色标桩菌(Stigmatellaaurantiaca)(NZ_AAMD01000005.1,SEQIDNO:73)和Phytophthoraramorum(Genbank登录号:AAQX01001105.1)。
FAR变体
在一些实施方案中,使用FAR酶的变体,例如使用分子进化技术选择的功能性片段和变体。如本文中所用,"功能性片段"是指这样的多肽,所述多肽具有氨基末端和/或羧基末端缺失和/或内部缺失,但其中剩余的氨基酸序列与进行比较的序列(例如,全长野生型FAR蛋白或全长FAR变体蛋白)中的对应位置相同或大体上相同,并且大体上保留全部(例如,保留至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或更多)的全长多肽(例如,全长野生型FAR蛋白或全长FAR变体蛋白)的活性。功能性片段可包含多达全长FAR蛋白的60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%和99%。因此,在该情况中,功能性片段是具有催化活性的天然存在的FAR多肽或其变体的片段。在一些实施方案中,功能性片段具有至少50%的其所源自的对应的全长野生型FAR(例如,FAR_Maa、FAR_Maq或FAR_Ocs)的活性。
在一些实施方案中,FAR变体相较于野生型FAR包含一个或多个突变(例如,置换),以便所得的FAR变体多肽相较于野生型FAR具有改善的特征和/或性质,例如当FAR变体在宿主细胞中表达时,增加的脂肪醇产量。在一些实施方案中,变体FAR蛋白相对于天然(野生型)FAR蛋白例如FAR_Maa(SEQIDNO:2)、FAR_Maq(SEQIDNO:4)或FAR_Ocs(SEQIDNO:6)可具有1至50个例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或更多个氨基酸置换。在一些实施方案中,变体FAR蛋白相对于SEQIDNO:2的天然FAR蛋白可具有1至50个例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或更多个氨基酸置换。在一些实施方案中,变体FAR蛋白相对于SEQIDNO:4的天然FAR蛋白可具有1至50个例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或更多个氨基酸置换。在一些实施方案中,变体FAR蛋白相对于SEQIDNO:6的天然FAR蛋白可具有1至50个例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或更多个氨基酸置换。
在一些实施方案中,FAR变体与野生型FAR(例如,SEQIDNO:2、SEQIDNO:4或SEQIDNO:6的FAR多肽)具有至少约70%(或至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%或至少约99%)的序列同一性,并且相对于野生型FAR还包含一个或多个氨基酸置换(例如,1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或更多个氨基酸置换),并且当在相同条件下进行测定时,与其所源自的野生型FAR相比,能够产生至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍或至少约10倍的脂肪醇。
在某些实施方案中,微生物生物体不表达内源FAR(即,野生型生物体的基因组不编码FAR)。在一些实施方案中,微生物生物体是表达内源FAR蛋白的生物体。在某些实施方案中,微生物生物体是不表达外源FAR蛋白的生物体。在一些实施方案中,微生物生物体是既不表达内源FAR蛋白也不表达外源FAR蛋白的生物体。在一些实施方案中,微生物生物体表达内源FAR和外源FAR。
用于将外源基因(例如,FAR编码基因)引入宿主生物体并且表达外源蛋白质的方法在本领域是已知的。参见下文VII部分。
VI.微生物生物体
宿主细胞
其中一个或多个内源基因被破坏并且显示提高的脂酰CoA衍生物产量的微生物生物体可以是产生脂酰CoA衍生物的任何“宿主细胞”。适当的宿主细胞包括但不限于,藻类、细菌、霉菌、丝状真菌和酵母,包括产油酵母(例如,解脂耶罗维亚酵母)。在一些实施方案中,微生物生物体是产油生物体(oleaginousorganism),例如,倾向于以油的形式贮存其能量来源的生物体。宿主细胞可以是真核或原核细胞。
在一个实施方案中,微生物生物体是真菌。适当的真菌宿主细胞包括但不限于,子囊菌纲(Ascomycota)、担子菌纲(Basidiomycota)、半知菌门(Deuteromycota)、接合菌亚纲(Zygomycota)、半知真菌(Fungiimperfecti)。特别优选的真菌宿主细胞是酵母细胞和丝状真菌细胞。
在一个实施方案中,微生物生物体是酵母。在一个实施方案中,酵母来自下列属之一:耶罗维亚酵母属、酒香酵母属、假丝酵母属、隐球酵母属、拟内孢霉属、汉逊酵母属、克鲁维酵母属、油脂酵母属、管囊酵母属、毕赤酵母属、红冬孢酵母属、红酵母属、酵母菌属、裂殖酵母属、毛孢子菌属或三角酵母属。在一个实施方案中,酵母来自耶罗维亚酵母属。在本发明的一些实施方案中,酵母细胞是多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、卡氏酵母(Saccaromycescarlsbergensis)、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、Saccharomycesnorbensis、克鲁弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、巴斯得毕赤酵母(Pichiapastoris)、Pichiafinlandica、Pichiatrehalophila、Pichiakodamae、膜醭毕赤酵母(Pichiamembranaefaciens)、Pichiaopuntiae、Pichiathermotolerans、Pichiasalictaria、Pichiaquercuum、Pichiapijperi、树干毕赤酵母(Pichiastipitis)、甲醇毕赤酵母(Pichiamethanolica)、安格斯毕赤酵母(Pichiaangusta)、乳克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)、白色假丝酵母(Candidaalbicans)和解脂耶罗维亚酵母。
在一个实施方案中,微生物生物体是产油酵母。产油酵母积累脂质例如三酰基甘油。产油酵母的实例包括但不限于,解脂耶罗维亚酵母、副解脂耶罗维亚酵母、Candidarevkauji、铁红假丝酵母、热带假丝酵母、产朊假丝酵母、弯假丝酵母D、弯假丝酵母R、Candidadiddensiae、Candidaboldinii、粘红酵母、禾本红酵母、胶红酵母、小红酵母、高产酵母菌株、圆红冬孢酵母菌、Cryptococcus(terricolus)albidusvar.albidus、罗伦隐球酵母、Trichosporonpullans、皮状丝孢酵母、Trichosporoncutancum、茁芽丝孢酵母、Lipomycesstarkeyii、Lipomyceslipoferus、子囊菌油脂酵母、Endomycopsisvernalis、Hansenulaciferri、星汉逊酵母或变异三角酵母。
在一个实施方案中,酵母是解脂耶罗维亚酵母。示例性解脂耶罗维亚酵母菌株包括但不限于可从DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH获得的DSMZ1345,DSMZ3286,DSMZ8218,DSMZ70561,DSMZ70562,DSMZ21175,以及可从农业研究局(AgriculturalResearchService)(NRRL)获得的菌株例如但不限于NRRLYB-421,NRRLYB-423,NRRLYB-423-12和NRRLYB-423-3。
在一个实施方案中,宿主细胞是丝状真菌。本发明的丝状真菌宿主细胞包括真菌亚门(Eumycotina)和卵菌门(Oomycota)的所有丝状体形式(Hawksworth等人,1995,AinsworthandBisby'sDictionaryofTheFungi,第8版)。丝状真菌的特征在于,具有由壳多糖、纤维素和其它复杂多糖组成的细胞壁的营养菌丝体。如本文中所用,本发明的丝状真菌宿主细胞在形态学上不同于酵母。示例性丝状真菌细胞包括但不限于下列属的种:绵霉属(Achlya)、支顶孢属(Acremonium)、曲霉菌属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管菌属(Bjerkandera)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、头孢菌属(Cephalosporium)、金小孢子属(Chrysosporium)、旋孢腔菌属(Cochliobolus)、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳属(Cryphonectria)、隐球酵母属(Cryptococcus)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、色二孢属(Diplodia)、Endothis、镰刀菌属(Fusarium)、赤霉菌属(Gibberella)、胶霉属(Gliocladium)、腐质霉属(Humicola)、肉座菌属(Hypocrea)、毁丝霉属(Myceliophthora)、毛霉菌属(Mucor)、链孢霉属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、柄孢壳菌(Podospora)、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、梨孢属(Pyricularia)、根毛霉菌属(Rhizomucor)、根霉属菌(Rhizopus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱霉属(Scytalidium)、侧孢霉属(Sporotrichum)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、栓孔菌属(Trametes)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、轮枝孢属(Verticillium)、小包脚菇属(Volvariella)、包括其有性型(teleomorphs)、无性型(anamorphs)、异名(synonyms)、基本异名(basionyms)和分类学等同物。
在一些实施方案中,宿主细胞是藻类细胞例如衣藻属(Chlamydomonas)(例如,莱氏衣藻(C.Reinhardtii))和席藻属(Phormidium)(P.sp.ATCC29409)。
适当的原核细胞包括革兰氏阳性、革兰氏阴性和革兰氏不定细菌细胞。示例性原核宿主细胞包括但不限于下列属的种:土壤杆菌属(Agrobacterium)、环脂酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus)、鱼腥藻属(Anabaena)、组囊藻属(Anacystis)、不动杆菌属(Acinetobacter)、热酸菌属(Acidothermus)、节杆菌属(Arthrobacter)、固氮菌属(Azobacter)、芽胞杆菌属(Bacillus)、双岐杆菌属(Bifidobacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、丁酸弧菌属(Butyrivibrio)、黑草属(Buchnera)、Campestris、弯曲菌属(Camplyobacter)、梭菌属(Clostridium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、着色菌属(Chromatium)、粪球菌属(Coprococcus)、埃希氏菌属(Escherichia)、肠球菌属(Enterococcus)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、梭杆菌属(Fusobacterium)、Faecalibacterium、弗郎西斯氏菌属(Francisella)、黄杆菌属(Flavobacterium)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、嗜血菌属(Haemophilus)、螺杆菌属(Helicobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、泥杆菌属(Ilyobacter)、微球菌属(Micrococcus)、微杆菌属(Microbacterium)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)、甲基菌属(Methylobacterium)、甲基菌属(Methylobacterium)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、泛菌属(Pantoea)、假单胞菌属(Pseudomonas)、原绿球藻属(Prochlorococcus)、红杆菌属(Rhodobacter)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、罗氏菌属(Roseburia)、红螺菌属(Rhodospirillum)、红球菌属(Rhodococcus)、栅藻属(Scenedesmus)、链霉菌属(Streptomyces)、链球菌属(Streptococcus)、Synecoccus、糖单孢子菌属(Saccharomonospora)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、沙雷氏菌属(Serratia)、沙门菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacterium)、吸收障碍菌属(Tropheryma)、Tularensis、Temecula、嗜热聚球藻属(Thermosynechococcus)、热球菌属(Thermococcus)、脲原体属(Ureaplasma)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、木杆菌属(Xylella)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、和发酵单胞菌属(Zymomonas)。在一些实施方案中,宿主细胞是下列属的种:土壤杆菌属(Agrobacterium)、不动杆菌属(Acinetobacter)、固氮菌属(Azobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、双岐杆菌属(Bifidobacterium)、黑草属(Buchnera)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、梭菌属(Clostridium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、埃希氏菌属(Escherichia)、肠球菌属(Enterococcus)、欧文氏菌属(Erwinia)、黄杆菌属(Flavobacterium)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、泛菌属(Pantoea)、假单胞菌属(Pseudomonas)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、沙门菌属(Salmonella)、链球菌属(Streptococcus)、链霉菌属(Streptomyces)或发酵单胞菌属(Zymomonas)。
转化和细胞培养
在另一个实施方案中,本发明提供了方法,所述方法包括提供本文中描述的微生物生物体,在产生脂酰CoA衍生物的条件下培养微生物生物体。在一些实施方案中,具有一个或多个被破坏的内源基因的微生物生物体相较于相同类型的对照生物体(例如,其中所述一个或多个基因未被破坏的、在其它方面相同的对照微生物生物体),能够具有提高的上述产量,例如至少1倍的脂酰CoA衍生物产量的增加。
在一些实施方案中,将编码FAR多肽(例如,野生型FAR多肽或FAR变体多肽)的多核苷酸引入微生物生物体以表达野生型FAR多肽或FAR变体多肽。可将多核苷酸作为自主复制的附加体(例如,表达载体)引入细胞或可将其稳定地整合入宿主细胞DNA。
用于转化本文中的微生物生物体例如细菌、酵母(包括产油酵母)和丝状真菌的方法、试剂和工具在本领域是已知的。用于转化例如细菌的一般方法、试剂和工具可见于例如Sambrook等人(2001)MolecularCloning:ALaboratoryManual,第3版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork中。用于转化酵母的方法、试剂和工具描述于"GuidetoYeastGeneticsandMolecularBiology,"C.Guthrie和G.Fink,Eds.,MethodsinEnzymology350(AcademicPress,SanDiego,2002)中。用于转化、培养和操作解脂耶罗维亚酵母菌的方法、试剂和工具见于"Yarrowialipolytica,"C.Madzak,J.M.Nicaud和C.Gaillardin,"ProductionofRecombinantProteins.NovelMicrobialandEucaryoticExpressionSystems,"G.Gellissen,Ed.2005(其通过引用并入本文,用于所有目的)中。在一些实施方案中,可通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、PEG-介导的转化、电穿孔或其它常用技术(参见Davis等人,1986,BasicMethodsinMolecularBiology,其通过引用并入本文)实现本发明的DNA构建体或载体至宿主细胞内的引入。
可在改进为适合于激活启动子、选择转化子或扩增FAR多核苷酸的常规营养培养基中培养微生物生物体。培养条件,例如温度、pH等对于本领域技术人员来说是显然的。如所指出的,关于许多细胞包括细菌、植物、动物(特别地哺乳动物)和古细菌来源的细胞的培养和生产,许多参考资料是可获得的。参见例如,Sambrook,Ausubel和Berger(全部同上),以及Freshney(1994)CultureofAnimalCells,aManualofBasicTechnique,第3版,Wiley-Liss,NewYork和本文中引用的参考资料;Doyle和Griffiths(1997)MammalianCellCulture:EssentialTechniquesJohnWileyandSons,NY;Humason(1979)AnimalTissueTechniques,第4版W.H.Freeman和Company;和Ricciardelli,等人,(1989)InVitroCellDev.Biol.25:1016-1024,所述参考资料全部通过引用并入本文。关于植物细胞的培养和再生,Payne等人(1992)PlantCellandTissueCultureinLiquidSystemsJohnWiley&Sons,Inc.NewYork,NY;Gamborg和Phillips(eds)(1995)PlantCell,TissueandOrganCulture;FundamentalMethodsSpringerLabManual,Springer-Verlag(BerlinHeidelbergNewYork);Jones,ed.(1984)PlantGeneTransferandExpressionProtocols,HumanaPress,Totowa,NewJerseyandPlantMolecularBiology(1993)R.R.D.Croy,Ed.BiosScientificPublishers,Oxford,U.K.ISBN0121983706,所述参考资料全部通过引用并入本文。一般的细胞培养基示于Atlas和Parks(eds.)TheHandbookofMicrobiologicalMedia(1993)CRCPress,BocaRaton,FL,其通过引用并入本文。关于细胞培养的其它信息见于可获得的商业文献,例如来自Sigma-Aldrich,Inc(StLouis,MO)的LifeScienceResearchCellCultureCatalogue(1998)("Sigma-LSRCCC")和例如,也来自Sigma-Aldrich,Inc(StLouis,MO)的PlantCultureCatalogueandsupplement(1997)("Sigma-PCCS"),所述文献全都通过引用并入本文。
VII.其它代谢工程
在一个实施方案中,显示提高的脂酰CoA衍生物产量的经修饰的微生物生物体包含,有效地连接于在微生物生物体中具有功能的启动子的外源基因。外源基因(例如,上述FAR基因)的引入可通过本领域公知的技术来实现。
在一些实施方案中,可修饰微生物生物体以表达或过表达一种或多种编码酶(除FAR外)的基因,所述酶参与脂酰CoA衍生物的生物合成。参见图1。在具体实施方案中,所述基因编码脂肪酸合酶(FAS)、酯合酶、酰基-ACP硫酯酶(TE)、脂酰CoA合酶(FACS)或乙酰-CoA羧化酶(ACC)。例如,在一个实施方案中,可修饰微生物生物体以表达酯合酶来产生脂肪酯。类似地,在另一个实施方案中,可修饰微生物生物体以表达硫酯酶来产生脂肪酸。可不使用FAR而使用此类示例性基因的任一个,或除FAR外还可使用此类示例性基因的任一个。当表达多个外源基因时,在一些实施方案中,编码第一酶(例如,FAR)的表达载体和编码第二酶(例如,FAS、酯合酶、TE、FACS或ACC)的表达载体是分开的核酸。在其它实施方案中,在相同的表达载体上编码第一酶和第二酶,每一种酶的表达独立地受不同启动子调控。
如图1中显示的,微生物生物体可产生不同的脂酰CoA衍生物。当期望回收特定衍生物时,可改变参与该代谢途径的一种或多种多肽的表达或活性以优先产生期望的衍生物。例如,可改变乙酰-CoA羧化酶、丙酮酸脱羧酶、异柠檬酸脱氢酶、ATP-柠檬酸裂合酶、苹果酸酶、AMP-脱氨酶、葡糖-6-磷酸脱氢酶、6-磷酸葡糖酸脱氢酶、果糖1,6二磷酸酶、NADH激酶、转氢酶、酰基-CoA:二酰甘油酰基转移酶、磷脂:二酰甘油酰基转移酶、酰基-CoA:胆固醇酰基转移酶、甘油三酯脂酶和酰基-辅酶A氧化酶中的一种或多种的表达或活性。
作为另一个实例,可修饰微生物生物体以利用特别期望的底物。例如,尽管野生型解脂耶罗维亚酵母菌不优先利用木糖作为底物,但可对其进行基因工程改造以使其优先利用木糖作为底物。参见,例如,Brat等人,2009,"FunctionalexpressionofabacterialxyloseisomeraseinSaccharomycescerevisiae"AppliedandEnvironmentalMicrobiology75:2304-11;Ho等人,1998,"GeneticallyengineeredSaccharomycesyeastcapableofeffectivecofermentationofglucoseandxylose"AppliedandEnvironmentalMicrobiology64:1852-59。类似地,还可对解脂耶罗维亚酵母菌工程改造以利用蔗糖。参见,例如,Nicaud等人,1989,"ExpressionofinvertaseactivityinYarrowialipolyticaanditsuseasaselectablemarker"CurrentGenetics16:253-260。可以有利地工程化微生物生物体以使其适合特定环境条件,例如,利用获自纤维质或木质纤维质生物质的原料,其中可将原料与纤维素酶接触以提供可发酵的糖(包括但不限于葡萄糖、果糖、木糖和蔗糖)。
在一些实施方案中,本文中描述的微生物生物体(例如,包含选自YALI0C17545、YALI0E28336、YALI0E11099、YALI0B10406、YALI0A19536、YALI0E28534、YALI0E32769、YALI0E30283、YALI0E12463、YALI0E17787、YALI0B14014、YALI0A10769、YALI0A15147、YALI0A16379、YALI0A20944、YALI0B07755、YALI0B10175、YALI0B13838、YALI0C02387、YALI0C05511、YALI0D01738、YALI0D02167、YALI0D04246、YALI0D05291、YALI0D07986、YALI0D10417、YALI0D14366、YALI0D25630、YALI0E03212、ALI0E07810、YALI0E12859、YALI0E14322、YALI0E15378、YALI0E15400、YALI0E18502、YALI0E18568、YALI0E22781、YALI0E25982、YALI0E28314、YALI0E32417、YALI0F01320、YALI0F06578、YALI0F07535、YALI0F14729、YALI0F22121、YALI0F25003、YALI0E14729、YALI0B17512及其同源物的一个或多个被破坏的内源基因以及有效地连接于启动子的编码外源FAR的外源基因的微生物生物体)还包含编码催化可发酵的糖(例如,蔗糖、阿拉伯糖或甘露糖)水解的酶的外源基因。催化可发酵的糖水解的酶的实例包括但不限于蔗糖酶和转化酶。因此,在一些实施方案中,外源基因编码蔗糖酶或转化酶。在一些实施方案中,外源基因是SUC2基因,其编码转化酶。转化酶(EC3.2.1.26)催化蔗糖水解,产生葡萄糖和果糖的混合物。蔗糖酶与转化酶相关,但通过不同的机制催化蔗糖水解。
编码催化可发酵的糖水解的酶的外源基因可来源于任何适当的微生物生物体,例如来自藻类、细菌、霉菌、丝状真菌或酵母。在一些实施方案中,包含一个或多个被破坏的内源基因的微生物生物体是解脂耶罗维亚酵母菌,编码催化蔗糖水解的酶的外源基因来自酿酒酵母。在一些实施方案中,外源基因酿酒酵母SUC2转化酶。
外源基因的靶向整合
在一些实施方案中,外源基因在微生物生物体中的表达可通过将在附加型质粒上的外源基因引入生物体来实现。在一些实施方案中,外源基因的表达可通过将基因整合入微生物生物体的基因组来实现。外源基因至微生物生物体的基因组中的整合具有优于质粒的使用的多种有利方面,包括但不限于蛋白质表达的较少变化、发酵培养基的选择上的更大的灵活性和通过引入多个拷贝的单基因来实现高水平表达的潜能。
因此,在一些实施方案中,如本文中描述的具有一个或多个被破坏的内源基因的微生物生物体还包含编码参与脂酰CoA衍生物生物合成的酶(例如,FAR酶)的外源基因,其中外源基因被整合入微生物生物体的基因组。在一些实施方案中,微生物生物体包含被整合入微生物生物体基因组的编码FAR蛋白(例如,与SEQIDNO:2、4或6的任一个的FAR多肽同一或大体上同一的野生型FAR蛋白,或者本文中描述的FAR变体蛋白)的外源基因。
在一些实施方案中,微生物生物体包含一个拷贝的外源基因。在一些实施方案中,微生物生物体包含2、3、4、5或更多个拷贝的外源基因。在一些实施方案中,多个拷贝的外源基因(例如,2、3、4、5或更多个拷贝)被以同向重复结构或反向重复结构整合入微生物生物体的基因组。
在一些实施方案中,外源基因至微生物生物体的基因组中的整合可被靶向至微生物基因组的一个或多个特定区域。可定位微生物生物体的基因组以鉴定这样的区域(也称为表达的"热点(hotspot)"),在所述区域中外源基因的整合导致,相对于相同类型的对照生物体(例如,在其它方面相同的生物体)通过质粒进行的外源基因的表达,提高的基因表达或改善的性质(例如,提高的脂肪醇产量)。如下文实施例中显示的,在将编码FAR蛋白的外源基因整合入解脂耶罗维亚酵母菌株后,鉴定相对于通过质粒表达FAR的解脂耶罗维亚酵母菌株,显示特别良好的脂肪醇产量的提高的菌株。一旦定位,就可通过同源重组将外源基因的随后整合靶向这些表达的整合热点。
因此,在一些实施方案中,将外源基因在其为表达热点的染色体位置上整合入微生物生物体基因组。在一些其中微生物生物体是解脂耶罗维亚酵母菌的实施方案中,将外源基因在本文中(例如实施例1中)描述的染色体位置的一个或多个位置上整合入微生物生物体基因组。
外源基因至本发明的微生物生物体基因组的靶向整合还可通过"无缝"标记回收("seamless"markerrecycling)来实现。如下文实施例部分所描述的,在无缝标记回收中,将双功能选择标记引入特定基因组位置,以破坏天然基因或引入外源基因。使用选择标记(正选择,例如,使用赋予抗生素抗性的标记)来鉴定整合体。通过两个侧翼重复之间的同源重组切除或“回收”标记,并且通过反选择(counter-selection)(负选择,例如,使用诱导毒性的标记)鉴定已成功地回收标记的生物体。随后可将选择标记再次用于将其它修饰引入生物体的基因组。该方法是有利的,因为其在理论上允许对生物体的基因组进行无限次的靶向修饰(例如,基因的靶向缺失或外源基因的靶向整合),从而有利于菌株开发。
因此,在一些实施方案中,使用具有正选择标记和负选择标记的可回收的双功能选择标记,将外源基因(例如,编码参与脂酰CoA衍生物生物合成的酶例如FAR酶的基因)整合入本发明的微生物生物体(例如,本文中描述的具有一个或多个被破坏的内源基因的微生物生物体)的基因组,其中使用正选择标记鉴定外源基因至基因组的整合以及其中使用负选择标记鉴定双功能标记的随后回收。在一些实施方案中,双功能选择标记具有潮霉素正选择标记和胸苷激酶负选择标记。
载体
表达载体可用于将编码FAR酶的基因和/或编码参与脂酰CoA衍生物生物合成的酶(除FAR外)的基因,和/或编码催化可发酵的糖水解的酶的基因转化入本发明的微生物生物体(例如,如本文中描述的具有一个或多个被破坏的内源基因的微生物生物体)。重组表达载体可以是任何载体,例如质粒或病毒,其可通过重组DNA技术来操作,以促进外源基因在微生物生物体中表达。在一些实施方案中,表达载体被稳定地整合入微生物生物体的染色体。在其它实施方案中,表达载体是染色体外复制型DNA分子,例如,线性或闭合环状质粒,其以低拷贝数(例如,每基因组当量约1至约10个拷贝)或以高拷贝数(例如,每基因组当量超过约10个拷贝)存在。
用于表达一个或多个外源基因的表达载体是商购可得的,例如,来自Sigma-AldrichChemicals,St.Louis,MO和Stratagene,LaJolla,CA。在一些实施方案中,适当的表达载体的实例是源自pBR322(GibcoBRL)、pUC(GibcoBRL)、pREP4、pCEP4(Invitrogen)或pPoly(Lathe等人,1987,Gene57:193-201)的质粒。
在一些实施方案中,表达载体任选地包含用于翻译起始的核糖体结合位点(RBS)和转录终止子例如PinII。载体还任选地包括用于增强表达的适当序列例如增强子。
在特定实施方案中,本公开内容提供了用于在耶罗维亚酵母,特别地解脂耶罗维亚酵母菌中表达外源基因的自主复制型质粒。示例性质粒示于图2中并且描述于实施例中。还可进一步修饰这样的质粒以在酵母,特别是解脂耶罗维亚酵母菌中表达用于脂酰CoA衍生物生产的外源基因。
在一些实施方案(其中待在微生物生物体中表达超过一种的外源基因(例如,编码野生型FAR多肽或FAR变体多肽的第一外源基因,和编码参与脂酰CoA衍生物生物合成的酶(FAR除外)或催化可发酵的糖水解的酶的第二外源基因))中,编码FAR多肽的表达载体和编码第二酶的表达载体是分开的核酸。在其它实施方案中,在相同的表达载体上编码FAR多肽和第二酶,每一种酶的表达独立地受不同启动子调控。
启动子
启动子序列是被宿主细胞识别以表达多核苷酸例如包含编码区的多核苷酸的核酸序列。一般而言,启动子序列包含转录控制序列,其介导多核苷酸的表达。启动子可以是在选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核酸序列,包括突变启动子、截短启动子和杂合启动子,并且可从对于宿主细胞是同源的或异源的、编码细胞外或细胞内多肽的基因获得。用于分离、鉴定和操作不同强度的启动子的方法在本领域中是可获得的或可容易地从现有技术改造而来。参见,例如,Nevoigt等人(2006)Appl.Environ.Microbiol.72:5266-5273,其公开内容通过引用整体并入本文。
在酵母宿主中,有用的启动子包括但不限于,来自酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GALl)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸酯激酶的基因的启动子。示例性解脂耶罗维亚酵母菌启动子包括但不限于,TEF1、RPS7(Müller等人,1998,"ComparisonofexpressionsystemsintheyeastsSaccharomycescerevisiae,Hansenulapolymorpha,Klyveromyceslactis,SchizosaccharomycespombeandYarrowialipolytica.CloningoftwonovelpromotersfromYarrowialipolytica"Yeast14:1267-1283)、GPD、GPM(US7259255)、GPAT(US7264949)、FBA1(US7202356)、Leu2启动子及其变体(US5786212)、EF1α蛋白启动子(WO97/44470)、Xpr2(US4937189)、Tefl、Caml(YALI0C24420g)、YALI0DI6467g、Tef4(YALI0BI2562g)、Yef3(YALI0E13277g)、Pox2、Yat1(US2005/0130280)、US2004/0146975和US5952195中公开的启动子、CYP52A2A(US2002/0034788);来自真菌(例如,热带假丝酵母)过氧化氢酶、柠檬酸合酶、3-酮脂酰-CoA硫解酶A、柠檬酸合酶、O-acetylhornserinesulphydrylase、蛋白酶、肉碱O-乙酰基转移酶、水合酶脱氢酶、表异构酶基因;Pox4基因(US2004/0265980)以及Met2、Met3、Met6、Met25和YALI0DI2903g基因的序列。也参见WO2008/042338。用于酵母宿主细胞的其它有用的启动子由Romanos等人,1992,"Foreigngeneexpressioninyeast:areview"Yeast8:423-488描述。
对于细菌宿主细胞,适当的启动子包括但不限于,获自大肠杆菌(E.coli)lac操纵子、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)琼脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、藓样芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)生麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)、藓样芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因的启动子、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)启动子和原核生物β-内酰胺酶基因启动子(Villa-Kamaroff等人,Proc.NatlAcad.Sci.USA75:3727-3731(1978))以及tac启动子(DeBoer等人,Proc.NatlAcad.Sci.USA80:21-25(1993))。其它启动子包括trp启动子、噬菌体λPL、T7启动子等。适用于本发明的启动子描述于Gilbert等人,1980,"Usefulproteinsfromrecombinantbacteria"SciAm242:74-94和Sambrook等人(同上)中。
对于丝状真菌宿主细胞,适当的启动子包括但不限于,获自米曲霉菌(Aspergillusoryzae)TAKA淀粉酶、米赫根毛霉(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉菌(Aspergillusniger)中性α淀粉酶、黑曲霉菌酸稳定性α淀粉酶、黑曲霉菌或泡盛曲霉(Aspergillusawamori)葡糖淀粉酶(glaA)、米赫根毛霉脂肪酶、米曲霉菌碱性蛋白酶、米曲霉菌丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉菌(Aspergillusnidulans)乙酰胺酶和尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶(WO96/00787)的基因的启动子以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉菌中性α淀粉酶和米曲霉菌丙糖磷酸异构酶的基因的启动子的杂合体)。
启动子可以是美国专利申请No.13/330,324所列的启动子的任一种。具体地,启动子可以是来自解脂耶罗维亚酵母菌基因YALI0E12683部分的启动子区域、来自解脂耶罗维亚酵母菌基因YALI0E19206部分的启动子区域或来自解脂耶罗维亚酵母菌基因YALI0E34749部分的启动子区域。在一些实施方案中,启动子包含SEQIDNO:74(YALI0E12683的0.25kb序列)、SEQIDNO:75(YALI0E19206的0.25kb序列)或SEQIDNO:76(YALI0E34749的0.25kb序列)的核苷酸序列。在一些实施方案中,启动子与SEQIDNO:74、SEQIDNO:75或SEQIDNO:76的核苷酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%和至少99%的序列同一性。
其它调控元件
外源基因的表达还可通过掺入转录终止子、前导序列、多腺苷酸化序列、分泌信号、前肽编码区、调控序列和/或选择标记来增强,这对于本领域技术人员来说是很显然的。用于本公开内容的多核苷酸构建体的适当控制序列的选择在本领域技术人员的能力之内,并且在不同的实施方案中,取决于所使用的重组宿主细胞和期望的回收产生的脂肪醇组合物的方法。
用于耶罗维亚酵母的有用调控序列包括但不限于,Xpr2启动子片段(US6083717)。有用的终止子序列包括但不限于,解脂耶罗维亚酵母菌Xpr2(US4937189)和Pox2(YALIOFI0857g)终止子序列。
在不同的实施方案中,表达载体包括一个或多个选择标记,其允许容易地选择转化的细胞。用于本文中描述的宿主生物体的选择标记包括但不限于,赋予包含所述载体的重组宿主生物体抗生素抗性(例如,氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、潮霉素或四环素抗性)的基因。
VIII.提高的脂酰CoA衍生物产量
本文中描述的经修饰的微生物生物体显示提高的脂酰CoA衍生物产量。可将本发明的经修饰的微生物生物体的脂酰CoA衍生物的产率与相同类型的对照生物体(例如,其中内源基因未被破坏的、在其它方面相同的对照微生物生物体)相比较。在一个实施方案中,经修饰的微生物生物体具有至少一个被破坏的内源基因和有效地连接于启动子的编码功能性脂肪酰基还原酶的外源基因,所述内源基因为YALI0C17545、YALI0E28336、YALI0E11099、YALI0B10406、YALI0A19536、YALI0E28534、YALI0E32769、YALI0E30283、YALI0E12463、YALI0E17787、YALI0B14014、YALI0A10769、YALI0A15147、YALI0A16379、YALI0A20944、YALI0B07755、YALI0B10175、YALI0B13838、YALI0C02387、YALI0C05511、YALI0D01738、YALI0D02167、YALI0D04246、YALI0D05291、YALI0D07986、YALI0D10417、YALI0D14366、YALI0D25630、YALI0E03212、ALI0E07810、YALI0E12859、YALI0E14322、YALI0E15378、YALI0E15400、YALI0E18502、YALI0E18568、YALI0E22781、YALI0E25982、YALI0E28314、YALI0E32417、YALI0F01320、YALI0F06578、YALI0F07535、YALI0F14729、YALI0F22121、YALI0F25003、YALI0E14792、YALI0B17512或此类基因的任一个的同源物。在一些实施方案中,相较于相同类型的对照生物体(例如,其中一个或多个内源基因未被破坏的在其它方面相同的对照微生物生物体),所述生物体显示脂酰CoA衍生物产量的至少1.2倍的增加。在其它实施方案中,提高的产量为对照微生物生物体的至少1倍、至少1.2倍、至少1.5倍、至少2.5倍、至少4倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、或至少60倍。在一些实施方案中,编码脂肪酰基还原酶的外源基因是与FAR_Maa(SEQIDNO:1)、FAR_Maq(SEQIDNO:3)或FAR_Ocs(SEQIDNO:5)的核苷酸序列具有至少80%的序列同一性的基因。在一些实施方案中,外源基因编码与野生型FAR_Maa(SEQIDNO:2)、野生型FAR_Maq(SEQIDNO:4)或野生型FAR_Ocs(SEQIDNO:6)具有至少80%的序列同一性的FAR多肽。在一些实施方案中,外源基因编码来源于FAR_Maa(SEQIDNO:2)、FAR_Maq(SEQIDNO:4)或FAR_Ocs(SEQIDNO:6)的FAR变体。
在一些实施方案中,本发明提供包含1、2、3、4或更多个被破坏的内源基因以及有效地连接于启动子的编码功能性脂肪酰基还原酶基因的外源基因的微生物生物体(例如,藻类、细菌、霉菌、丝状真菌、酵母或产油酵母),其中至少一个被破坏的内源基因选自C17545基因、E28336基因、E11099基因、E28534基因及其同源物,其中所述微生物生物体相较于对照微生物生物体(例如,其中一个或多个基因未被破坏的、在其它方面相同的对照微生物生物体),显示至少1倍、至少1.2倍、至少1.5倍、至少2.5倍、至少4倍、至少10倍、至少15倍或至少20倍的脂酰CoA衍生物产量的增加。
在一个实施方案中,本发明提供了包含至少一个被破坏的内源基因以及有效地连接于启动子的编码功能性脂肪酰基还原酶基因的外源基因的解脂耶罗维亚酵母细胞,所述内源基因是YALI0C17545,YALI0E28336,YALI0E11099,YALI0B10406,YALI0A19536,YALI0E28534,YALI0E32769,YALI0E30283,YALI0E12463,YALI0E14729或YALI0B17512或此类基因的任一个的同源物,其中解脂耶罗维亚酵母细胞相较于对照微生物生物体(例如,其中一个或多个基因未被破坏的、在其它方面相同的对照微生物生物体),显示至少1倍的脂酰CoA衍生物产量的增加。在某些实施方案中,本发明提供了包含表3或表4中所示的被破坏的基因或被破坏的基因的组合的解脂耶罗维亚酵母细胞。在某些实施方案中,本发明提供了包含被破坏的基因或被破坏的基因的组合的酵母细胞,所述被破坏的基因是表3或表4中所示的基因的同源物。
对照微生物生物体可以是例如解脂耶罗维亚酵母菌DSMZ1345(野生型)或解脂耶罗维亚酵母菌株CY-201(在以十六烷为唯一碳源的生长培养基中生长不良的解脂耶罗维亚酵母菌DSMZ1345变体)。在一些实施方案中,对照微生物生物体是与具有被破坏的基因的微生物生物体一样具有相同整合的外源基因的重组生物体。例如,具有一个或多个被破坏的内源基因的微生物生物体和对照微生物生物体都可包含外源FAR基因。
当将具有一个或多个被破坏的内源基因的微生物生物体与对照微生物生物体相比较时,应当在基本上相同的条件下培养生物体,应当使用基本上相同的方法测量或回收脂酰CoA衍生物。
脂肪醇的产量
在一些实施方案中,产生的脂酰CoA衍生物是脂肪醇。因此,在一些实施方案中,本发明提供了相较于其中一个或多个基因未被破坏的对照微生物生物体,显示至少1倍、至少1.2倍、至少1.5倍、至少2.5倍、至少4倍、至少10倍、至少15倍或至少20倍的脂肪醇产量增加的经修饰的微生物生物体。
脂肪醇产量可通过实施例部分(例如,实施例3和6)中描述的方法和/或使用本领域已知的任何其它方法来测量。本发明的生物体(例如,具有被破坏的内源基因的微生物生物体)产生的脂肪醇产量可描述为绝对量(例如,摩尔/升培养物)或描述为相对于对照生物体(例如,其中内源基因未被破坏的微生物生物体)的产量的倍数提高。可以例如使用气相色谱来测量由本发明的微生物生物体产生的脂肪醇产量。一般而言,培养微生物,分离总的或分泌的脂肪醇,测量脂肪醇的量和/或含量。
许多测定法可用于确定,相较于其中一个或多个基因未被破坏的对照微生物生物体,如本文中描述的包含至少一个被破坏的内源基因的微生物生物体是否产生增加量的脂肪醇(例如,至少多1倍的脂肪醇),包括本文中描述的示例性测定法。在一个示例性测定法中,通过使用1mL异丙醇:己烷(4:6比率)提取细胞培养物来收集由生产性解脂耶罗维亚酵母菌株产生的脂肪醇。将提取混合物离心,将上面的有机相转移至96孔板中,利用配备有火焰离子化检测器(FID)和HP-5柱(长度30m、I.D.0.32mm、膜0.25um)的气相色谱(GC)来进行分析(始于100℃,以25℃/分钟的速率使温度升高至246℃,随后保持1.96分钟)。
IX.产生脂酰COA衍生物的方法
本公开内容还提供了使用本文中描述的微生物生物体产生脂酰CoA衍生物的方法以及所得的利用所述方法产生的脂酰CoA衍生物组合物。
发酵
在适当的条件下进行宿主细胞的发酵,进行足以产生脂酰CoA衍生物的时间。用于细胞(包括丝状真菌、细菌和酵母细胞)的培养和生产的条件是可容易获得的。细胞培养基通常示于Atlas和Parks,eds.,1993,TheHandbookofMicrobiologicalMedia中。此类培养基的各个组分可从商业来源获得,例如在DIFCOTM和BBLTM商标下获得。在一些实施方案中,含水营养培养基是包含氮、盐和碳的复合来源的"丰富培养基(richmedium)",例如YP培养基,其包括10g/L的蛋白胨和10g/L的酵母提取物。在其它实施方案中,含水营养培养基是补充有氨基酸的适当混合物的YeastNitrogenBase(DIFCOTM),例如SC培养基。在特定实施方案中,氨基酸混合物缺乏一种或多种氨基酸,从而施加选择压力以将表达载体维持在重组宿主细胞中。
培养基可包含可同化的碳源。可同化的碳源可以以许多形式获得,包括可更新的碳源以及从其获得的纤维质和淀粉原料底物。示例性可同化的碳源包括但不限于单糖、二糖、寡糖、饱和和不饱和脂肪酸、琥珀酸盐/酯、醋酸盐/酯及其混合物。其它碳源包括但不限于葡萄糖、半乳糖、蔗糖、木糖、果糖、甘油、阿拉伯糖、甘露糖、棉子糖、乳糖、麦芽糖及其混合物。培养基可包括例如,来自含纤维素生物质、木质纤维质生物质或含蔗糖生物质的原料。
在一些实施方案中,将"可发酵的糖"用作可同化的碳源。"可发酵的糖"意指简单的糖(单糖、二糖和短的寡糖),包括但不限于葡萄糖、果糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖和蔗糖。在一个实施方案中,利用葡萄糖和半乳糖的混合物作为可同化的碳源进行发酵。在另一个实施方案中,仅使用葡萄糖进行发酵以积累生物质,随后充分除去葡萄糖,利用诱导剂例如半乳糖进行替代,以诱导一个或多个参与脂酰CoA衍生物产生的外源基因表达。在另一个实施方案中,利用不介导葡萄糖阻遏作用的可同化碳源例如棉子糖进行发酵以积累生物质,随后添加诱导剂例如半乳糖以诱导一个或多个参与脂酰CoA衍生物产生的外源基因表达。在一些实施方案中,可同化碳源来自纤维质和淀粉原料,所述原料来源于但不限于木材、木浆、纸浆、谷粒、玉米秸、玉米纤维、稻、纸张和纸浆处理废物、木本或草本植物、果实或蔬菜浆、酒糟、草、稻壳、麦秸、棉花、大麻、亚麻、剑麻、玉米芯、甘蔗渣、柳枝稷及其混合物。
在一个实施方案中,产生脂酰CoA衍生物的方法还包括步骤:将含纤维素生物质与一种或多种纤维素酶接触以产生可发酵的糖的原料,和将可发酵的糖与本文中描述的微生物生物体接触。在一个实施方案中,微生物生物体是解脂耶罗维亚酵母菌,可发酵的糖是葡萄糖、蔗糖和/或果糖。
可在分批、分批补料或连续发酵条件下生长微生物,所述条件在本领域全都是已知的。经典分批发酵是个封闭系统,其中培养基的组成在发酵开始时进行设置,且在发酵过程中不经历人工改变。分批系统的变型是分批补料发酵,其中随着发酵进行以一定的增量添加底物。当分解代谢产物阻遏作用可能抑制细胞的代谢时以及当期望在培养基中具有有限量的底物时,分批补料系统是有用的。连续发酵是开放系统,其中将确定的发酵培养基连续添加至生物反应器,同时取出等量的条件培养基以进行处理。连续发酵通常以恒定的高密度维持培养物,其中细胞主要处于对数生长期。连续发酵系统努力维持稳态生长条件。用于调节连续发酵过程的营养物和生长因子的方法以及用于使产物形成速率最大化的技术在工业微生物领域是公知的。
在一些实施方案中,在约10℃至约60℃、约15℃至约50℃、约20℃至约45℃、约20℃至约40℃、约20℃至约35℃或约25℃至约45℃的温度下进行发酵。在一个实施方案中,在约28℃和/或约30℃的温度下进行发酵。应理解,在其中使用热稳定性宿主细胞的某些实施方案中,可在更高的温度下进行发酵。
在一些实施方案中,发酵进行约8小时至240小时、约8小时至约168小时、约8小时至144小时、约16小时至约120小时或约24小时至约72小时的一段时间。
在一些实施方案中,在约3至约8、约4.5至约7.5、约5至约7或约5.5至约6.5的pH下进行发酵。
在一个实施方案中,用于产生脂酰CoA衍生物的方法包括:
a)提供具有一个或多个被破坏的内源基因和有效地连接于启动子的编码功能性脂肪酰基还原酶的外源基因的微生物生物体(例如,解脂耶罗维亚酵母细胞),其中至少一个被破坏的基因是YALI0C17545,YALI0E28336,YALI0E11099,YALI0B10406,YALI0A19536,YALI0E28534,YALI0E32769,YALI0E30283,YALI0E12463,YALI0E17787,YALI0B14014,YALI0A10769,YALI0A15147,YALI0A16379,YALI0A20944,YALI0B07755,YALI0B10175,YALI0B13838,YALI0C02387,YALI0C05511,YALI0D01738,YALI0D02167,YALI0D04246,YALI0D05291,YALI0D07986,YALI0D10417,YALI0D14366,YALI0D25630,YALI0E03212,ALI0E07810,YALI0E12859,YALI0E14322,YALI0E15378,YALI0E15400,YALI0E18502,YALI0E18568,YALI0E22781,YALI0E25982,YALI0E28314,YALI0E32417,YALI0F01320,YALI0F06578,YALI0F07535,YALI0F14729,YALI0F22121,YALI0F25003,YALI0E14720,YALI0B17512或此类基因的任一个的同源物;和
b)培养微生物生物体(例如,耶罗维亚酵母细胞)以允许产生脂酰CoA衍生物,其中培养条件包括约20℃至约40℃的温度、约16至约120小时的时期,和包含获自纤维质原料的可发酵的糖的培养基。
在另一个实施方案中,改进上述方法以包括含有蔗糖的培养基。在其中培养基包含蔗糖的一些实施方案中,微生物生物体(例如,耶罗维亚酵母细胞)还包含编码转化酶(例如,酿酒酵母SUC2转化酶)的外源基因。
在一些实施方案中,用于产生脂酰CoA衍生物的方法产生至少0.5g/L脂酰CoA衍生物,如下文中所描述的。
产量水平
本文中描述的方法以高产率产生脂酰CoA衍生物。取决于被破坏的基因,常规培养条件(例如酵母例如解脂耶罗维亚酵母的培养)可产生约0.5g至约35g脂酰CoA衍生物(例如脂肪醇)/升培养基(例如,营养培养)基。在一些实施方案中,由本文中描述的方法产生的脂酰CoA衍生物例如脂肪醇的量为至少0.5g/L、至少1g/L、至少1.5g/L、至少2g/L、至少2.5g/L、至少3g/L、至少3.5g/L、至少4g/L、至少4.5g/L、至少约5g/L、或至少10g/L、至少20g/L、至少30g/L、至少40g/L、或至少50g/L的培养基。
在一些实施方案中,通过培养条件的常规改进,由本文中描述的方法产生的脂酰CoA衍生物例如脂肪醇的量为约40mg/g至约1g/g,约40mg/g至约5g/g,约100mg/g至约1g/g,约100mg/g至约5g/g,约500mg/g至约2g/g,约1g/g至约4g/g或约2g/g至约3g/g的干细胞重量。
在某些实施方案中,通过培养条件的常规改进,由本文中描述的方法产生脂酰CoA衍生物例如脂肪醇的量为约4%至约20%、约10%至约20%、约20%至约30%、约30%至约40%、约40%至约50%、约50%至约60%、约60%至约70%、或约70%至约80%的干细胞重量。
脂酰CoA衍生物的回收
所述方法还可包括,回收例如分离脂酰CoA衍生物以产生脂酰CoA衍生物组合物的步骤。回收或分离产生的脂酰CoA衍生物是指,将至少一部分脂酰CoA衍生物与培养基或发酵过程的其它组分分开。用于从重组宿主细胞和/或培养基回收或分离脂酰CoA衍生物的适当方案(例如,蒸馏、层析)对于本领技术人员来说是已知的。在某些实施方案中,衍生物是经纯化的(例如,大体上不含除所述衍生物外的有机化合物)。可使用本领域公知的纯化法纯化衍生物。
在一些实施方案中,重组微生物宿主将脂酰CoA衍生物分泌入营养培养基。在该情况下,可利用适当的不能与水混溶的溶剂,通过含水营养培养基的溶剂萃取来分离脂酰CoA衍生物。在相分离后除去溶剂,从而提供了脂酰CoA衍生物,随后其可使用本领域已知的方法和设备进一步纯化和分级分离。在其它实施方案中,合并分泌的脂酰CoA衍生物以形成与水不混溶的相,可将该相与含水营养培养基(在发酵过程中或在其完成后)直接分离。
在一些实施方案中,通过将细胞与含水营养培养基分离(例如通过离心、重悬浮)和使用有机溶剂或溶剂混合物从重组宿主细胞提取脂酰CoA衍生物,来分离脂酰CoA衍生物例如脂肪醇。
对于不将脂酰CoA衍生物分泌进营养培养基的微生物宿主,可通过首先裂解细胞以释放脂酰CoA衍生物和使用常规方法从裂解物提取脂酰CoA衍生物来回收脂酰CoA衍生物。参见ClontechLaboratories,Inc.,2009,YeastProtocolsHandbook,100:9156-9161。
X.脂酰COA衍生物
如上所述,脂酰CoA衍生物包括通过图1显示的细胞代谢途径酶促产生的各种化合物。参与这些途径的酶的遗传修饰可优先产生特定衍生物例如脂肪醇。参见上文中的VII部分。另外或备选地,可化学修饰(在培养中或回收后)特定脂酰CoA衍生物以产生不同的衍生物。
脂酰CoA衍生物组合物可包括饱和的(例如,单不饱和的)、不饱和的和分枝的脂酰CoA衍生物,例如脂肪醇。在一些实施方案中,不饱和脂酰CoA衍生物(例如,脂肪醇)的量可少于50%、少于40%、少于30%、少于20%、少于10%、少于5%或少于1%的总脂酰CoA衍生物组合物。在一些实施方案中,饱和脂酰CoA衍生物的量可少于50%、少于40%、少于30%、少于20%、少于10%、少于5%或少于1%的总脂酰CoA衍生物组合物。在一些实施方案中,分枝的脂酰CoA衍生物的量可少于50%、少于40%、少于30%、少于20%、少于10%、少于5%或少于1%的总脂酰CoA衍生物组合物。
在一些实施方案中,具有C8至C20、C10至C18、C14至C18或C16至C18的碳链长度的脂酰CoA衍生物(例如,脂肪醇、脂肪酯、烷烃、烯烃等)按重量计占至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少97%或至少99%的总脂酰CoA衍生物组合物。在一些实施方案中,具有C8至C20、C10至C18、C14至C18或C16至C18的碳链长度的脂肪醇按重量计占至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少97%或至少99%的总脂肪醇组合物。在一些实施方案中,脂酰CoA衍生物(例如,脂肪醇)具有C16至C18的碳链长度。这样的C16至C18脂酰CoA衍生物例如脂肪醇可以是饱和衍生物、不饱和衍生物或饱和与不饱和衍生物的混合物。当衍生物是烷烃或烯烃时,应指出,可以例如通过HPLC将具有特定碳链长度的烷烃和/或烯烃与更长和/或更短的烷烃和/或烯烃分离。
在一些实施方案中,脂酰CoA衍生物是脂肪醇。脂肪醇可以是1-辛醇(C8:0)、1-癸醇(C10:0)、1-十二醇(C12:0)、1-十四醇(C14:0)、1-十六醇(C16:0)、1-十八醇(C18:0)、1-花生醇(C20:0)、1-二十二醇、1-二十四醇、十六碳烯醇(C16:1)和十八烯醇(C18:1)中的一种或多种。
烷烃和/或烯烃组合物
在一些实施方案中,脂酰CoA衍生物是烷烃和/或烯烃。可从反应混合物(其可包含未还原的脂肪醇)分离烷烃和/或烯烃以产生包含大体上全部烷烃和/或烯烃的组合物。或者,可从反应混合物分离烷烃/烯烃和未还原的脂肪醇,以产生包含烷烃和/或烯烃和脂肪醇的组合物。在一些实施方案中,在还原后,脂酰CoA衍生物组合物按组合物的重量计包含至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的烷烃和/或烯烃。
在一些实施方案中,烷烃是辛烷、癸烷、十二烷、十四烷、十六烷、十八烷、二十碳烷、二十二烷、二十四烷或其混合物。在一些实施方案中,烯烃是辛烯、癸烯、十二烯、十四烯、十六烯、十八烯、二十碳烯、二十二烯、二十四烯或其混合物。
在一些实施方案中,可还原根据本文中描述的方法产生的脂肪醇,以产生具有与脂肪醇起始材料相同的碳链长度的烷烃和/或烯烃。不希望受任何特定理论束缚,醇的羟基为不良离去基团,因此在原则上,可将结合羟基的氧原子以使其成为更好的离去基团的化学部分用于还原本文中描述的脂肪醇。
可使用本领域已知的任何方法来还原脂肪醇。在一些实施方案中,可化学地,例如通过Barton脱氧(或Barton-McCombie脱氧)(其中首先将醇转化成甲基黄原酸酯或硫代咪唑氨基甲酸酯,随后在极端条件下利用氢化锡或三烷基硅烷试剂还原黄原酸酯或硫代咪唑氨基甲酸酯以产生烷烃和/或烯烃的两步骤反应)进行脂肪醇的还原。参见Li等人,2007,ModernOrganicSynthesisintheLaboratory,p.81-83。
在另一个实施方案中,可通过氢化脂肪醇或脂肪酸来产生烷烃。
酯组合物
在其它实施方案中,将脂肪醇与羧酸反应以形成酸酯。脂肪醇的酯化反应在本领域是公知的。在某些实施方案中,在强催化剂例如强碱例如氢氧化钠存在的情况下进行转酯反应。在其它实施方案中,使用催化脂肪醇至酸酯的转化的酶例如脂蛋白脂肪酶来酶促进行酯化反应。参见,例如,Tsujita等人,1999,"FattyAcidAlcoholEster-SynthesizingActivityofLipoproteinLipase"J.Biochem.126:1074-1079。
XI.包含脂酰CoA衍生物的示例性组合物
在另一个方面,本发明涉及本文中描述的微生物生物体用于产生各种组合物的用途,所述组合物包括但不限于燃料组合物(例如,生化柴油和石化柴油)、去垢剂组合物(例如,液体和粉剂形式的洗衣用洗涤剂、硬表面清洁剂、洗碗液等);工业组合物(例如,润滑剂、溶剂和工业清洁剂);和个人护理组合物(例如,肥皂、化妆品、香波和凝胶)。
燃料组合物
在某些实施方案中,可将本文中描述的脂酰CoA衍生物组合物用作燃料组合物的组分。在某些实施方案中,通过上述方法产生的脂酰CoA衍生物可直接用于燃料组合物。包含通过本发明方法产生的脂酰CoA衍生物的燃料组合物包括,用于为内燃机提供动力的任何组合物,包括但不限于生化柴油燃料和石化柴油燃料(例如,喷气燃料和火箭燃料)。
在一些实施方案中,燃料组合物是柴油燃料。柴油燃料是用于柴油机的任何燃料,包括石化柴油和生化柴油。石化柴油是化石燃料油的特殊分馏物。其由约75%的饱和烃和25%的芳香烃组成。生化柴油不来源于石油,而来自植物油或动物脂肪,并且包含长链烷基酯。生化柴油通过用醇进行脂质(例如,来自油炸锅的废植物油或种子油)的转酯来制造,并且比石化柴油燃烧更干净。可将生化柴油单独地或以任何量与石化柴油混合用于现代发动机。
在一些实施方案中,燃料组合物是煤油。煤油是易燃的烃,其也是化石燃料的特殊分馏物并且包含具有6至16个碳原子的烃。煤油具有与石化柴油的燃烧热相当的燃烧热,被广泛用于喷气燃料以给喷气式发动机提供动力,以及在某些国家用于采暖。基于煤油的燃料还可利用液氧来进行燃烧和用作火箭燃料(例如,RP-1)。
在特定实施方案中,将脂肪酯用作生化柴油燃料组合物的组分。在不同的实施方案中,将脂肪酸酯用作生化柴油燃料,而不与其它组分混合。在某些实施方案中,将脂肪酸酯与其它组分例如石化柴油燃料混合。在其它实施方案中,将烷烃和/或烯烃(例如,C10至C14)用作喷气燃料组合物的组分。在其它实施方案中,将烷烃和/或烯烃用作火箭燃料的组分。在其它实施方案中,将烷烃和/或烯烃(例如,C16至C24)用作石化柴油-样燃料组合物的组分。
在一些实施方案中,燃料组合物包含烷烃和/或烯烃。在某些实施方案中,烷烃和/或烯烃具有6至16个碳,并且燃料组合物是煤油-样燃料组合物。在不同的实施方案中,将煤油-样燃料组合物包含在喷气燃料组合物中。在特定实施方案中,将煤油-样燃料组合物包含在各种等级的喷气燃料(包括但不限于Avtur、JetA、JetA-1、JetB、JP-4、JP-5、JP-7和JP-8级)中。在其它实施方案中,将煤油-样燃料组合物包含在用于采暖的燃料组合物中。在其它实施方案中,用液氧燃烧煤油-样燃料组合物以提供火箭燃料。在特定实施方案中,将煤油-样燃料组合物用于RP-1火箭燃料。
在一些实施方案中,将烷烃和/或烯烃用于与石化柴油燃料组合物类似的燃料组合物,例如包含饱和和芳香烃的燃料。在某些实施方案中,燃料组合物仅包含烷烃和/或烯烃。在其它实施方案中,燃料组合物包含与其它组分例如石化柴油燃料混合的烷烃和/或烯烃。
在某些实施方案中,将脂肪醇、脂肪酯、烷烃和/或烯烃与其它燃料或燃料添加剂组合以产生具有用于其期望用途的期望特征的组合物。用于特定应用的示例性燃料和燃料添加剂在本领域是公知的。可与本文中描述的组合物组合的示例性燃料包括但不限于,常规燃料例如基于乙醇和石油的燃料。可与本文中描述的组合物组合的示例性燃料添加剂包括但不限于,浊点降低添加剂(cloudpointloweringadditive)、表面活性剂、抗氧化剂、金属减活剂、缓蚀剂、抗结冰添加剂、抗磨损添加剂、沉积改良添加剂(deposit-modifyingadditive)和辛烷增强剂。
去垢剂组合物
在一些实施方案中,本文中描述的脂酰CoA衍生物组合物和从其衍生的化合物可用作去垢剂组合物的组分。包含通过本发明的方法产生的脂酰CoA衍生物的去垢剂组合物包括用于清洁应用的组合物,包括但不限于以液体、凝胶、颗粒、粉剂或片剂形式存在的洗衣用洗涤剂、洗手剂、洗碗洗涤剂、漂洗助剂(rinse-aiddetergent)、家用洗涤剂和家用清洁剂。在一些实施方案中,通过上述方法产生的脂酰CoA衍生物(例如,脂肪醇)可直接用于去垢剂组合物。在一些实施方案中,可将脂酰CoA衍生物(例如,脂肪醇)与磺酸基反应以产生可用作去垢剂组合物的组分的硫酸盐/酯衍生物。可使用通过本发明的方法产生的脂酰CoA衍生物产生的去垢剂组合物包括但不限于,头发香波和调理剂(conditioner)、地毯香波(carpetshampoo)、轻型家用清洁剂、轻型家用去垢剂、重型家用清洁剂和重型家用去垢剂。除了脂酰CoA衍生物以外,去垢剂组合物通常还包括一种或多种增洁剂(builder)(例如,碳酸钠、络合剂、肥皂和沸石)、酶(例如,蛋白酶、脂肪酯和淀粉酶);羧甲基纤维素、光学增白剂、衣物柔顺剂、着色剂和香水(例如,环己基水杨酸酯)。
在一些实施方案中,将从脂酰CoA衍生物衍生的硫酸酯衍生物(例如,C12-15)用于产品例如头发香波、地毯香波、轻型家用清洁剂和轻型家用去垢剂。在一些实施方案中,从脂酰CoA衍生物衍生的硫酸酯衍生物(例如,C16-C18)用于产品例如头发香波和调理剂。在一些实施方案中,将从脂酰CoA衍生物衍生的硫酸酯衍生物(例如,C16-18)用于产品例如重型家用清洁剂和重型家用去垢剂。
个人护理组合物
在一些实施方案中,本文中描述的的脂酰CoA衍生物组合物和从其衍生的化合物可用作个人护理组合物的组分。在一些实施方案中,可将通过上述方法产生的脂酰CoA衍生物直接用于个人护理组合物。包含通过本发明方法产生的脂酰CoA衍生物的个人护理组合物包括,为了身体的整饰(grooming)、清洁、美化或护理目的而对身体应用(例如,应用至皮肤、头发、指甲或口腔)的组合物,包括但不限于洗液、香膏、乳膏剂、凝胶、血清、清洁剂、调色剂、掩蔽剂(mask)、防晒剂、肥皂、香波、调理剂、沐浴露、定型剂(stylingaids)和化妆品组合物(例如,以液体、乳膏剂、固体、无水或笔的形式制造的)。在一些实施方案中,可将脂酰CoA衍生物(例如,脂肪醇)与磺酸基反应,以产生可用作所述组合物的组分的硫酸酯衍生物。
在一些实施方案中,将通过本文中描述的方法产生的脂酰CoA衍生物组合物(例如,C12)用于产品例如润滑油、药物以及用作化妆品的软化剂。在一些实施方案中,因其软化剂性质,将通过本文中描述的方法产生的脂酰CoA衍生物组合物(例如,C14)用于产品例如化妆品(例如,冷霜)。在一些实施方案中,通过本文中描述的方法产生的脂酰CoA衍生物组合物(例如,C16)在产品例如化妆品(例如,润肤霜和洗剂)中用作软化剂、乳化剂或增稠剂。在一些实施方案中,将通过本文中描述的方法产生的脂酰CoA衍生物组合物(例如,C18)在产品例如润滑剂、树脂、香水和化妆品中例如用作软化剂、乳化剂或增稠剂。在一些实施方案中,将从通过本文中描述的方法产生的脂酰CoA衍生物组合物衍生的硫酸酯衍生物(例如,C12-14)用于产品例如牙膏中。
其它组合物
在一些实施方案中,脂酰CoA衍生物(例如,脂肪醇,尤其是鲸蜡醇、硬脂醇和肉豆蔻醇)可用作食品添加剂(例如,佐剂和生产助剂)。
XII.实施例
下列实施例被提供用于举例说明但非限制所请求保护的发明。
实施例1:野生型栖藻海杆菌DG893FAR在解脂耶罗维亚酵母菌株中的表达
在解脂耶罗维亚酵母菌株中表达来自栖藻海杆菌的野生型FAR(FAR_Maa)。密码子最优化的栖藻海杆菌DG893FAR基因的序列对应于SEQIDNO:1,对应的多肽序列为SEQIDNO:2。构建自主复制质粒pCEN354以用于在解脂耶罗维亚酵母菌株中表达栖藻海杆菌DG893FAR基因。利用抗潮霉素和腐草霉素的两种抗生素选择标记盒(分别地HygB(R)或Ble(R))对复制型质粒进行工程改造。每一个盒的表达独立地受从解脂耶罗维亚酵母菌分离的强组成型启动子调节:pTEF1(用于Ble(R)表达)和pRPS7(用于HygB(R)表达)。将质粒pCEN354用于装配解脂耶罗维亚酵母菌表达质粒。通过使用"无限制克隆(restrictionfreecloning)"法,用栖藻海杆菌DG893FAR基因替代Ble(R)基因来提供质粒pCEN411(图2)。在pCEN411中,FAR基因的表达处于组成型TEF1启动子的控制之下,并且HygB(R)基因允许在含有潮霉素的培养基中进行选择。Ars18是从解脂耶罗维亚酵母菌基因组DNA分离的自主复制型序列。使用常规转化法将所得的质粒转化入解脂耶罗维亚酵母菌株。参见,例如,Chen等人,1997,"One-steptransformationofthedimorphicyeastYarrowialipolytica"ApplMicrobiolBiotechnol48:232-235。
通过将表达盒整合至解脂耶罗维亚酵母菌基因组上的特定位置来表达FAR。在该情况下,待整合的DNA包含栖藻海杆菌FAR表达盒和编码潮霉素抗性的第二表达盒。编码此类表达盒的DNA在任一侧上侧翼连接约1kb的解脂耶罗维亚酵母菌DNA(用于将该DNA靶向染色体E上的特定整合位点)。通过FAR表达盒的随机整合,随后对最具活性的转化体的整合位点进行定位来将该位点鉴定为表达"热点"。通过PCR扩增整合构建体,使用常规转化法将其转化进入解脂耶罗维亚酵母。
通过将栖藻海杆菌FAR表达盒随机整合入解脂耶罗维亚酵母菌基因组,许多菌株经鉴定具有提高的脂肪醇滴度(相对于具有基于质粒的FAR表达的菌株)。使用“人造载体(vectorette)”PCR法测定5个最佳随机整合体菌株的整合位置。在此类菌株的每一个菌株中,在同向或反向重复结构中存在两个拷贝的FAR基因。
通过靶向整合将一个拷贝的栖藻海杆菌FAR表达盒引入至在解脂耶罗维亚酵母菌CY-201菌株的基因组中鉴定的5个热点之一的正链或负链。整合位点tFARi-1位于染色体E上负链的bp1433493与bp1433495之间。整合位点tFARi-2位于染色体C上正链的bp2526105与bp2526114之间。整合位点tFARi-3位于染色体B上正链的bp2431420与bp2431425之间。整合位点tFARi-4位于染色体D上正链的bp1669582与bp1669588之间。整合位点tFARi-5位于染色体D上正链的bp518746与bp518789之间。整合位点tFARi-6位于染色体B上负链的bp2431420与bp231425之间。整合位点tFARi-7位于染色体D上负链的bp1669582与bp1669588之间。整合位点tFARi-8位于染色体D上负链的bp518746与bp518789之间。
实施例2:外源栖藻海杆菌FAR在重组解脂耶罗维亚酵母菌株中的体内活性
将两种解脂耶罗维亚酵母菌株用于构建基因敲除:1)获自GermanResourceCentreforBiologicalMaterial(DSMZ)的解脂耶罗维亚酵母菌DSMZ1345,和2)解脂耶罗维亚酵母菌CY-201,通过解脂耶罗维亚酵母菌DSMZ1345的UV-诱变而获得的、在以十六烷为唯一碳源的培养基上具有生长缺陷的改良生产性宿主。当用pCEN411转化时,解脂耶罗维亚酵母菌CY-201相较于解脂耶罗维亚酵母菌DSMZ1345,产生7-10倍的脂肪醇,并且还显著地降低了在含有8%葡萄糖和500μg/mL潮霉素的YPD培养基中的外源1-十六醇的降解速率。可使用类似方法评估备选FAR基因和变体在修饰的解脂耶罗维亚酵母菌株中的表达。
实施例3:包含外源FAR的解脂耶罗维亚酵母菌株中脂肪醇产量的分析
将包含含有编码栖藻海杆菌DG893FAR的外源基因的质粒的解脂耶罗维亚酵母菌株培养在装有250μLYPD(补充以2%葡萄糖和500μg/mL潮霉素)的96孔Axygen板中。将板在Kuhner振荡培养箱(shaker-incubator)中于30℃、200rpm和85%相对湿度下温育约40-48小时。通过将50μL过夜生长的培养物转移至装有250μLYPD(补充以2%葡萄糖和500μg/mL潮霉素)的Axygen96孔板中来稀释细胞培养物。将板在Kuhner振荡培养箱中在相同条件下温育约24-28小时。将20μL细胞培养物转移至含有380μLYPD(补充有8%葡萄糖和500μg/mL潮霉素)的96孔深孔板中。将板在相同条件下温育约22-26小时。通过以3500rpm离心10分钟收集细胞。将细胞沉淀重悬浮于400μL含有500μg/mL潮霉素的氮限制培养基(1.7g/L酵母氮基,1.4g/L(NH4)2SO4,30g/L葡萄糖)中,在Kuhner振荡培养箱中于30℃、200rpm和85%相对湿度下温育约22-26小时。用1mL异丙醇:己烷(4:6的比率)萃取细胞培养物,进行2小时。将萃取物离心,将上层有机相转移至聚丙烯96孔板中。使用下列GC-FID法分析样品。
使用下列条件通过具有1:10分流比的GC-FID来分析1μL样品:来自AgilentTechnologies的配备有FID检测和HP-5柱(长30m,I.D.0.32mm,膜0.25um)的GC-6890N。GC法:始于100℃,以25℃/分钟的速度将温度升高至246℃,并且保持1.96分钟。总运行时间,7.8分钟。在上述GC条件下,产生的脂肪醇和酸的近似驻留时间(分钟)如下:5.74,C16:1-OH;5.93,C16:0-OH;6.11,C16:0-OOMe(内部标准);6.16,C16:1-OOH;6.29,C16:0-OOH;6.80,C18:1-OH;6.90,C18:0-OH;7.3,C18:0-和C18:1-OOH。通过与商业标准(SigmaChemicalCompany)相比较来进行各个脂肪醇的鉴定。在测试的条件下,栖藻海杆菌DG893FAR在亲代解脂耶罗维亚酵母菌DSMZ1345和CY-201菌株中的表达分别导致5-20mg/L和100-200mg/L的脂肪醇产量。产生的脂肪醇为:70-80%C16:0(1-十六醇)、10-15%18:0(1-十八醇)和10-15%C18:1(顺式Δ9-1-十八烯醇)。
实施例4:用于破坏的解脂耶罗维亚酵母菌基因靶的鉴定
以几种方式鉴定被选择进行破坏的基因。一些基因基于它们在利用烷烃的酵母中在碳水化合物同化途径中的作用来选择。因为脂酰CoA是这些途径中因烷烃氧化而产生的中间产物,因此可通过破坏负责烷烃利用的基因来改善脂酰CoA衍生物的稳定性。其它要破坏的基因基于它们与此类基因的同源性来进行选择。这类基因包括其序列预示它们可能用作参与脂质生物合成的酶脱氢酶或酰基转移酶的基因。
进行破坏的其它基因包括,编码参与新合成的蛋白质至内质网中的输入的蛋白质的基因。此类蛋白质包括三聚体蛋白质传导通道(Sec61、Ssh1、Sbh1和Sss1)、四聚体Sec62/Sec63复合物(Sec62、Sec63、Sec66和Sec72)和其它内质网驻留蛋白(Kar2和Sls1)的亚基(BoisrameA.等人,"InteractionofKar2pandSls1pIsRequiredforEfficientCo-translationalTranslocationofSecretedProteinsintheYeastYarrowialipolytica,"J.Biol.Chem.(1998)273:30903)。
进行破坏的其它基因通过在基于葡萄糖和甘油的培养基中比较全局基因表达而鉴定。具体地,选择其表达被甘油抑制的基因,因为烷烃利用在含甘油的培养基中被抑制。使用从在丰富培养基和脂质积累培养基中培养的解脂耶罗维亚酵母菌DSMZ1345制备的RNA,通过微阵列分析来鉴定甘油抑制的基因。
实施例5:具有被破坏的基因的菌株的构建和分析
可通过用DNA构建体转化解脂耶罗维亚酵母菌来构建基因敲除菌株,所述DNA构建体被设计来通过同源重组用选择标记替代目的开放阅读框架的大部分或全部。因此,DNA构建体可包括侧翼连接有紧接目的基因的上游和下游的约1kb序列的选择标记,所述约1kb序列是发生同源重组所必需的。将这类DNA构建体包含在使用标准质粒构建法装配的质粒中。为了进行转化,使用PCR从对应质粒扩增目的DNA构建体,以产生约1μg的线性DNA。使用Madzak等人,2003,"Yarrowialipolytica."InGellissen,ed.ProductionofRecombinantProteinsNovelMicrobialandEukaryoticExpressionSystems,p.163-189中描述的方法,将该DNA转化入解脂耶罗维亚酵母菌。通过在选择培养基上生长的能力和通过PCR基因分型来鉴定其中目的基因被选择标记替代的菌株。典型的选择标记是本领域技术人员所熟知的(参见,例如,Fickers等人,2003,"NewdisruptioncassettesforrapidgenedisruptionandmarkerrescueintheyeastYarrowialipolytica"JournalofMicrobiologicalMethods55:727-737)。
在第二步骤中,使用本领域技术人员熟知的方法从染色体切除选择标记。参见,例如,Fickers等人,supra;Akada等人,2006,"PCR-mediatedseamlessgenedeletionandmarkerrecyclinginSaccharomycescerevisiae"Yeast23:399-405;Fonzi等人,1993,"IsogenicstrainconstructionandgenemappinginCandidaalbicans"Genetics134:717-728。如果使用的选择标记是双功能的,即其编码酶,所述酶的产物是在正选择培养基上生长所必需的并且在另一种选择培养基上是有毒的,则可通过在反向选择培养基上生长来容易地鉴定已切除标记的菌株。此类双功能标记是本领域技术人员所熟知的。
为了构建具有多个基因破坏的菌株,可用一系列DNA构建体连续转化解脂耶罗维亚酵母菌,所述DNA构建体被设计来敲除目的基因。可利用上述方法来进行每一个转化,以便在每一个破坏步骤后切除选择标记。因此,可使用具有上述DNA构建体的质粒的集合,在给定的菌株中产生敲除的任意组合。
实施例6:经修饰的解脂耶罗维亚酵母菌株中的脂肪醇产量的分析
在DSMZ1345和CY-201菌株背景中产生约233个菌株的集合,其包括具有单个基因破坏的菌株和具有2个或更多个基因破坏的菌株。使用表达野生型栖藻海杆菌DG893FAR的质粒pCEN411(参见图2)转化这些菌株,随后如上所述筛选脂肪醇的产量。下面的表3和4提供了,表达野生型栖藻海杆菌DG893FAR基因的、靶向基因破坏的解脂耶罗维亚酵母DSMZ1345和CY-201菌株,相对于不具有靶向基因缺失并且表达野生型栖藻海杆菌DG893FAR基因的对应解脂耶罗维亚酵母菌株的相对脂肪醇产量。所产生的脂肪醇为:70-80%C16:0(1-十六醇)、10-15%18:0(1-十八醇)和10-15%C18:1(顺Δ9-1-十八烯醇)。
表3.解脂耶罗维亚酵母菌DSMZ1345中的靶向基因破坏
被破坏的基因 | 相对于DSMZ1345的脂肪醇产量 |
C17545E28336E11099E28534 | +++++ |
C17545E28336E12463E28534 | +++++ |
C17545E28336A19536E28534 | +++++ |
E28336E32769C17545E28534 | +++++ |
C17545E28534 | +++++ |
C17545E28336E12463 | +++++ |
C17545E28336E28534 | +++++ |
C17545E28336A19536B10406 | +++++ |
E28336E32769C17545B10406 | +++++ |
C17545E28336E11099B10406 | +++++ |
C17545B10406E11099 | +++++ |
C17545E28336B10406 | +++++ |
E28336E32769C17545E11099 | +++++ |
C17545E28336E12463 | +++++ |
C17545E28336E11099 | +++++ |
C17545E28336A19536E11099 | +++++ |
C17545E28534B17512 | +++++ |
E11099A19536B10406B17512 | +++++ |
E28336C17545 | ++++ |
E28336C17545 | ++++ |
C17545E28336E11099 | ++++ |
C17545E28336A19536 | ++++ |
E11099A19536B10406 | ++++ |
E28336E32769C17545 | ++++ |
C17545E28336A19536 | ++++ |
E28336E32769C17545 | ++++ |
C17545E28336 | ++++ |
E28336B10406E11099 | ++++ |
E11099E30283 | ++++ |
E28336E32769E11099B10406 | ++++ |
C17545B10406E11099 | ++++ |
E28336E30283 | ++++ |
E30283 | ++++ |
C17545E30283 | ++++ |
A19536E30283 | ++++ |
C17545B10406A19536 | ++++ |
被破坏的基因 | 相对于DSMZ1345的脂肪醇产量 |
E12463E30283 | ++++ |
C17545B10406 | ++++ |
A19536E28534 | ++++ |
B17512 | ++++ |
E14729 | +++ |
C17545E28336E17787 | +++ |
E28336E32769E28534 | +++ |
E28336B10406 | +++ |
E28336E28534 | +++ |
E28336E15378E12463 | +++ |
C17545B10406 | +++ |
D25630A16379E17787A15147C17545 | +++ |
C17545E11099 | +++ |
E28336E15378 | +++ |
C17545A19536 | +++ |
E28336E15378E11099 | +++ |
B10406E28534 | +++ |
E28336E15378A19536 | +++ |
E28336E32769A19536B10406 | +++ |
E11099A19536C17545 | +++ |
E17787E28534 | +++ |
C17545A12859 | +++ |
A15147E17787A16379D25630 | +++ |
D25630A16379E17787A15147E11099 | +++ |
C17545D01738 | +++ |
E28336E32769A19536E11099 | +++ |
D25630A16379E17787A15147A19536 | +++ |
D25630A16379E17787A15147E12463 | +++ |
D25630A16379E17787A15147E28336 | +++ |
C17545E12463 | +++ |
E28336E32769A19536 | +++ |
E28534 | +++ |
A19536E28336 | +++ |
E28336D01738 | +++ |
E28336E11099 | +++ |
E28336A19536A16379 | +++ |
C17545 | +++ |
被破坏的基因 | 相对于DSMZ1345的脂肪醇产量 |
E17787C17545 | +++ |
E28336E32769 | +++ |
E28336A12859 | +++ |
E28336B14014E15378 | +++ |
E28336E32769E11099 | +++ |
E28336E32769A19536 | +++ |
E28336 | +++ |
E28336E32769 | +++ |
E28336E32769E11099 | +++ |
E12463 | +++ |
E28336C02387 | +++ |
A19536 | +++ |
E28336B10406 | +++ |
E17787E28336 | +++ |
E28336E32769E12463 | +++ |
E28336A16379 | +++ |
E28336E32769E17787 | +++ |
E28336E15378E17787 | +++ |
B10406E11099 | +++ |
E28336B10175A16379 | +++ |
E12463E28336 | +++ |
E11099A19536E28336 | +++ |
E28336 | +++ |
B10406E17787 | +++ |
E28336C02387B10175 | +++ |
B14014C17545 | +++ |
B10175B10406 | +++ |
E17787 | +++ |
E11099 | +++ |
B10406 | +++ |
E28336A16379E15400 | +++ |
E28336E06831 | +++ |
E15400 | +++ |
A19536E11099 | +++ |
B14014B10406 | +++ |
E28336E32769B10175 | +++ |
B14014 | +++ |
被破坏的基因 | 相对于DSMZ1345的脂肪醇产量 |
B10175 | +++ |
E11099B14014 | +++ |
D01738 | +++ |
E12859 | +++ |
B13838 | +++ |
D02167 | +++ |
F01320 | +++ |
E28336E32769B14014 | +++ |
A19536E15400 | +++ |
B10406A19536 | ++ |
B07755 | ++ |
B10175A19536 | ++ |
D05291 | ++ |
A15147E17787A16379D25630 | ++ |
E15378 | ++ |
F25003 | ++ |
F22121 | ++ |
B14014A12859 | ++ |
E18502 | ++ |
C02387 | ++ |
C08415 | ++ |
A10769 | ++ |
F06578 | ++ |
F07535 | ++ |
D14366 | ++ |
F14729 | ++ |
D07986 | ++ |
E32769 | ++ |
A16379D25630 | ++ |
E03212 | ++ |
D10417 | ++ |
B14014A16379 | ++ |
E07810 | ++ |
B14014D25630 | ++ |
E25982 | ++ |
A20944 | ++ |
E18568 | ++ |
被破坏的基因 | 相对于DSMZ1345的脂肪醇产量 |
E32417 | ++ |
E28314 | ++ |
E22781 | ++ |
A15147 | ++ |
D04246 | ++ |
C05511 | ++ |
E14322 | ++ |
A17875E15400B01298 | ++ |
D25322 | ++ |
B04906 | ++ |
F29623 | ++ |
A06655 | ++ |
E17787A16379D25630 | ++ |
F19514 | ++ |
B13816 | ++ |
B00462 | ++ |
E12463A19536 | ++ |
E06567 | ++ |
D17314 | ++ |
B14014A15147E17787A16379D25630 | ++ |
E12463E11099 | ++ |
C23859 | ++ |
E12463B10406 | ++ |
B08404 | ++ |
D25960 | ++ |
A17875 | ++ |
E01210 | ++ |
E27654 | ++ |
A17875E15400B01298F23793 | ++ |
E21560 | ++ |
D12628 | ++ |
E06831 | ++ |
D25630 | ++ |
B10175E17787 | + |
E15818 | + |
E14509 | + |
C19580 | + |
被破坏的基因 | 相对于DSMZ1345的脂肪醇产量 |
B12386 | + |
A10769 | + |
A16379B14014D25630 | + |
B10175E12463 | + |
B14014E17787 | + |
F19580 | + |
A17875B01298 | + |
E01298 | + |
E32835 | + |
D04884 | + |
E17787E30283 | + |
E28336C02387B14014 | + |
F10857 | + |
A07733 | + |
E15400B10175 | + |
C19096 | + |
D07942 | + |
E15400B01298F23793 | + |
E11099B10175 | + |
E19921 | + |
E12463E17787 | + |
D00176 | + |
E17787A19536 | + |
E04961 | + |
A19536E11099 | + |
C10054 | + |
E15400B01298 | + |
E07766 | + |
C14784 | + |
E18700 | + |
B01298 | + |
E17787E11099 | + |
F23793 | + |
F23793B01298 | + |
E12463A12859 | + |
B21692 | + |
C09284 | + |
被破坏的基因 | 相对于DSMZ1345的脂肪醇产量 |
D17864 | + |
A00374 | + |
B14014D01738 | + |
B14014E12463 | + |
E28336E15378B10406 | + |
A16379 | + |
E12419 | + |
E16016 | + |
E12463D01738 | + |
D27302 | + |
C04092 | + |
E29161 | + |
B05456 | + |
F00748 | + |
D00891 | + |
F22539 | + |
+++++=>30.0倍的提高
++++=10.0至30.0倍的提高
+++=1.5至9.99倍的提高
++=1.0至1.49倍的提高
+=0.0至0.99倍的提高
表4.解脂耶罗维亚酵母菌CY-201中的靶向基因破坏
被破坏的基因 | 相对于CY-201的脂肪醇产量 |
E14729 | +++++ |
E11099E28336C17545E14729 | +++++ |
C17545B10406E28336 | ++++ |
E11099E28336C17545A00374 | ++++ |
E11099A19536C17545A00374 | ++++ |
E11099A19536C17545 | ++++ |
C17545B10406A19536 | ++++ |
B10406E14729 | ++++ |
C17545E14729 | ++++ |
E11099E14729 | ++++ |
E28336E14729 | +++ |
被破坏的基因 | 相对于CY-201的脂肪醇产量 |
E11099E28336C17545 | +++ |
E11099A19536C17545B10406 | +++ |
E11099E28336E18502 | +++ |
C17545B10406 | +++ |
E28336A19536B10406 | +++ |
E28336A19536B10406 | +++ |
E28336A19536B10406C17545 | +++ |
C17545B10406 | +++ |
E28336E11099 | +++ |
E11099A19536C17545 | +++ |
C17545B10406 | +++ |
E28336A19536B10406E11099 | +++ |
E28336A19536 | +++ |
E28336C17545 | +++ |
E28534 | +++ |
E11099E28336E18502 | +++ |
E11099E28336F09603 | +++ |
C17545A19536 | +++ |
E28336 | +++ |
E11099 | +++ |
E11099A19536B10406 | +++ |
C17545 | +++ |
E29336C08415 | +++ |
E11099A19536A00374 | +++ |
A19536E11099 | +++ |
B10406 | +++ |
E11099A19536C08415 | +++ |
E28336A19536 | +++ |
E28336 | +++ |
C17545F09603 | ++ |
C17545E11099 | ++ |
E12463E11099 | ++ |
A19536F09603 | ++ |
E12859 | ++ |
E11099E28336C17545A19536 | ++ |
E11099A19536 | ++ |
A19536 | ++ |
被破坏的基因 | 相对于CY-201的脂肪醇产量 |
E17787E11099 | ++ |
E11099A19536F09603 | ++ |
D02167 | ++ |
E28336F09603 | ++ |
E28336E32769 | ++ |
B13838 | ++ |
A00374 | ++ |
E18502 | ++ |
E11099A19536E18502 | ++ |
F09603 | ++ |
C08415 | ++ |
A20944 | ++ |
F01320 | ++ |
D04246 | ++ |
F14729 | ++ |
C04092 | ++ |
E11099F09603 | ++ |
F19514 | ++ |
D07942 | ++ |
E11099E18502 | ++ |
F07535 | ++ |
B07755 | ++ |
B21692 | ++ |
B05456 | ++ |
C19580 | ++ |
F22121 | ++ |
E11099C08415 | ++ |
D05291 | ++ |
D01738 | ++ |
F25003 | ++ |
E11099E28336B10406 | ++ |
E03212 | + |
D10417 | + |
B10175 | + |
E25982 | + |
A16379D25630 | + |
A19536C08415 | + |
被破坏的基因 | 相对于CY-201的脂肪醇产量 |
B10406F09603 | + |
D25630 | + |
A17875 | + |
E28336D07986E32769 | + |
B04906 | + |
D14366 | + |
E32769 | + |
E17787 | + |
B10406E28336 | + |
F10857 | + |
F19514E32769 | + |
C02387 | + |
D07986E32769 | + |
B14014D25630 | + |
D25630A16379E17787 | + |
F06578E32769 | + |
E28336C02387 | + |
F06578 | + |
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被破坏的基因 | 相对于CY-201的脂肪醇产量 |
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D00891 | + |
E15400g | + |
B01298F23793 | + |
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E12463 | + |
A17875F23793 | + |
B10406A19536 | + |
F22539 | + |
F23793 | + |
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E28336A19536C17545 | + |
++++=>4.0倍的提高
+++=1.5至4.0倍的提高
++=1.0至1.49倍的提高
+=0.0至0.99倍的提高
实施例7:经修饰的解脂耶罗维亚酵母菌株在发酵时的脂肪醇产量
包含YALI0E11099g、YALI0E28336g、YALI0C17545和YALI0E14729的缺失并且具有两个拷贝的整合的栖藻海杆菌FAR的CY-201菌株衍生物("CY-202菌株")用于在搅拌釜发酵罐中产生脂肪醇。发酵按照两阶段方案进行,其中将细胞在富含营养物的培养基中进行增殖,随后将其转移至营养物受限培养基(nutrientlimitedmedium)中以进行脂肪醇产生。对于第一阶段,通过在30℃下将CY-202菌株在带挡板的摇瓶中于YPD培养基(10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖)中培养24小时来制备接种培养物。该培养物用于接种装有10L增殖培养基(6.7g/L无氨基酸的YeastNitrogenbase,20.9g/LBisTris缓冲液,80g/L葡萄糖,10g/L玉米浆和0.22mL/L止泡剂(聚(丙二醇)和止泡剂B的1:1混合物),用KOH调整至pH6.5)的发酵罐。以分批法利用受控的传氧速率(15-20mMO2/hr)在30℃下将该增殖培养物培养至12-18的终OD600。对于第二阶段,通过离心收集增殖培养基中的细胞,随后将其重悬浮于1.1L脂肪醇生产培养基(200g/L葡萄糖,1g/LKH2PO4,5g/L(NH4)2SO4,2.5mg/LMgSO4*7H201mg/LFeSO4*7H20,0.5mg/LH3BO3,0.5mg/LMnSO4-H20,0.5mg/LNa2MoO4-2H20,0.5mg/LZnSO4*7H20,0.5mg/LCoCl2*H20,0.1mg/LKI,0.1mg/LCuCl2*2H20,50mg/L盐酸硫胺素以及50mg/L肌醇和0.8mL/L止泡剂)中。调整细胞悬浮液的体积以产生20g/L(细胞干重)的用于第二阶段的初始细胞密度,随后将重悬物加载至搅拌釜发酵罐。在30℃和溶解氧控制(30%dO2)下以分批法进行发酵。通过添加KOH将pH控制在3.5。必要时添加葡萄糖以防止葡萄糖耗尽(在整个发酵过程中,35g/L)。
在接种生产阶段培养物后24小时、48小时和72小时收集样品。基本上如实施例3中所述通过GC-FID分析脂肪醇滴度。24小时后,观察到9g/L的脂肪醇滴度。48小时后,观察到16g/L的脂肪醇滴度。72小时后,观察到21g/L的脂肪醇滴度。
实施例8:Sec62基因的部分缺失
通过用DNA构建体转化解脂耶罗维亚酵母菌来构建具有Sec62基因(YALI0B17512g;SEQIDNO:54)的部分缺失的菌株,所述DNA构建体经设计用于(1)将密码子Trp235突变成终止密码子并且(2)通过同源重组用选择标记替代密码子236-396。紧接Sec62编码序列之后的3'非翻译区的30个核苷酸也被缺失。该部分缺失对应于Sec62的细胞质结构域的缺失,其正好始于预测的跨膜结构域之后的Leu206,连续至蛋白质的末端的Glu396。如表3中显示的,该菌株(在表中鉴定为"B17512")与不具有Sec62基因的部分缺失的对应DSMZ1345菌株相比,产生约10倍更多的脂肪醇产量。
通过用DNA构建体转化解脂耶罗维亚酵母菌来产生Sec62基因(YALI0B17512g)的3个其它部分缺失,所述DNA构建体(1)将编码Glu267的密码子、编码Ala302的密码子或编码Ile337的密码子突变成终止密码子,并且(2)通过使用同源重组用选择标记替代随后的密码子。这些菌株与不具有Sec62基因的部分缺失的对应DSMZ1345菌株相比,产生约1.5至2倍更多的脂肪醇产量。
用于DNA构建和转化的方法描述于实施例4中,并且为本领域技术人员所熟知。简而言之,用于转化的DNA构建体包含,侧翼连接有紧接待缺失的核苷酸的上游和下游的约1kb基因组序列的双功能选择标记。转化后,通过在正选择培养基中的生长来选择具有期望的修饰的菌株。然后从基因组切除选择标记,并且通过在反向选择培养基上的生长来鉴定已失去标记的菌株。PCR基因分型用于确认,菌株具有期望的修饰。
***
应理解,本文中描述的实施例和实施方案仅用于举例说明目的,并且基于其的各种变动或改变对于本领域技术人员来说是显然的,并且包括在本申请的精神和实质内以及所附权利要求的范围内。本文中引用的所有公开案、专利和专利申请通过引用整体并入本文,用于所有目的。
Claims (14)
1.一种重组解脂耶罗维亚酵母(Yarrowialipolytica)细胞,其中一个或多个内源基因被破坏,其中所述内源基因是YALI0C17545和YALI0E28336,所述YALI0C17545与SEQIDNO:7具有至少80%的序列同一性,所述YALI0E28336与SEQIDNO:8具有至少80%的序列同一性,并且所述重组酵母细胞包含有效地连接于启动子的编码脂肪酰基还原酶(FAR)蛋白的外源基因。
2.权利要求1的重组解脂耶罗维亚酵母细胞,其还包含经破坏的内源基因YALI0E11099以及经破坏的内源基因YALI0E28534,所述YALI0E11099与SEQIDNO:9具有至少80%的序列同一性,所述YALI0E28534与SEQIDNO:12具有至少80%的序列同一性。
3.权利要求1或2的重组解脂耶罗维亚酵母细胞,其还包含经破坏的内源基因YALI0E12463,所述YALI0E12463与SEQIDNO:15具有至少80%的序列同一性。
4.权利要求1或2的重组解脂耶罗维亚酵母细胞,其还包含经破坏的内源基因YALI0B17512,所述YALI0B17512与SEQIDNO:54具有至少80%的序列同一性。
5.权利要求1或2的重组解脂耶罗维亚酵母细胞,其中所述外源基因编码功能性FAR蛋白,所述功能性FAR蛋白包含与包含SEQIDNO:2的栖藻海杆菌(Marinobacteralgicola)FAR蛋白具有至少80%的序列同一性的多肽序列。
6.权利要求1或2的重组解脂耶罗维亚酵母细胞,其中所述外源基因编码功能性FAR蛋白,所述功能性FAR蛋白包含与包含SEQIDNO:4的水油海杆菌(Marinobacteraquaeolei)FAR蛋白具有至少80%的序列同一性的多肽序列。
7.权利要求1或2的重组解脂耶罗维亚酵母细胞,其中所述外源基因编码功能性FAR蛋白,所述功能性FAR蛋白包含与含有SEQIDNO:6的海洋杆菌属的种(Oceanobactersp.)RED65的FAR蛋白具有至少80%的序列同一性的多肽序列。
8.权利要求1或2的重组解脂耶罗维亚酵母细胞,其还包含编码脂肪酸合酶(FAS)、酯合酶、酰基-ACP硫酯酶(TE)、脂酰CoA合酶(FACS)、乙酰-CoA羧化酶(ACC)、木糖异构酶或转化酶的第二外源基因。
9.权利要求4的重组解脂耶罗维亚酵母细胞,其中由内源基因YALI0B17512编码的多肽包含细胞质结构域,并且其中所述破坏包括所述细胞质结构域的至少部分的缺失。
10.一种产生脂酰CoA衍生物的方法,所述方法包括,在产生脂酰CoA衍生物的条件下,培养权利要求1-9中任一项的重组解脂耶罗维亚酵母细胞。
11.权利要求10的方法,其中所述脂酰CoA衍生物是脂肪醇、脂肪酸、脂肪醛、脂肪酯、脂肪醋酸酯、蜡酯、烷烃或烯烃。
12.权利要求11的方法,其中所述脂酰CoA衍生物是脂肪醇。
13.权利要求10-12中任一项的方法,其包含:
将含有纤维素的生物质与一种或多种纤维素酶接触以产生可发酵的糖;和
在产生脂酰CoA衍生物的条件下,将所述重组解脂耶罗维亚酵母细胞与所述可发酵的糖接触。
14.权利要求13的方法,其中所述可发酵的糖包含蔗糖。
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